Additivlösung für Erythrozytenkonzentrate

Gegenstand der Erfindung sind eine Additivlösung zur Lagerung von Erythrozyten konzentraten, Erythrozytenkonzentrate versehen mit der Additivlösung und ein Verfahren zur Herstellung von mit der Additivlösung verdünnten Erythrozytenkon zentraten umfassend den Schritt der Bestrahlung mit UV-Licht im Bereich von 300 bis 200 nm sowie die Verwendung der Additivlösung oder der Komponenten der Additivlösung zur Lagerung von Erythrozytenkonzentraten.

Technisches Umfeld

Erythrozytenkonzentrate (EK) sind aus roten Blutkörperchen (Erythrozyten) beste hende „Blutkonserven“. Erythrozytenkonzentrate sind in Deutschland als verkehrs fähige Formen solche, die mindestens 40 g Hämoglobin pro Einheit enthalten und einen Hämatokrit von 0,5 bis 0,7 aufweisen. Der Hämatokrit (Abkürzung: Hkt) be zeichnet den Anteil der roten Blutkörperchen (Erythrozyten) am Volumen des Blu tes und versteht sich jeweils im Folgenden in der Einheit L/L. Erythrozytenkonzent rate werden nach dem Stand der Technik üblicherweise mit einer Additivlösung verdünnt und so besser lagerfähig gemacht. Die Additivlösung, häufig auch als La gerlösung bezeichnet, dient dem Suspendieren und Lagern der Erythrozyten.

Erythrozytenkonzentrate können auf unterschiedliche Weise gewonnen werden. Üblich ist die Gewinnung aus Vollblutspenden oder im Apherese-Verfahren. Im A- pherese-Verfahren werden in einem Dialyse-ähnlichen Apparat im Durchflussver fahren Erythrozyten aus dem Spenderblut abgetrennt und die übrigen Blutbe standteile zurück in den Spenderkreislauf geleitet. Für die maschinelle Blutspende wird z.B. das Antikoagulanz ACD-A verwendet.

Vollblutspenden erfolgen, indem mittels venöser Blutentnahme ein bestimmtes Vo lumen an Vollblut von jeweils einem Spender in jeweils einem Blutbeutel aus ei nem Kunststoffmaterial verfüllt wird, z.B. 450 mL Vollblut. Der Blutbeutel enthält eine Stabilisatorlösung oder die Stabilisatorlösung wird dem Vollblut hinzugefügt, um die Haltbarkeit des Vollblutes zu erhöhen und dessen Gerinnung entgegenzu wirken. Eine typische Stabilisatorlösung ist eine CPD-Stabilisatorlösung, umfassend Ci trat-Puffer, Natriumdihydrogenphosphat und D-Glukose. Hier werden in der Regel 63 ml_ CPD-Stabilisatorlösung auf 450 ml_ Vollblut bzw. 70 ml_ CPD-Stabilisatorlö- sung auf 500 ml_ Vollblut eingesetzt. Durch die Stabilisatorlösung wird der pH- Wert des Vollblutes auf 7,1 bis 7,2 stabilisiert.

Bei der Auftrennung der Vollblutspende in seine Einzelkomponenten werden u.a. die Erythrozytenkonzentrate (EK) gewonnen.

In der Regel wird vor Herstellung der Erythrozytenkonzentrate eine Leukozytende- pletion am Vollblut durchgeführt oder die Erythrozytenkonzentrate werden einer Leukozytendepletion unterzogen. Unter Leukozytendepletion versteht man die weitgehende Entfernung der Spender-Leukozyten. In vielen Ländern, wie z.B. in Deutschland, ist dies gesetzlich vorgeschrieben. Die Leukozytendepletion erfolgt z.B., indem das Blut nach Zugabe der Stabilisatorlösung oder das Erythrozyten konzentrat mit der Additivlösung einen Filter passiert, welches die Leukozyten zu rückhält oder z.B. während der Apherese, bei der die Leukozyten durch Zentrifu gation von den Erythrozyten getrennt werden. Die verwendeten Filter bestehen häufig aus zu Packungen verpressten Polyesterfasern, so dass Poren definierter Größe entstehen, oder aus einem Polyurethanschwamm mit einer definierten Po rengröße.

Die Filtration zur Leukozytendepletion kann unmittelbar nach Gewinnung des Blu tes und vor Gewinnung der Erythrozytenkonzentrate oder nach Lagerung der Erythrozytenkonzentrate, ggf. auch erst am Krankenbett vor Verabreichung an ei nen Patienten erfolgen. Zumindest in Deutschland ist es gängige Praxis, die Leu kozytendepletion vor der Lagerung der Erythrozytenkonzentrate durchzuführen.

Zur Herstellung der Erythrozytenkonzentrate wird das Vollblut zentrifugiert. Der Überstand, der das Plasma und den sogenannten Buffy-Coat, bestehend aus Thrombozyten und Leukozyten, enthält, wird abgetrennt und die als Zentrifugat oder Bodensatz verbleibenden Erythrozyten werden in einer Additivlösung aufge schwemmt. Ggf. wird das Erythrozytenkonzentrat zuvor noch einmal in einer Nährlösung, die auch unterschiedlich von der Additivlösung sein kann, aufgeschwemmt und erneut zentrifugiert, um diese wieder abzutrennen, sodass Reste des Spender-Blutplas mas durch die Nährlösung ersetzt werden, bevor die Erythrozyten in der Additivlö sung aufgeschwemmt und gelagert werden. Diese gewaschenen Erythrozytenkon zentrate sind sinnvoll bei Unverträglichkeiten vorangegangener Transfusionen (z.B. allergische Reaktionen gegen Proteine des Spender-Plasmas, z.B. bei Pati enten mit IgA-Mangel).

Um die Erythrozytenkonzentrate, wie sie aus der Zentrifugation erhältlich sind, auf eine physiologisch verträgliche Viskosität einzustellen, muss eine Additivlösung zugesetzt werden, mit der auch für die Erhöhung der Lagerungsfähigkeit notwen dige Substanzen zugeführt werden. Die Additivlösung verbessert die Überlebens rate und reduziert die während der Lagerung auftretende Hämolyse der Erythrozy ten.

Additivlösungen für Erythrozytenkonzentrate sind an sich bekannt und in verschie denen Ausgestaltungen bisher vorgeschlagen worden.

Aus der US 4267269 ist eine Lösung bekannt, die neben Natriumchlorid, Glucose oder Fructose und Adenin, den Zuckeralkohol Mannit enthält. In der EP 0100419 A2 wird eine Lösung vorgeschlagen, die ebenfalls Natriumchlorid, Glucose oder Fructose und Adenin jedoch als Zuckeralkohol Sorbit bzw. Xylit enthält und ggf. zusätzlich Guanosin. Die EP 0301250 A1 offenbart Additivlösungen, enthaltend Natriumchlorid, Di-Natriumhydrogenphosphat und/oder Natriumdihydrogenphos- phat, Glucose und/oder Fructose, Sorbit, Mannit und/oder Xylit, Adenin und/oder Guanosin und ggf. Kolloide.

