Die Erfindung betrifft Wirkstoff-Konjugate mit einem intrazellulär wirk- samen Liganden, einer Targeting-Domäne sowie meist auch einer den Ein- tritt ins Cytoplasma der Zielzelle gewährleistenden Lokalisations-Domäne sowie deren Verwendung als Diagnostikum und Arzneimittel auch in ver- schiedenen Indikationen sowie Verfahren zu deren Herstellung.

Eine durchschnittliche Zelle enthält ca. 30 000 Proteine, die an intrazellu- lärer Signaltransduktion, Regulation der Transkription, Zell-Zell- Kommunikation und intrazellulärem Transport teilnehmen. Die funktio- nelle Analyse oder therapeutische Beeinflussung dieser Vorgänge im Kon- text der lebenden Zelle wird dadurch behindert, dass die Plasmamembran nur einen selektiven Stoffaustausch zulässt und verschiedene hochspezifi- sche Bindemoleküle (z. B. Antikörper) die Plasmamembran nicht durch- dringen können. Für entsprechende Analysen wurden deshalb bisher Mik- roinjektion oder Poren-formende Substanzen eingesetzt, die aber eine au- ßergewöhnliche Belastung für die Zelle bedeuten und in einem therapeuti- schen Ansatz nicht verwendbar sind. Gerade Mikroinjektion in einzelne Zellen ist für eine Therapie nicht geeignet. Deshalb wurden in den letzten Jahren genetische Methoden entwickelt, um das komplexe Geflecht der Funktionsbeziehungen der og. Proteine zu untersuchen. Dies sind vor al-

lem : genetische Knockouts, dominant negative Mutanten und Antisense- RNA-Expression. Genetische Knockouts sind aufwendig in ihrer Herstel- lung, da sie in aller Regel erst bei homozygoten Tieren signifikante Effekte zeigen. Für eine Therapie sind sie völlig ungeeignet, da sie eine Keim- bahn-Gentherapie erfordern würden. Die zweite bisher benutzte Methode der dominant negativen Mutanten durch Überexpression von Proteinen mit Mutationen, die die gewünschte Funktion zerstört haben, wird oft durch Nebeneffekte der dafür erforderlichen starken Überexpression behindert und erfordert zudem genaue Informationen über die Wirkungsweise der entsprechenden Proteine zur Herstellung der gewünschten Mutanten. Das gleiche gilt für RNA-Antisense-Ansätze. Zudem erfordern auch diese bei- den Ansätze eine genetische Transformation, die für therapeutische Ver- wendungen nicht geeignet ist.

Aufgabe der Erfindung war es daher, geeignete Agentien zur Verfügung zu stellen, mit denen eine bessere, insbesondere spezifischere und effektivere Untersuchung und Beeinflussung lebender Zellen möglich ist.

Diese Aufgabe wird durch ein Wirkstoff-Konjugat enthaltend mindestens einen Liganden und mindestens eine spezifisch an eine Oberflächenstruk- tur einer Zielzelle eines humanen oder nichthumanen Säugetiers bindende Targeting-Domäne, wobei der Ligand innerhalb der Zielzelle eine intrazel- luläre Signalkaskade moduliert, gelöst.

Die hier beschriebenen Agentien wirken funktional modulierend direkt auf das zu untersuchende Zielmolekül, bzw. auf davon abhängige Reaktionen

des Zellstoffwechsels. Experimente mithilfe von Mikroinjektion von mo- noklonalen Antikörpern in einzelne Zellen oder durch die intrazelluläre Expression von Antikörpern oder"dominant negativen"Liganden belegen die Anwendbarkeit dieses Aspektes der Erfindung.

Die Erfindung unterscheidet sich von bisher beschriebenen Kopplungen von Antikörpern oder Liganden mit intrazellulären Effektoren dadurch, dass die intrazellulären Effektoren bisher Stoffe (Diphterietoxin, RNasen, Pseudomonas-Exotoxin Domänen u. a.) waren, deren intrazelluläre Wir- kung primär toxisch ist (Immuntoxine). Bei der Erfindung ist dagegen eine die Zellen abtötende Wirkung nicht der primäre Effekt. In einigen Anwen- dungsbeispielen kann zwar im weiteren Verlauf der Signalkaskade eine Inaktivierung oder sogar Abtötung der Zelle erfolgen (z. B. durch Apopto- seinduktion), diese Wirkung unterscheidet sich allerdings von den Immun- toxinen nicht nur dadurch, dass sie nicht primär von den in der Erfindung beschriebenen Agentien verursacht wird, sondern auch dadurch, dass sie vom Status der Signaltransduktionskaskade in der jeweiligen Zelle ab- hängt, was eine zusätzliche Spezifität ermöglicht.

Die Möglichkeit, den intrazellulären Effektor Zell-/Gewebe-spezifisch ein- zubringen, ist ein weiterer Vorteil der hier beschriebenen Klasse von A- gentien. Damit unterscheiden sie sich im Besonderen von den verschiede- nen anderen in letzter Zeit beschriebenen Transportdomänen und ihrer Konjugate, welche die Aufnahme von Peptiden oder Proteinen von außen durch die Zellmembran gewährleisten. Hsp70, ein primär cytoplasmati-

sches Protein, kann nichtkovalent gebundene Peptide der MHC- Beladungsmaschinerie zuführen, wenn es den Zellen von außen zugegeben wird. Auch viele Virenproteine besitzen Translokationsdomänen, z. B das tat-Genprodukt des HIV oder ein Protein der Herpesviren. Auch syntheti- sche Peptide wurden beschrieben, die Biomembranen effizient durchdrin- gen können und dabei an sie gekoppelte andere Peptide transportieren. Al- le diesen Ansätzen ist aber gemeinsam, dass sie die Membrandurchdrin- gung nicht mit der notwendigen Spezifität durchführen. Die in dieser Er- findung beschriebene Agentien weisen dagegen eine Entkopplung von Bindung und Transport auf, die es ermöglicht, über geeignete Domänen, z. B. Antikörperfragmente, eine spezifische Bindung zu erreichen. Diese Entkopplung kann in dieser Erfindung dadurch erreicht werden, dass für die Bindung an die Zelle eine andere Moleküldomäne zuständig ist als für den Übertritt ins Cytoplasma.

