Domaine de l'invention

La présente invention a pour objet un additif pour améliorer la stabilité protéique à la chaleur, aux variations de température et/ou au vieillissement, dans une boisson à base de moût végétal. La présente invention a également pour objet un procédé pour améliorer la stabilité protéique à la chaleur, aux variations de température et/ou au vieillissement, dans une boisson à base de moût végétal. L'invention se situe donc dans le domaine des produits et procédés de préparation et de conservation de boissons à base de moût végétal, notamment le vin.

Etat de la technique

Les protéines sont à l'origine d'une instabilité dans les boissons à base de moût végétal, telles que le vin, la bière, le cidre et les jus de fruit. En effet, lors de variations brutales de température et/ou lors du stockage, selon la durée et les conditions de celui-ci, les protéines thermosensibles présentes dans la boisson peuvent floculer ou précipiter, occasionnant l'apparition d'un trouble dans la boisson qui peut être préjudiciable à sa consommation. En œnologie, l'expression « casse protéique » désigne le phénomène lors duquel les protéines de la boisson précipitent et provoquent l'apparition d'un trouble. Dans le cas du vin, l'instabilité protéique est favorisée par l'augmentation de la température du vin lors du transport ou du stockage. Présentes à faibles concentrations, de 15 à 300 mg.L ^-1 , dans les vins blancs, les protéines s'agrègent et précipitent. Les risques afférant à l'instabilité protéique dépendent d'un grand nombre de facteurs tels que le cépage, Sauvignon et Gewurztraminer étant plus susceptibles d'instabilité, l'origine géographique et le millésime. Les vins issus de l'agriculture biologique sont également exposés. En France, 34% des vins blancs souffrent d'instabilité protéique.

Le traitement usuel, notamment pour stabiliser les vins blancs ou rosés, est l'élimination des protéines du vin au moyen d'une argile présentant des propriétés colloïdales, la bentonite. L'un des principaux inconvénients liés à l'utilisation de la bentonite est la perte d'arômes, fortement dommageable pour les qualités organoleptiques du vin. D'autre part, le mode de fonctionnement de la bentonite vis-à-vis des protéines instables mène à de fortes pertes volumétriques : les pertes volumétriques associées à l'emploi de bentonite sont estimées à près de 200 millions d'euros dans le monde, soit l'équivalent de la production annuelle néo- zélandaise de vin blanc (2,85 millions d'hectolitres en 2017).

De nombreuses alternatives à la bentonite ont été testées sans qu'aucune ne réponde de façon satisfaisante aux attentes des producteurs de vin. Parmi les alternatives possibles à la bentonite, l'emploi de protéases conduisant à l'hydrolyse des liaisons peptidiques des protéines pour les décomposer en différents peptides et acides aminés de moindre taille, a connu un vif intérêt. L'efficacité partielle de protéases fongiques utilisées de manière isolée a été montrée avec deux enzymes protéolytiques de type Apergillopepsine I et II (Marangon et al, « Dégradation of white wine haze proteins by Argillopepsin I and II during juice flash pasteurization », Food Chemistry, Vol. 135, issue 3, p. 1157-65, 2012). L'effet stabilisant de ces protéases est dû au fait qu'elles hydrolysent les protéines du vin, réduisant ainsi leur précipitation lors de changements thermiques. Une flash pasteurisation à 70-75°C pendant une minute, suivie d'un refroidissement, sont nécessaires, préalablement à l'ajout de 1 à 3 g/hl de protéases. Cette étape de chauffage permet notamment de dénaturer les protéines, le changement de la conformation des protéines les rendant ainsi plus accessibles aux protéases. Selon une autre approche, l'addition de protéases suivie d'une flash pasteurisation a également été testée.

Sous l'impulsion des attentes des consommateurs, les protéases d'origine végétale constituent une voie préférentielle pour les boissons alimentaires. La papaïne et la bromélaïne purifiées commerciales ont été utilisées pour la stabilisation protéique du vin (Benucci et al, « Effect of free and immobiiised stem bromelain on protein haze in white wine », Australian Journal of Grape and Wine Research, Vol. 20, issue 3, pp 347-352, 2014), la bromélaïne étant préalablement immobilisée sur un support constitué par du chitosan. La papaïne et la bromélaïne sont des protéases à cystéine. Les résultats montrent que l'activité de l'enzyme est peu maîtrisée et aboutit à une réduction partielle et limitée du taux de protéines.

La chitine-glucane est principalement utilisée sur les vins blancs pour la clarification des moûts et des vins, ainsi que le traitement préventif des casses protéiques. Le chitosan est majoritairement utilisé pour la réduction de micro organismes indésirables de types Brettanomyces. Ces deux composés précipitent et sédimentent, entraînant les composés indésirables. Utilisés de manière simultanée, ils facilitent le débourbage et la clarification des moûts et des vins.

La mannoprotéine MP32, d'un poids moléculaire de 31.8 KDa, est issue d'un fragment d'invertase de S. cerevisiae qui serait généré lors de l'autolyse des lies de levures par l'action combinée de béta-glucanase de la paroi cellulaire des levures et de protéase vacuolaire. La production industrielle de MP32 serait possible par digestion enzymatique de la paroi cellulaire de levures grâce à une béta-glucanase commerciale, la Glucanex™. Des essais en laboratoire ont été réalisés et les mannoprotéines extraites ont permis une réduction totale de l'instabilité protéique d'un vin à ~40NTU (Néphélometric Turbidity Unit) mais le mécanisme de protection n'est pas connu. (V. Moine et D. Dubourdieu, « An invertase fragment responsible for improving the protein stability of dry white wines » 1999, E. Waters « A Saccharomyces mannoprotein that protects wine from protein haze » 1994). Le procédé de production de la protéine MP32 est cependant extrêmement coûteux, l'utilisation de cette protéine en tant que telle n'est donc pas viable économiquement.