Wirtschaftliche Bedeutung hat z.B. die Additivlösung SAG-M erlangt. Diese enthält Adenin, Glukose, D-Mannitol und Natriumchlorid (C.F. Högman, K. Hedlund, Y. Sahleström: „Red cell preservation in protein-poor media. III. Protection against in vitro hemolysis” in Vox Sang. 1981 Nov-Dec; 41(5-6):274-81). Ein weitere bekannte Additivlösung ist PAGGS-Mannitol (PAGGS-M), die derzeit wie folgt als wässrige Lösung vertrieben wird:

47,4 mmol/L D-Glukose Monohydrat

8,0 mmol/L Natriumdihydrogenphosphat Dihydrat 8,0 mmol/L Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat 1,4 mmol/L Adenin 1,4 mmol/L Guanosin 54,9 mmol/L Mannitol 72 mmol/L Natriumchlorid

Walter et al. haben in W.H. Walker, M. Netz, K.H. Gänshrit: „49 Tage Lagerung von Erythrozytenkonzentraten in Blutbeuteln mit der Konservierungslösung PAGGS-Mannitol“. Beitr. Infusionsther. 26(1990): 55-59 die Lagerfähigkeit von Erythrozytenkonzentraten mit der Additivlösung PAGGS-M untersucht, wobei CPD als Stabilisatorlösung eingesetzt wurde.

Es ist bekannt, dass die therapeutische Anwendung von Blutpräparaten das Risiko birgt, dass die Empfänger des Blutpräparates mit Viren und/oder Bakterien infiziert werden. Genannt seien z.B. die Viren Hepatitis-B (HBV), West-Nil (WNV) und He- patitis-C (HCV) sowie die Aids-Erreger HIV-1 und HIV-2 oder Bakterien, wie z.B. Staphylokokken oder Streptokokken. Das Risiko besteht immer dann, wenn bei der Herstellung des Präparates kein Schritt zur Inaktivierung bzw. Eliminierung der genannten Pathogene Anwendung findet.

Eine Pathogeninaktivierung kann z.B. mit UV-Strahlung durchgeführt werden. Ein derartiges Verfahren ist z.B. aus der WO 2007/076832 A1 bekannt. Ultraviolettes (UV-) Licht wird je nach Wellenlänge differenziert. Im Sinne dieser Anmeldung er folgt folgende Definition: UVA: 400 bis 320 nm, UVB: 320 bis 280 nm und UVC: 280 bis 200 nm. Es ist bekannt, dass man durch Bestrahlung mit kurzwelligem ult ravioletten (UV-) Licht, d.h. im Wellenbereich unterhalb von ca. 320 nm (UVB und UVC), sowohl Viren als auch Bakterien inaktivieren kann, etwa in Blutplasma oder in zellulären Blutpräparaten. Oberhalb von 320 nm ist die Energie der Strahlung zu gering, um Mikroorganismen und Viren effektiv zu inaktivieren. Gegenüber chemi schen, photochemischen und photodynamischen Methoden zur Pathogeninaktivie rung besitzt die bloße Bestrahlung mit UV-Licht grundsätzlich den Vorteil für sich allein wirksam zu sein und nicht des Zusatzes reaktiver Chemikalien oder photo aktiver Substanzen zu bedürfen. Aufgabe der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, die Lagerfähigkeit von Erythrozytenkonzentraten zu verbessern, insbesondere für Erythrozyten, die einer UV-Bestrahlung ausgesetzt waren, bevor sie in die Additivlösung eingebracht werden, oder auch ein Medium für die UV-Bestrahlung der Erythrozyten und die Lagerung bereitzustellen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung ist durch die unabhängigen Patentansprüche gekennzeichnet, be vorzugte Ausführungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche und/oder nachfolgend beschrieben.

Die erfindungsgemäße Additivlösung umfasst neben Wasser folgende Komponen ten:

12 bis 50 mmol/L, insbesondere 17 bis 50 mmol/L oder 20 bis 25 mmol/L, Dinatri- umhydrogenphosphat (Na2HP04);

0,1 bis 3,5 mmol/L, insbesondere 1 ,5 bis 2,5 mmol/L, Adenin;

10 bis 90 mmol/L, insbesondere 45 bis 55 mmol/L, D-Glukose;

0,1 bis 3 mmol/L, insbesondere 1,25 bis 1,75 mmol/L, Guanosin;

10 bis 80 mmol/L, insbesondere 20 bis 60 mmol/L oder sogar 35 bis 45 mmol/L, Natriumchlorid; und

10 bis 50 mmol/L, insbesondere 14 bis 50 mmol/L oder 25 bis 35 mmol/L, Tri-Natri- umcitrat.

Insbesondere besteht die Additivlösung aus folgenden Komponenten:

12 bis 50 mmol/L, insbesondere 17 bis 50 mmol/L oder 20 bis 25 mmol/L, Dinatri- umhydrogenphosphat (Na2HP04);

0,1 bis 3,5 mmol/L, insbesondere 1 ,5 bis 2,5 mmol/L, Adenin;

10 bis 90 mmol/L, insbesondere 45 bis 55 mmol/L, D-Glukose;

0,1 bis 3 mmol/L, insbesondere 1,25 bis 1,75 mmol/L, Guanosin;

10 bis 80 mmol/L, insbesondere 20 bis 60 mmol/L oder 35 bis 45 mmol/L, Natrium chlorid;

10 bis 50 mmol/L, insbesondere 14 bis 50 mmol/L oder 25 bis 35 mmol/L, Tri-Natri- umcitrat; wobei der Rest Wasser ist. Die obigen Komponenten können jeweils auch als ihre Hydrate eingesetzt werden. Die Komponenten liegen in Lösung i.d.R. dissoziiert vor.

Ebenso beansprucht sind Konzentrate oder Verdünnungen, insbesondere Verdün nungen obiger Additivlösungen.

Die Additivlösung weist vorzugsweise einen pH von größer 7, vorzugsweise grö ßer 7,5, insbesondere einen pH von 8 bis 9, jeweils bei 22°C, auf.

Die Osmolalität der Additivlösung beträgt vorzugsweise von 260 bis 300 mOsm/kg. Die Messung der Osmolalität erfolgt mittels Gefrierpunkts-Erniedri- gungs-Methode (Osmometer).

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von mit der Additivlösung verdünnter Erythrozytenkonzentrate, umfassend den Schritt der Be strahlung der Erythrozytenkonzentrate und/oder von Vorprodukten der Erythrozy tenkonzentrate, wie Vollblut, mit UV-Licht im Bereich von 300 bis 200 nm, insbe sondere 280 bis 220 nm, und bevorzugt 260 bis 240 nm (nachfolgend auch allge mein „UV-Bestrahlung“ oder „UV-bestrah!t“ genannt).