Daher ist bevorzugt, wenn das Wirkstoff-Konjugat auch eine separate Lo- kalisations-Domäne enthält, die den Durchtritt des Wirkstoff-Konjugats in das Cytoplasma der Zielzelle gewährleistet.

Insgesamt wird die gestellte Aufgabe aber auch durch ein Wirkstoff- Konjugat enthaltend mindestens eine spezifisch an eine Oberflächenstruk- tur einer Zielzelle eines humanen oder nichthumanen Säugetiers bindende Targeting-Domäne, mindestens eine separate Lokalisationsdomäne, die den Durchtritt des Wirkstoff-Konjugats in das Cytoplasma der Zielzelle gewährleistet, und mindestens einen innerhalb der Zielzelle wirkenden Li-

ganden, gelöst. Bei diesem Wirkstoff-Konjugat ist es aber auch bevorzugt, wenn der Ligand des Wirkstoff-Konjugats innerhalb der Zielzelle eine in- trazelluläre Signalkaskade moduliert.

Insgesamt ist es eine besonders bevorzugte Ausführungsform der erfin- dungsgemäßen Wirkstoff-Konjugate, wenn die Targeting-und die Lokali- sations-Domäne Teil einer Targeting-Komponente aus mehreren Domänen sind.

Mit und bei der Erfindung insgesamt sollen zur Erzeugung immunologi- scher Toleranz, zur Entzündungshemmung, zur Tumortherapie, oder zur Beeinflussung des Differenzierungs-oder Wachstumsstatus von Zellen intrazelluläre Rezeptor-Signalwege durch intrazelluläre Liganden modu- liert werden. Dabei ist der bisher nicht beschriebene Vorteil der Erfindung, dass intrazelluläre Liganden mit Targeting-Komponenten gekoppelt wer- den, die eine zell-/gewebespezifische Wirkung der Liganden dadurch ge- währleisten, dass sie einen Übertritt ins Cytoplasma dieser spezifischen Zellen ermöglichen ("Ligand Sneaking").

Es ist für ein beispielhaftes, erfindungsgemäßes Wirkstoff-Konjugat zur Erzeugung immunologischer Toleranz besonders bevorzugt, wenn der Li- gand die intrazellulären Signalwege von Interleukin 1, Interleukin 6, des Tumornekrosefaktors alpha, von CD28, des T-Zellrezeptors oder den ras/raf-Signaltransduktionsweg moduliert.

Dabei ist es günstig, wenn der Ligand : -an den cytoplasmatisch zugänglichen Teil der Rezeptoren von Inter- leukin 1, Interleukin 6, des Tumornekrosefaktors alpha, von CD28 oder des T-Zellrezeptors, -an ein Mitglied der STAT-Proteinfamilie, insbesondere STAT3, -an ein Mitglied der NF-kB/rel-Proteinfamilie, vorzugsweise NIK, -an am NFkB-Signaltransduktionsweg beteiligte Moleküle, vorzugs- weise IkB-Proteine, IkB-Kinasen alpha und beta oder AKT, -an am ras/raf-Signaltransduktionsweg beteiligte Moleküle, insbe- sondere ras-Proteine, -an Mitglieder der ras-Superfamilie monomerer GTPasen inclusive Unterfamilien der Ras-, Rho-, Rac-, Rab-Unterfamilien, -an am MAP-Kinasen-Signaltransduktionsweg beteiligte Moleküle oder -an Pospholipase C-gamma oder PI-3-Kinase bindet.

Es ist weiter bevorzugt, wenn der im erfindungsgemäßen Wirkstoff- Konjugat enthaltene Ligand eine dominant negative Mutante

-eines IkB-Proteins, einer IkB-Kinase oder der NIK ist, vorzugsweise eine Mutante, die keiner signal-induzierten Degradation unterliegt, -eines ras-Proteins, vorzugsweise eine konstitutiv aktive oder inakti- ve Mutante, -eines Bestandteils des MAP-Kinasen-Transduktionsweges oder -einer Pospholipase C-gamma oder der PI-3-Kinase ist.

Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist bei erfindungsge- mäßen Wirkstoff-Konjugaten bevorzugt, wenn der Ligand einen-vorzugsweise rekombinanten-Antikörper oder ein Antikörperfragment, vorzugsweise einen intrazellulären Anti- körper, vorzugsweise gegen Einheiten eines intrazellulären Signaltransduktionswegs, umfaßt oder aus diesem besteht, oder der Ligand einen natürlichen Bindungspartner eines intrazellulären Elements einer Säugetier-Zielzelle oder eine Mutante eines solchen natürlichen Bindungspartner umfaßt oder aus diesem besteht, und/oder

-der Ligand ein natürliches oder synthetisches Peptid oder Protein, ein Kohlehydrat, eine Nukleinsäure, ein Aptamer, ein Hormon, einen Neurotransmitter, ein Lipid, eine synthetische organische Verbin- dung oder ein Derivat dieser Moleküle umfaßt oder aus diesem be- steht.