Actuellement, il n'existe donc aucune solution industrielle satisfaisante alternative à la bentonite, et aucune protéase n'agit de manière efficace sur le vin dans les conditions œnologiques sans nécessiter de traitement thermique de type flash pasteurisation.

Il existe donc un besoin d'un additif permettant de résoudre le problème de l'instabilité protéique dans les boissons à base de moût végétal. Il existe également le besoin de disposer d'un moyen simple permettant de disposer d'un procédé simplifié d'augmenter la stabilité protéique des boissons, en particulier un procédé ne requérant pas d'étape de chauffage de la boisson.

Exposé de l'invention

La présente invention répond à ces objectifs. Les inventeurs ont en effet mis au point un groupe d'additifs efficaces permettant d'améliorer la stabilité protéique à la chaleur, aux variations de température et au vieillissement, dans une boisson à base de moût végétal. De façon surprenante, un additif selon l'invention comprenant au moins une protéase et caractérisé en ce qu'en sa présence, le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié, améliore très sensiblement la stabilité protéique dans une boisson à base de moût végétal pour un coût économiquement raisonnable et sans nécessiter de flash pasteurisation. Par rapport aux compositions de l'état de l'art, un additif selon l'invention permet de réduire jusqu'à 80 ou 90 % du trouble lié à la casse protéique, tel que mesuré dans un test classique de trouble à la chaleur effectué sur du vin blanc, qui représente la boisson typiquement sensible à la casse protéique. Ce résultat est démontré avec plusieurs échantillons différents de vins particulièrement sensibles à la casse protéique.

Un additif selon l'invention présente l'originalité d'inhiber la précipitation d'au moins une partie des protéines présentes dans ladite boisson sans toutefois entraîner l'hydrolyse des protéines de la boisson. Ceci est mis en évidence par le fait qu'en présence dudit additif, le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié. Plus particulièrement, l'activité protéase de l'additif est différente d'une activité de type protéase à cystéine. Autrement dit, un additif selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend une protéase active, différente d'une protéase à cystéine. Encore plus particulièrement, un additif selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend une protéase active, différente d'une protéase à cystéine, et présente en outre une activité invertase.

La présente invention a également pour objet un procédé pour améliorer la stabilité protéique, à la chaleur, aux variations de température et/ou au vieillissement, dans une boisson à base de moût végétal, ledit procédé étant dépourvu de toute étape de chauffage de ladite boisson et comprenant l'ajout d'un additif comprenant une protéase active, l'additif étant caractérisé en ce qu'en sa présence, le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié. Plus particulièrement, un procédé selon l'invention comprend l'ajout d'un additif comprenant au moins une protéase active qui n'est pas une protéase à cystéine. Encore plus particulièrement, un procédé selon l'invention comprend l'ajout d'un additif comprenant une protéase active, différente d'une protéase à cystéine, et présentant en outre une activité invertase.

L'invention a également pour objet l'utilisation, pour améliorer la stabilité protéique, à la chaleur, aux variations de température et/ou au vieillissement, dans une boisson à base de moût végétal, d'un additif comprenant au moins une protéase active, ledit additif étant caractérisé en ce qu'en sa présence le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié. Plus particulièrement, une utilisation selon l'invention comprend l'ajout d'un additif comprenant au moins une protéase active qui n'est pas une protéase à cystéine. Encore plus particulièrement, une utilisation selon l'invention comprend l'ajout d'un additif comprenant une protéase active, différente d'une protéase à cystéine, et présentant en outre une activité invertase.

Exposé de l'invention

Selon un premier objet, l'invention concerne un additif pour augmenter la stabilité protéique à la chaleur, aux variations de température et/ou au vieillissement, dans une boisson à base de moût végétal, ledit additif exerçant une activité inhibitrice de la précipitation d'au moins une partie des protéines présentes dans ladite boisson et comprenant au moins une protéase active, et caractérisé en ce qu'en sa présence le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié, ladite protéase n'étant pas une protéase à cystéine.

Par « stabilité protéique » on entend le fait que les protéines présentes dans la boisson ne précipitent pas et restent solubles, c'est-à-dire qu'on n'observe pas ou peu de précipité ou de trouble de la boisson notamment dû à la floculation des protéines dans la boisson. Ce trouble peut être évalué par toute méthode connue de mesure de la turbidité, observée à l'œil nu ou par une technique de néphélométrie qui mesure la teneur de particules en suspension d'un milieu, et dont le résultat est exprimé en unités de turbidité néphélométrique, soit UTN ou NTU (Nephelometry Turbidity Unit) en anglais.

Par « augmentation de la stabilité protéique » on entend la diminution de l'apparition du trouble, caractérisée notamment par la comparaison du trouble dans la boisson, traitée et non traitée, tel qu'observé dans un test à la chaleur au cours duquel ladite boisson est soumise à une température élevée puis caractérisée pour sa turbidité.

Par « profil protéique » on entend la représentation des différentes protéines présentes dans un échantillon et séparées en fonction de leur masse molaire. Une telle représentation peut notamment être obtenue grâce à une analyse par électrophorèse en conditions dénaturantes, notamment de type SDS- PAGE (Sodium-Dodecyl-Sulfate PolyAmide Gel Electrophoresis) et/ou par électrophorèse automatique mettant en oeuvre un dispositif de type LabChip®. La modification de la masse moléculaire apparente d'une ou plusieurs protéines indique notamment la dégradation protéolytique de ladite ou lesdites protéines.