Das Verfahren zur Herstellung von Erythrozytenkonzentraten umfasst in den nach folgenden drei Ausgestaltungen folgende Schritte:

- Bestrahlung von Vollblut oder verdünntem Vollblut mit UV-Strahlung, Gewin nung eines Erythrozytenkonzentrates aus dem so bestrahlten Vollblut unter Zu satz der Additivlösung oder der Komponenten der Additivlösung; oder

- Bestrahlung eines Erythrozytenkonzentrates, umfassend die Additivlösung oder die Komponenten der Additivlösung, unter UV-Bestrahlung, wobei das Erythro zytenkonzentrat vorzugsweise ein verdünntes Erythrozytenkonzentrat mit einem Hkt kleiner 0,5 ist und nach der UV-Bestrahlung auf einen Hkt größer oder gleich 0,5 aufkonzentriert wird; oder

- Bestrahlung eines verdünnten Erythrozytenkonzentrates, umfassend eine zweite Additivlösung unter UV-Bestrahlung, wobei das verdünnte Erythrozyten konzentrat vorzugsweise einen Hkt kleiner 0,5 aufweist und nach der UV-Be- strahlung auf einen Hkt größer 0,5 aufkonzentriert wird, wobei die zweite Additivlösung gegen die Additivlösung oder die Komponenten der Additivlösung nach der Bestrahlung zumindest zu größer 75 Gew.%, bezo gen auf die zweite Additivlösung, ausgetauscht wird, vorzugsweise vollständig ausgetauscht wird; wobei die UV-Bestrahlung jeweils mit einer Wellenlänge von 300 bis 200 nm, ins besondere 280 bis 220 nm und bevorzugt 260 bis 240 nm, erfolgt. Werden die Komponenten der Additivlösung zugegeben, meint dies, dass diese so zugegeben werden, dass sich jeweils dieselben Konzentrationen ergeben, als wenn die Addi tivlösung zugegeben worden wäre. Insofern ist dies nichts anderes als wäre die Additivlösung zugegeben worden.

Weiterhin betrifft die Erfindung somit ein verdünntes Erythrozytenkonzentrat mit ei nem Hkt 0,1 bis 0,4, vorzugsweise 0,25 bis 0,35, enthaltend obige Additivlösung, insbesondere ein leukozytendepletiertes verdünntes Erythrozytenkonzentrat. Das verdünnte Erythrozytenkonzentrat wird z.B. erhalten aus einer 1 :2 Verdünnung ei nes Erythrozytenkonzentrats mit der Additivlösung. Erythrozytenkonzentrate mit einem Hkt von kleiner 0,5 werden vorliegend auch als „verdünnte Erythrozyten konzentrate“ bezeichnet.

Das Erythrozytenkonzentrat ist vorzugsweise wie folgt zusammengesetzt, umfas send (L= Liter):

Erythrozyten 0,40 - 0,80 L/L, insbesondere 0,50 - 0,70 L/L

Additivlösung 0,10 - 0,60 L/L, insbesondere 0,25 - 0,50 L/L und ggf.

Stabilisatorlösung 0,0001 - 0,10 L/L, insbesondere CPD-Stabilisatorlö- sung

Humanplasma 0,0001 - 0,2 L/L

Die Summe der Zahlen ergänzt sich jeweils zu einem Zahlenwert von 1 oder klei ner 1 L/L, insbesondere 1 L/L.

Insbesondere ist die Zusammensetzung des Erythrozytenkonzentrats, wenn die UV-Bestrahlung am Vollblut (VB) erfolgte, folgende, umfassend oder bestehend aus: Erythrozyten 0,5 - 0,7 L/L

Additivlösung 0,27 - 0,48 L/L

CPD-Stabilisatorlösung 0,03 - 0,09 L/L

Humanplasma 0,025 - 0,15 L/L oder 0,015 - 0,025 L/L oder nach UV- Bestrahlung des Erythrozytenkonzentrats, wenn die UV-Bestrah- lung nicht am Vollblut (VB) erfolgte, umfassend oder bestehend aus:

Erythrozyten 0,5 - 0,7 L/L

Additivlösung 0,27 - 0,49 L/L

CPD-Stabilisatorlösung 0,001 - 0,009 L/L oder 0,001 - 0,014 L/L

Humanplasma 0,005 - 0,05 L/L

Eine geeignete CPD-Stabilisatorlösung ist nach einer Ausführungsform wie folgt aufgebaut, enthaltend:

Tri-Natriumcitrat Dihydrat 80 bis 100 mmol/L insbesondere 89,4 mmol/L Citronensäure Monohydrat 13 bis 18 mmol/L, insbesondere 15,6 mmol/L Nah PC Dihydrat 13 bis 19 mmol/L, insbesondere 16,1 mmol/L

D-Glucose Monohydrat 115 bis 140 mmol/L, insbesondere 128,7 mmol/L

Die CPD-Stabilisatorlösung wird nach einer Ausführungsform dem Vollblut im Vo lumenverhältnis 1 : 6,1 bis 1 : 8,1 insbesondere 1: 7,14 (jeweils V/V), z.B. 63 mL CPD-Stabilisatorlösung auf 450 mL Vollblut oder 70 mL CPD-Stabilisatorlösung auf 500 mL, zugesetzt und zwar bevor die Additivlösung eingesetzt wird. Entspre chend der Aufarbeitung verbleiben dann die obigen Bestandteile der CPD-Stabi lisatorlösung in bestimmten Konzentrationen im Erythrozytenkonzentrat.

Da Glukose und Tri-Natriumcitrat auch in der Stabilistorlösung enthalten, sind er höht sich deren Anteil im Erythrozytenkonzentrat entsprechend, wenn CPD-Stabi lisatorlösung eingesetzt wird. Es ist aber auch möglich, andere Stabilisatorlösun gen einzusetzen.

Nach einer Ausführungsform enthält das Erythrozytenkonzentrat:

10 bis 30 mmol/l, insbesondere 14 bis 26 mmol/l, D-Glukose;

5 bis 12 mmol/l, insbesondere 6 bis 10 mmol/l, Dinatriumhydrogenphosphat, z.B. als Dihydrat; 0,3 bis 1,2 mmol/L, insbesondere 0,5 bis 0,8 mmol/l, Adenin 0,25 bis 0,9 mmol/L, insbesondere 0,4 bis 0,7 mmol/L, Guanosin;

8 bis 25 mmol/L, insbesondere 11 bis 20 mmol/L, Natriumchlorid;

6 bis 18 mmol/L, insbesondere 8 bis 16 mmol/L, Tri-Natriumcitrat; und fakultativ

0,01 bis 1 mmol/L, insbesondere 0,02 bis 0,8 mmol/L, Natriumdihydrogenphos- phat, z.B. als Dihydrat;

0,01 bis 1 mmol/L, insbesondere 0,02 bis 0,8 mmol/L, Citronensäure, z.B. als Mo nohydrat.

Diese Ausführungsform ist z.B. erhältlich, wenn das Erythrozytenkonzentrat durch Zugabe von CPD- oder CPDA-1 -Stabilisatorlösung zur Blutspende und erfin dungsgemäßer Additivlösung erhalten wurde, wobei dann das Natriumdihydrogen- phosphat und die Citronensäure durch die CPD-Stabilisatorlösung eingetragen werden.

Weiterhin betrifft die Erfindung somit die Verwendung der Additivlösung oder der Komponenten der Additivlösung zur Lagerung von Erythrozytenkonzentraten.