Es ist ein wichtiger Aspekt der Erfindung, dass intrazelluläre Liganden ne- ben den natürlichen Liganden oder ihren Mutanten auch Antikörper sein können. Neu ist in diesem Fall, dass diese Antikörper nicht wie im Falle intrazellulärer Antikörper (Intrabodies) im für ihre Faltung äußerst ungüns- tigen Cytoplasma hergestellt werden brauchen, aber trotzdem ihre cy- toplasmatischen Targets effektiv erreichen können.

Die Erfindung überwindet in Ihren Ausführungsformen und Gegenständen die Schwierigkeiten, die sich beim Einsatz von bisher beschriebenen hö- hermolekularen Agentien zur Modulation intrazellulärer Signalkaskaden durch intrazelluläre Antikörper ("Intrabodies") oder Überexpression von Mutanten des natürlichen Liganden ("dominant negative Mutationen") er- geben.

Intrazelluläre Antikörper wurden bereits in verschiedenen Zellkomparti- menten exprimiert. Es gelang die Inaktivierung des ras-Genproduktes p21 durch intrazelluläre cytoplasmatische Antikörper. Auch die Beeinträchti- gung der Transaktivierungsfunktion von p53 durch cytoplasmatische Anti- körperfragmente wurde beschrieben. Allerdings wurde auch gezeigt, dass die internen Disulphidbrücken cytoplasmatisch exprimierter Antikörper-

fragmente wegen des reduzierenden Milieus des Cytoplasmas nicht korrekt oxidiert werden. Zwar wurden kürzlich Antikörper beschrieben, die ohne intrazelluläre Disulphidbrücken auskommen und deshalb möglicherweise für eine Funktion im Cytoplasma besser geeignet sein könnten, doch zeig- ten diese eine verringerte Stabilität. Zudem ist dieser Ansatz nicht generell für alle Antikörper zu verallgemeinern. Im Cytoplasma stehen auch nicht die Chaperone zur Verfügung, die für die Antikörperfaltung notwendig sind. Eine vergleichende Studie, bei der der gleiche scFv-Antikörper mit- hilfe verschiedener Signalsequenzen in verschiedenen Zellkompartimenten exprimiert wurde, zeigte, dass signifikante Antigenbindeaktivität nur im ER und auf der Membran nachgewiesen werden konnte, nicht aber im Kern oder Cytoplasma. Ein weiterer Nachteil von Intrabodies liegen zum einen darin, dass sie innerhalb der Zelle hergestellt werden müssen, für eine Therapie ohne den Einsatz von Gentransfer also nicht verfügbar sind.

Auch"dominant negative"Mutationsprodukte haben ebenfalls den Nach- teil, ohne den Einsatz von Gentransfer nicht in der Zielzelle verfügbar zu sein. Die Erfindung umgeht beide Hindernisse, indem die Fusionsproteine außerhalb der zu therapierenden Zellen in einem geeigneten Produktions- system hergestellt werden.

Die vorgeschlagenen Liganden und Konjugate ermöglichen die Modulati- on der Schlüsselstellen von Signalkaskaden, die z. B. bei der T- Lymphozyten-Aktivierung über CD28 bzw. über Cytokinrezeptoren für TNFa, IL-1 oder IL-6 kostimulatorisch wirken. TNFa und IL-1 sind dar- über hinaus zentrale Mediatoren bei akuten und chronischen Entzündungs-

reaktionen. Die Blockade dieser Signalwege soll für die Dämpfung von Entzündungsprozessen eingesetzt werden und/oder die Induktion immuno- logischer Toleranz durch Blockade des zweiten (kostimulatorischen) Sig- nals unterstützen. Die Konjugate haben jedoch auch eine universelle Be- deutung für die Immunologie, Onkologie und Entzündungsforschung, da es ermöglicht, selektiv Zellfunktionen zu stimulieren oder zu inhibieren und dies therapeutisch zu nutzen.

Als Modulatoren der intrazellulären Signalwege werden entweder natürli- che Liganden oder ihre Mutationen (z. B. Dominant negative Mutanten), oder rekombinante Antikörper gegen verschiedene Elemente von intrazel- lulären Signaltransduktionskaskaden gewonnen oder künstliche bzw. syn- thetische Liganden, z. B. ausgewählt wegen ihrer besonderen Resistenz gegenüber Degradation, hergestellt und eingesetzt, die mit hinreichender Affinität Targetepitope in den Elementen der Signalwege erkennen. Dabei können Elemente der Bindungsregion (Paratope) eines geeigneten Anti- körpermoleküls auf genetischem Weg in die ausgewählte Ligan- dengrundstruktur eingebracht werden. Die Spezifität der Modulation kann dabei durch den Angriffspunkt im Signalweg kontrolliert werden. Als Ziel- struktur (Antigen) im beschriebenen Modellsystem besonders attraktiv sind dabei Faktoren (hier : Kinasen), bei denen mehrere Signalwege ver- schiedener Rezeptoren zusammenlaufen. Die Signalwege sowohl des TNFa-wie des IL-1 Rezeptors treffen sich zum Beispiel in der NFkB- induzierenden Kinase (NIK). Nahezu alle NF-kB-aktivierende Signalwege dürften sich auf der Ebene der IkB-Kinasen (IKK) a und b treffen, was die-

