本发明属于医药生物工程技术领域。 具体涉及活性提高的 L-天冬酰胺 酶变体以及这些变体在肿瘤治疗中的用途。 说

背景技术

白血病是当今世界上严重危及人类生命的一种 恶性疾病， 占肿瘤发病 率的第六位， 占青少年恶性肿瘤发病率的第一位 [1]。 这其中， 急性淋巴细 胞白血病 (acute lymphocytic leukaemia, AL书L)是发病率较高的血液系统恶性 肿瘤， 特别在青少年和儿童中比较普遍， 其发病率占所有青少年癌症发病 率的约 25%以及白血病发病率的约 80%[2]。 由于恶性细胞的急剧增加和扩 散， 在不治疗的情况下病人在数月甚至数周内死亡 。

在各种治疗方法中， L-天冬酰胺酶 （L-asparaginase, L-ASP, EC 3.5.1.1) 是一种重要的白血病化疗药物， 是几乎所有的 ALL联合化疗的重要组成部 分。 它的作用机理是分解血液循环中的 L-天冬酰胺， 肿瘤细胞由于不能自 身合成 L-天冬酰胺， 当失去外源 L-天冬酰胺后导致死亡； 而正常细胞由于 还具有 L-天冬酰胺的第二合成途径， 因此不受影响。 应用以 L-ASP为主的 联合化疗， 使预后有了明显改观， 完全缓解 (CR)率达 80%以上， 5年以上无 病生存率大于 40%[3]。

已上市的 L-ASP作为白血病化疗药物仍然具有局限性。 目前临床上应 用的 L-ASP 酶活性低， 体内半衰期短 (<5 小时）， 因而用药剂量很大 (30-50mg), 需要频繁注射 (每周 3 次)， 常引起患者过敏反应、 热原反应及 其它副作用 [4]。 PEG化修饰的 L-ASP虽然有明显延长的半衰期， 过敏反应 总体发生率较天然提取产物降低， 但 PEG修饰造成酶活性降低 30%， 而且 对天然 L-ASP不过敏的患者有 11%对 PEG化产品过敏 (数据来源为 Enzon 公司 PEG化 L-ASP Oncaspar的产品说明书）。加之 PEG化修饰的 L-ASP价 格昂贵， 其加重了患者的经济负担， 因而目前的治疗仍然主要采用从大肠 杆菌提取的天然产物。 上述不足使得 L-ASP的应用受到限制。 蛋白质体外定向进化技术能够用来对各种酶进 行改造， 如： Moon-soo Kim等人 [8]通过易错 PCR技术增强了来源于大肠杆菌肌醇六憐酸酶 AppA2 的热稳定性； An YF等人 [9]将易错 PCR与 StEP重组技术结合提高了 S-腺 苷基蛋氨酸合成酶 Saml 的酶活性， 使体内合成 S-腺苷基蛋氨酸累积量增 加了 56%。

曾有研究报道： 利用蛋白质体外定向进化技术对来源于欧文氏 菌 (Erwinia c/i ^w ^m )的 L-ASP进行改造，获得热稳定性提高的变体 L-ASP (D133V) , 其体外半失活温度 (Tm)较野生型 L-ASP提高 9.4°C [10]。

本领域仍需要能够降低蛋白剂量， 延长给药间隔， 大幅降低副反应， 降低生产成本和治疗费用的具有较高酶活性和 热稳定性的 L-ASP。 本发明 使用蛋白质体外定向进化技术获得了这样的 L-ASP。 发明概述

本发明通过体外定向进化 -易错 PCR技术对大肠杆菌 (¾dien'di fl coli) 野生型 L-天冬酰胺酶 (L-ansB)进行改造， 获得活性提高和热稳定性提高的

L-天冬酰胺酶变体。

因此，在一个方面，本发明提供了 L-天冬酰胺酶的变体，其是如 SEQ ID

NO:3所示的大肠杆菌野生型 L-天冬酰胺酶的变体，所述 L-天冬酰胺酶变体 包含在对应于 SEQ ID NO:3的第 48、 49、 152和 283位上具有一或多个氨 基酸取代的氨基酸序列。 本发明的 L-天冬酰胺酶变体与野生型酶相比具有 提高的活性和热稳定性。

