Die Herzleistung ist von wesentlicher Bedeutung für die Gesundheit und für die Leistungsfähigkeit des Menschen.

Zahlreiche Herzerkrankungen sind mit einer Herabsetzung der Pumpleistung des Herzens verbunden, die zu erheblichen Belastungen des Patienten führen und außerdem eine der Haupttodesursachen sind. Es ist daher von großem Interesse, auch für eine effektive Gestaltung des Gesundheitswesens, die Leistung des Herzens auf dem notwendigen Stand zu halten und ggf. zu erhöhen.

Die Muskelkontraktion und die Zellbewegung des Herzens wird durch das Motorprotein Myosin durch zyklische Interaktion mit Aktin und Hydrolyse von ATP bewirkt. Myosin ist ein Hexamer aus zwei schweren (MHC) und 4 leichten Ketten, 2 sog. essentielle (MLC-1) und zwei regulatorische (MCL-2). Im Humanherzen werden verschiedene Isoformen der leichten Myosinketten quasi gewebespezifisch exprimiert, nämlich atrium-spezifische (ALC-1 bzw. ALC-2) und ventrikelspezifische (VLC-1 und VLC-2). Die dreidimensionale Struktur der MHC und die Assoziation der MHC mit den MLC wurden vor kurzem aufgeklärt (Rayment et al., 1993). Die MHC hat ein Molekulargewicht von etwa 200 kDa und besteht aus einer aminoterminalen globulären Domäne, in der sich das Aktinbindungszentrum und das katalytische (ATPase-) Zentrum befinden, und einer etwa 150 nm langen fadenförmigen carboxyterminalen Domäne. Die Bindung der Myosin-Leichtkette l (MLC-1) an den C-Terminus von Aktin ist für die Bewegung des Herzens notwendig, belastet jedoch die Querbrücken und führt dadurch prinzipiell zu einer Verminderung der Leistung.

Die Erfindung hat das Ziel, eine Mittel zur Steigerung der Herzkraft zur Verfügung zu stellen. Ihr liegt die Aufgabe zugrunde, die Querbrücken zu entlasten und damit eine Leistungssteigerung des Herzmuskels zu erreichen.

Das Ziel der Erfindung wird gemäß den Ansprüchen 1 und 8 erreicht, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.

Das erfindungsgemäße Mittel zur Steigerung der Herzkraft ist dadurch gekennzeichnet, daß es ein Peptid der allgemeinen Formel I MAPKKPEPKKXYAK (I) umfaßt in welcher X = E oder D und Y = A oder D bedeuten, oder Teile davon oder durch Punktmutationen an einer Stelle veränderte Varianten dieses Peptids.

Eine bevorzugte Variante des Mittels ist gekennzeichnet durch ein Dekamer der Sequenz KPEPKKXYAK, wobei X und Y die oben genannte Bedeutung haben.

Spezielle Ausführungsformen der Erfindung sind Mittel, die die Peptide KPEPKKEAAK und KPEPKKDDAK enthalten.

Zur Erfindung gehören auch Mittel, enthaltend Peptide der Formel I bzw. ihre Dekamere (5-14) mit einer Mutation in Anfangs-oder in Endstellung.

Im Schutzbereich der Erfindung liegen auch die Peptid als solche, d. h. alle Peptide der allgemeinen Formel I MAPKKPEPKKXYAK (I) in welcher X = E oder D und Y = A oder D bedeuten, oder Teile davon oder durch Punktmutationen an einer Stelle veränderte Varianten dieser Peptide. Bevorzugt sind Dekamere der Sequenz KPEPKKXYAK, wobei X und Y die oben genannte Bedeutung haben, sowie speziell die Peptide KPEPKKEAAK und KPEPKKDDAK. In allen Fällen sind Mutationen an einer Stelle des Peptids, bevorzugt in Anfangs-oder Endstellung, eingeschlossen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, anstelle der erfindungsgemäßen Peptide Gene einzusetzten, die für diese und analoge Peptide kodieren.

