Die vorliegende Erfindung betrifft einen Fibrinogen- haltigen Kleber, der zum Verkleben von biologischen Geweben, insbesondere menschlichen Körpergeweben, bestimmt ist. Die physiologische Wundheilung beruht auf einer kom¬ plexen, in mehreren Phasen ablaufenden Wechselwirkung zwischen Proteinen, Zellen und Korpuskeln des Blutes einer¬ seits und Strukturproteinen, Polysacchariden und Zellen des Gewebes andererseits und führt schliesslich zum Schluss der Oberfläche und zur Ausfüllung der Wunde mit Gewebe.

Zur Verbindung und Wiederherstellung von Gewebestruk¬ turen, die durch chirurgische Eingriffe, traumatische oder pathologische Einflüsse unterbrochen wurden, gelangen oft mechanische Massnahmen, wie z.B. Näh-, Klemm-, Nagel- und Schraubtechniken mittels natürlicher oder synthetischer, organischer oder anorganischer Hilfsmittel, zur Anwendung.

In neuerer Zeit wurden ausser diesen mechanischen Verfahren auch synthetische chemische Klebesysteme zur Verbindung von Geweben untersucht. Es gelangten vor allem Kunstharzkleber auf Basis von Polyacrylsäureestern, wie z.B. 2-Cyanoacrylsäure-isobutylester (Bucrylat TM), zur Anwendung.

Polyacrylkleber ergeben jedoch eine körperfremde, starre Klebezone, die sich nicht der Plastizität und Elastizität weicher Gewebe und Organe anpasst und durch mechanische Reizung Entzündungen verursacht. Die Anwendung derartiger Kunstharzkleber beschränkt sich darum heute auf den Bereich der Zahnmedizin und wenige spezielle orthopädisch-chirurgi¬ sche Indikationen.

Um die genannten Nachteile der Kunstharzkleber zu überwinden, wurde versucht, an der physiologischen Wundhei- lung beteiligte Proteine als Wundklebemittel einzusetzen. So setzt sich ein Handelsprodukt (Tissucol Kit, Immuno AG, Wien, Oesterreich) aus A) sogenanntem Cryopräzipitat von Humanblut, einem Gemisch von plasminogenhaltigem Fibrinogen, Fibronectin und als inaktives Proenzym vorliegendem Gerin- nungsfaktor XIII, B) Rinderthrombin, C) Aprotininlösung und D) Calciumchloridlösung zusammen. Die Komponenten A und B sind Lyophilisate, welche vor der Anwendung in Wasser, unter dosiertem Zusatz der Komponenten C bezw. D, gelöst werden. Die zähflüssige, 75 bis 115 mg gerinnbares Protein pro ml enthaltende Lösung A/C und die, je nach Anwendung, 4 bis 500 Einheiten Thrombin enthaltende Lösung B/D werden nun entwe¬ der simultan oder nacheinander auf die Wundfläche aufgetra¬ gen und polymerisieren gelassen. Das im System enthaltene Thrombin katalysiert die Abspaltung von Fibrinopeptiden (A und B) aus Fibrinogen und die Bildung von Fibrinmonomeren sowie die Aktivierung des fibrinstabilisierenden Faktors XIII. Je nach eingesetzter Thrombindosis entsteht innert weniger Sekunden bis einigen Minuten eine adhäsive, den Wunddefekt verschliessende Klebezone, welche je nach beige- mengter Aprotininkonzentration mehr oder weniger rasch fibrinolytisch abgebaut und aufgelöst wird.

Das in Klebesystemen enthaltene bovine Thrombin ist ein instabiles, hitzeempfindliches Enzym, in welchem weder durch physikalische noch durch chemische Massnahmen Viren und Prionen inaktiviert oder abgeschwächt werden können, ohne dessen Enzymaktivität zu zerstören, und welches darum Träger von boviner spongifor er Enzephalopathie (BSE) und von