Der Unterschied in der Konzentration der CPD-Stabilisatorlösung und des Human plasmas ergibt sich durch Verdünnung des EK mit der Additivlösung und anschlie ßende Aufkonzentration. Beim Aufkonzentrieren wird ein Teil des Überstandes entfernt und damit auch ein Teil des ursprünglich enthaltenen Plasmas und der CPD-Stabilisatorlösung.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Erythrozytenkonzentrate werden nach einer Ausführungsform aus einzelnen Blut spenden isoliert oder aber durch maschinelle Apherese von einzelnen Spendern gewonnen. Das Volumen der Präparate liegt im Allgemeinen zwischen ca. 200 und 350 ml_. Das Volumen von Vollblutspenden liegt meist zwischen 400 und 500 ml_. Die Präparate werden jeweils in flachen Kunststoffbeuteln im Allgemeinen bei ca. 4°C bis 37°C für Vollblut und 4°C +/- 2°C für Erythrozytenkonzentrat gelagert. Die Leukozytendepletion kann auf der Stufe des Vollblutes durchgeführt werden, d.h. vor dem ersten Zentrifugieren des Vollblutes, oder auf der Stufe, wo die durch Zentrifugieren gewonnenen Erythrozyten in der Additivlösung aufgeschwemmt und verdünnt sind, d.h. auf der Stufe der Erythrozytenkonzentrate. Die Leukozytende pletion erfolgt in der Regel durch Filtration. Bei der Gewinnung der Erythrozyten mittels Apherese ist eine gesonderte Leukozytendepletion nicht notwendig, die Leukozytendepletion erfolgt hier bereits in Rahmen der Apherese.

Nach einer Ausgestaltung erfolgt die Durchführung der Leukozytendepletion an ei nem mit der erfindungsgemäßen Additivlösung verdünnten Erythrozytenkonzentrat bei einem Hkt von z.B. 0,1 bis 0,4. Nach der Leukozytendepletion erfolgen dann ggf. eine UV-Bestrahlung und danach eine Aufkonzentration auf einen Hkt von ins besondere 0,5 bis 0,7. Die Leukozytendepletion kann vor oder nach UV-Bestrah- lung erfolgen, bevorzugt vorher.

Die UV- Bestrahlung kann am Vollblut (VB), d.h. vor der Herstellung des Erythro zytenkonzentrates, oder am Erythrozytenkonzentrat erfolgen. Als Produkt wird ein UV-behandeltes, pathogen-abgereichertes Erythrozytenkonzentrat und ggf. leuko- zytendepletiertes Erythrozytenkonzentrat in der erfindungsgemäßen Additivlösung erhalten.

Ausgangsmaterial für die UV-Bestrahlung von Erythrozytenkonzentraten sind z.B. Erythrozytenkonzentrate mit einem Hkt zwischen 0,8 bis 1, insbesondere zwi schen 0,8 und 0,98. Diese werden mittels der erfindungsgemäßen Additivlösung nach einer Ausführungsform auf einen Hkt von 0,5 bis 0,7 eingestellt und bei die ser Konzentration mit UV oder bevorzugt bei weiterer Verdünnung (verdünntes Erythrozytenkonzentrat) bestrahlt. Im Sinne der vorliegenden Anmeldung wird ein Erythrozytenkonzentrat mit einem Hkt kleiner 0,5 als verdünntes Erythrozytenkon zentrat bezeichnet.

Das leukozytendepletierte Erythrozytenkonzentrat kann auch auf einen Hkt von 0,1 bis 0,4, vorzugsweise 0,25 bis 0,35, (verdünntes Erythrozytenkonzentrat) durch weitere Verdünnung mit der Additivlösung, z.B. aus einer 1:2 Verdünnung des Erythrozytenkonzentrates mit Additivlösung, eingestellt werden. Die so ver dünnten Erythrozytenkonzentrate werden über eine sterile Schlauchverbindung in einen Bestrahlungsbeutel überführt und unter heftiger Bewegung mit UV-Licht be strahlt. Das bestrahlte Erythrozytenkonzentrat wird in einen Leerbeutel überführt und auf einen Hkt von 0,5-0, 8, insbesondere 0,5-0, 7, aufkonzentriert, z.B. durch Zentrifu gation und Abpressen des Überstands.

Es ist bekannt, dass man durch Bestrahlung mit kurzwelligem ultravioletten (UV-) Licht Pathogene in Blutprodukten inaktivieren kann. Dies erfolgt nach dem Verfah ren der Erfindung, indem die Blutprodukte einer Bestrahlung mit ultraviolettem (UV-) Licht bei Wellenlängen von 300 bis 200 (Bereich UVB bis UVC) ausgesetzt werden, insbesondere einer Bestrahlung bei Wellenlängen im UVC Bereich von 280 nm bis 220 nm, insbesondere 260 bis 240 nm.

Die Strahlungsenergie beträgt vorzugsweise von 0,3 bis 10 J/cm ² , weiter bevor zugt 2,5 bis 5,5 J/cm ² und besonders bevorzugt 3 bis 5 J/cm ² für Vollblut und bei Erythrozytenkonzentraten von vorzugsweise 1,5 bis 4,5 J/cm ² und besonders be vorzugt 2 bis 4 J/cm ² (jeweils bezogen auf die Strahlungsenergie, die auf das Blut produkt einwirkt). Die Strahlungsenergie, die auf das Behältnis wie einen Bestrah lungsbeutel einwirkt, ist tatsächlich größer, weil der Bestrahlungsbeutel je nach Material typischerweise Strahlungsenergie der relevanten Wellenlänge absorbiert.

Wenn die Bestrahlung durch ein Medium erfolgt, das UV-Strahlung absorbiert, ist die Strahlungsenergie entsprechend zu erhöhen. Bestrahlungsbeutel aus EVA (Ethylenvinylacetat) absorbieren z.B. etwa 30 bis 40% der Strahlungsenergie. Die Bestrahlung erfolgt insbesondere bei einer Temperatur des Blutproduktes von 2 bis 37°C.

Ein derartiges Verfahren zur UV-Bestrahlung ist z.B. aus der WO 2007/076832 A1 bekannt und wird auf die Erythrozytenkonzentrate nach der vorliegenden Erfin dung angewandt. Hiernach werden die Präparate, d.h. Spenderblut (Vollblut) und/oder Erythrozytenkonzentrate (EKs) in einem Bestrahlungsbeutel in geeigne ter Weise bewegt, so dass eine ständige Umwälzung der Proben im Behältnis er folgt. Die Bewegung erfolgt hierbei so heftig, dass sich innerhalb der Flüssigkeit bzw. Suspension bereichsweise Schichten ausbilden, die so dünn sind, dass sie vom eingesetzten Licht durchdrungen werden können. Die Bewegung erfolgt so, dass Flüssigkeit bzw. Suspension im Beutel wirksam vermischt wird. Beides wird insbesondere realisiert, wenn u.a. folgende Voraussetzungen gegeben sind: 1. Die Bestrahlungsbeutel sind flexibel.

2. Die Bestrahlungsbeutel sind zu maximal 40 %, insbesondere maximal 30 %, insbesondere zu maximal 15%, des maximalen Füllvolumens gefüllt.

3. Die Beutel werden heftig bewegt, z.B. entweder horizontal (linear in Hin- und Her-Richtung bzw. kreis- oder ellipsenförmig) und/oder aber vertikal (gewippt).

In Verbindung mit der ständigen Durchmischung, die gleichzeitig stattfindet, wird letztendlich das gesamte Präparat (und die darin enthaltenen Pathogene) be strahlt, und es ist somit pathogenreduziert.