另一方面， 本发明提供了包含编码本发明的 L-天冬酰胺酶变体的核苷 酸序列的分离的核酸、 包含所述核酸的表达构建体以及包含所述表达 构建 体的宿主细胞。

另外， 本发明还提供了产生本发明的 L-天冬酰胺酶变体的方法。

最后， 本发明还提供了包含本发明的 L-天冬酰胺酶变体的用于治疗肿 瘤的药物组合物。 附图说明

图 1. L-天冬酰胺酶分解 L-天冬酰胺反应示意图。

图 2. 示出纯化的 L-天冬酰胺酶变体蛋白电泳图。 泳道 1为发酵液; 泳道 2为穿透液；泳道 3为平衡漂洗液；泳道 4为用含 0.2M NaCl的 20mM PB (pH8.0)洗脱的洗脱液 (L-天冬酰胺酶变体蛋白)； 泳道 5、 6为用含有 0. 5M和 lM NaCl的 20mM PB (pH8.0)洗脱的洗脱液； 泳道 7为蛋白标记物。

图 3. L-天冬酰胺酶变体与野生型酶纯化后的蛋白电� ��图。 泳道 1为 蛋白标记物， 泳道 2为野生型酶， 泳道 3为变体 Ml , 泳道 4为变体 M13。

图 4. L-天冬酰胺酶变体 Ml与野生型酶体外半失活温度测定比较图。 图 5. L-天冬酰胺酶变体 Ml与野生型酶热稳定性比较图。 发明详述

通过体外定向进化 -易错 PCR技术对大肠杆菌野生型 L-天冬酰胺酶

(L-ansB)进行改造， 令人惊奇地， 本发明人获得了具有提高的活性和热稳定 性的 L-天冬酰胺酶变体。

在第一个方面， 本发明提供了 L-天冬酰胺酶的变体， 其是如 SEQ ID

NO:3所示的大肠杆菌野生型 L-天冬酰胺酶的变体，所述 L-天冬酰胺酶变体 包含在对应于 SEQ ID NO:3的第 48、 49、 152和 283位上具有一或多个氨 基酸取代的氨基酸序列， 任选地， 所述氨基酸序列不含有信号肽 SEQ ID

NO: 15。

在一个优选的实施方案中， 本发明的 L-天冬酰胺酶变体包含选自 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:7和 SEQ ID NO:8的 氨基酸序列， 优选包含 SEQ ID NO:4或 SEQ ID NO:8的氨基酸序列， 最优 选包含 SEQ ID NO:4的氨基酸序列， 以及任选地， 所述氨基酸序列不含有 信号肽 SEQ ID NO: 15。

"包含"一词在本文中用于描述蛋白质或核酸的� ��列时， 所述蛋白质 或核酸可以是由所述序列组成， 或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可 以具有额外的氨基酸或核苷酸， 但仍然具有本发明所述的活性。

在一些实施方案中， 本发明的 L-天冬酰胺酶变体可以包含额外的接头 或者与其它标签蛋白融合。 这些接头和 /或标签可以有利于本发明的 L-天冬 酰胺酶变体在目标宿主细胞中的产生， 增加表达量或增加可溶性表达， 有 利于所述变体的分离和纯化， 但基本上不会影响变体的活性。 本领域已知 许多这样的接头和 /或标签。合适的接头和 /或标签包括例如 6 XHis、 GST (；谷 胱甘肽转移酶)、 MBP (麦芽糖结合蛋白)等等。 合适的接头和 /或标签通常可 以通过选择合适的商品化表达载体而获得。

在第二个方面， 本发明还提供了分离的核酸， 其包含本发明的 L-天冬 酰胺酶变体的核苷酸序列， 任选地， 所述核苷酸序列不含有信号肽 SEQ ID NO: 15的编码序列。

编码本发明的 L-天冬酰胺酶变体的核苷酸序列可以由本发明� �� L-天冬 酰胺酶变体的氨基酸序列根据标准密码子表推 导得出。 本领域技术人员应 当了解可以针对所选择的不同表达系统对编码 本发明的 L-天冬酰胺酶变体 的核苷酸序列进行密码子优化以获得表达的最 大化。 例如在大肠杆菌表达 系统中， 可以选择大肠杆菌偏好的密码子来编码本发明 的 L-天冬酰胺酶变 体。