se zu einem idealen Angriffspunkt für eine potente Hemmung der NF-kB- Aktivierung macht, z. B. mithilfe dominant negativer Mutanten. Da jedoch zumindest eine komplette oder weitgehende Hemmung der IKK's im ge- samten Organismus zu erheblichen Nebenwirkungen fuhren dürfte (IKK-a und IKK-b defiziente Mäuse sterben perinatal bzw. noch embryonal), wäre hier die gezielte Hemmung in bestimmten Zellen wie T-Zellen oder Mono- zyten/Makrophagen mithilfe einer zellspezifischen"Targeting- Komponente"essentiell für einen therapeutischen Einsatz hochpotenter IKK-Inhibitoren. Auch IkB-Proteine, insbesondere Mutanten, die keiner signal-induzierten Degradation unterliegen, hemmen die NF-kB-Aktivität äußerst wirksam. Im Stand der Technik müssen diese NF-kB Inhibitoren jedoch zunächst als Gen in die Zielzellen eingeschleust werden mithilfe von Transfektionen oder aber durch Transduktion mithilfe von Viren (Gentherapie), was relativ unspezifisch ist, wegen der Antigenität von Vi- ren kaum wiederholt durchgeführt werden kann und derzeit insgesamt noch recht problematisch ist. Das hier insgesamt Beschriebene erlaubt die gezielte Einbringung eines biotechnisch in großen Mengen herstellbaren rekombinanten Fusionsproteins zur effizienten Modifizierung intrazellulä- rer Signalwege. Da insbesondere Fusionsprotein, aufgebaut aus einer "Targeting-"und einer Liganden-bzw. Effektor-Komponente, vorzugswei- se aus humanen Bestandteilen besteht, ist eine Immunantwort nicht zu er- warten, was eine wiederholte Applikation erlaubt.

Der ras/raf-Signaltransduktionsweg spielt eine wichtige Rolle unter ande- rem in der Wachstumsregulation. So können konstitutiv aktive ras-

Mutanten einen wesentlichen Schritt in der Onkogenese darstellen. Auch hier sollte das hier beschriebene Verfahren ermöglichen, inhibierende Li- ganden von ras-Proteinen bzw. Bestandteilen der ras- Signaltransduktionskette zielgerichtet in Tumorzellen einzuschleusen und somit die ungebremste Zellproliferation zu hemmen.

Beim IL-6-Rezeptor ist Stat3 ein interessantes Ziel, denn es ist nicht nur am IL-6-Signalweg beteiligt, sondern spielt auch eine wichtige Rolle bei zellulärer Transformation und Wachstumskontrolle von Tumorzellen.

Weitere Anwendungen ergeben sich dadurch, dass intrazelluläre Signal- wege mithilfe eines an IkB Proteine oder die IkB-Kinase a oder b (IKK- a/b) oder AKT bindenden Liganden oder dominant-negative Mutanten der IKK's moduliert werden.

Weitere Anwendungen ergeben sich dadurch, dass die intrazellulären Sig- nalwege mithilfe eines an Mitglieder der ras Superfamilie monomerer GTPasen (mit den Unterfamilien der Ras-, Rho-, Rac-, Rab-Unterfamilien) bindenden Liganden bzw. einer konstitutiv aktiven oder inaktiven Mutante eines ras-Proteins moduliert werden.

Weitere Anwendungen ergeben sich dadurch, dass die intrazellulären Sig- nalwege mithilfe eines an Mitglieder des MAP-Kinasen- Signaltransduktionsweges bindenden Liganden bzw. einer dominant nega- tiven Mutante eines Bestandteils des MAP-Kinasen- Signaltransduktionsweges moduliert werden.

Weitere Anwendungen ergeben sich dadurch, dass intrazelluläre Signal- wege mithilfe eines an die PI-3-Kinase oder Phosholipase C-g bindenden Liganden oder einer dominant negativen Mutante dieser Enzyme modifi- ziert werden.

Weitere Anwendungen ergeben sich dadurch, dass die intrazellulären Sig- nalwege des T-Zellrezeptors moduliert werden.

Es ist weiter bevorzugt, wenn bei einem erfindungsgemäßen Wirkstoff- Konjugat -die Targeting-Domäne einen-vorzugsweise rekombinanten-Anti- körper, ein Antikörperfragment oder einen"Single-chain"-Antikör- per umfaßt oder aus diesem besteht, oder -die Targeting-Domäne einen natürlichen Liganden der Zelloberflä- chenstruktur oder eine Mutante eines solchen natürlichen Liganden umfaßt oder aus diesem besteht, und/oder -die Targeting-Domäne ein natürliches oder synthetisches Peptid oder Protein, ein Kohlehydrat, eine Nukleinsäure, ein Aptamer, ein Hor- mon, einen Neurotransmitter, ein Lipid, eine synthetische organische Verbindung oder ein Derivat dieser Moleküle umfaßt oder aus die- sem besteht.

Ebenso kann ein synthetischer bzw. genetisch hergestellter Ligand zur Anwendung kommen, z. B. erzeugt durch erstens die Auswahl einer geeig- neten Grundstruktur (beispielsweise bezügliche Resistenz, Abbaubarkeit, Ähnlichkeit zu Antikörpern usw.) und zweitens die Veränderung durch Einbringen von Antigenbindungssequenzen (Paratope) aus bekannten An- tikörpern oder durch gesteuerte Mutation mittels genetischer Methoden und Optimierung der Bindungseigenschaften, z. B. der Affinität. Hierdurch kann ein Targeting an der Zelloberfläche (Resistenz-Blutplasma/-serum) bzw. eine Funktionsdomain im Zellinneren (Cytoplasma) angesprochen werden.

Dabei ist es weiter besonders günstig, wenn beim erfindungsgemäßen Wirkstoff-Konjugat die Targeting-Domäne an ein auf der Zelloberfläche der Zielzelle zugängliches Protein bindet, insbesondere an CD4, CD5, CD71, CD95, CD 1 a, CD 19, CD 14, CD7, CD20, CD22, CD69, CD25, MHCII, CD21, CD45RA, CD45RO, NCAM, ICAM, den EGF-Rezeptor oder Integrine.