Un additif selon la présente invention améliore la stabilité protéique, autrement dit, il inhibe la précipitation d'au moins une partie des protéines présentes dans l'échantillon, sans toutefois entraîner une modification du profil protéique, témoin de la dégradation ladite ou lesdites protéine.

Selon un premier aspect particulier, un additif selon l'invention comprend au moins une protéase active. Selon cet aspect, par « protéase active » on entend une enzyme présentant une activité hydrolytique des liaisons peptidiques d'une protéine, mesurable in vitro selon des techniques bien connues par un homme du métier. Plus particulièrement, un additif selon l'invention comprend au moins une protéase active et est caractérisé en ce qu'en sa présence, le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié. En d'autres termes, un additif selon l'invention présente une activité de type protéase cependant, en présence d'un échantillon d'une boisson à base de moût végétal, l'hydrolyse des protéines de ladite boisson n'est pas observée, notamment par électrophorèse.

L'activité enzymatique d'une protéase d'un additif selon l'invention peut être caractérisée par tout moyen connu d'une personne du métier, comme par exemple un test de dégradation de l'hémoglobine pendant 1 heure, à pH 3 et à 37°C.

Selon un aspect plus particulier, l'activité enzymatique de ladite protéase active dans un additif selon l'invention n'est pas inhibée par un inhibiteur de protéases à cystéines, comme par exemple l'iodoacétamide à une concentration de 1 ou 5 mM, et/ou cette activité enzymatique n'est pas améliorée en présence de cystéine. Selon cet aspect particulier, une protéase active d'un additif selon l'invention n'est pas une protéase à cystéine.

Selon un aspect particulier, un additif selon l'invention comprend au moins une protéase d'origine eucaryote ou procaryote, plus particulièrement une protéase d'origine fongique ou végétale. Plus particulièrement, un additif selon l'invention comprend une préparation enzymatique d'origine fongique ou végétale, cette préparation enzymatique présentant au moins une activité de type protéase.

Parmi les préparations enzymatiques d'origine fongique ou végétale, on peut citer les préparations obtenues à partir des microorganismes suivants :

- Les champignons du genre Aspergillus, en particulier Aspergillus oryzae,

- Les levures du genre Candida, en particulier Candida utilis.

- Les levures du genre Saccharomyces, en particulier Saccharomyces cerevisiae,

Parmi les préparations enzymatiques d'origine fongique ou végétale, on peut citer plus particulièrement :

- le produit vendu sous la dénomination de Sumizyme LPL®.

Plus particulièrement, parmi les protéases présentes dans une composition d'origine fongique, on peut citer les protéases présentes dans une préparation enzymatique d'origine fongique, plus particulièrement une préparation enzymatique obtenue à partir de Aspergillus oryzae, telle que notamment le produit vendu sous la dénomination de Sumizyme LPL®, sous forme granulaire ou sous forme de poudre. Ce produit présente une activité protéase et les activités béta-glucanase, cellulase, xylanase, alpha-amylase et invertase. Selon cet aspect, un additif selon l'invention comprend un additif fongique obtenu à partir de Aspergillus oryzae présentant une activité protéase.

Un additif selon l'invention comprend une protéase active, dont l'activité protéasique est supérieure à 1 unités d'enzyme (U) par gramme d'additif, de préférence comprise entre 10 et 10 000000 U par gramme d'additif, de préférence entre 100 et 1 000 000 U, de préférence centre 500 et 500 000 U par gramme d'additif.

L'activité enzymatique d'une protéase d'un additif selon l'invention peut être caractérisée par tout moyen connu d'une personne du métier, comme par exemple un test de dégradation de l'hémoglobine pendant lh, à pH 3 et à 37°C.

Un additif selon l'invention présente une activité protéasique comprise entre environ 10 et environ 10 000 000 U par gramme d'additif, de préférence comprise entre 100 et 1 000000 U par gramme d'additif, dans lequel chaque unité d'enzyme dégrade une solution à 2% en poids/volume d'hémoglobine en une heure, à pH 3 et à 37°C.

Selon un premier aspect particulier, un additif selon l'invention comprend une protéase active et est caractérisé en ce qu'en sa présence le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié, ledit additif présente en outre au moins une activité enzymatique invertase.

Un additif selon l'invention présente en outre une activité invertase, l'activité invertasique d'un additif selon l'invention est supérieure à 1 unité d'enzyme (U) par gramme d'additif, de préférence entre 1 et environ 1.000.000 U par gramme d'additif, de préférence entre 5 et 500.000 U, de préférence entre 10 et 100.000 U, de préférence entre 15 et 10.000 U, de préférence entre 20 et 5.000 U par gramme d'additif.

La présence de l'activité enzymatique invertase est aisément caractérisée par une personne du métier, mettant en oeuvre de techniques classiques, par exemple par la mesure spectrophotométrique de dégradation de sucrose en glucose à 40°C, pH 4,5.

Un additif selon l'invention présente donc une activité invertasique comprise entre environ 1 et environ 1.000.000 U par gramme d'additif, dans lequel chaque unité d'enzyme libère 1 pmole de glucose par minute, à pH 4,5 et à 40°C.

Selon un autre aspect particulier, un additif selon l'invention comprend une protéase active, est caractérisé en ce qu'en sa présence le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié, présente une activité enzymatique invertase et une activité enzymatique choisie parmi les suivantes : béta-glucanase, cellulase, xylanase et alpha-amylase. La présence de chacune de ces activités enzymatiques est aisément caractérisable par une personne du métier, suivant des techniques classiques.

Selon un autre aspect particulier, un additif selon l'invention comprend une protéase active et au moins un oligosaccharide ou un polyoside. Plus particulièrement, un additif selon l'invention comprend i) une protéase active et présente en outre au moins une activité enzymatique choisie parmi les suivantes : béta-glucanase, cellulase, xylanase, alpha-amylase et invertase, et ii) au moins un oligosaccharide ou un polyoside.