säugetierpathogenen Viren sein kann. Bovines Thrombin ist ausserdem ein starkes Antigen, welches anaphylaktische Reaktionen im menschlichen Organismus auslösen kann. Humanes Thrombin ist zwar nicht antigen, birgt aber die Gefahr einer Übertragung von Hepatitis- und HIV-Viren in sich, da es wegen seiner Empfindlichkeit weder durch Hitzeeinwirkung noch durch chemische Massnahmen von Viren befreit werden kann. Im Blut liegt schliesslich ein Hemmstoff für Thrombin, das sogenannte Antithrombin III vor, welches das Thrombin des Klebers neutralisieren kann. Da dieser Thrombin-hemmende Effekt von Antithrombin III durch das Antikoagulans Heparin potenziert wird, kann ein thrombinhaltiger Kleber bei Patienten, die unter Heparinbehandlung stehen, nicht oder nur unter Einsatz grosser Thrombinkonzentrationen angewendet werden. Je höher aber die Thrombinkonzentration des Klebers, desto grösser ist das Risiko anaphylaktischer und thrombo- embolischer Reaktionen. Von der Klebestelle abwanderndes Thrombin löst im zirkulierenden Blut eine Aktivierung der Plättchen-Adhäsions-, Aggregations- und Freisetzungs-Reak- tionen aus und wirkt deshalb thrombogen. Um ein Risiko anaphylaktischer und thromboembolischer Komplikationen auf ein Minimum zu reduzieren, muss bei der Applikation throm¬ binhaltiger Wundkleber sorgsam darauf geachtet werden, dass Thrombin von nicht zu versorgendem Gewebe der Wundumgebung ferngehalten wird. Keinesfalls darf Thrombin in die Blutbahn gelangen, weil es durch seine vielfältige Aktivatorwirkung auf Blutplättchen, Plasmagerinnungsfaktoren und Endothel- zellen Thrombosen und Embolien auslösen kann. Auch bei sorgfältiger Applikation bildet jedoch die Klebestelle ein Thrombindepot, welches intravasale Gerinnung auslösen und gegen welches der Organismus immunologische Abwehrreaktionen richten kann. Thrombinhaltige Fibrinkleber sind aus diesen Gründen nur mit bedeutenden Einschränkungen anwendbar und eignen sich keinesfalls für einen Einsatz bei chirurgischen Eingriffen an Blutgefässen.

Schliesslich bedingt die geringe Haltbarkeit von gelöstem Thrombin dessen Verwendung in lyophilisierter Form,

was zu einer beachtlichen Verteuerung des Klebesystems führt und dessen Anwendung durch einen zusätzlichen Auflösungs¬ vorgang kompliziert.

Ein gemeinsamer Nachteil aller Kleber, deren koagu- lierbares Protein in Form von Cryopräzipitat eingeführt wird, liegt in ihrer zähflüssigen Konsistenz, welche eine präzise Applikation verun öglicht. Derartig zähflüssige oder pastöse Kleber eignen sich nicht für microchirurgische Anwendungen oder für Operationen, welche durch das Endoskop ausgeführt werden.

Es wurde nun versucht, die Nachteile thrombinhaltiger Fibrinkleber dadurch zu umgehen, dass man an Stelle von Thrombin ein Fibrinogen-spaltendes Enzym aus einem Schlan¬ gengift als Polymerisationsauslöser auf eine fibrinogen- haltige Cryopräzipitat-Lösung einwirken lässt. Im Gegensatz zu Thrombin, welches aus Fibrinogen die Fibrinopeptide A und B abspaltet und dadurch eine End-zu-End und Seite-zu-Seite Polymerisation von Fibrin auslöst, katalysieren aber diese Schlangengiftenzyme spezifisch die ausschliessliche Abspal- tung von Fibrinopeptid A unter Bildung eines fragilen, für Klebezwecke untauglichen Fibrins.