在一个实施方案中， 本发明分离的核酸包含选自 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: ll、 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13和 SEQ ID NO: 14的核苷酸序列， 优选包含 SEQ ID NO: 10或 SEQ ID NO: 14的核苷酸序列， 最优选包含 SEQ ID NO: 10的核酸序列， 以及任选地， 所述核苷酸序列不含有信号肽 SEQ ID NO: 15的编码序列。

在第三个方面， 本发明提供了包含本发明的核酸的重组表达构 建体， 其中所述核苷酸序列可操纵地连接至表达载体 上的一或多个调控序列。

在本领域中已知有适用于各种宿主细胞的大量 的各种调控序列。例如， 存在于表达载体中的 "调控序列"可包括增强子， 启动子， 剪接供体 /受体 信号， Kozak序列， 终止子及聚腺苷酸化序列， 其如本领域所熟知的那样促 进可操纵地连接于其上的核苷酸序列的表达， 或促进被编码的蛋白质的表 达。 对于启动子， 可以使用例如在大肠杆菌或其他类似微生物中 表达本发 明的 L-天冬酰胺酶变体的 T71ac、 CAT, Tip或 T5启动子。 这些调控序列 是本领域已知的并在合适和已知条件下使用。

可用于构建本发明的重组表达构建体的表达载 体包括质粒载体、 酵母 穿梭载体、 杆状病毒、 复制缺陷的腺病毒等。 本领域中已知大量可获得的 适于表达本发明的 L-天冬酰胺酶变体的表达载体。

在一个优选的实施方案中， 用于表达本发明的 L-天冬酰胺酶变体的表 达载体是 pBV220质粒载体 (上海闪晶分子生物科技有限公司)。

在第四个方面， 本发明提供了用于产生本发明的 L-天冬酰胺酶变体的 重组宿主细胞， 其包含本发明的重组表达构建体。 用于表达本发明的 L-天冬酰胺酶变体的宿主细胞包括原核生物、 酵母 和高等真核细胞。 示例性的原核宿主包括埃希 芽孢杆 菌属 (BadZZi^)、 沙门氏菌属0¾½0«£?//")以及假单胞菌属 (Z^eMifomiWiM)和链 霉菌属 Cftreptomyci^的细菌。 在优选的实施方案中， 宿主细胞是埃希氏菌 属的， 优选是大肠杆菌。 在本发明的一个实施方案中， 所使用的宿主细胞 为大肠杆菌 Top 10菌株细胞。

可以通过许多已熟知的任一技术将本发明的重 组表达构建体导入宿主 细胞， 这样的技术包括但不限于： 热激转化， 电穿孔， DEAE-葡聚糖转染， 显微注射， 脂质体接介导的转染， 憐酸钙沉淀， 原生质融合， 微粒轰击， 病毒转化及类似技术。

本发明的 L-天冬酰胺酶变体可以通过本领域已知的各种� ��生蛋白质的 方法获得。 例如化学合成， 包括固相或液相合成。 然而， 出于生产成本的 原因， 优选使用遗传工程的方法。

因此， 在第五个方面， 本发明提供了产生本发明的 L-天冬酰胺酶变体 的方法， 其包括：

a) 在适合本发明的 L-天冬酰胺酶变体表达的条件下培养本发明的� �� 组宿主细胞； 和

b ) 从培养物中回收产生的 L-天冬酰胺酶变体。

在最后一个方面， 本发明还提供了包含本发明的 L-天冬酰胺酶变体的 用于治疗肿瘤的药物组合物。 优选地， 所述肿瘤是血液系统肿瘤， 更优选 是急性淋巴细胞白血病或淋巴瘤。