Die Bestrahlungsbeutel können mit einem Orbitalschüttler, Plattformschüttler, Wippschüttler oder Taumelschüttler geschüttelt werden und werden vorzugsweise während zumindest dreiviertel der gesamten Bestrahlungsdauer bewegt. Die Be strahlungsbeutel haben typischerweise ein Volumen von bis zu 5000 ml_. Wenn die Bestrahlungsbeutel einseitig aufgelegt sind, ändert sich während und durch das Bewegen bzw. Schütteln die Höhe des Bestrahlungsbeutels ständig über die gesamte obere Fläche des Bestrahlungsbeutels, die mit dem Beutelinhalt in Kon takt steht, bezogen auf die Distanz entlang der Flächennormale zwischen Fläche, auf der der Bestrahlungsbeutel aufliegt, und Schnittpunkt mit der oberen Fläche des Bestrahlungsbeutels.

Die Bestrahlungsbeutel sind aus UV-transparentem Kunststoffmaterial gefertigt. Geeignete Kunststoffe sind z.B. Ethylenvinylacetat und Polyolefine mit z.B. Folien stärken von 1 mm und weniger, insbesondere Folienstärken kleiner 0,5 mm. Die Bestrahlungsbeutel sind flächig ausgebildet und weisen vorzugsweise keine Ab- sorptionsmaxima im Bereich von 200 bis 320 nm auf. Die Bestrahlungsbeutel sind im liegenden gefüllten Zustand nur einige mm dick, z.B. kleiner 10 mm und insbe sondere 5 mm, vorzugsweise sogar kleiner 3 mm und sind bestimmt, Probenvolu mina von z.B. bis zu 600 ml_ aufzunehmen. Das maximale Fassungsvermögen (Volumen) des Bestrahlungsbeutels ist vorzugsweise aber um mindestens Faktor 3, i.d.R. um mindestens Faktor 5, größer oder mindestens 10 als das tatsächliche in ihm enthaltene zu behandelnde Probenvolumen. Beispielhaft hat der Bestrah lungsbeutel liegend eine Grundfläche von 19 x 38 cm und ein Füllvolumen von 500 bis 600 ml_, womit sich im liegenden und ruhenden Zustand eine mittlere Füll höhe von 6,9 bis 8,3 mm ergibt. Jede UV-bestrahlte Einheit ist vorzugsweise auf einen Spender zurückzuführen.

Hämatokrit (Hkt) bezeichnet den Anteil der zellulären Bestandteile im Blut. Nor male Hkt-Werte im Blut liegen bei Männern zwischen 0,42 und 0,5 und bei Frauen zwischen 0,37 und 0,45. Vorliegend ist dieser in L/L angegeben. Da die Erythrozy ten physiologisch 99 % des Gesamtvolumens der Blutzellen darstellen, entspricht der Hkt-Wert ungefähr dem Anteil des Zellvolumens.

Bestimmt wird der Hkt durch Zentrifugieren einer gerinnungsfreien Blutprobe in ei nem Röhrchen nach DIN 58933-1:1995-01. Die Gerinnung des Blutes wird dabei durch Zugabe von Antikoagulantien wie EDTA (Ethylendiamintetraacetat) oder He parin verhindert. Die schwereren roten Blutkörperchen setzen sich vom Plasma ab, die Höhe der Erythrozytensäule wird im Verhältnis zur gesamten Blutsäule ge messen. Die Grenzen zwischen Erythrozyten, Leukozyten/Thrombozyten und Blut plasma sind mit bloßem Auge erkennbar. Sind die Leukozyten und/oder Throm bozyten und Blutplasma bereits abgetrennt, besteht der sich absetzende Festkör per fast ausschließlich aus Erythrozyten.

Experimenteller Teil

Einfluss der Additivlösung UG65 auf die Qualität der UVC-bestrahlten Blutpräpa rate sowie Effektivität der Pathogeninaktivierung von Blutpräparaten mittels UV- Bestrahlung.

Herstellung der Komponenten

Vollblutspenden (450 - 500 mL) wurden in 70 mL des Antikoagulanz CPD gesam melt (Tag 0), nachfolgend gemeinsam Vollblutspende genannt, und über Nacht bei Raumtemperatur gelagert. Das Antikoagulanz CPD enthielt neben Wasser fol gende Bestandteile: mmol/L

Tri-Natriumcitrat Dihydrat 89,4 Citronensäure Monohydrat 15,6 NaH2P04 Dihydrat 16,1 D-Glucose Monohydrat 128,7 Am Tag 1 wurde das Vollblut direkt für Pathogeninaktivierungsexperimente ver wendet oder zum Erythrozytenkonzentrat weiterverarbeitet. Dazu wurden die Erythrozyten nach Zentrifugation in einer herkömmlichen Beutelzentrifuge und au tomatischer Komponententrennung durch einen Abpressautomaten als „trocke nes“ Erythrozytenkonzentrat gewonnen und anschließend in der jeweils angege benen Additivlösung (110 mL) aufgeschwemmt. Die Abreicherung der Leukozyten erfolgte mittels Filtration auf der Stufe des Vollbluts („Vollblutfiltration“) oder des Erythrozytenkonzentrates (Filtration nach Zentrifugation und Abpressen) mittels ei nes Leukozytendepletionsfilter.

Zusammensetzung der Additivlösung UG65:

Die wässrige Lösung enthält die folgenden Bestandteile: 22,7 mmol/L Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat

1 ,85 mmol/L Adenin 51 ,6 mmol/L D-Glukose Monohydrat 1,44 mmol/L Guanosin 40 mmol/L Natriumchlorid 28,4 mmol/L Tri-Natriumcitrat Dihydrat Rest Wasser

Zusammensetzung der Additivlösung SAG-M:

Die wässrige Lösung enthält die folgenden Bestandteile:

1,25 mmol/L Adenin

45,4 mmol/L D-Glukose Monohydrat

28,8 mmol/L D-Mannitol

150 mmol/L Natriumchlorid

Rest Wasser

Pathogeninaktivierung mittels UV-Bestrahlung

Vollblut (520 - 570 mL) oder in Additivlösung verdünntes Erythrozytenkonzentrat (600 mL, Hkt ca. 0,3) wurden in einen UV-durchlässigen Beutel (19 x 38 cm Grundfläche aus EVA) gefüllt und auf einer UV-Bestrahlungsanlage (Macotronic UV) mit UVC-Licht (254 nm) mit einer UVC-Dosis von 4,5 J/cm ² (EK) bzw. 6 J/cm ² (VB) bestrahlt und gleichzeitig geschüttelt (300 rpm). Aus dem Vollblut oder dem verdünnten Erythrozytenkonzentrat wurde anschlie ßend mittels Zentrifugation und automatischer Separation ein herkömmliches Erythrozytenkonzentrat mit einem Hkt von 0,5 bis 0,7 gewonnen.

Die Angaben zur eingestrahlten Energie wirken auf das Äußere des Bestrahlungs beutels ein. Den Bestrahlungsbeutel durchdringt ca. 50 bis 75 %, vorliegend ge schätzt 60% der eingestrahlten Energie. Der Bestrahlungsbeutel wurde von oben und von unten bestrahlt.

Bestimmung der Qualitätsparameter

Die Hämolyserate [%] ist definiert als der prozentuale Anteil des freien Hämoglob ins im Überstand der Erythrozytenkonzentrate im Vergleich zum Gesamtgehalt. Hämolyse (%) = ((100-Hämatokrit ^* 100) x freies Hämoglobin im Überstand / Ge samthämoglobin).