Neben Peptiden, welche die aminoterminalen Domänen der leichten kardialen Myosinketten imitieren werden also Plasmide konstruiert, die -die atriale leichte Myosinkette (hALC-1) des Humanherzen und -mindestens die ersten 15 Aminosäuren der ventrikulären leichten Myosinkette (hVLC-1/1-15) bzw. mindestens die ersten 15 Aminosäuren der atrialen leichten Myosinkette (hALC-1/1- 15) des Menschen kodieren.

Diese Konstrukte werden in gentechnologischen Experimenten eingesetzt. Die therapeutische Expression der hALC-l im Ventrikel imitiert und unterstützt den zelleigenen Anpassungsmechanismus und verbessert die Ventrikelfunktion.

In solchen gentechnologischen Ansätzen werden ferner auch die Minigene, die nur für die ersten 15 Aminosäuren der hVLC-1 bzw. hALC-1 kodieren, eingesetzt. Dies führt zur zelleigenen Produktion der Light-Chain Peptide, die dann über eine Hemmung der Aktin-Light-Chain-Interaktion die Ventrikelfunktion steigern.

Im folgenden werden dazu nähere Erläuterungen gegeben.

1) Konstrukt mit der atrialen leichten Myosinkette (hALC-1) des Humanherzen Hierbei handelt es sich um Plasmide, in denen h-ALC-1 cDNA vor einen herzspezifischen Promoter kloniert wird. Downstream schließt sich ein Polyadenylierungssignal an.

2) Minigene, welche die ersten 15 N-terminalen Aminosäuren der h-ALC-1 und h-VLC-1 kodieren Beide Minigene werden wie in 1) erzeugt. Allerdings wird nicht die gesamte cDNA der leichten Myosinketten in die Plasmide zwischen herzspezifischen Promoter und Polyadenylierungssignal kloniert, sondern lediglich die cDNA, welche die ersten 15 Aminosäuren der hVLC-1 und hALC-1 kodieren.

Zu 1) Beispiel für die Erzeugung des hALC-1 Konstruktes (paMHC-hALC-1) Teile der Promoterregion der schweren alpha-Myosinkette (- 614-+425) wurden in die Multikloningsite von pBluescript II SK kloniert. Downstream wurde eine hALC-1 cDNA dann vor den alpha-Myosinpromoter kloniert (-82-+768) und danach ein Polyadenylierungssignal (SV40IntronpA) eingesetzt. Das Konstrukt ist schematisch (Abbildung 3) gezeigt. Es wurde bereits vollständig sequenziert (siehe Sequenz und Klonierungskarte).