Überraschenderweise wurde jedoch gefunden, dass die mittels des Schlangengiftenzyms Batroxobin in Anwesenheit von Calciumionen ausgelöste Abspaltung von Fibrinopeptid A in einer Lösung von gereinigtem humanem Fibrinogen zur Entstehung eines Co-polymerisates mit hervorragenden bio¬ physikalischen Eigenschaften führt, wenn dem Gemisch akti¬ vierter Faktor XIII (Faktor Xllla) zugesetzt wird. Unter Verwendung von gereinigtem humanem Fibrinogen, gereinigtem humanem Fibronectin und gereinigtem, humanem aktiviertem Faktor XIII können Gemische mit verschiedenen Viskositäten und auch Lyophilisate, welche nach Auflösung dünnflüssige, einfach und präzis applizierbare Komponenten eines Klebe¬ systems liefern, hergestellt werden. Die vorliegende Erfindung betrifft einen Kleber zum Verkleben von menschlichen Körpergeweben, welcher (a) Fibrinogen,

(b) ein Fibrinogen-spaltendes Enzym,

(c) einen Calciumionen liefernden Stoff und

(d) Blutgerinnungsfaktor XIII enthält und dadurch gekennzeichnet ist, dass er den Blutge- rinnungsfaktor XIII in aktivierter Form (Faktor Xllla) und als Fibrinogen-spaltendes Enzym ein Fibrinogen-spaltendes Schlangengiftenzym enthält.

Fibrinogen-spaltende Schlangengiftenzyme können aus den Giften der Schlangenfamilie Viperidae gewonnen werden. Bis heute sind 27 Fibrinogen-spaltende Enzyme aus Schlangen¬ giften der Schlangenfamilie Viperidae isoliert und charak¬ terisiert worden (H. Pirkle and K. Stocker, Thrombin-like enzymes fro snake venoms: An inventory. Thromb. Hae ostas., in press). Zwei dieser Enzyme, Ancrod und Batroxobin, werden in der Humanmedizin als antithrombotische Arzneimittel zur therapeutischen Defibrinogenierung eingesetzt. Sie sind in Lösung sehr stabil, werden durch Antithrombin III auch in Anwesenheit von Heparin nicht gehemmt, sind für den mensch¬ lichen Organismus als sehr schwache Antigene gut verträglich und wirken spezifisch nur auf Fibrinogen ein. Andere Gerin¬ nungsfaktoren oder Thrombozytenfunktionen werden durch diese beiden Enzyme weder aktiviert noch gehemmt. Thromboemboli- sche Nebenwirkungen sind praktisch ausgeschlossen. Ferner besteht bei diesen von Reptilienarten stammenden Enzymen keine Kontaminationsgefahr durch Säugetier-pathogene Viren oder Prionen.

Der erfindungsgemässe Kleber eignet sich darum nicht nur zur Anwendung in den herkömmlichen Indikationen für Fibrinkleber, sondern auch bei endoskopischen Operationen beispielsweise im Gelenkbereich und im besonderen bei gefässchirurgischen Eingriffen.

Die Klebekapazität des erfindungsgemässen Klebers kann durch Zugabe von Fibronectin zu der Klebermischung wesent¬ lich erhöht werden. Es wurde ferner gefunden, dass die Festigkeit der Gewebeverklebungen beträchtlich verstärkt werden kann, wenn der Klebermischung ein Reduktionsmittel beigemengt wird.

Geeignete Reduktionsmittel sind vorzugsweise Thiolverbin¬ dungen wie Cystein, Dithiothreitol, Dithioerythrit, Gluta- thion, Thioredoxin oder ähnliche Verbindungen. Die verstär¬ kende Wirkung dieser Thiolverbindungen beruht möglicherweise auf ihrer stabilisierenden Wirkung auf die aktive, redu¬ zierte Form von Faktor Xllla und möglicherweise auch auf einer Auslösung von Disulfid-Austauschreaktionen im polyme- risierten Klebermaterial. Man kann beispielsweise Dithio¬ threitol in Konzentrationen von 0,1 - 1 mM pro Liter des Gesamtklebers verwenden.

Der Gerinnungsfaktor XIII wird vor der Zugabe zum Klebergemisch mittels Thrombin, Trypsin oder dem Schlangen¬ giftenzym Thrombocytin aktiviert. Die Aktivierung kann folgendermassen durchgeführt werden: 10 ml einer Lösung von 500 Einheiten Faktor XIII, in gepufferter (pH 7,4) 0,05 molarer Natriumchloridlösung werden mit 100 Einheiten Thrombin oder 20 Einheiten Thrombocytin inkubiert. Die zur Aktivierung von Faktor XIII verwendeten Enzyme werden vor¬ zugsweise durch Fixierung an einen unlöslichen Träger, wie z.B. Sepharose 4B (Pharmacia, Schweden), insolubilisiert. Nach vollendeter Aktivierung können die insolubilisierten Enzyme einfach durch Zentrifugation oder Filtration vom aktivierten Faktor XIII abgetrennt werden.