适当地， 所述药物组合物进一步包含药物学上可接受的 载体， 稀释剂 或赋形剂。

"药物学上可接受的载体、 稀释剂或赋形剂"是指可以安全地进行系 统性施用的固体或液体填充物、 稀释剂或做成胶囊的物质等。 依照施用时 的特殊途径， 可以使用本领域中所熟知的各种不同的载体。 这些载体可以 选自包括糖类， 淀粉， 纤维素及其衍生物， 麦芽糖， 明胶， 滑石， 硫酸钙， 植物油， 合成油， 多元醇， 藻酸， 憐酸缓冲液， 乳化剂， 等张盐水与盐类， 盐类是如同包括了氯化氢的矿物酸盐， 溴化物与硫化物， 有机酸如醋酸盐， 丙酸盐与丙二酸盐以及无热原水。 可用任何安全途径为患者提供本发明的药物组 合物。可使用例如经口， 直肠， 肠外注射， 舌下， 口腔， 静脉内， 关节内， 肌肉内， 真皮内与皮下 的注射， 或经吸入， 眼球内， 腹膜内， 脑室内或经透皮肤等及其类似途径。 优选静脉注射。

可用与药剂设计兼容的方法来以药物有效量施 用本发明的药物组合 物。 对患者施用的剂量应当足以在一段适当时间后 在患者身上产生有利的 应答。 施用剂量应由医师判断， 视施用对象的各种因素而定， 如年龄、 性 另 |J、 体重及其一般健康状况等。 实施例

下面将通过实施例的方式进一步说明本发明， 但并不因此将本发明限 制在所描述的实施例范围中。 实施例 1： 大肠杆菌 L-ansB基因的克隆

根据 NCBI 公布 的 L-ansB 核苷酸序列设计上游 引物 mansB-001 (5'-CGGAAITCATGGAGTTTTTCAAAAAGACG-3')(SEQ ID NO： 1 )禾口下游弓 | 物 mansB-002(5'-CGGGATCCTTAGTACTGATTGAAGATCTG-3'¥SEO ID NO: 2)， 其中 下划线示出分别额外添加的 EcoRI和 BamHI酶切位点， 引物 5'末端还额外 添加两个保护碱基。

以 E.coli DH5a基因组为模板进行 PCR反应。 反应条件为： 95°C预变 性 5min， 再按如下参数循环反应 30次： 95°C变性 30s， 55°C退火 30s， 72 °C延伸 90s； 最后 72°C延伸 lOmino

PCR产物经 1%低融点琼脂糖凝胶电泳后，切出含目的片段� ��胶块并放 入 1.5mL Eppendorf管中， 使用 E.Z.N.A Gel Extraction Kit试剂盒 (Omega Bio-Tek公司)进行回收， 取 5(^L预热至 55°C的无菌水进行洗脱， 取 3 L 进行电泳检测， -20 °C保存备用。

纯化后的 PCR产物片段和 T载体 pMD18T(宝生物工程（大连）有限公 司)按以下体系使用 NEB公司的 T4连接酶进行连接反应：

T载体 pMD18T ΙμΙ

PCR产物片段 4 L 10 X T4连接酶缓冲液 l L

T4连接酶 l L

加双蒸水至 1( L

将混匀后的连接反应液， 放置于 25 °C反应 30min， 4°C备用或直接用于转化 反应。

将 1( L连接反应液加入 ΙΟΟμΙ^大肠杆菌 DH5a感受态细胞中，轻轻混 匀， 冰浴 30min， 42 °C水浴热激 90s, 再冰浴 3min， 加 LB培养基至 lmL， 置于 37°C、 170rpm摇床中振荡培养 lh， 取 200μΙ^上述培养物涂布于含 100mg/mL氨苄青霉素的 LB平板， 经 37°C恒温培养过夜。挑取菌落扩大培 养后使用 E.Z.N.A Plasmid Mini Kit试剂盒 (Omega Bio-Tek公司）提取质粒， 经 EcoRI和 BamHI酶切电泳鉴定， 将正确克隆送往测序， 核苷酸测序由北 京诺赛基因组研究中心有限公司完成， 经核对与 NCBI公布 L-ansB核苷酸 序列一致， 将该测序构建体命名为 pMD18T-ansB。 实施例 2 : 重组表达构建体 pBV-ansB的构建

对实施例 1中测序构建体 pMD18T-ansB进行 EcoRI和 BamHI(宝生物 工程 （大连） 有限公司)双酶切反应以回收 L-ansB目的基因片段：

质粒 pMD18T-ansB 20μ

ΙΟχΚ缓冲液 5 L

EcoRI 1 μ

BamHI Ι μΙ

无菌水补至 5(^L

混匀完毕后的酶切反应液， 放置于 37°C保温过夜后， 用实施例 1中的方法 纯化回收。 pBV220表达载体以同样的方式进行 EcoRI和 BamHI双酶切反 应， 纯化回收线性 pBV220表达载体片段。