CAAAATGAATGCCCTCCCTGGACATCATGACTTTGTCCCTGGGGAGCCAGCACTGTG GAA<BR> GTTTTACTTACGGGAGGGACCTGTAGTACTGAAACAGGGACCCCTCGGTCGTGACACCTT 70 80 90 100 110 120 CTCCAGGTCTGAGAGTAGGAGGCACCCCTCAGCCTGAAGCTGTGCAGATAGCTAGGGTGT GAGGTCCAGACTCTCATCCTCCGTGGGGAGTCGGACTTCGACACGTCTATCGATCCCACA 130 140 150 160 170 180 <BR> <BR> P. 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GCTCCCAAGGAACCTGCCTTTGACCCCAAGAGTGTAAAGATAGACTrCACTGCCGACCAG <BR> CGAGGGTTCCTTGGACGGAAACTGGGGTTCTCACATTTCTATCTGAAGTGACGGCTGGTC 1270 1280 1290 1300 1310 1320 <BR> <BR> ATTGAAGAGTTCAAAGAGGCCTTTTCATTGTTTGACCGGACCCCGACTGGAGAGATGAAG <BR> TAACTTCTCAAGTTTCTCCGGAAAAGTAACAAACTGGCCTGGGGCTGACCTCTCTACTTC 1330 1340 1350 1360 1370 1380 <BR> <BR> ATCACCTACGGCCAGTGCGGGGATGTACTGCGGGCCCTGGGCCAGAACCCTACCAATGCC TAGTGGATGCCGGTCACGCCCCTACATGACGCCCGGGACCCGGTCTTGGGATGGTTACGG 1390 1400 1410 1420 1430 1440 <BR> <BR> GAGGTGCTGCGTGTGCTGGGCAAGCCCAAGCCTGAAGAGATGAATGTCAAGATGCTGGAC <BR> CTCCACGACGCACACGACCCGTTCGGGTTCGGACTTCTCTACTTACAGTTCTACGACCTG 1450 1460 1470 1480 1490 1500 <BR> <BR> TTTGAGACGTTCTTGCCCATCCTGCAGCACATTTCCCGCAACAAGGAGCAGGGCACCTAT <BR> AAACTCTGCAAGAACGGGTAGGACGTCGTGTAAAGGGCGTTGTTCCTCGTCCCGTGGATA 1510 1520 1530 1540 1550 1560 <BR> <BR> GAGGACTTCGTGGAGGGCCTGCGTGTCTTTGACAAGGAGAGCAATGGCACGGTCATGGGT CTCCTGAAGCACCTCCCGGACGCACAGAAACTGTTCCTCTCGTTACCGTGCCAGTACCCA 1570 1580 1590 162-^ 1610 1620 <BR> <BR> 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TTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTTAACCAATAGGCC <BR> AAAACAATTTTAAGCGCAATTTAAAAACAATTTAGTCGAGTAAAAAAATTGGTTATCCGG 2350 2360 2370 2380 2390 2400 <BR> <BR> GAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTT<BR> CTTTAGCCGTTTTAGGGAATATTTAGTTTTCTTATCTGGCTCTATCCCAA 2410 2420 2430 2440 2450 Zu 2) Anstelle der kodierenden Sequenz der hALC-1 in paMHC- hALC-1 wird ein synthetisches Oligonucleotid der Sequenz kloniert, das der kodierenden Sequenz Aminosäuren 1-15 der hALC-1 entspricht und die folgende Sequenz besitzt : AGCTTGCCACCATGGCTCCCAAGAAGCCTGAGCCTAAGAAGGAGGCAGCCAAGCCATGAA Desweiteren wird ein Konstrukt erzeugt, das Anstelle der kodierenden hALC-1 Sequenz in paMHC-hALC-1 die kodierende Sequenz der ersten 15 Aminosäuren der hVLC-1 besitzt : AGCTTGCCACCATGGCCCCCAAAAAGCCAGAGCCCAAGAAGGATGATGCCAAGGCATGAA Die Wirkung des erfindungsgemäßen Mittels wird nachfolgend näher dargestellt.

Gemäß der Erfindung wurde ein in vitro Aktin-Bindungsassay entwickelt, bestehend aus Aminohexylagarose, das mit einem synthetischen Peptid entsprechend der N-terminalen Aktin Bindungsdomäne 4-14 von VLC-1 kovalent gekoppelt wurde, vorinkubiert mit freiem ALC-1 oder VLC-1 Peptiden (oder den entsprechenden scrambled Peptiden), um ein Gleichgewicht zwischen gebundenem und freiem Aktin zu erhalten. Der Gleichgewichtskomplex wird dann mit dem Affinitätsgel inkubiert, das das freie G-Aktin bindet. Die Vorhersage war, daß in der Gleichgewichtsreaktion mit niederer Affinität Peptiden eine höhere Fraktion von freiem G-Aktin existiert, welches durch nachfolgende Inkubation mit dem Affinitätsgel bestimmt werden kann.

Es wurde demonstriert, daß G-Aktin an Affinitätsgel bindet.