Die in Lösung gut haltbaren Schlangengiftenzyme brau- chen nicht lyophilisiert zu werden, was die Anwendung des Klebers vereinfacht und seine Gestehungskosten reduziert. Die Fibrinogen-spaltenden Schlangengiftenzyme können in wässrigen Elektrolytlösungen, z.B. in Natriumchlorid- oder Calciu chloridlösungen, gelöst werden. Weil die ohnehin nur wenig antigenen Schlangengiftenzyme durch Antithrombin selbst in Anwesenheit von Heparin nicht gehemmt werden, können sie sogar bei Patienten, die unter Heparinbehandlung stehen, in sehr niedriger Dosis eingesetzt werden, wodurch die Gefahr anaphylaktischer Reaktionen praktisch ausge- schlössen wird. Da schliesslich die Schlangengiftenzyme weder die endogene oder exogene Prothro binaktivierung bewirken noch die Adhäsions-, Aggregations- und

Freisetzungsreaktionen bei Blutplättchen auslösen, ist bei der Anwendung des erfindungsgemässen Klebers auch eine Gefahr thromboembolischer Komplikationen ausgeschlossen.

Als Ausgangsmaterial zur Gewinnung Fibrinogen-spalten- der Schlangengiftenzyme eignen sich die Giftdrüsensekrete von solenoglyphen Schlangen (also solchen mit beweglichen, röhrenförmigen Giftzähnen), die der Familie der Vipern (Viperidae), insbesondere dem Tribus der Grubenottern (Crotalinae) angehören. Insbesondere eignet sich das Gift der Bothrops atrox, der Bothrops moojeni und der Callose- lasma (Agkistrodon) rhodostoma, aus welchem die bereits in der Humanmedizin anwendbaren Fibrinogen-spaltenden Enzyme Batroxobin und Ancrod hergestellt werden (Stocker, K. Defibrinogenation with thro bin-like snake venom enzymes, in Fibrinolytics and Antifibrinolytics, Markwardt, F., Ed., Springer-Verlag, Berlin, 1978, 451).

Die im erfindungsgemässen Kleber verwendeten humanen

Proteine Fibrinogen und Faktor XIII werden aus Blut von kontrollierten Spendern gewonnen und durch an sich bekannte chemische und physikalische Verfahren zur Virusinaktivierung behandelt.

Der erfindungsgemässe Kleber kann im gebrauchsfertigen

Zustand beispielsweise 2 bis 40 mg Fibrinogen pro ml, 0,5 bis 10 mg Fibronectin pro ml, 0,4 bis 2 Einheiten aktivier- ten Faktor XIII pro ml, 5 bis 20 mMol Calciumchlorid pro L,

0,1 mMol Natriumchlorid pro L, 0,05 mMol Pufferionen pro L, z.B. Tris-hydroxymethylaminomethan (TRIS), und 1 bis 100

KIE-Einheiten Aprotinin pro ml enthalten. Unmittelbar vor der Applikation solcher Gemische auf zu verklebendes Gewebe wird die Polymerisation und Gelierung des Fibrinogens durch

Zusatz einer wässrigen Batroxobinlösung ausgelöst. Die

Batroxobinkonzentration der Lösung wird derart eingestellt, dass der gebrauchsfertige Gesamtkleber 5 - 100 Einheiten

Batroxobin enthält. Mit Batroxobinmengen von 10 bis 50 Einheiten pro ml Klebergemisch werden Gelierungszeiten von

10 bis ^' 30 Sekunden erzielt.