纯化后的 L-ansB目的基因片段和线性 pBV220表达载体片段按以下体 系进行连接反应：

pBV220片段 l L

L-ansB片段 4 L

10 X T4连接酶缓冲液 1

T4连接酶 l L 加双蒸水至 1( L

将混匀后的连接反应液， 放置于 25 °C反应 30min， 4°C备用或直接用于转化 反应。

将 1( L连接反应液加入 ΙΟΟμΙ^ E.coli ToplO感受态细胞 (天根生化科技 (北京)有限公司， 目录号 CB104)中， 轻轻混匀， 冰浴 30min， 42 °C水浴热激 90s, 再冰浴 3min， 力 B SOC培养基至 lmL， 置于 32°C、 170 rpm摇床中振 荡培养 lh， 取 200μΙ^菌液涂布于含 100mg/mL氨苄青霉素的 LB平板， 32 °C温育过夜。 挑取菌落扩大培养后使用 E.Z.N.A Plasmid Mini Kit试剂盒 (Omega Bio-Tek公司)提取质粒， 经 EcoRI和 BamHI酶切电泳鉴定，将正确 克隆送往测序， 核苷酸测序由北京诺赛基因组研究中心有限公 司完成， 经 核对与 NCBI 公布 L-ansB 核苷酸序列一致， 将获得的构建体命名为 pBV-ansB。

；施例 3： 易错 PCR随机突变 L-ansB基因

按如下体系配制易错 PCR反应溶液：

■ lOxPCR缓冲液 ΙΟμΕ

■ 50xdNTPs混合物

- 10mM dCTP

- 10mM dTTP

■ 10xMgCl ₂ ΙΟμΙ

. MnCl ₂ 5μL

■ 上游引物 mansB-001

■ 下游引物 mansB-002

■ 模板 BV-ansB 10〜100ng

- rTaq DNA聚合酶

- 加双蒸水至 ΙΟΟμΙ^

10 X PCR缓冲液： 20mM MgC12 , 200mM KCl, 50mM Tris-HCl, pH8.3 ; 50 X dNTPs 混合物： 含有 dATP、 dGTP、 dTTP, dCTP各 lOmM; rTaq DNA聚合酶： 购自宝生物工程 (大连)有限公司， 目录号 DR001。 易错 PCR反应条件为： 95°C预变性 5min， 再按如下参数循环反应 20 次： 95°C变性 30s， 55°C退火 30s， 72 °C延伸 90s; 最后 72°C延伸 lOmin PCR产物经 1%低融点琼脂糖凝胶电泳后，切出含目的片段� ��胶块并放 入 1.5mL Eppendorf管中， 使用 E.Z.N.A Gel Extraction Kit试剂盒 (Omega Bio-Tek公司)进行回收， 取 50 μ L预热至 55 °C的无菌水进行洗脱， 取 3 L 进行电泳检测， -20 °C保存备用。 实施例 4: L-ansB变体库的构建

取实施例 3 中纯化后的易错 PCR产物片段按以下体系进行 EcoRI和

BamHI双酶切反应：

易错 PCR产物片段 4(^L

ΙΟχΚ缓冲液 5 L

EcoRI 1 μΐ^

BamHI lμL

无菌水补至 5(^L

混匀完毕后的酶切反应液，放置于 37°C温育 3h后，使用 E.Z.N.A Cycle Pure Kit试剂盒 (Omega Bio-Tek公司)对酶切片段进行直接回收， 取 50μΙ^预热至 55°C的无菌水进行洗脱， 取 3 L进行电泳检测， -20 °C保存备用或直接用于 连接反应。 pBV220表达载体以同样的方式进行 EcoRI和 BamHI双酶切反 应， 纯化回收线性 pBV220表达载体片段。