Damit ist zum 1. Mal gezeigt, daß die N-terminale Sequenz 4- 14 von human cardiac VLC-1 tatsächlich mit Aktin reagiert.

Vorinkubation von G-Aktin mit dem N-terminalen Peptid 5-14 von VLC-1 verhindert die Aktin-Bindung an das Affinitätsgel bei einer Peptidkonzentration von etwa 1UM. Das entsprechende scrambled Peptid war bei der selben Konzentration ohne Effekt, was zeigt, daß die Bindung des N-terminalen MLC-1 Peptids hochspezifisch ist. Der wichtigste Befund liegt darin, daß sich die Aktinaffinität der N-terminalen Peptide 5-14 von ALC-1 und VLC-1 unterscheidet : im gewählten Assaysystem war die halb-maximale effektive Dosis von P5-14 von VLC-1 0,32 pM, während die halb-maximale effektive Dosis von P5-14 von ALC-1 0,71M war. Daraus ist abzuleiten, daß die Aminosäuren 7 und 8 des MLC-1 die Affinität des N- Terminus von MLC-1 zu Aktin regulieren. Das unterstützt die Hypothese, daß die höhere Querbrückenkinetik in Gegenwart von ALC-1 auf der schwachen Aktin-Bindung seines N-Terminus beruht. Deshalb übt ALC-1 eine schwächere Last auf die Querbrücke aus als VLC-1, und erhöht seine Kinetik und seine Kraftentwicklung.

Zusammenfassend zeigen die in den Ausführungsbeispielen näher erläuterten Daten, daß die Interaktion zwischen den N- terminalen Domänen von ALC-1 mit Aktin die Querbrückenkinetik und die Kraft pro Querbrücke fördert, was den Kontraktilitätsstatus des menschlichen Herzens verbessert.

Die Erfindung soll nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

Aktinreinigung Aktin wurde aus Kaninchen psoas (Pardee JD et al. (1982) In : Methods in Enzymology Vol 85, pp 164-182, Academic Press, New York, London) gewonnen. Lyophilisiertes Aktin (100 mg) wurde in 3 ml Aktinpuffer, enthaltend 5 mM Hepes, pH 7,5,1 mM ATP, 0,2 mM CaCl2,0,5 mM NaN3 suspendiert und durch einen Glas- Teflon-Homogenisator homogenisiert. Nachfolgende Zentrifugation bei 200 000 g in 1 Stunde ergab G-Aktin im Überstand. Die Konzentration wurde durch Messung der optischen Dichte bei 290 nm : 0,63 = lmg/ml geschätzt.

Synthetische Peptide Die N-terminalen Säuresequenzen 5-14 von VLC-1 (KPEPKKDDAK) und ALC-1 (KPEPKKEAAK) (humane Herzsequenz) (Kurabayashi M et al. (1988) J. Biol. Chem. 263 : 13930-13936) und die entsprechenden scrambled Peptide (PKDKEAKPKD) für VLC-1 und PKEKEAKPKA für ALC-1) wurden in einer Reinheit von 98 % hergestellt (bestimmt durch HPLC und Massenspektroskopie).

MLC Affinitätsgel Ein synthetisches Peptid mit der N-terminalen Sequenz 4-14 (KKPEPKKDDAK) von VLC-1 wurde kovalent an ein Agarosegel gekoppelt. Um diese Kopplung zu erreichen, wurde das Peptid mit einem N-terminalen Monochlor-acetyl-glycyl-Rest synthetisiert. Dieses Peptid wurde dann an aktivierte w- Aminohexylagarose über Aktivierung durch 2-Iminothiolane- Hydrochloride immobilisiert wie beschrieben (Calovini T. et al. (1995) J. Cell Biochem. 59 : 69-78). Die Kopplungsreaktion wurde in Phosphat-gepufferter Saline (PBS, pH 7,4) innerhalb von 3 Stunden bei Raumtemperatur und einer Peptid- konzentration von 6 mg/ml gepacktem Gel durchgeführt. Das Peptid-Harz wurde dann für 1 Stunde mit 5 ml von 40 mM Jodacetamid inkubiert, um die verbleibenden aktiven Gruppen zu blockieren. Das MLC Affinitätsgel wurde gründlich mit PBS gewaschen und in Gegenwart von 1 % bovinem Serum-Albumin und 0,02 % Natrium aufbewahrt.