Der erfindungsgemässe Kleber kann beispielsweise aus drei separaten, bei Gebrauch des Klebers zu mischenden ampullierten Komponenten zusammengesetzt sein. .Ampulle 1 enthält 20 mg Fibrinogen, 1 mg Fibronectin, 1 Einheit (KIE) Aprotinin und 1 Einheit aktivierten Faktor XIII in lyophi- lisierter Form. Ampulle 2 enthält 1 ml 0,02 molare Calcium- chloridlösung, die als Lösungsmittel für den Inhalt der Ampulle 1 dient. Ampulle 3 enthält 0,2 ml einer wässrigen Lösung, die 50 Batroxobin-Einheiten und 4 μg Dithiothreitol pe ml enthält. Bei Gebrauch des Klebers wird der Inhalt der Ampulle 1 im Inhalt der Ampulle 2 gelöst. Die Lösung wird in eine sterile Injektionsspritze aufgesogen. In eine zweite Injektionsspritze wird die Lösung aus Ampulle 3 aufgenommen. Man trägt die Inhalte beider Spritzen simultan auf die zu verklebenden Gewebeflächen und vereinigt die letzteren unter angemessener Kraftanwendung.

Die Eigenschaften der erfindungsgemässen Klebergemische können einerseits durch chemische und physico-chemische Prüfungen des erzeugten Fibrins und andererseits durch Messungen mechanischer Parameter, wie Steifheit, Zugfestig¬ keit und Adhäsivität des Klebers gegenüber verschiedenen Geweben untersucht werden.

Chemische Methoden zur Untersuchung der Klebereigen¬ schaften beinhalten die Bestimmung der Proteinmasse durch Aminosäurenanalyse und des Quervernetzungsgrades durch elektrophoretische Prozeduren. Durch turbido etrische Messungen und durch Bestimmung der Permeabilität nach Blombäck et al. (Biochim. Biophys. Acta 997. 96-110, 1989) können die Porosität und die mittlere Dicke der Fibrinfasern in Polymerisaten verschiedener Klebergemische ermittelt werden.

Zur Messung der mechanischen Eigenschaften von Kleber¬ gemischen wurde die nachfolgend beschriebene neue Methode entwickelt: Eine kreisförmige Scheibe eines ausgewählten biologischen Gewebes wird auf das eine Ende eines MetallZy¬ linders montiert. Dieses Zylinderende ist mit einem Metall¬ netz von definierter Maschenweite bedeckt, um die

aufgebrachte Gewebeprobe daran zu hindern, in den Zylinder hineinzugleiten. Das andere Zylinderende ist mit einer dichten Metallplatte hermetisch verschlossen. Auf die gleiche Weise wird eine zweite kreisförmige Scheibe dessel- ben biologischen Gewebes auf einen zweiten Metalizylinder montiert. Der zu prüfende Kleber wird nun auf die freilie¬ gende Oberfläche der einen Gewebescheibe appliziert, worauf die beiden auf ihren Metalizylindern montierten Gewebe¬ scheiben fest gegeneinander gepresst werden. Nach erfolgter Polymerisation des Fibrinogens werden beide Zylinder unter Vakuum gesetzt, wodurch die beiden Gewebeproben mit be¬ kannter Kraft gegen die auf den Zylinderenden angebrachten Metallnetze gesogen werden. Dann wird auf beide Metalizy¬ linder eine Zugkraft bei konstanter Geschwindigkeit ausgeübt und die Zugbewegung über eine mit dem System verbundene Kraftmesszelle digital und graphisch registriert. Diese Aufzeichnungen objektivieren die mechanischen Eigenschaften der zwischen dem biologischen Gewebe und dem Kleber ent¬ standenen mechanischen Verbindung. Zur Bestimmung der mechanischen Eigenschaften des Klebers selbst gelangt das selbe Testprinzip zur Anwendung, jedoch werden die Gewebe¬ proben durch kreisförmige Scheiben aus polymerisiertem Kleber ersetzt.

Beispiel 1

Es wurde eine aus 3 separaten Komponenten bestehende Kleberkombination in der nachfolgend beschriebenen Weise hergestellt:

Komponente I: 2 g plasminogenfreies, menschliches Fibrino¬ gen, 0,1 g menschliches Fibronectin, 100 Einheiten Faktor Xllla und 100 Kallikreininhibitor-Einheiten (KIE) Aprotinin wurden in 100 ml einer wässrigen, sterilen, pyrogenfreien Pufferlösung, die 0,05 Mol pro L Tris-hydroxymethylaminome- than, 0,1 Mol pro L Natriumchlorid und 1 mMol pro L Ethy- lendiamintetraessigsäure enthielt und ein pH von 7,4 auf- wies, aufgelöst. Die Lösung wurde durch einen

Membran-Bakterienfilter mit einer Porengrösse von 0,2 μ sterilfiltriert, unter sterilen Bedingungen in Portionen von je 1,0 ml in 10 ml-Ampullen abgefüllt und unter sterilen Bedingungen lyophilisiert. Die Ampullen wurden anschliessend verschweisst.