纯化后的易错 PCR产物片段和线性 pBV220表达载体片段按以下体系 进行连接反应：

PBV220片段

易错 PCR产物片段

10 X T4连接酶缓冲液

T4连接酶

加双蒸水至

将混匀后的连接反应液， 放置于 25°C反应 30min， 4°C备用或直接用于转化 反应。

将 1( L连接反应液加入 lOO L E.coli ToplO感受态细胞中，轻轻混匀， 冰浴 30min， 42°C水浴热激 90s, 再冰浴 3min， 力 B SOC培养基至 lmL， 置 于 32°C、 170rpm摇床中振荡培养 lh， 离心上述培养物， 剩余 200μΙ^上清 并吹吸混匀后涂布于含 100mg/mL氨苄青霉素的 LB平板， 32 °C恒温培养过 夜。 实施例 5 : L-天冬酰胺酶变体的筛选

原理：

L-天冬酰胺酶的高通量筛选是基于比色法而建� ��的， 由于 L-天冬酰胺 酶的特异性底物 L-天冬酰胺可以被水解生成氨 (见图 1)，而生成的氨可以与 奈氏试剂发生特异性化学反应生成红棕色络合 物碘化双汞胺， 在 460nm处 有最大吸收值，通过比色可以筛选出具有增加 的活性的 L-天冬酰胺酶变体。 试剂：

L-天冬酰胺溶液： 精密称取 0.15g L-天冬酰胺， 溶于 25mL的 0.1M PB缓冲 液 (憐酸二氢钠-憐酸氢二钠缓冲液)， pH8.0(新鲜配制)。

细胞裂解液： 0.2 mg/mL溶菌酶， 50mM PB， pH8.0。

25% 三氯乙酸 (TCA)溶液： 精密称取 34g TCA溶于 60mL去离子水 (室温避 光保存)。

奈氏试剂： 取碘化汞 11.5g， 碘化钾 8g， 溶于 50mL去离子水中， 充分混匀， 放置过夜得到碘化汞钾溶液， 临用时取等体积与 20%氢氧化钠溶液混合使 用 (室温避光保存)。 初级筛选：

1) 吸取 30(^L含有氨苄抗性 LB液体培养基加至 96深孔板， 并用灭菌牙 签挑取实施例 4所得单菌落至各个孔中轻微晃动 (分别在 94、 95、 96号孔中 挑入含有表达野生型 L-天门冬酰胺酶的单菌落作为筛选对照)， 再在已画有 方格并标有序号的新鲜 LB平板上进行保种， 平板置于 32 °C培养过夜。

2) 将 96深孔板固定于 32°C摇床中， 170rpm振荡 24h。

3) 培养结束后， 再向各孔中加入 30(^L含有氨苄抗性 LB液体培养基， 再 固定于 42°C摇床中， 170rpm振荡诱导培养 5h。

4) 诱导培养结束后， 取出 96深孔板。 吸取 ΙΟΟμΙ^诱导后的菌液至另一深 孔板中， 2500g离心 10min， 弃去培养基上清， 加盖置于 -80°C放置 15min。

5) 再加入 20(^L预冷的细胞裂解液， 加盖放置于 4°C冰箱中 lOmin, 再固 定于微孔板振荡器上， 室温 200rpm振荡 lOmin, 充分裂解菌体。

6) 充分裂解后， 向各孔中加入 20(^L已预热的 0.04M L-天冬酰胺溶液， 放 置于 37°C培养箱中振荡反应 15min。准确反应 15min后，立即加入 50 L 25% 三氯乙酸 (TCA) 终止反应， 轻微振荡数十秒。

7) 2500g离心 lOmin, 吸取 ΙΟμΙ^上清至含有 90 μ L ΡΒ的 96孔板中， 再加 入 4(^L奈氏试剂进行显色， 反应 lOmin后在主波长 450nm， 副波长 630nm 处进行测定， 吸光值 A=A450-A630。 次级筛选