Aktinbindung an Affinitätsgel MLC Affinitätsgele (15 Ml des Gels) werden mit 50 Ug G-Aktin in einem Endvolumen von 500 Al Aktinpuffer für 1 Stunde bei +4 °C in einem rotierenden Kolben inkubiert. Vergleichs- Experimente werden durch Inkubation verschiedener Konzentrationen von ventrikulärem MLC Peptid 5-14 des atrialen MLC Peptids 5-14 oder der entsprechenden scrambled Peptide mit G-Aktin für 12 Stunden bei +4 *C vor Bindung an das Affinitätsgel für 1 Stunde bei +4 C wie oben beschrieben, durchgeführt. Nach der Aktinbindung wird das Gel dreimal mit Aktinpuffer gewaschen, mit 20 ml SDS Puffer (5% SDS, 50 mM Tris-HCL, pH 7,5,250 mM Sucrose, 75 mM Harnstoff, 60 mM ß-Mercaptoethanol) extrahiert und für 2 min auf 95 C erhitzt. Die erhaltenen Überstände werden weiter mit SDS-PAGE behandelt, während das Affinitätsgel verworfen wird.

SDS-PAGE und Immunoblot Analyse Proben werden elektrophoretisch auf 8% Polyacrylamidgelen bei 4 C für 3 Stunden getrennt und auf Nitrozellulose (Hybond-C, 45 pm, Amersham, Germany) in einen Puffer gebracht, der 40 mM Tris, 300 mM Glycin, 0,01% SDS und 20% (V/V) Methanol enthält. Die Blots werden dann mit dem monoklonalen Antikörper gegen a-sarcomerisches Aktin (Sigma, München, Germany) in einer Lösung von 1 : 500 für 90 min und dem zweiten Peroxidase-konjugierten Antikörper (Anti-Maus IgG, BioGenes, Germany diluted 1 : 10.000) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die 43-kDa Aktin-Bande wurde durch einen verstärkten Chemolumineszenz-Reaktions-Kit (Amersham, Germany) auf einem Röntgenfilm sichtbar gemacht.

Statistische Analyse Die statistische Analyse wurde mit dem kommerziell erhältlichen statistischen Programm Instat2 auf einem IBM kompatiblen PC (Mittel, Standard deviation (SD), Students's t-Test für unpaare Werte). Alle Werte sind als Mittel SEM ausgedrückt.

Ergebnisse 1. Bindung von G-Aktin an Affinitätsgel Wie in Abbildung 1 gezeigt, bindet das synthetische Peptid entsprechend der N-terminalen VCL-1 Sequenz 4-14, kovalent gebunden an Aminohexylagarose, G-Aktin in einer zeitabhängigen Weise. Bei +4 C konnte maximale Aktinbindung nach einer Stunde gemessen werden. Unter den selben experimentellen Bedingungen wurde keine G-Aktin-Bindung an die Aminohexylagarose-Matrix allein beobachtet.

2. Bindung von N-terminalem ALC-1 und VLC-1 an G-Aktin Zur Demonstration, daß Peptide, abgeleitet von den N- terminalen Domänen 5-14 (P5-14) von ALC-1 und VLC-1, G-Aktin mit verschiedener Affinität binden, wurde G-Aktin mit verschiedenen Peptid-Konzentrationen für 12 Stunden bei +4 °C vor der Inkubation mit dem Agarosegel inkubiert. Verschiedene Peptidaffinitäten sollten verschiedene Fraktionen von ungebundenen G-Aktin Konzentrationen ergeben, welche nachfolgend von den Affinitätsgelen abgetrennt und im Western-blot nachgewiesen werden können.