Selon cet aspect, par « oligosaccharide » et « polyoside » on entend respectivement un oligomère ou un polymère formé de plusieurs oses, notamment fructose, galactose, glucose et/ou mannose, liés par une liaison glycosidique alpha ou bêta. Parmi les oligosaccharides et les polyosides, on peut citer le chitosan, les oligosides de chitosan et la chitine-glucane.

Selon un aspect encore plus particulier, un additif selon l'invention comprend au moins une protéase active et présente une activité invertase, et au moins un oligosaccharide ou un polyoside, choisi parmi le chitosan et les oligomères de chitosan.

Selon un aspect encore plus particulier, un additif selon l'invention comprend au moins une protéase active, présente une activité invertase, et présente en outre une activité choisie parmi : béta-glucanase, cellulase, xylanase et/ou alpha- amylase, et comprend au moins un oligosaccharide ou un polyoside, choisi parmi le chitosan et les oligomères de chitosan.

Selon un autre aspect particulier, un additif selon l'invention comprend en outre une composition comprenant une mannoprotéine ou un fragment d'invertase. Dans un additif selon l'invention, ladite mannoprotéine est de préférence la protéine MP32, une protéine de masse molaire 32 kDa qui correspond à un fragment d'invertase de Saccharomyces cerevisiae. Par « mannoprotéines » on entend des polysaccharidiques liés à des protéines, issus de levure et notamment obtenus industriellement par digestion des parois de levures, en particulier Saccharomyces cerevisiae.

Selon un aspect encore plus particulier, un additif selon l'invention comprend au moins : i) une protéase active, ii) du chitosan et/ou un oligoside de chitosan, et et présente en outre une activité béta-glucanase, cellulase, xylanase, alpha-amylase et/ou invertase. Chacun des éléments dudit additif peut être ajouté de façon séparée à ladite boisson lors de sa préparation, ou bien au moins deux des additifs sont mélangés puis ajoutés simultanément à la boisson.

Selon ledit premier aspect de l'invention, la concentration dans l'additif de chacun des éléments précédemment cités est compatible avec une concentration finale dans ladite boisson telle qu'indiquée ci-dessous : additif fongique entre 0,01 et 2000 g/hectolitre, de préférence entre 0,1 et 200 g/hectolitre, de préférence entre 1 et 200 g/hectolitre, de préférence entre 10 et 100 g/hectolitre, de préférence 20 g/hectolitre ; oligoside entre 1 et 200 g/hectolitre et de préférence entre 5 et 50 g/hectolitre ; mannoprotéines entre 1 et 200 g/hectolitre et de préférence entre 25 et 50 g/hectolitre.

Par « boisson à base de moût végétal » on entend le moût, le vin, la bière, le cidre et les jus de fruit. Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un additif, un procédé et une utilisation destinés à améliorer la stabilité protéique dans le vin, de préférence le vin blanc et le vin rosé, produit à partir de tout cépage connu, et notamment Gewurztraminer et Sauvignon.

Selon un deuxième objet, l'invention concerne un procédé pour augmenter la stabilité protéique à la chaleur, aux variations de température et/ou au vieillissement, dans une boisson à base de moût végétal, ledit procédé étant dépourvu de toute étape de chauffage de ladite boisson et comprenant au moins une étape d'ajout à ladite boisson d'un additif comprenant au moins une protéase active, ledit additif étant caractérisé en ce qu'en sa présence le profil protéique de la boisson traitée n'est pas modifié. Ledit additif est caractérisé en ce que ladite protéasique est différente de celle d'une protéase à cystéine.

Plus particulièrement, un procédé selon l'invention comprend l'ajout d'un additif comprenant une protéase active, qui n'est pas une protéase à cystéine, est caractérisé en ce qu'en sa présence le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié, ledit additif présente en outre une activité enzymatique invertase. Par « procédé dépourvu de toute étape de chauffage » on entend un procédé dépourvu d'un chauffage de type « flash pasteurisation », soit notamment un chauffage à une température comprise entre 65°C et 75°C pendant une courte durée, notamment de 1 minute, ou une étape de chauffage équivalente.

Selon un aspect particulier, un procédé selon l'invention comprend l'addition d'une composition comprenant une protéase active et/ou d'un oligosaccharide ou un polyoside. Plus particulièrement, un procédé selon l'invention comprend l'addition d'un oligosaccharide ou un polyoside et d'une composition comprenant une protéase active. Encore plus particulièrement, un procédé selon l'invention comprend l'addition d'un oligosaccharide ou un polyoside, et d'une composition comprenant une protéase active, présentant une activité invertase et présentant au moins une autre activité enzymatique telle que béta-glucanase, cellulase, xylanase et alpha-amylase. Dans un procédé selon l'invention, ladite composition comprenant une protéase active est notamment choisie parmi les compositions d'origine fongique comprenant une protéase active et éventuellement présentant au moins une autre activité enzymatique telle que béta-glucanase, cellulase, xylanase, alpha-amylase et invertase, une telle composition est notamment la Sumizyme LPL®.

Dans un procédé selon l'invention, le ou les composés sont ajoutés à dans ladite boisson à une concentration finale respective de : composition comprenant une protéase active entre 1 et 200 g/hectolitre, de préférence entre 5 et 50 g/hectolitre, de préférence entre 10 et 40 g/hectolitre et de préférence 20 g/hectolitre ; oligoside entre 1 et 200 g/hectolitre et de préférence entre 5 et 50 g/hectolitre ; mannoprotéine entre 1 et 200 g/hectolitre et de préférence entre 25 et 50 g/hectolitre.