Komponente II: Als Lösungsmittel für die lyophilisierte Komponente I wurde eine wässrige 0,02 molare Calciumchlo- ridlösung zubereitet. Die Lösung wurde durch einen Membran¬ filter faserfrei filtriert, in Ampullen zu je 1 ml abgefüllt und während 30 Minuten im Autoklaven bei 120 ^" c sterilisiert. Komponente III: Zur Aktivierung der durch Auflösung von Komponente I in Komponente II erhaltenen, Calciumionen enthaltenden Proteinlösung wurden zwei Batroxobinlösungen (lila und Illb) mit zwei die Polymerisation des Fibrinogens unterschiedlich schnell katalysierenden Batroxobinkonzen- trationen verwendet. Zur Erzielung einer langsamen Polyme¬ risation bestand die Komponente lila aus 0,2 ml einer sterilen wässrigen Lösung von 10 Einheiten Batroxobin und 4 μg Dithiothreitol pro ml und zur Erzielung einer schnellen Polymerisation enthielt Komponente Illb 0,2 ml einer Lösung von 50 Einheiten Batroxobin und 4 μg Dithiothreitol pro ml. Die Batroxobin/Dithiothreitol-Lösungen lila und Illb wurden durch Sterilfiltration sterilisiert und unter aseptischen Bedingungen in Ampullen mit je 0,2 ml abgefüllt. Bei Gebrauch des Klebers löste man die Komponente I (Lyophilisat) in der Komponente II (Lösungsmittel) und gab der Lösung die Komponente III zu. Der gebrauchsfertige Kleber enthielt pro ml 0,0167 g Fibrinogen, 0,0008 g Fibro- nectin, 0,833 Einheit Faktor Xllla, 0,833 KIE Aprotinin, 0,0018 g CaCl_, 8,333 bzw. 33,333 Einheiten Batroxobin und 0,66 μg Dithiothreitol.

Beispiel 2

Es wurde die Wirkung von Thrombin und Batroxobin auf Fibrinogen in Anwesenheit bzw. Abwesenheit von Faktor Xllla untersucht.

Eine Lösung von Faktor XHI-haltigem Fibrinogen (1,5 mg/ml in TNE-Puffer enthaltend 0,05 Mol TRIS, 0,1 Mol NaCl und 1 mMol EDTA pro L) wurde in Gegenwart von Calciumchlorid (20 mMol pro L Reaktionsgemisch) während 15 Stunden mit ₅ Thrombin bzw. Batroxobin inkubiert. Das entstandene Gerinn¬ sel wurde durch Turbiditäts- und Viskositätsmessungen geprüft. Die Porosität, (μ), das Verhältnis Fasermasse zu Faserlänge und Faserdurchmesser, wurde berechnet. In denje¬ nigen Experimenten, in welchen die Gerinnung mittels Batro- ₀ xobin ausgelöst wurde, setzte man dem Reaktionsgemisch aktivierten Faktor XIII (FXIIIa) zu. Die Ergebnisse der Turbiditäts- und Viskositätsmessungen, ausgedrückt durch die errechnete Gerinnselporosität (μ) sind in Tabelle I zusam¬ mengestellt.

5 Tabelle I

Probe Thrombin Batroxobin FXIIIa Einheiten Einheiten Einheiten Dalton/

/ml /ml // _/ mmll-i c-—m x" 1,0„-12

(zugesetzt)

0 Fbg + Ba 0

Fbg + Ba + FXIIIa 0

Fbg + Ba + FXIIIa 0

Fbg + Thr 1

Fbg = Fibrinogen, Ba = Batroxobin, Thr = Thrombin, Fibri- 5 nogen enthielt 0,4 Einheiten FXIII pro ml.