Vorinkubation von G-Aktin mit 1 pM von P5-14 von VLC-1 gesättigtem Aktin Interaktionsorte verhindern dabei die nachfolgende Bindung an die Affinitätsgele (Abbildung 2). Das entsprechende VLC-1 scrambled Peptid (3 ßM) bindet nicht an Aktin. Die Western-blots in Abbildung 2 zeigen, daß das G- Aktinsignal, erhalten nach Inkubation mit 3 MM scrambled Peptid, ungefähr das gleiche war wie das G- Aktinbindungssignal allein (siehe die Gele Nr. 5 und 7 in Abbildung 2a). Diese Resultate weisen darauf hin, daß die Bindung der N-terminalen Domäne 5-14 von VLC-1 zu Aktin ortsspezifisch ist. Halbmaximale effektive Dosierung von VLC- 1 Peptid war pM (6 verschiedene Experimente, Abbildung 2b).

Wahrscheinlich entfernt die N-terminale Sequenz 5-14 das G- Aktin aus der Gleichgewichtsreaktion in einer konzentrations- abhängigen Weise, während das entsprechende scrambled Peptid bis zu 3pM nicht effektiv war (Abbildung 2) : Western-blots (Abbildung 2a) zeigen, daß das G-Aktinsignal, erhalten nach Inkubation mit 3 MM scrambled Peptid, ungefähr dasselbe war, wie das bei alleiniger G-Aktinbindung (siehe Gele Nr. 5 und 6 in Abbildung 2a). Jedoch die Bindung des ALC-1 Peptids an G- Aktin war deutlich schwächer als die Bindung des VLC-1 Peptids. Selbst bei 3 p ALC-1 Peptid konnte eine bedeutende Menge von G-Aktin von den Affinitätsgelen eluiert werden. Die halbmaximale effektive Konzentration von ALC-1 Peptid wurde mit (Abbildung 2b) bestimmt und war deutlich (p<0,01) höher als verschieden von VLC-1 Peptid.

Legende zu den Abbildungen : Abbildung 1 : Abbildung la : stellt die zeitabhängige Bindung von G-Aktin an Affinitätsgelen dar, die nach Elution und Western-blot (ECL- Signal) erscheint. Ein Peptid entsprechend der humanen VLC-1 Sequenz 4-14 war kovalent an Aminohexylagarose gekoppelt, um G-Aktin zu binden. a, b, und c korrespondieren mit den Signalen nach 10min, 30min, 60min und 120 min.

Abbildung lb : Die ECL Signale gemäß Abbildung la (optische Dichte OD in Vergleichseinheiten) werden gegen die Inkubationszeit der Affinitätsgele mit G-Aktin aufgetragen.

Abbildung 2 : Abbildung 2a : Rückgewinnung von G-Aktin aus Affinitätsgelen (ECL-Signale). G-Aktin wurde mit verschiedenen Konzentrationen (in mol/1) von synthetischen Peptiden inkubiert, die den N-terminalen Domänen von 5-14 (P5-14) der atrialen und ventrikulären Myosin Leichtkette 1 (entsprechend ALC-1 und VLC-1)) des menschlichen Herzens. 1,2,3 und 4 entsprechen 3pM, 1ZM, 0,3UM und 0, lMM Peptid. 5 betrifft Aktin allein, 6 und 7 betrifft 3M ALC-1 und VLC-1 scrambled Peptide.

Abbildung 2b : G-Aktin zurückgewonnen aus Affinitätsgelen (in % des maximalen ECL-Signals erhalten ohne konkurrierendes Peptid) gegen verschiedene Konzentrationen von ALC-1 (Kreise) und VLC-1 (Felder) Peptiden entsprechend den N-terminalen Domänen 5-14 (P5-14) des menschlichen Herzens.