Plus particulièrement, dans un procédé selon l'invention, le ou les composés sont ajoutés à dans ladite boisson de telle sorte que l'activité protéasique finale dans ladite boisson soit comprise entre 1.000 et 10.000.000 U /hectolitre.

Encore plus particulièrement, dans un procédé selon l'invention, le ou les composés sont ajoutés à dans ladite boisson de telle sorte que l'activité protéasique finale dans ladite boisson soit comprise entre 1.000 et 10.000.000 U /hectolitre et que l'activité invertasique finale dans ladite boisson soit comprise entre 200 et 5.000.000 unités /hectolitre, de préférence entre 20 et 500.000 U /hectolitre.

Selon un troisième objet, l'invention concerne l'utilisation pour augmenter la stabilité protéique, dans une boisson à base de moût végétal, à la chaleur, aux variations de température et/ou au vieillissement, d'un additif ou d'une composition comprenant au moins une protéase active, caractérisé en ce qu'en présence dudit additif le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié. Plus particulièrement, l'invention a pour objet l'utilisation d'un additif ou d'une composition comprenant au moins une protéase active, différente d'une protéase à cystéine, et présentant une activité invertase.

Description des figures et modes de réalisation

D'autres avantages et caractéristiques apparaîtront à l'examen de la description détaillé d'un mode de réalisation nullement limitatif, et des dessins annexés, dans lesquels :

La Figure 1 représente le résultat de l'analyse par SDS-PAGE de différents échantillons avec, de gauche à droite : marqueur (1), GW519 (2), GW519 et cystéine (3), GW510 et additif fongique avec protéase (4), GW510, additif fongique avec protéase et cystéine (5), GW123B (6), GW123B et cystéine (7), GW123B et additif fongique avec protéase (8), GW123B et additif fongique avec protéase et cystéine (9).

Les Figures 2A et 2B représentent respectivement le résultat de l'analyse par électrophorèse automatique d'échantillons de vin Gewurztraminer GW123B ou GW519 traités par un additif fongique. Sur la figure 2A, les tracés représentent, de gauche à droite, GW123B (bleu), GW123B et cystéine (rouge), GW123B et additif fongique avec protéase (marron), GW123B, cystéine et additif fongique avec protéase (vert). Sur la figure 2B, les tracés représentent, de gauche à droite, GW519 (bleu), GW519 et cystéine (rouge), GW519 et additif fongique avec protéase (marron), GW519, cystéine et additif fongique avec protéase (vert).

Il est bien entendu que les modes de réalisation qui seront décrits par la suite ne sont nullement limitatifs. On pourra notamment imaginer des variantes de l'invention ne comprenant qu'une sélection de caractéristiques décrites par la suite isolées des autres caractéristiques décrites, si cette sélection de caractéristiques est suffisante pour conférer un avantage technique ou pour différencier l'invention par rapport à de l'état de la technique antérieur.

La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants, qui sont donnés pour illustrer l'invention et non pour en limiter la portée.

EXEMPLES

Exemple 1 : Développement de compositions pour améliorer la stabilité protéique des moûts végétaux.

1.1. Matériel et méthodes

1.1.1. Boissons testées

Des tests de stabilité ont été réalisés sur trois cépages principaux connus pour leur forte instabilité protéique : 6 échantillons différents de cépages

Gewurztraminer (GW) : GW 1, GW 117, GW 520, GW 219, GW 123 B et GW 519, un échantillon de Sémillon et 2 échantillons de Sauvignon blanc : Sauvignon 1 et Sauvignon. Les vins sont stockés à 21°C. Les additifs sont évalués après fermentation, sur des vins n'ayant pas subi de traitement à la bentonite. Les vins ne subissent aucune flash fermentation au cours des tests.

L'électrophorèse SDS-PAGE permet de faire migrer des protéines sous l'influence d'un courant électrique, dans un gel de 14% de polyacrylamide, permettant la séparation des protéines selon leur poids moléculaire. Les résultats sont interprétables grâce à l'utilisation d'un marqueur contenant des protéines de 14,4 à 97 kDa. L'électrophorèse automatique consiste en la détermination des poids moléculaires de protéines par électrophorèse automatique grâce à l'appareil LabChip® GR de PerkinElmer. Les échantillons sont préparés selon le protocole décrit par le fournisseur et la réponse en fluorescence lors de la mesure permet de dénombrer les protéines présentes et leur concentration respective.

Le pH des vins a été rigoureusement noté mais n'a pas été ajusté après ajout des additifs. Il est connu que plus le pH de la boisson est élevé, plus les protéines précipitent. Il est connu que certaines molécules, comme la cystéine, sont connues pour leur capacité à modifier le pH du vin, selon leur concentration.

Les caractéristiques des échantillons sont définies dans le tableau 1 qui suit.

Tableau 1

1.1.2. Additifs testés

Les additifs sont préparés à partir de compositions sous forme granulaire ou de poudre, à partir desquelles une solution mère est préparée le jour du lancement de l'incubation. L'additif est ajouté au vin, une incubation sans agitation pendant 24 à 48h à 21°C est réalisée. Les additifs sont ajoutés pour obtenir une concentration finale dans le vin qui est comprise de préférence entre 10 et 40 g/hL.