Es ist eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Wirkstoff-Konjugats, wenn die Lokalisations-Domäne die intrazelluläre Lokalisation des Moleküls durch den Übertritt aus dem endozytotischen Vesikelweg in das Cytoplasma bestimmt, vorzugsweise ein Protein mit ei- nem"Endosome-escape"-Signal, insbesondere beispielsweise die Endoso- men Escape-Domäne des Pseudomonas aeruginosa Exotoxins A oder eine Deletionsmutante des Diphterietoxins, umfaßt oder daraus besteht.

Es ist weiter bevorzugt, wenn die Lokalisations-Domäne des erfindungs- gemäßen Wirkstoff-Konjugats ein Fragment eines biologischen Toxins o- der einer RNase umfaßt oder daraus besteht und/oder an Integrin beta5 o- der Integrin beta3 bindet.

Weiter ist es bevorzugt, wenn bei einem erfindungsgemäßen Wirkstoff- Konjugat die Lokalisations-Domäne mindestens ein Fragment eines Virus- proteins, vorzugsweise ein Oberflächenprotein bzw. Viruskapsid-Protein, umfaßt oder daraus besteht, vorzugsweise ausgewählt aus Oberflächenpro- teinen des adenoassoziierten Virus (AAV), des Adenovirus, der Hepatitis- viren ; des Influenza-Virus, insbesondere das aminoterminale Peptid des Influenza-Virus-Hemagglutinins und seine sauren Varianten ; des Poly- oma-Virus, des Kaninchen-Parvovirus, des Tollwut-Virus, des Semliki- Forest-Virus, des humanen Rhinovirus, von Herpesviren oder Enzephali- tis-Viren.

Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn die Lokalisations-Domäne des er- findungsgemäßen Wirkstoff-Konjugats das biochemische Milieu in den Endosomen oder endozytotischen Vesikeln ansäuert, vorzugsweise ade- novirale Proteine oder ihre Fragmente enthält oder daraus besteht.

Der Übertritt ins Cytoplasma kann mit einer Vielzahl verschiedener be- schriebener Moleküldomänen erreicht werden, so z. B. von bakteriellen Toxinen, Viruskapsid-Proteinen, aber auch durch Teile von RNasen. Auch Kopplung an nichtpeptidische Moleküle, wie kationische Lipide, kann die- sen Übertritt begünstigen.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Wirkstoff-Konjugats liegt vor, wenn das Wirkstoff-Konjugat einen intra- zellulären Antikörper gegen einen Bestandteil eines intrazellulären Sig- nalwegs oder eine dominant negative Mutante eines Bestandteils eines in- trazellulären Signalwegs als Teil des Liganden, einen Antikörper gegen oder Liganden für eine Oberflächenstruktur, vorzugsweise einen internal- sierenden Rezeptor, als Teil der Targeting-Domäne und vorzugsweise eine Endosomen-Escape-Sequenz als Teil der Lokalisationsdomäne enthält.

Bei dieser Ausführungsform ist es besonders hervorzuheben, wenn das Wirkstoff-Konjugat (bispezifisches Antikörperfusionsprotein) einen intra- zellulären und einen oberflächenstrukturspezifischen Antikörper, insbe- sondere als zwei scFv-Antikörper, in Form von Diabodies, Triabodies, V- bodies, Minibodies, dsFv-dsFv', Tandem-scFv oder zweier chemisch kon- jugierter Antikörper oder Antikörperfragmente, sowie gegebenenfalls eine Endosomen-Escape-Sequenz enthält.

Zur zelltypspezifischen Anlieferung von Liganden werden diese in Form bispezifischer Proteine mit einem rekombinanten Antikörperfragment oder dem natürlichen Liganden der Oberflächenstruktur kombiniert, die idealer Weise an einen internalisierenden Zelloberflächen-Rezeptor binden. Um einen Übertritt aus den Endocytosevesikeln in den Wirkort der Modulato- ren, das Cytoplasma, zu gewährleisten, wird in manchen Fällen noch eine Protein-Domäne mit einem endosome escape-Signal erforderlich sein.

Es ist weiter bevorzugt, wenn an das erfindungsgemäße Wirkstoff- Konjugat, insbesondere die Lokalisationsdomäne, kationische Lipide ange- fügt werden, insbesondere 3-tetradecylamino-N-tert-butyl-N'- tetradecylpropionamidine, N- (1-2, 3-dioleyloxypropyl)-N, N, N- triethylammonium (DOTMA), dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE), N- [l- (2, 3-dimyristyloxy) propyl]-N, N-dimethyl-N- (2-hydroxyethyl) am- monium bromide (DMRIE) oder Cholesterol.

Alternativ werden die Modulatoren genetisch in die Zielzellen einge- schleust. Für einen potentiellen therapeutischen Ansatz wird die genetische Information für die Modulatoren durch gewebespezifische somatische Gentherapie vermittelt. Dazu wird die Oberfläche der als Gentherapie- Vektoren eingesetzten Adenoviren (bzw. AAV) durch Einfügen gewebe- spezifischer Peptide oder Antikörperfragmente gegen T-Zell- Oberflächenproteine modifiziert, um ihre Infektiosität auf die Zielzellen zu beschränken.

Eine besondere Ausführungsform des Wirkstoff-Konjugats liegt daher vor, wenn der Ligand Nukleinsäure mit für einen eine intrazelluläre Signalkas- kade innerhalb der Zielzelle modulierenden, vorzugsweise einem bereits oben beschriebenen Liganden, kodierende (n) Abschnitt (en) enthält. Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn das Wirkstoff-Konjugat einen Adenovi- rus-Vektor, einen AAV-Vektor, einen retroviralen Vektor, einen NDV- Vektor, einen JCV-Vektor oder andere DNA-Molekülkomplexe enthält,

wobei diese Übertragungseinheit modifiziert sein kann, vorzugsweise eine Targeting-Domäne enthält.