1) 初级筛选获得的酶活性提高的初级变体单菌落 接种入含有 20mL LB培 养基的小摇瓶中， 32°C、 170rpm振荡培养。

2) 当 OD600至 0.6左右时， 将温度调至 42°C进行诱导培养 5h。

3) 诱导培养结束后， 取 ImL菌液进行 5000rpm离心 5min， 弃去上清液， 置于 -80°C放置 15min。

4) 再加入 ImL预冷的细菌裂解液， 室温振荡 5min， 充分裂解菌体， 然后 5000rpm离心 5min。

5) 取 ΙΟΟμΙ^裂解上清液与 20(^L已预热的 0.04M L-天冬酰胺溶液，放置于 37°C培养箱中振荡反应 15min。 准确反应 15min后， 立即加入 50μΙ^ 25%三 氯乙酸 (TCA) 终止反应， 轻微振荡数十秒。

6) 5000rpm离心 5min， 向上述反应液中加入 ΙΟΟμ 奈氏试剂进行显色， 反 应 lOmin 后在主波长 450nm， 副波长 630nm 处进行测定， 吸光值

7) 将吸收值与初级筛选吸收值进行核对比较， 获得较野生型酶活性提高的

L-天冬酰胺酶变体。

将活性提高的 L-天冬酰胺酶变体的编码基因进行 DNA序列测定，证实 获得了三种具有提高的活性的 L-天冬酰胺酶变体， 总结于下表 1 : 1

实施例 6: L-天冬酰胺酶变体的纯化

2L发酵菌液经 8000rpm， 4°C离心 20min，收集菌体沉淀，加 20mL 20mM PB(pH8.0)重悬菌体后， 在冰浴上进行超声破碎， 破碎完成后 12000rpm， 4 °C离心 20min， 收集超声破碎上清液。

取 DEAE sepharose FastFlow柱 (3 cmX IO cm)(填料购自 GE Healthcare 公司， 目录号 17-0709-01)， 用 20mM PB(pH8.0)平衡。 20mL含 L-天冬酰胺 酶变体的超声破碎上清液经 0.45μηι滤膜过滤后， 缓慢过柱 (AKTA-Prime, 0.3MPa， 2mL/min), 然后用含有 0.05M〜lM NaCl的 20mM PB(pH8.0)分段 洗脱蛋白。 SDS-PAGE结果见图 2。

将收获的 L-天冬酰胺酶变体蛋白透析至 20mM PB(pH8.0)缓冲液中，超 滤浓縮后采用 BCA蛋白浓度测定试剂盒 (Pierce Biotechnology)进行蛋白浓 度定量， 调整浓度至 20mg/ml， 小瓶分装， 冷冻干燥， -20°C保存。 实施例 7: 变体的活性测定

按照中国药典-天冬酰胺酶比活测定方法， 测定单位时间内产物氨的生 成量， OD460测定氨与奈氏试剂生成特异性棕红色络合� ��碘化双汞胺生成 量， 计算酶活性单位。 L-天冬酰胺酶变体比活测定结果见表 2: 氨基酸 相对野生型 获得方法 名称 比活性 (U/mg)

突变位置 倍数

野生型

无 260 1.0

L-ASP

易错 PCR+高

Ml 48、 49 1296 5

通量筛选 易错 PCR+高

M2 152 598 2.3

通量筛选 易错 PCR+高

M3 283 676 2.6

通量筛选 实施例 8: 组合不同突变位点的变体

获得了活性提高的 Ml、 M2、 M3的 3种变体。 为了考察不同突变位点 的组合对变体酶活性的影响， 对已获得的突变位点进行组合， 获得多种变 体。 按照实施例 6的方法获得纯化后的变体， 再通过实施例 7的方法进行 酶活测定并比较酶活。 变体的比活性测定结果见下表 3 : 实施例 9: 变体热稳定性的测定

体外半失活温度测定

将纯化后的野生型酶和变体 Ml在 37°C、 42°C、 50°C、 55°C、 60°C、 70°C热水浴中进行热处理 60min后， 分别以未经热处理的野生型酶和变体 Ml作为对照， 进行残留酶活测定。 结果如图 4所示， 变体 Ml体外半失活 温度较野生型酶提高了约 6.5°C， 热稳定性明显得到提高。 常见温度条件下稳定性测定