Les additifs testés sont un additif fongique (selon l'invention), des additifs connus de l'état de l'art et des additifs présentant une activité enzymatique. a. Additif fongique

L'additif fongique est une préparation enzymatique granulaire dérivée de Aspergillus oryzae, de type Sumizyme LPL®, cette préparation comprend une protéase active ainsi que d'autres activités enzymatiques, observées lorsque l'additif fongique est présent à une concentration dans le vin, respectivement indiquée entre parenthèses : activités béta-glucanase (20 g/hL) cellulase (20 g/hL), xylanase (2 kg/hL), alpha amylase (200 g/hL) et invertase (20 g/hL). Une solution mère de Sumizyme LPL® à 50 g.L-1 est préparée, puis diluée lors de l'inoculation pour une concentration finale, par exemple, de 20 g/hL. b. Autres additifs

Le chitosan en poudre (Laffort) est préparé sous forme d'une solution mère à 5% W/v dans de l'eau purifiée, qui est ensuite diluée comme indiqué.

Le chitosan liquide pH 3,5 est préparé sous forme d'une solution mère à 5% W/v dans de l'eau purifiée, la solution est préparée à partir de chitosan en poudre, dilué dans de l'HCI (solution d'HCI concentré 36%) jusqu'à obtention d'un pH 3,5 (MilliQ).

La chitine-glucane (Lallemand) est préparée sous forme d'une solution mère à 5% w/v dans de l'eau purifiée. (MilliQ). La mannoprotéine MP32 est préparée sous forme d'une solution mère de mannoprotéines MP32 selon le protocole décrit dans la demande internationale WO 97/49794 à 1% w/v dans de l'eau purifiée (MilliQ).

Selon les cas, de la cystéine en poudre est ajoutée, jusqu'à obtenir une concentration finale de 10 mM dans l'échantillon traité. c. Additifs à activité enzymatique

Invertase Novozyme (Additif 2)

Invertase Sigma de Sc (Additif 3)

Invertase Danisco liquide (Additif 4)

Invertase Sigma de Candida utilis (Additif 5)

Protéase : AB enzyme Aspergillus Oryzae (Veron PS) (Additif 6)

Protéase : Novozyme Aspergillus Oryzae (Flavourzyme exopeptidase) (Additif 7)

1.1.3. Test à la chaleur

Un test à la chaleur permet de simuler l'effet du temps et des potentielles variations de température auxquelles un vin peut être exposé pendant son stockage et son transport. Pendant ce test, le vin est exposé à des températures définies pendant une durée précise, les tests sont réalisés en triplicata. Le test standard est réalisé sur des échantillons de 50 ml de vin. Les échantillons sont préalablement filtrés sur une membrane polyéther sulfone 0,45 micromètre. La turbidité, exprimée en NTU (Néphélometric Turbidity Unit) et mesurée avec un néphélomètre, est mesurée avant chauffage, puis les échantillons sont déposés comme suit : 1) flacons fermés pendant 30 min dans un bain-marie à 80°C, 2) flacons ouverts pendant 30 min à température ambiante, 3) flacons fermés pendant 15 min dans un bain-marie à 20°C. La turbidité est ensuite mesurée après ces différents chauffages.

Le calcul du ANTU = turbidité après chauffage - turbidité avant chauffage ainsi la valeur du trouble à la chaleur, représentative de l'instabilité protéique du vin. Un vin de type Sauvignon Blanc est considéré stable pour un ANTU = 2 NTU maximum. Le cépage Gewurztraminer (GW) étant plus difficile à stabiliser, les producteurs de vin GW se fixent une limite d'environ 10 à 20 NTU pour considérer le vin stable protéiquement.

Un test miniaturisé a été développé et permet de réduire les volumes de vins utilisés en utilisant, grâce à une gamme étalon établie préalablement, la lecture en cuve de 1.5 mL de la Densité Optique à 600nm (ODeoonm). Les résultats sont exprimés en terme de % de diminution du trouble à la chaleur, soit (DNTII vin avec additif - DNTII vin témoin sans additif) / 100.

Le test à la chaleur est dans le monde de l'œnologie l'unique test qui permet de valider la stabilité d'un vin. Ainsi, dans le cadre de l'invention présentée, il a été utilisé comme test de référence pour démontrer l'efficacité de l'additif améliorant la stabilité protéique et réduisant donc le DNTu en comparaison avec le vin témoin. Le vin étant une matrice complexe et évoluant avec le temps, notamment chez un vin instable protéiquement, il est normal d'observer de légères variations entre plusieurs séries de données, d'où l'importance de systématiquement inclure un vin témoin (= n'ayant subi aucun traitement quel qu'il soit) à chaque série. Des analyses complémentaires ont été également réalisées pour notamment le suivi des protéines suite aux différents traitements appliqués, notamment par électrophorèse SDS-PAGE et électrophorèse automatique.

1.2. Résultats

1.2.1. Caractérisation de l'activité protéase dans l'additif fongique

Les résultats, obtenus en présence et en absence de cystéine, sont rassemblés dans le tableau 2 suivant.

Tableau 2

Les résultats obtenus en présence d'additif fongique à 20 g/hL montrent que cet additif permet une réduction du trouble à la chaleur sur les échantillons Sauvignon, GW 519 et GW 123B. L'ajout de cystéine n'améliore pas significativement la performance de l'additif fongique, car on considère comme négligeable l'écart entre 15 et 13 NTU. Les protéases contenues dans l'additif fongique n'ont donc pas besoin du cofacteur cystéine pour réduire le trouble à la chaleur des vins testés. Il est reconnu que plus le pH du vin est haut, plus les protéines ont tendance à précipiter à la chaleur. L'ajout de cystéine, faisant baisser le pH de 0.3 unités de pH, ne conduit pas à une chute de la turbidité. Sans être lié par une théorie particulière, comme l'exemple 1 montre qu'après ajout de l'additif fongique le profil protéique de la boisson n'est pas modifié, la réduction de trouble à la chaleur observée en présence de l'additif fongique ne serait donc pas majoritairement liée à une hydrolyse des protéines du vin.