Entsprechend ist auch ein weiterer Gegenstand der Erfindung, der eben- falls die Aufgabe löst, ein Wirkstoff-Konjugat enthaltend Nukleinsäure mit für einen eine intrazelluläre Signalkaskade innerhalb der Zielzelle modu- lierenden, vorzugsweise bereits oben beschriebenen Liganden kodierenden Abschnitt (en) und mindestens einer Übertragungseinheit ausgewählt aus dem Adenovirus-Vektor, dem AAV-Vektor, einem retroviralen Vektor, einem NDV-Vektor, einem JCV-Vektor oder anderen DNA- Molekülkomplexen, wobei die Übertragungseinheit modifiziert sein kann und/oder das Wirkstoff-Konjugat vorzugsweise auch eine oben bereits be- schriebene Targeting-Domäne enthält. Insofern kann hierdurch ein gezielt modulierte Ligand erzeugt werden.

Eine insgesamt bevorzugte Form aller erfindungsgemäßen Wirkstoff- Konjugate ist eine Ausführungsform, bei der der Ligand, die Targeting Domäne sowie gegebenenfalls andere enthaltene Teile des Wirkstoff- Konjugats wie beispielsweise die Lokalisations-Domäne bzw. die Targe- ting-Komponente über kovalente Bindungen miteinander verbunden sind.

Überwiegend wird allen Konstrukten und Konjugaten eine Optimierung für die weitgehende Vermeidung der Immunantwort gegen das therapeuti- sche Konstrukt gemeinsam sein. Deshalb werden bevorzugt humane Mole- küle verwendet.

Die Verträglichkeit für den Patienten wird dabei gewährleistet, indem ein möglichst großer Anteil des therapeutischen Agens, im besonderen Teile des Liganden oder der Targeting-Komponente oder die dafür kodierenden Gene humanen Ursprungs sind.

Besonders bevorzugt ist es daher, wenn bei einem erfindungsgemäßen Wirkstoff-Konjugat der Ligand, die Targeting Domäne sowie gegebenen- falls andere enthaltene Teile des Wirkstoff-Konjugats wie insbesondere die Lokalisations-Domäne bzw. die Targeting-Komponente oder dafür gege- benenfalls kodierende Gene ganz oder teilweise humanen Ursprungs sind.

Ein weiterer Gegenstand der Anmeldung ist ein Verfahren zum Einbringen von Liganden in lebende Zellen, bei dem ein erfindungsgemäßes Wirk- stoff-Konjugat mit den Zellen in Kontakt gebracht wird.

Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn beim erfindungsgemäßen Verfah- ren kationische Lipide beigefügt werden, insbesondere 3-tetradecylamino- N-tert-butyl-N'-tetradecylpropionamidine, N- (1-2, 3-dioleyloxypropyl)- N, N, N-triethylammonium (DOTMA), dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE), N- [l- (2, 3-dimyristyloxy) propyl]-N, N-dimethyl-N- (2- hydroxyethyl) ammonium bromide (DMRIE) oder Cholesterol. Diese er- leichtern den Übertritt ins Cytoplasma.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoff-Konjugate sind therapeutisch hoch wirksam, spezifisch und toxikologisch unbedenklich. Damit sind sie ge- eignet und vorgesehen als Therapeutika eingesetzt zu werden. Ein weiterer

Gegenstand der Erfindung sind daher Arzneimittel, die mindestens ein er- findungsgemäßes Wirkstoff-Konjugat sowie gegebenenfalls geeignete Zu- satz-und/oder Hilfsstoffe und gegebenenfalls weitere Wirkstoffe enthalten.

Prinzipiell können die erfindungsgemäßen Arzneimittel als flüssige Arz- neiformen insbesondere als Injektionslösungen aber je nach Anwendungs- bereich auch in Form von Aerosolen, Tropfen oder Säften oder als halbfes- te Arzneiformen in Form von Granulaten, Tabletten, Pellets oder Kapseln verabreicht werden.

Geeignete Zusatz-und/oder Hilfsstoffe sind z. B. Lösungs-oder Verdün- nungsmittel, Stabilisatoren, Suspensionsvermittler, Puffersubstanzen, Kon- servierungsmittel, sowie Farbstoffe, Füllstoffe, und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie die einzusetzenden Mengen derselben hängt davon ab, ob das Arzneimittel z. B. inhalativ, oral, peroral, parenteral, intravasal, intravenös, intraperitoneal, rektal, subkutan, perkutan oder in- tramuskulär appliziert werden soll. Für orale Applikationen eignen sich Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten oder Suspensionen wie Tropfen, Säften und Sirupen, für intravasale Applikatio- nen Suspensionen und (Injektions-) Lösungen. Naturgemäß ist hier die intravasale Applikation bevorzugt, aber je nach Wirkort und chemischer Natur des Wirkstoff-Konjugats können auch andere Applikationsarten und -formen geeignet sein.

Ein weitere Gegenstand der Erfindung ist ein Diagnostikum enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Wirkstoff-Konjugat sowie gegebenen- falls geeignete Zusatz-und/oder Hilfsstoffe.

Die beschriebenen Agentien und Konjugate sind universell einsetzbar.

Nach Austausch der jeweils spezifischen Elemente (d. h. der Targeting- Domäne/Komponente und/oder des modulierenden Liganden) können sie verwendet werden, um in zellulären Systemen die funktionelle Bedeutung von einzelnen Signaltransduktionsschritten durch selektive Hemmung auf- zuklären. Diese Konjugate können aber im besonderen für die Behandlung von Infektionen, Autoimmunerkrankungen, degenerativen Erkrankungen und Krebs genutzt werden.