考虑到酶在生产、 运输、 储存和治疗中及极端条件下的实际情况， 我 们进一步分别在 50°C、 37°C和 4°C条件下测定了酶的热稳定性情况。

将纯化后的野生型酶和变体 Ml分别置于 50°C、 37°C和 4°C环境中，分 别以未经处理的野生型酶和变体 Ml作为对照，每个温度条件各设置 6个测 定点， 置于 50°C环境中的酶每小时测定一次残留酶活 (图 5-A); 置于 37°C 环境中的酶每天测定一次残留酶活 (图 5-B); 置于 4°C环境中的酶每月测定 一次残留酶活 (图 5-C)。 结果如图 5所示， 变体 Ml在各温度条件下的稳定 性较野生型酶都得到了提高。 实施例 10: 变体特异性底物动力学参数的测定

通过以下两种酶偶联催化反应对 L-ASP进行动力学参数测定： L-天冬酰胺 + H ₂ 0 = L-天冬氨酸 + NH ₃

α-酮戊二酸 + NH ₃ + NADH + H+= L-谷氨酸 + H ₂ 0 + NAD+ 试剂溶液：

L-天门冬酰胺溶液： 0.09375mM、0.1875mM、0.375mM、0.5625mM、0.75mM、 1.125mM、 1.5mM、 3mM、 6mM。

反应溶液： 66.7mM Tris、 7.5mM a-酮戊二酸、 0.25mM NADH， pH8.0。 谷氨酸脱氢酶溶液 (Toyobo CO., Ltd. Bio Chemical Department) : 浓度为 纯化后野生型或变体酶溶液 (电泳图见图 3): 浓度为 0.0025mg/mL。 实验方法：

在 3ml的体系中，首先加入 2.4ml反应溶液和 0.2ml的不同浓度 L-天冬 酰胺溶液， 混合后置于 37°C预热 5min， 加入 0.2ml谷氨酸脱氢酶溶液， 反 应 2min，加入野生型酶或变体酶溶液 0.2ml，每 lmin测定一次，持续 10min。

以双倒数作图法Lineweaver-Burk Plot)求取 Km及其 kcat值。测定结果 示于下表 4:

4

实施例 11 : 变体对急性淋巴瘤白血病小鼠治疗效果测定 [11]

取 18〜22g的 DBA/2小鼠 (中国医学科学院实验动物研究所 )70只， 雌 雄各半， 按移植性肿瘤研究法 [12]接种 L5178Y-R腹水瘤 (ATCC 目录号 CRL-1722)。 接种后随机分为 7组， 每组 10只， 分别按以下剂量给药： 野 生型酶溶液 (4000 IU/kg体重)； Ml酶溶液 (4000 IU/kg体重)； M2酶溶液 (4000 IU/kg体重)； M3酶溶液 (4000 IU/kg体重)； Ml 2酶溶液 (4000 IU/kg体重)； M13酶溶液 (4000 IU/kg体重)； 另设立 PBS空白对照组 (20ml/kg体重)。 于 接种 L5178Y-R腹水瘤后， 24h腹腔注射给药， 每天一次， 共给药 10d， 观 察荷瘤 DBA/2小鼠接种腹水瘤后的存活天数。

L5178Y-R 小鼠腹腔注射野生型酶和变体的平均生存时间 (均值士标准 差， n=10)测定结果总结于下表 5， 差异用统计学进行分析 (t-test)。

注： a为野生型酶组对比对照组， PO.01 ; b为 Ml组对比野生型酶组， PO.01 ; c为 M13组对比野生型酶组， PO.05

取 18〜22g昆明种小鼠 (军事医学科学院实验动物中心) 300只， 雌雄各 半， 随机分为 30组， 每组 10只将野生型酶和变体分别按剂距比为 1 :0.5分 成剂量 25 X 10 ³ 、 50 X 10 ³ 、 100 X 10 ³ 、 200 X 10 ³ 、 400 X 10 ³ IU/kg体重， 进 行静脉注射给药， 给药体积为 25ml/kg体重。 给药后观察 14d， 逐日记录小 鼠活动和死亡情况。正常小鼠静脉注射野生型 酶和变体的死亡率 (n=10)测定 结果示于下表 6。 剂量 死亡率 /%

χΐο ³ ιυ½ ^_1 野生型酶组 Ml组 M2组 M3组 M12组 M13组

25 0 0 0 0 0 0

50 0 0 0 0 0 0

100 10 0 0 0 0 0

200 30 0 0 0 0 0

400 100 0 20 20 0 0 参考文献

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