On note une différence d'activité en fonction des vins, et même au sein d'un même cépage. En effet une réduction de 58% du trouble à la chaleur est observée lors de l'ajout de l'additif fongique au GW 123B contre une réduction de 39% sur le GW 519. Cette différence s'explique par une variation, entre cépage et au sein d'un même cépage, de la répartition et de la concentration des protéines de défense, mais également d'autres paramètres pouvant rentrer en compte dans le mécanisme de précipitation à la chaleur.

1.2.2. Caractérisation des protéines de l'échantillon après traitement

Des analyses complémentaires par électrophorèse SDS-PAGE et électrophorèse automatique sont réalisées pour caractériser les protéines présentes à la suite des différents traitements appliqués.

Les échantillons des 2 GW ont été déposés sur gel SDS-PAGE (Figure 1), pour suivre l'évolution de l'ensemble des protéines du vin lors de la diminution du trouble à la chaleur après ajout de l'additif fongique. Dans la figure 1, les vins témoins des puits 2 et 6 ont un profil caractéristique des vins blancs avec notamment des bandes à 20, 32 et 70 KDa représentant respectivement les protéines Thaumatin-Like, les glucanases et les Invertases. Les chitinases apparaissent de manière plus diffuse et étendue entre 10 et 35 kDa. Les puits 4 et 8 montrent bien que les protéines du vin sont inchangées lors de l'ajout de l'additif fongique. Des bandes supplémentaires correspondant aux protéines (enzymes) de la préparation fongique apparaissent.

Ces résultats montrent que l'additif fongique contenant plusieurs activités enzymatiques n'hydrolyse pas les protéines du vin. Il est envisageable que cet additif fongique agit probablement sur le mécanisme de précipitation des protéines du vin à la chaleur. Les échantillons ont également été analysés par électrophorèse automatique (LabChip®) selon les instructions données par le fournisseur (Figures 2A et 2B). Dans le cas des deux vins, on observe une faible différence dans les profils protéiques entre vins témoins et vins traités avec l'additif fongique. L'additif fongique étant notamment composé de protéases il est normal de constater une très faible diminution des pics de fluorescence associés aux protéines du vin, observable sur le profil obtenu par LabChip® du GW 123B, cette diminution n'étant même pas visible sur gel SDS-PAGE.

Il apparaît clairement, en comparaison avec ce qui a pu être présenté dans des études précédentes, que la réduction de 57 et 39% du trouble à la chaleur sur les GW 123B et GW 519 respectivement n'est pas liée à une hydrolyse totale des protéines. Cela vient confirmer les résultats précédemment trouvés sur gel SDS- PAGE : l'additif fongique agit probablement sur le mécanisme de précipitation des protéines du vin à la chaleur.

1.2.3. Résultats : comparaison de l'effet de différents additifs

Un deuxième essai a visé à évaluer pour 5 vins différents les additifs suivants : l'additif fongique (additif selon l'invention), le chitosan sous forme de poudre réhydratée dans de l'eau MilliQ ou sous forme liquide acide (pH 3.5), la chitine- glucane et enfin la mannoprotéine MP32. Les résultats sont montrés dans le tableau 3 suivant.

Tableau 3

Les résultats obtenus montrent une fois de plus une grande différence de comportement en fonction des vins. Chaque vin a une composition bien particulière, aussi bien au niveau des protéines, jusqu'à présent jugées responsables de l'instabilité des vins blancs et rosés à la chaleur, qu'au niveau des sucres, des tanins, des stilbènes et des anthocyanes, à titre d'exemple. Il existe un grand nombre de molécules entrant dans la composition du vin et certaines entrent en jeu dans le mécanisme de précipitation à la chaleur. D'un vin à l'autre ces molécules ne sont pas présentes dans les mêmes proportions.

Ainsi, l'additif fongique à 20 g/hL et la mannoprotéine MP32 à 25 g/hL ont un effet très important sur le Sauvignon menant respectivement à une réduction du trouble à la chaleur de 71 et 81%.

Le chitosan acidifié semble plus efficace que le chitosan pur, et mène à des réductions du trouble à la chaleur les plus importantes pour les échantillons GW 219 et 519. La chitine-glucane a un effet relativement similaire au chitosan pur. Plusieurs gels électrophorèse SDS-PAGE ont été réalisés par vin (résultats non montrés). Dans chaque gel on note, pour les pistes correspondant aux conditions de test à la MP 32 et à la préparation fongique, l'apparition de bandes supplémentaires correspondant respectivement à la MP 32 et aux protéines de la préparation fongique.

D'autre part, si l'on compare chacune des pistes correspondant au vin traité avec l'un de ces additifs avec la piste correspondant au vin témoin, que le vin soit traité à l'additif fongique, au chitosan, à la chitine ou à la MP32, les bandes protéiques du vin demeurent inchangées. Chacun de ces additifs, ayant un degré d'action notable mais différent sur le trouble à la chaleur des vins, agit donc sur le mécanisme de précipitation des protéines à la chaleur, et non pas sur les protéines elles-mêmes.

1.2.4. Effet d'additifs présentant une activité enzymatique

L'effet de différents additifs présentant une activité enzymatique sur la turbidité est comparé pour différents vins, les résultats sont présentés dans le tableau 4 suivant.