Weitere Anwendungen ergeben sich für die Behandlung von Krankheiten, die dadurch gekennzeichnet sind, dass bestimmte Zelltypen bzw. Zellpopu- lationen von ihrer normalen physiologischen Funktions-und Verhaltens- weise abweichen, indem sie z. B. hyper (über) aktiviert sind oder sich im Gegenteil nicht mehr oder nur noch unzulänglich aktivieren lassen. Diese Zustände treten z. B. bei lokalen und systemischen Entzündungen und bei Autoimmunkrankheiten auf. In diesen Fällen soll durch gezielte Eingriffe in Signalkaskaden dieser Zellen der Normalzustand wiederhergestellt wer- den. Dabei genügt es, eine hinreichend große Zahl von Zellen zu erreichen.

Es ist nicht erforderlich, jede Zelle in den Normalzustand zurückzustellen, da Selbstregulationsmechanismen die Heilung unterstützen können. Sinn- gemäß gilt das gleiche für Tumorzellen, bei denen häufig physiologische

Signalübertragungswege permanent überaktiviert sind. Das Behandlungs- prinzip ist auch anwendbar fur zelluläre Speicherkrankheiten, bei denen fehlgeleitete Synthesen zur schädlichen Ablagerung von Molekülen führen (z. B. Amyloidose, Hämochromatose oder andere Thesaurismosen, u. a. auch M. Alzheimer).

Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung eines er- findungsgemäßen Wirkstoff-Konjugats zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten, bei denen bestimmte Zelltypen oder Zellpopulationen von der normalen physiologischen Funktions-oder Ver- haltensweise abweichen, insbesondere zur Behandlung von Krebs, lokalen und systemischen Entzündungen, zellulären Speicherkrankheiten wie A- myloidose, Hämochromatose, oder anderen Thesaurismosen und M. Alz- heimer ; Autoimmunerkrankungen, Infektionen oder degenerativen Erkran- kungen oder zur Beeinflussung des Differenzierungs-oder Wachstumssta- tus von Zellen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines er- findungsgemäßen Wirkstoff-Konjugats zur Aufklärung der funktionellen Bedeutung einzelner Signaltransduktionsschritte in zellulären Systemen.

Auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Wirkstoff-Konjugats zum Einbringen von Liganden in lebende Zellen ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung.

Ebenso ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Wirkstoff-Konjugats wobei a) das Wirkstoff-Konjugat aus Ligand, Targeting Domäne und/oder gege- benenfalls anderen enthaltenen Teilen des Wirkstoff-Konjugats wie insbe- sondere der Lokalisations-Domäne bzw. der Targeting-Komponente als Fusionsprotein hergestellt wird, wobei geeignete Zellen mit einer entspre- chend kodierenden Nukleinsäure, vorzugsweise in einem Expressionsvek- tor, transfiziert werden und das Fusionsprotein exprimiert und anschlie- Bend aus den Zellen isoliert und gereinigt wird, oder b) Ligand, Targeting Domäne und/oder gegebenenfalls andere enthaltene Teile des Wirkstoff-Konjugats wie insbesondere die Lokalisations- Domäne bzw. die Targeting-Komponente chemisch kovalent konjugiert werden, oder c) das Wirkstoff-Konjugat in einer beliebigen Abfolge und Kombination der Verfahren nach a) und b) hergestellt wird.

Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn die Herstellung durch molekulare Kombinatorik erfolgt, wobei mindestens teilweise der Ligand, die Targe- ting Domäne und/oder gegebenenfalls andere enthaltene Teile des Wirk- stoff-Konjugats wie insbesondere die Lokalisations-Domäne bzw. die Tar-

geting-Komponente aus Molekülbibliotheken isoliert werden, vorzugswei- se mit Hilfe des Phagen-Displays, Ribosomal-Displays oder des"Two- Hybrid"-Systems.

Das therapeutische Agens kann von den Methoden der molekularen Kom- binatorik im besonderen profitieren, da Teile des Liganden oder der Targe- ting-Komponente aus Molekülbibliotheken isoliert werden können, im be- sonderen mithilfe des Phagen-Displays, Ribosomal-Displays oder des Two-Hybrid-Systems. Die Produktion kann dadurch erleichtert werden, dass die Targeting-Komponente und der Ligand als zusammenhängendes Fusionsprotein hergestellt werden. Im Falle dass als Liganden auch andere Stoffe als Proteine verwendet werden (z. B. Kohlehydrate, Aptamere, Nuk- leinsäuren oder andere Biomoleküle), ist auch eine chemische Konjugation möglich.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch die Behandlung eines Menschen oder Tieres, der oder das diese Behandlung benötigt, mit oder unter Verwendung der erfindungsgemäßen Wirstoff-Konjugate. Besonders geeignet ist diese Behandlung bei den vorgenannten Indikationen und An- wendungsarten.

Eine lokale Produktion des Agens in der Nähe der Zielzellen ist durch ent- sprechenden gezielten Gentransfer (durch"targeted gene delivery"oder gezielte Perfusion einzelner physiologischer Kompartimente) ebenfalls möglich.

Die folgenden Abbildungen und Beispiele sollen die Erfindung erläutern ohne ihren Gegenstand zu beschränken.

Abbildungen : Abb. 1) Abbildung 1 zeigt das Prinzip des"Ligand Sneakings". Als Modulator ist beispielhaft ein Fusionsprotein aus einer Endosomen-Escape-Domäne [z. B. ein Peptid aus den Aminosäuren 252-366 des Pseudomonas Exoto- xins A ("Translokationsdomäne")] und einem bispezifischen scFv (single chain)-Antikörper dargestellt. Moleküle und Fusionsanteile sind nicht maßstäblich dargestellt. Abb. 1 gibt eine generelle Übersicht über ein den Gegenständen der Erfindung zugrunde liegendes Prinzip.