Der Hkt wurde mittels Hämatokritzentrifuge (Haematokrit 210, Hettich) bestimmt. Freies Hämoglobin im Überstand wurde photometrisch mit der 3-Wellenlängenme- thode nach Harboe bestimmt (vergleiche: M. Harboe, A method for determination of hemoglobin in plasma by near-ultraviolet spectrophotometry. Scand J Clin Lab Invest, 1959. 11(1): p. 66-70). Gesamthämoglobin wurde mittels Hämatologieauto mat (XS1000i oderXN550, Sysmex) gemessen.

Die Bestimmung der Glukose- und Laktatkonzentration erfolgte mit dem Blut gasanalysator ABL90 FLEX (Radiometer). Der ATP-Gehalt der Erythrozyten wurde mit dem kommerziell erhältlichen Kit ATP Hexokinase FS (DiaSys Greiner) gemessen. Der pH wurde bei 22°C an einem herkömmlichen pH-Meter bestimmt. Das Volumen wurde durch Wägen unter Berücksichtigung der spezifischen Dichte des Erythrozytenkonzentrats ermittelt.

Versuch 1

Qualitätsparameter in UG65 UVC-bestrahlter und in UG65 gelagerter Erythrozytenkonzentrate

Erythrozytenkonzentrate (n=9) in Additivlösung UG65 wurden wie oben beschrie ben UVC-bestrahlt und wieder aufkonzentriert. Die fertigen Erythrozytenkonzent rate mit einem Hkt von ca. 0,6 wurden anschließend bei 4 ± 2°C gelagert und wö chentlich wurden Proben zur Bestimmung der in vitro Qualität entnommen. Ergebnisse

Die UVC-bestrahlten Erythrozytenkonzentrate wiesen einen Hkt zwischen 0,59 und 0,64 auf und entsprachen damit den Guidelines des Council of Europe. Die Hämolyserate stieg im Verlauf der Lagerung an. Am Tag 36 der Lagerung zeigten aber alle neun Erythrozytenkonzentrate eine Hämolyserate von unter 0,8 % und entsprachen damit den Qualitätsanforderungen der Guideline des Council of Eu rope.

Der pH-Wert der UVC-bestrahlten Erythrozytenkonzentrate lag bei 7,14 ± 0,06 an Tag 2 und sank im Verlauf der Lagerung auf 6,54 ± 0,05 an Tag 36. Parallel dazu fiel der Glukosegehalt der Erythrozytenkonzentrate von 37,8 ± 1 ,6 auf 23,7 ± 1 ,9 und die Laktatkonzentration nahm von 6,9 ± 0,6 auf 30,4 ± 1 ,6 zu.

Fig. 1 zeigt die Hämolyserate im Verlauf der Lagerung als Funktion der Zeit in Ta gen.

Fig. 2 zeigt die Abnahme der Glukosekonzentration der in UG65 UVC-bestrahlten und in UG65 gelagerten Erythrozytenkonzentrate und Fig. 3 die Zunahme der Laktatkonzentration der in UG65 UVC-bestrahlten und in UG65 gelagerten Eryth rozytenkonzentrate im Verlauf der Lagerung.

Die Werte sind jeweils als Mittelwert aus 9 Proben angegeben.

Es konnte festgestellt werden, dass die neu entwickelte Additivlösung geeignet zur Herstellung von UVC-bestrahlten Erythrozytenkonzentraten in einer guten Qualität ist.

Versuch 2:

Einfluss unterschiedlicher Additivlösungen während der UVC-Bestrahlung bei nachfolgender Lagerung in der Additivlösung UG65

Vier trockene Erythrozytenkonzentrate wurden gepoolt und wieder aufgeteilt. Ein Erythrozytenkonzentrat wurde mit 110 ml_ UG65 aufgeschwemmt und zur Leuko- zytendepletion filtriert (unbehandelte Kontrolle ohne UVC-Bestrahlung). Für die drei übrigen Erythrozytenkonzentrate wurde jeweils ein gepooltes Erythro zytenkonzentrat mit 110 ml_ isotoner Kochsalzlösung (NaCI 0,9%), mit 110 ml_ Ad ditivlösung SAG-M und mit 110 ml_ Additivlösung UG65 aufgeschwemmt, filtriert und anschließend auf einen Hkt von ca. 0,3 mit der jeweils gleichen Additivlösung verdünnt. Die UVC-Bestrahlung erfolgte wie oben angegeben mit einer UVC-Dosis von 4,5 J/cm ² Anschließend wurden die UVC-bestrahlten Erythrozytenkonzentrate zentrifugiert, der Überstand wurde abgenommen und die Erythrozyten wurden alle jeweils in Additivlösung UG65 wieder aufgeschwemmt. Die Lagerung der Erythro zytenkonzentrate in der Additivlösung UG65 erfolgte bei 4 ± 2°C und wöchentlich wurden Proben zur Bestimmung der in vitro Qualität entnommen.

Ergebnisse

Wie in Fig. 4 gezeigt, führte die UVC-Bestrahlung im Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle zu einer erhöhten Hämolyserate. Die Hämolyserate war am höchsten, wenn die Erythrozyten in Anwesenheit von NaCI oder SAG-M bestrahlt wurden.

Die beste Qualität der UVC-bestrahlten Erythrozytenkonzentrate wurde erreicht, wenn die Additivlösung UG65 bereits bei der Bestrahlung anwesend war.

Der ATP-Gehalt als Parameter für den Energiestatus der Erythrozyten wurde ebenfalls durch die UVC-Bestrahlung beeinflusst. Der ATP-Gehalt am Ende der Lagerung war am höchsten, wenn die Erythrozyten in Anwesenheit von UG65 be strahlt wurden (Fig. 5). Die Bestrahlung der Erythrozytenkonzentrate in Anwesen heit von NaCI oder SAG-M führte zu einer Abnahme des ATP-Gehalts im Ver gleich zur unbestrahlten Kontrolle.

Fig. 4 gibt die Hämolyserate und Fig. 5 den ATP-Gehalt der UVC-bestrahlten Erythrozytenkonzentrate an, die in Anwesenheit von NaCI, SAG-M oder UG65 be strahlt wurden und sodann in UG65 gelagert wurden. Als Kontrolle diente ein EK, das ohne UVC-Bestrahlung in UG65 gelagert wurde.