Tableau 4

Les additifs ne présentent pas tous la même efficacité sur un même vin. Par exemple, un additif selon l'invention (1), l'invertase Sigma (3) et l'invertase Danisco (4), ont un impact positif sur la stabilité du GW117 puisqu'ils réduisent le trouble de 48 à 63% alors que les additifs Protéase AB (6) et Protéase Novozyme (7) ne réduisent pas le trouble ; on considère qu'une réduction de 6 % n'est pas significative. 1.2.5. Caractérisation de l'activité protéasique et invertasique

L'activité protéasique est mesurée par un test de dégradation de l'hémoglobine pendant lh, à pH 3 et à 37°C. L'activité invertasique est caractérisée par une méthode spectrophotométrique connue : dégradation du sucrose en glucose à 40°C, pH 4,5 Les activités protéasique et invertasique des différents additifs sont les données issues des fiches techniques (chacune des fiches techniques indiquant le protocole utilisé pour la mesure de l'activité enzymatique, auxquelles sont ajoutées les données mesurées en laboratoire. L'activités invertasique des additifs 1, 6 et 7 ont été mesurés au laboratoire. Les résultats sont présentés dans le tableau 5 ci- dessous.

Tableau 5

Ces résultats permettent de comparer les additifs entre eux en terme d'efficacité sur vin en tenant compte des niveaux d'activités invertasique et protéasique et des doses associées.

Les additifs « Protéase AB enzyme » (6) et « Protéase Novozyme » (7) ne contenant qu'une activité protéasique, décrite et mesurée, ne sont pas efficaces sur la stabilité des vins.

L'additif fongique selon l'invention (additif 1) contient une activité invertasique 7200 fois moins importante que l'additif « Invertase Novozyme » (2), respectivement 20 et 144 000 unités/g, pourtant il présente la même efficacité sur le GW117 pour une dose de 10 g/hL. Ce résultat est également observé pour l'ensemble des vins testés.

La présence combinée d'une activité protéasique et invertasique dans un additif selon l'invention est la clef pour la stabilité à la chaleur. Ce résultat permet de réduire de 7200 fois l'activité invertasique à utiliser par rapport à un additif présentant uniquement une activité invertasique.

1.2.6. Caractérisation des additifs après chauffage

L'activité des additifs sur la stabilité du vin GW1 est mesurée après une étape éventuelle de chauffage. Le terme « Inv exotique » désigne une invertase de Candida utilis. Le traitement par chauffage de l'additif consiste en un chauffage à 80°C pendant 10 minutes. Les résultats sont présentés dans le tableau 6 ci- dessous.

Tableau 6

Les résultats montrent que le chauffage conduisant à l'inactivation des activités enzymatiques réduit très largement l'activité des additifs testés sur la stabilité des vins, passant de 80% à 25% dans le meilleur des cas. Exemple 2 : Développement d'additifs comprenant une ou plusieurs compositions

Les compositions décrites dans l'exemple 1 sont combinées pour tester leur effet sur la stabilité protéique à la chaleur dans des échantillons de Gewurztraminer. Les différents additifs et les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 7 suivant.

Tableau 7 Les résultats montrent que, d'une manière générale, il est possible d'arriver à une stabilisation quasiment totale en combinant l'ensemble des additifs, notamment pour les GW 520 et GW 219. Le GW 219, malgré un profil protéique identique aux trois autres GW, semble avoir un comportement différent des autres vins, il semble notamment moins affecté par la MP32. Si l'on regarde plus particulièrement la modalité « Chitosan pH 3.5 à 25 g/hL et additif fongique à lOg/hL », on peut noter que l'effet de ces deux additifs combinés (i.e 41 NTU pour le GW 520 et 57 NTU pour le GW 123B) n'est pas égal à la somme des effets des additifs utilisés séparément (36 + 32 = 67 NTU pour le GW 520 et 34 + 40 = 74 NTU pour le GW 123B). Il est envisageable que ces effets non cumulatifs s'expliquent, soit par des mécanismes d'action différents mais liés : l'additif fongique bloquerait une molécule entrant en jeu dans le mécanisme de précipitation des protéines et inhiberait l'action de la MP32, ou l'inverse, soit par des mécanismes compétitifs : l'additif fongique bloquerait une molécule entrant en jeu dans le mécanisme de précipitation des protéines ; la MP32 visant la même molécule deviendrait moins efficace de par l'indisponibilité partielle de sa cible. L'importance est de retenir ici une action conjuguée, même si elle n'est pas strictement additionnelle, de l'additif fongique et du chitosan. Exemple 3 : Développement d'additifs comprenant un oligomère du chitosan

Les compositions décrites dans l'exemple 1 sont ensuite combinées avec un oligomère du chitosan, pour comparer l'effet d'un oligomère du chitosan et du chitosan conforme au Codex œnologique sur la stabilité protéique à la chaleur dans différents échantillons de Gewurztraminer. Les oligomères de chitosan sont préparés à partir de GU3511 (Chitosan oligosaccharide, origine fongique, Glentham). Une solution mère à 5%w/v d'oligomère du chitosan est préparée et rajoutée directement dans le vin pour atteindre la concentration souhaitée. Les essais ont été réalisés sur les vins GW 123B et Sauvignon Les résultats sont présentés dans le tableau 6 suivant.

Tableau 8

Les résultats expérimentaux montrent que pour les combinaisons aux concentrations hautes (20 g/hL d'additif fongique et 25 g/hL de chitosan ou son oligomère), la réduction du trouble à la chaleur des deux vins lorsque les additifs sont utilisés de manière combinée est toujours inférieure (ou égale, dans un seul cas) à la réduction du trouble à la chaleur des additifs utilisés de manière isolée. Ces essais confirment la série précédente et montrent que le chitosan et son oligomère ont une action semblable sur la réduction du trouble à la chaleur. Une concentration de 25 g/hL dans les deux cas est nécessaire pour observer un effet sur la réduction du trouble à la chaleur.

Les échantillons traités ont été analysés sur SDS-PAGE, les résultats montrent que quel que soit l'additif utilisé, aucune hydrolyse des protéines n'est observée dans l'échantillon.