Abb. 2) Abbildung 2 ist eine schematische Darstellung des Fusionsproteins zur Immunsuppression gemäß Beispiel 1. Die einzelnen Fusionsanteile sind nicht maßstabsgerecht dargestellt.

Abb. 3) Abbildung 3 ist eine schematische Darstellung eines bispezifischen Anti- körper-Pusionsproteins zur Immunsuppression gemäß Beispiel 2. Die ein- zelnen Fusionsanteile sind nicht maßstabsgerecht dargestellt.

Ausführungsbeispiele :

Beispiel 1 : Herstellung eines erfindungsgemäßen Antikörper-Fusionsproteins als the- rapeutisches Agens zur Immunsuppression Das Gen für ein scFv-Antikörper-Konstrukt (sc = single chain) mit spezifi- scher Bindungsaktivität zum humanen Lymphozyten-Oberflächenantigen CD4 wird durch Phagen-Display nach dem Verfahren von Welschof et al.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, (1997) S1902-1907, aus humanen Lympho- zyten von Spendern mit hohem anti-CD4 Antikörpertiter erzeugt und in den Expressionsvektor pOPE101 (Genebank Nr. : Y14585) einkloniert.

Dieser Expressionsvektor ermöglicht nach Zugabe von 50, uM IPTG zu dem Kulturmedium der Bakterien eine Herstellung des scFv-Antikörper- Fusionsproteins im Periplasma der Bakterien, aus dem es isoliert werden kann. Durch PCR-Mutagenese werden weiterhin folgende weitere Mutati- onen vorgenommen sowie Genfragmente in diesen Expressionsvektor einkloniert, welche für folgende Fusionsanteile in Anordnung gemäß Abb.

2 codieren : -das His-Tag in Nähe des Carboxyterminus wird entfernt, dafür am Aminoterminus des exprimierten Fusionsproteins eingesetzt.

-Am Carboxyterminus wird eine Sequenz"KDEL"codiert, welche eine Lokalisation im endoplasmatischen Retikulum bewirkt.

-Eine für IkB alpha als intrazellulären Modulator (Ligand) kodieren- de Nukleinsäure wird einkloniert, im besonderen für eine Mutante,

welche durch eine Deletion am Aminoterminus nicht mehr signalin- duziert degradiert wird, und damit eine verstärkte Wirkung des the- rapeutischen Agens gewährleistet.

-die Endosomen-Escape-Domäne des Pseudomonas aeruginosa Exo- toxin A (Aminosäurereste 252-366) gemäß Fominaya & Wels, J. Bi- ol. Chem. 271 (1966) S. 10560-10568 -Spacer-Peptide der Sequenz GS in Anordnung wie in Abb. 2 gezeigt Durch Zugabe von 100, uM IPTG wird die Produktion des Fusionsproteins in mit dem Vektor transformierten E. coli-Zellen induziert. Lösliches Fusi- onsprotein wird nach dem Verfahren von Schmiedl, Breitling & Dübel, Protein Engineering 13 (2000), S. 725-734 produziert und mithilfe des His- Tags und mit Ionentauscher-Chromatographie gereinigt.

Das therapeutische Agens ist für die immunsuppressive Behandlung von entzündlichen Erkrankungen mit maßgeblicher Beteiligung von CD4- positiven Entzündungszellen (T-Helferzellen, Monozyten, Makrophagen, Astrozyten) einsetzbar.

Beispiel 2 : Herstellung eines erfindungsgemäßen bispezifischen Antikörper- Fusionsproteins als therapeutisches Agens zur Immunsuppression Aus 2 verschiedenen Hybridom-Zellinien werden nach dem Verfahren von Breitling & Dübel, Methods in Molecular Medicine, Vol. 13 (1997) ed. U.

Reischl, Humana press Inc., Totowa, N. Y., S. 581-591, zwei scFv- Antikörperfragmente kloniert. Diese Antikörperfragmente sind spezifisch für a) die phosphorylierte (= aktivierte) Form von humanem STAT3, und b) das Lymphozyten-Oberflächenantigen CD4. Im Plasmid pcDNA3 wer- den die für diese beiden scFv-Fragmente codierenden Gene in Form eines Tandem-scFv gemäß der in Abb. 3 gezeigten Anordnung so einkloniert, dass sie im exprimierten Fusionsprotein durch einen Linker der Sequenz GSSSSGSSSSGSSSS verbunden sind. Weiterhin wird ein Genfragment einkloniert, welches bewirkt, dass am Aminoterminus des Fusionsproteins eine Deletionsmutante des Diphterietoxins nach London, Biochim, Bi- ophys Acta 1113 (1992), S. 25-51 angefügt ist, welche den Endosomen- escape bewirkt.

Der Expressionsvektor wird in CHO-Zellen eingebracht und das Expressi- onsprodukt nach Stand der Technik produziert und gereinigt. In das Kon- strukt kann mit üblichen Methoden ein His-Tag oder eine andere Sequenz einkloniert werden, welche die Aufreinigung des Proteins durch Affini- tätschromatografie erleichtert bzw. erlaubt.

Das Agens ist zur immunsuppressiven Behandlung von zytokingetriebenen entzündlichen Erkrankungen und besonders bei der Behandlung von IL6- abhängigen Immun-Überreaktionen einsetzbar.

Bei dieser Anwendung können die bispezifischen Antikörperanteile alter- nativ auch in Form von Diabodies, Triabodies, V-bodies, Minibodies, dsFv-dsFv', Tandem-scFv (laut Definition in Dübel & Konntermann Re-

combinant antibodies. (2001) In : Antibody Engineering, ed : R. Konter- mann & S. Dübel, Springer Verlag, Heidelberg/New York) oder durch zwei chemisch konjugierte Antikörper oder Antikörperfragmente darge- stellt werden.