Die Erfindung betrifft Mittel und Verfahren zur Modifizierung der 5 '-Kappe von RNA. Durch Untersuchung des Erbguts einer Zelle können wichtige Informationen über deren

Zustand gewonnen werden, beispielsweise darüber, ob zelleigene regulatorische Prozesse korrekt ablaufen oder ob hier Veränderungen im Vergleich zum Normalzustand vorliegen. Diese Informationen können dann zum Beispiel für die Feststellung genutzt werden, ob eine Zelle entartet ist, durch Viren infiziert wurde oder sich in einem irregulären bzw. krankhaften Zustand befindet. Auf diese Weise können beispielsweise Rückschlüsse auf etwaige

vorliegende Krankheiten gezogen werden.

Hierzu ist es beispielsweise bekannt, die Expression von Genen mittels Isolation und Analyse der in den Zellen vorhandenen mRNA-Moleküle zu untersuchen. Um verlässliche

Informationen zu erhalten, ist die Qualität der mRNA-Präparation hierbei von besonderer

Bedeutung. Da in der Zelle neben mRNAs jedoch zahlreiche weitere Moleküle sowie weitere RNA-Spezies, insbesondere nicht-kodierende RNAs (z.B. sRNAs, tRNA, rRNA, ncRNA, miRNA etc.) vorliegen, muss eine selektive Anreicherung aufgrund spezifischer Merkmale erfolgen. Zur spezifischen Isolierung von mRNA aus Eukaryoten nutzt man deren

charakteristischen Merkmale, nämlich den sogenannten Poly(A)-Schwanz am 3 '-Ende und die Kappenstruktur am 5'-Ende (J. Pease, R. Sooknanan, Nat Meth 2012, 9; J. S. Marcus, W. F. Anderson, S. R. Quake, Analytical Chemistry 2006, 78, 3084-3089; Z. Y. Yang, H. J.

Edenberg, R. L. Davis, Nucleic Acids Res 2005, 33; M. E. Folkers, D. A. Deiker, C. I.

Maxwell, C. A. Nelson, J. J. Schwartz, D. A. Nix, C. H. Hagedorn, Plos One 2011, 6; Z. Gao, Q. Zhang, Y. Cao, P. Pan, F. Bai, G. Bai, Journal of Chromatography A 2009, 1216, 7670-

7676; U. Schibler, D. Rifat, D. J. Lavery, Methods 2001 , 24, 3-14; E. Z. Bajak, C. H. Hagedorn, Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 2008, 419, 147-160; A. K. Shukla, A. K. Shasany, S. P. S. Khanuja, Indian journal of experimental biology 2005, 43, 197-201). Über diese Merkmale wird die mRNA normalerweise nicht-kovalent an andere Moleküle gebunden, die beispielsweise an entsprechenden Säulenmaterialien immobilisiert sind (z.B. Bindung über den Poly(A)-Schwanz an Oligo-dT-Säulen oder über die 5 '-Kappe an das Protein eIF4E). Zur Isolierung von mRNAs wird derzeit hauptsächlich der enthaltene Poly(A)-Schwanz genutzt. Dieser ist, wie auch die Kappe, eine charakteristische Struktur von reifen rnRNA- Molekülen und miRNA- Vorläufern (pri-miRNA). Über diesen Bereich können die Moleküle an immobilisierte, komplementäre Desoxynukleotid(01igo-dT)-Sonden hybridisieren und somit aus komplexen Proben isoliert werden. Die hierzu benötigten Säulenmaterialien („beads") sind im Stand der Technik bekannt und werden standardmäßig eingesetzt.

Bajak und Hagedorn (E. Z. Bajak, C. H. Hagedorn, Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 2008, 419, 147-160) haben eine Methode etabliert, bei der eine Variante des

Translationsinititaionsfaktors eIF4E zur Isolierung von RNA über deren Kappenstruktur verwendet wird (s. auch US 6841363 B2, Gowda, Nucleic Acids Research, 2010, 38, 21, 7558- 7569). Ein Vorteil hierbei ist, dass RNA-Moleküle unabhängig von der Länge ihres Poly(A)- Schwanzes, lediglich aufgrund der enthaltenen Kappenstruktur identifiziert und angereichert werden, wodurch auch RNAs mit kurzem Poly(A)-Schwanz (sowohl mRNAs als auch