Aus der Versuchsserie geht hervor, dass die Verdünnung der Erythrozytenkon zentrate mit der Additivlösung UG65 während der UVC-Bestrahlung einen positi ven Effekt auf die Qualität der Erythrozyten hat. Die neu entwickelte Additivlösung bietet einen Vorteil gegenüber anderen möglichen Verdünnungslösungen wie Kochsalzlösung oder herkömmlichen Additivlösungen. Versuch 3:

Vergleich der Qualität von UVC-behandelten Erythrozytenkonzentraten bestrahlt und gelagert in der Additivlösung UG65 im Vergleich zu Erythrozytenkonzentraten bestrahlt und gelagert in der konventionellen Additivlösung SAG-M

„Trockenes“ Erythrozytenkonzentrat (Hämatokrit > 0,8) wurde wie oben beschrie ben gewonnen. Zwei trockene Erythrozytenkonzentrate wurden gepoolt und wie der aufgesplittet und anschließend einmal in 110 ml_ der handelsüblichen Additiv lösung SAG-M (Kontrolle) und einmal in 110 ml_ der neu entwickelten Additivlö sung UG65 (Test) aufgeschwemmt. Die Abreicherung der Leukozyten erfolgte mit tels Filtration dieser Erythrozytenkonzentrate durch einen herkömmlichen Leuko- zytendepletionsfilter. Nach der Filtration wurde das jeweilige Erythrozytenkonzent rat mit der gleichen Menge der jeweiligen Additivlösung (w/w) versetzt. 600 g des verdünnten Erythrozytenkonzentrates wurden in einen UVC-durchlässigen Be strahlungsbeutel transferiert. Die UVC-Bestrahlung erfolgte wie oben beschrieben. Anschließend wurde aus dem verdünnten Erythrozytenkonzentrat mittels Zentrifu gation und automatischer Separation ein herkömmliches Erythrozytenkonzentrat gewonnen. Die fertigen Erythrozytenkonzentrate (n=3, Test und Kontrolle) wurden bei 4 ± 2°C gelagert und wöchentlich wurden Proben zur Bestimmung der in vitro Qualität entnommen.

Ergebnisse

Nach Herstellung hatten die Test- und Kontroll- Erythrozytenkonzentrate vergleich bare Werte für Volumen, Hkt und Hämoglobin pro Einheit (Tabelle 1).

Tabelle 1: Herstellungsdaten UVC-bestrahlter Erythrozytenkonzentrate (EKs) in UG65 und SAG-M (n=3) Als wichtigster Qualitätsparameter für Erythrozytenkonzentrate war die Hämolyse rate der in UG65 UVC-bestrahlten und gelagerten Erythrozytenkonzentrate deut lich erniedrigt im Vergleich zu den in herkömmlicher Additivlösung SAG-M UVC- bestrahlten und gelagerten Erythrozytenkonzentraten (Fig. 6). Im Verlauf der La gerung zeigten auch alle weiteren Qualitätsparameter signifikante Unterschiede zwischen den Kontroll- und Test-Erythrozytenkonzentraten (Fig. 7-9).

Fig. 6 zeigt die Hämolyserate im Verlauf der Lagerung von EKs UVC-bestahlt und gelagert in der gleichen Additivlösung.

Fig. 7 zeigt den ATP-Gehalt, Fig.8 den Glukose-Gehalt und Fig.9 den Laktat-Ge halt, jeweils am Ende der Lagerung (Woche 5) von EKs UVC-bestahlt und gela gert mit der gleichen Additivlösung.

Im Verlauf der Lagerung zeigte sich ein deutlicher Vorteil der neu entwickelten Ad ditivlösung UG65 für die UVC-Bestrahlung von Erythrozytenkonzentraten. Die in UG65 UVC-bestrahlten und in UG65 gelagerten EKs waren hinsichtlich der Quali tät denen in der konventionellen Additivlösung SAG-M überlegen.

Versuch 4

Qualität von Erythrozytenkonzentraten nach UVC-Bestrahlung auf der Stufe der Vollblute, Vergleich der Additivlösung UG65 mit konventioneller Additivlösung SAG-M

Vollblutspenden (ca. 570 mL) wurden wie oben beschrieben mit UVC bestrahlt und anschließend mittels automatischer Komponententrennung durch einen Ab pressautomaten als „trockenes“ Erythrozytenkonzentrat gewonnen (Hämatokrit > 0,8). Zwei trockene Erythrozytenkonzentrate wurden gepoolt und wieder aufge splittet und anschließend einmal in 110 mL der handelsüblichen Additivlösung SAG-M (Kontrolle) und einmal in 110 mL der neu entwickelten Lösung UG65 (Test) aufgeschwemmt. Die Abreicherung der Leukozyten erfolgte mittels Filtration dieser Erythrozytenkonzentrate durch einen herkömmlichen Leukozytendepleti- onsfilter. Die Erythrozytenkonzentrate (n=4, Test und Kontrolle) wurden anschlie ßend bei 4 ± 2°C gelagert und wöchentlich wurden Proben zur Bestimmung der in vitro Qualität entnommen. Ergebnisse

Nach Herstellung hatten die Test- und Kontroll- Erythrozytenkonzentrate vergleich bare Werte für Volumen, Hkt und Hämoglobin pro Einheit (Tabelle 2).

Tabelle 2: Herstellungsdaten von aus UVC-bestrahltem Vollblut hergestellten Erythrozytenkonzentraten (EKs) gelagert in UG65 oder SAG-M (n=4)

Als wichtigster Qualitätsparameter für Erythrozytenkonzentrate war die Hämolyse rate der aus UVC-bestrahltem Vollblut gewonnenen Erythrozytenkonzentrate in UG65 deutlich erniedrigt im Vergleich zu den aus UVC-bestrahltem Vollblut ge wonnenen Erythrozytenkonzentraten in der herkömmlichen Additivlösung SAG-M (Fig. 10). Im Verlauf der Lagerung zeigten auch weitere Qualitätsparameter signifi kante Unterschiede zwischen den Kontroll- und Test- Erythrozytenkonzentraten (Fig 11 - 13).

Fig.10 zeigt die Hämolyserate im Verlauf der Lagerung von EKs gewonnen aus UVC-bestrahltem Vollblut, gelagert in UG65 und SAG-M.

Fig. 11 zeigt den ATP-Gehalt, Fig.12 den Glukose-Gehalt und Fig.13 den Laktat- Gehalt, jeweils am Ende der Lagerung (Woche 4).

Im Verlauf der Lagerung zeigte sich ein deutlicher Vorteil der neu entwickelten Ad ditivlösung UG65 für die Gewinnung von Erythrozytenkonzentraten aus UVC-be strahltem Vollblut. Die Qualität von EKs aus UVC-bestrahltem Vollblut in UG65 ist denen in der konventionellen Additivlösung SAG-M überlegen. Versuch 5

Bakterieninaktivierung

Die Bakterienstämme Klebsiella pneumoniae (PEI-B-P-08-01), Serratia marcescens (PEI-B-P-56) und Pseudomonas fluorescens (PEI-B-P-77) wurden in CASA Bouillon vermehrt, mit humanem Serumalbumin versetzt und bis zur Ver wendung eingefroren gelagert (siehe U. Gravemann, et al. , Bacterial inactivation of platelet concentrates with the THERAFLEX UV-Platelets pathogen inactivation System. Transfusion, 2019. 59(4): p. 1324-1332.). Vollblut oder verdünnte Erythro zytenkonzentrate mit einem Hkt von ca. 0,3 wurden mit ca. 1 x 10 ⁶ KBE/mL Bakte riensuspension gespikt (n=3 für jedes verwendete Bakterium) und anschließend mit UVC-Licht und unter Schütteln bestrahlt. Anschließend wurde aus dem ver dünnten Erythrozytenkonzentrat oder dem Vollblut ein herkömmliches Erythrozy tenkonzentrat gewonnen. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden Proben ent nommen und der Bakterientiter wurde durch Ausplatttieren auf Agarplatten be stimmt.