Die in Tabelle I zusammengestellten Versuchsergebnisse zeigen, dass die Porosität (μ = Verhältnis Fasermasse zu Faserlänge und Faserdurchmesser) der mittels Batroxobin erhaltenen Gele kleiner ist als diejenige der mittels _Q Thrombin erhaltenen Gele und dass durch Zugabe von Faktor Xllla die Porosität der mittels Batroxobin erhaltenen Gele

wesentlich verringert wird und dadurch die Gele verdichtet sind.

Beis iel 3

Verklebunσ von Endotheloberflachen - Einflug? Y£D Fifrri- noσen. Fibronectin und Faktor Xllla auf die maximale Zugfe¬ stigkeit

Endothelproben wurden aus Schweineaorta gewonnen.

₂ Scheiben von 1 cm Durchmesser wurden aus der Aortawand herausgeschnitten. 100 μl von mit Batroxobin aktiviertem Kleber (Tabelle II) wurden auf die Endotheloberflache einer Scheibe aufpipettiert, worauf sofort eine zweite Aorta¬ scheibe auf die Kleberschicht derart aufgebracht wurde, dass deren Endotheloberflache dem Kleber zugekehrt war. Nachdem der auf diese Weise zubereitete Aorta-Kleber-Aorta- ^M Sand- wich" während einer Stunde bei Raumtemperatur aufbewahrt worden war, wurde die Zugfestigkeit (N/cm ) der Klebestelle gemessen. Die spezifische Zusammensetzung der Kleberproben bezüglich Fibrinogen, Fibronectin, FXIIIa und aktivierendes Enzym ist in Tabelle II angegeben. In allen Fällen (mit Ausnahme des Kontrollversuches) wurden dem Kleber Calcium¬ chlorid in einer Endkonzentration von 20 mMol pro L und Dithiothreitol in einer Konzentration von 0,5 mMol pro L zugesetzt. Für den Kontrollversuch wurden Aortascheiben ohne

Kleber vereinigt. Bei der Prüfung des Verklebungsvermögens 2 (N/cm ) wurde nachgewiesen, dass Fibrinogen, Fibronectin und

FXIIIa wesentliche Komponenten des mittels Batroxobin polymerisierten Klebers darstellen und dass das Endothel-

Verklebungsvermögen dieser Mischung mindestens ebenso gut ist wie dasjenige des mittels Thrombin aktivierten Klebers.

Tabelle II

Zusammensetzung des Klebers Max. Zug¬ Versuch Fbg FN FXIIIa Ba Thr festigkeit mg/ml mg/ml Einhei- Einhei- Einhei¬ (N/cm ² ) ten/ml ten/ml ten/ml

Fbg = Fibrinogen, FN = Fibronectin, Ba = Batroxobin, Thr = Thrombin

Beispiel 4

Verklebunα von Haut - Einfluss der Variation der Fibrinogen- 5 und Dithiothreitol-Konzentration auf die maximale Zugfe¬ stigkeit

Zur Durchführung dieser Versuche wurde Schweinehaut verwendet. Anästhesierten Schweinen wurden mittels eines Dermatoms 1 mm dicke Hautlappen entnommen, aus welchen o Scheiben ausgeschnitten wurden. Die Scheiben wurden wie in Beispiel 3 beschrieben zusammengeklebt, wobei mittels Batroxobin aktivierte Klebergemische mit unterschiedlicher Fibrinogen- und Fibronectinkonzentration, ohne bzw. mit Dithiothreitol (DTT, Endkonzentration 0,5 mM) zu Prüfung 5 gelangten. Bei den in Tabelle III zusammengefassten Ver¬ suchen betrug die Gerinnungszeit des aktivierten Klebers 30 bis 40 Sekunden. Die Klebefestigkeit, ausgedrückt als

2 maximale Zugfestigkeit (N/cm ), wurde geprüft.

Tabelle III

Ver¬ Fbg DTT FN FXIIIa Ba Ma . Zug- such mg/ml mM mg/ml Einhei- Einhei- festigkeit ten/ml ten/ml (N/cuT)

Fbg = Fibrinogen, DTT = Dithiothreitol, FN = Fibronectin, Ba = Batroxobin