Ergebnisse

Die Bakterien wurden sowohl in Erythrozytenkonzentraten (Tabelle 3) als auch im Vollblut (Tabelle 4) dosisabhängig inaktiviert mit log-Reduktionsfaktoren zwischen 4 und 6 log Stufen. Die Versuche belegen die Bakterien-Inaktivierungseffizienz des Verfahrens.

Tabelle 3: Bakterieninaktivierung in Erythrozytenkonzentrat (Titer in KBE/mL, MW, n=3), mit erfindungsgemäßer Additivlösung UG65 Tabelle 4: Bakterieninaktivierung in Vollblut (Titer in KBE/mL, MW, n=3), ohne Additivlösung während der UV-Bestrahlung

Versuch 6 Virusinaktivierung

EMCV (strain EMC, ATCC VR129B), Sindbis Virus (Strain Ar339, ATCC VR-68) und VSV (Strain Indiana, ATCC VR-158) wurden auf Verozellen (African Green monkey cell line from kidney tissue, ATCC, Bio Whittaker No. BE76-108B) ver mehrt und titriert. Die Anzucht und Titration erfolgte wie bei Mohr et al beschrieben (H. Mohr et al., A novel approach to pathogen reduction in platelet concentrates using short-wave ultraviolet light. Transfusion, 2009. 49(12): p. 2612-24).

Vollblut oder in der Additivlösung UG65 verdünnte Erythrozytenkonzentrate mit ei nem Hkt von ca. 0,3 wurden mit Virussuspension gespikt (10% v/v, n=3 für jedes verwendete Virus) und anschließend mit UVC-Licht und unter Schütteln bestrahlt. Anschließend wurde aus dem verdünnten Erythrozytenkonzentrat oder dem Voll blut ein herkömmliches Erythrozytenkonzentrat gewonnen. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden Proben entnommen und der Virustiter durch Endpunkttitration bestimmt. Bei Erreichen der Detektionsgrenze wurde statt der Endpunkttitration das Large Volume Plating angewandt.

Die Viren wurden sowohl in Erythrozytenkonzentrat (Tabelle 5) als auch im Voll blut (Tabelle 6) dosisabhängig inaktiviert mit log-Reduktionsfaktoren zwischen 3 und 5 log Stufen. Die Versuche belegen die Virus-Inaktivierungseffizienz des Ver fahrens. Tabelle 5: Virusinaktivierung in Erythrozytenkonzentrat (logioTClDso, MW, n=3) mit erfindungsgemäßer Additivlösung UG65

Tabelle 6: Virusinaktivierung in Vollblut (logioTClDso, MW, n=3), ohne Additivlösung während der UV-Bestrahlung

Versuch 7

Qualität von Erythrozytenkonzentraten nach UVC-Bestrahlung auf der Stufe der Vollblute, Vergleich der Additivlösung UG65 mit der Additivlösung PA- GGS-M Zwei Vollblutspenden (jeweils ca. 500 mL Vollblut + 70 mL CPD Stabilisatorlö sung) wurden gepoolt und wieder aufgeteilt. Die Vollblute wurden wie oben be schrieben mit UVC bestrahlt und anschließend mittels automatischer Komponen tentrennung durch einen Abpressautomaten als „trockenes“ Erythrozytenkonzent rat gewonnen (Hämatokrit > 0,8). Zwei trockene Erythrozytenkonzentrate wurden gepoolt und wieder aufgesplittet und anschließend einmal in 110 ml_ einer handelsüblichen Additivlösung PAGGS- M wie vorne beschrieben (Kontrolle, Zusammensetzung wie weiter vorne be schrieben) und einmal in 110 ml_ der neu entwickelten Lösung UG65 (Test) aufge schwemmt. Die Abreicherung der Leukozyten erfolgte mittels Filtration dieser Erythrozytenkonzentrate durch einen herkömmlichen Leukozytendepletionsfilter. Die Erythrozytenkonzentrate (n=4, Test und Kontrolle) wurden anschließend bei 4 ± 2°C gelagert und wöchentlich wurden Proben zur Bestimmung der in vitro Quali tät entnommen. Die Erythrozytenkonzentrate unterscheiden sich bei Verwendung der gleichen Menge CPD in Ihre Zusammensetzung zumindest jeweils dadurch, dass die Erythrozytenkonzentrate additiviert nach der Erfindung kein Mannitol auf wiesen und der Gehalt an Dinatriumhydrogenphosphat und Tri-Natriumcitrat deut lich größer war in den Erythrozytenkonzentraten nach der Erfindung verglichen mit solchen die neben CPD auch PAGGS-M enthielten.

Tabelle 7: Konzentration im EK mit Additivlösung UG65

D-Glukose mmol/l 18,6

Natriumdihydrogenphosphat Dihydrat mmol/l 0,03

Dinatriumhydrogenphosphat mmol/l 8,1

Adenin mmol/l 0,7

Guanosin mmol/l 0,5

Natriumchlorid mmol/l 14,2

Tri-Natriumcitrat mmol/l 10,3

Citronensäure Monohydrat mmol/l 0,03

Tabelle 8: Konzentration im EK mit Additivlösung PAGGS-M

D-Glukose mmol/l 17,1

Natriumdihydrogenphosphat Dihydrat mmol/l 2,9

Dinatriumhydrogenphosphat mmol/l 2,9

Adenin mmol/l 0,5

Guanosin mmol/l 0,5

Natriumchlorid mmol/l 25,6

Tri-Natriumcitrat mmol/l 0,2

Citronensäure Monohydrat mmol/l 0,03

Mannitol mmol/l 19,5 Ergebnisse

Nach Herstellung hatten die Test- und Kontroll- Erythrozytenkonzentrate vergleich bare Werte für Volumen, Hkt und Hämoglobin pro Einheit (Tabelle 9).

Tabelle 9: Herstellungsdaten von aus UVC-bestrahltem Vollblut hergestellten Erythrozytenkonzentraten (EKs) gelagert in UG65 oder PAGGS-M (n=4)

Als wichtigster Qualitätsparameter für Erythrozytenkonzentrate war die Hämolyse rate der aus UVC-bestrahltem Vollblut gewonnenen Erythrozytenkonzentrate in UG65 deutlich erniedrigt im Vergleich zu den aus UVC-bestrahltem Vollblut ge wonnenen Erythrozytenkonzentraten in der herkömmlichen Additivlösung PAGGS- M (Fig. 14). Im Verlauf der Lagerung zeigten auch weitere Qualitätsparameter sig nifikante Unterschiede zwischen den Kontroll- und Test- Erythrozytenkonzentraten (Fig. 15 bis 17).

Fig. 14 zeigt die Hämolyserate im Verlauf der Lagerung von EKs gewonnen aus UVC-bestrahltem Vollblut, gelagert in UG65 und PAGGS-M.

Fig. 15 zeigt den ATP-Gehalt, Fig. 16 den Glukose-Gehalt und Fig. 17 den Laktat- Gehalt, jeweils am Ende der Lagerung (Woche 4).

Im Verlauf der Lagerung zeigte sich ein deutlicher Vorteil der neu entwickelten Ad ditivlösung UG65 für die Gewinnung von Erythrozytenkonzentraten aus UVC-be strahltem Vollblut. Die Qualität von EKs aus UVC-bestrahltem Vollblut in UG65 ist denen in der Additivlösung PAGGS-M überlegen.