Vorläufer von miRNAs) für nachfolgende Analysen zugänglich werden. Zur Durchführung des Assays wird eine eIF4E-Variante, die eine bis zu lOfach höhere Affinität gegenüber den Zielmolekülen als das Wildtyp-Protein aufweist, über einen Protein- Affinitätstag (insbes. Glutathion-S-Transferase, GST) auf Glutathion-Beads immobilisiert und mit der Probe inkubiert. Die RNA mit einer Kappenstruktur bindet nicht-kovalent an das immobilisierte Protein und kann so mit Hilfe der Beads aus der komplexen Probe isoliert werden. Auf diese Weise konnten, unabhängig vom variierenden Motiv des Poly(A)-Schwanzes, RNA-Moleküle Hepatitis-C-infizierter Zellen isoliert werden. Nach Durchführung eines„Next-generation- sequencing "-Experimentes konnten neue Aussagen bezüglich der Änderungen der

Genregulation innerhalb der Wirtszelle nach Infektion durch das Virus gemacht werden (M. Folkers, PLOS one, 2011, 6, 2, el4697, Papic, 2012, Viruses, 2012, 4, 581.612).

Ein Nachteil dieser Verfahren ist die fehlende Möglichkeit, RNA-Moleküle direkt kovalent an einen Träger zu binden, wodurch die Auswahl von Waschbedingungen bei der Abtrennung von Verunreinigungen eingeschränkt ist. Darüber hinaus beschränkt auch die häufig vorliegende 1 : 1 -Beziehung zwischen Bindemolekül und RNA- Molekül den Einsatz dieser Verfahren. Dalhoff et al. (Dalhoff C, Lukinavicius G, Klimasäuskas S, Weinhold E., 2006, Nat Chem Biol. 2(1): 31-32) beschreiben den direkten Transfer einer Ethyl-, Propyl-, Propenyl- und 2- Butinylgruppe auf 2'-Desoxycytidin und 2'-Desoxyadenosin durch drei S-Adenosyl-L- methionin(AdoMet)-abhängige DNA-Methyltransferasen über den Einsatz entsprechender Analoga dieses Kofaktors. Dabei trägt das AdoMet-Analogon die entsprechende Gruppe statt einer Methylgruppe am Schwefelatom. Lukinavicius et al. (G. Lukinavicius, V. Lapiene, Z. Stasevskij, C. Dalhoff, E. Weinhold, S. Klimasäuskas, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 2758- 2759) verwendeten ein weiteres, eine NH ₂ -Gruppe enthaltendes, AdoMet-Analogon zur Übertragung dieser Gruppe mittels geeigneter DNA-Methyltransferasen auf DNA-Nucleoside. Einen ähnlichen Ansatz haben auch Motorin et al. gewählt, die den Einsatz einer Kombination aus enzymatischem Transfer und Click-Chemie zur ortsspezifischen Markierung von tRNA- Molekülen für biophysikalische Studien beschreiben (Y. Motorin, J. Burhenne, R. Teimer, K. Koynov, S. Willnow, E. Weinhold, M. Helm, Nucleic Acids Research, 2010, 1-10,

doi: 10.1093/nar/gkq825). Dabei wurde AdoEnYn, ebenfalls ein Analogon des Kosubstrats S- adenosyl-L-methionin, verwendet, um den Penteninrest CH=C-CH=CH-CH ₂ - mittels tRNA:Methyltransferase Trml enzymatisch auf das exocyclische N2-Atom des Guanosins an Position 26 einer tRNA ^phe zu übertragen. Anschließend wurde ein Fluorophor mittels Cu(I)- katalysierter Azid- Alkin- 1,3-dipolarer Cycloaddition (CuAAC) an die modifizierte tRNA ^phe gebunden. Ebenfalls wurde sequenspezifisches Click-Labeling von RNA erreicht, indem Box C/D RNP Methyltransferasen verwendet wurden (M. Tomkuviene, B. Clouet-d'Orval, I.

Cerniauskas, E. Weinhold, S. Klimasäuskas, Nucleic Acids Res 2012).

Es besteht jedoch nach wie vor ein Bedürfnis für weitere Möglichkeiten, bestimmte RNA- Moleküle, insbesondere mRNA- Moleküle, aus Zellen zu isolieren und einer Analyse zuzuführen.

Die vorliegende Erfindung macht es sich daher zur Aufgabe, solch eine weitere Möglichkeit zur Verfügung zu stellen. Gelöst wird diese Aufgabe durch die Gegenstände der nebengeordneten Ansprüche.

Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben. Es hat sich überraschend herausgestellt, dass ein an einer bestimmten Position verändertes Enzym, nämlich die Trimethylguanosinsynthase 2 aus Giardia lamblia (im Folgenden mit „GlaTgs2" abgekürzt), deren Wildtyp-Sequenz in SEQ ID NO: 1 wiedergegeben ist, neue Möglichkeiten zur Markierung und/oder Isolierung von RNA-Spezies eröffnet, die über eine 5'- m ⁷ GpppN-Kappe verfügen. Bei dieser m ⁷ GpppN-Kappe (engl,„m ⁷ GpppN cap") handelt es sich um einen an Position N7 methylierten Guanosinrest, der an Position 5 ' über eine

Triphosphorsäureesterbrücke an das 5 '-Ende eines RNA-Moleküls gebunden ist (5'-5'- Verknüpfung), wie aus folgender Formel (II) ersichtlich:

R ¹ ist dabei OH oder OCH ₃ . Das B in der obigen Formel steht für eine beliebige Nucleobase. Das N in dem Ausdruck m ⁷ GpppN steht für Nucleosid, Nucleotid, Nucleosid- oder Nucleotid- analogon, ppp für die Triphosphatbrücke, G für Guanosin und m ⁷ für die Methylgruppe an N7.

Eine solche Kappe weisen beispielsweise eukaryotische mRNA-Moleküle auf, aber auch bestimmte nicht-kodierende RNA-Spezies, z.B. snRNAs, snoRNAs und Telomerase-RNAs.

Wildtyp GlaTgs2 (s. SEQ ID NO: 1) weist 258 Aminosäuren auf und katalysiert die weitere Methylierung (Hypermethylierung) des Kappen-Guanosins an Position N2 mit S-adenosyl-L- methionin (AdoMet) als Kofaktor (S. Hausmann et al, J. Biol. Chem. 2008, 283, 31706- 31718). Anders als die menschliche Trimethylguanosinsynthase hTgs, die die Übertragung von zwei Methylresten auf N2 katalysieren kann, scheint das Enzym aus Giardia lamblia keine dimethylierten Nukleotide als Substrat zu akzeptieren, so dass durch das Enzym lediglich die Übertragung eines einzelnen Methylrestes auf das N2 erfolgt. Somit dürfte es sich hier eigentlich um eine Dimethylguanosinsynthase und nicht um eine Trimethylguanosinsynthase handeln. Zur Vermeidung von Missverständnissen wird hier jedoch trotzdem der Begriff Trimethylguanosinsynthase oder abgekürzt Tgs für dieses Enzym verwendet.

AdoMet wird auch mit„SAM" abgekürzt und dient diversen Enzymen als Kofaktor zur Übertragung der am Schwefelatom befindlichen Methylgruppe. Nach Abspaltung der CH ₃ - Gruppe bleibt S-adenosyl-L-homocystein zurück, das auch mit„AdoHcy" oder„SAH" abgekürzt wird.

Es wurde nun überraschend gefunden, dass ein Aminosäureaustausch an Position 34 der Wildtyp-GlaTgs2 gemäß SEQ ID NO: 1, der dazu führt, dass die an dieser Position befindliche Aminosäure Valin gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht wird, vorzugsweise gegen eine unpolare/hydrophobe oder polare/neutrale Aminosäure, und besonders bevorzugt gegen Alanin, Glycin oder Methionin, die enzymatische Aktivität des resultierenden Enzyms dahingehend ändert, dass es AdoMet- Analoga als Kofaktoren nutzen kann bzw. im Vergleich zum

Wildtypenzym besser nutzen kann. Vorzugsweise handelt es sich bei der anstelle von Valin eingeführten Aminosäure nicht um Tryptophan oder Leucin. Damit eröffnet sich die

Möglichkeit einer gezielten Modifikation des 5 '-Endes von RNA-Spezies, die eine m ⁷ GpppN- Kappe tragen, um dort gegebenenfalls in nachfolgenden Schritten Reportergruppen anzubringen und/oder eine spezifische Immobilisierung dieser RNA-Spezies zu erreichen.

Beispiele für unpolare/hydrophobe Aminosäuren sind Alanin, Valin, Methionin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Tryptophan und Phenylalanin. Beispiele für polare/neutrale Aminosäuren sind Tyrosin, Threonin, Glutamin, Glycin, Serin, Cystein und Asparagin.

Unter dem Begriff„AdoMet- Analogon" wird hier eine Verbindung der folgenden Formel (I)

verstanden, die am Schwefelatom einen Rest R trägt, der keine Methylgruppe ist. Es handelt sich somit um eine Verbindung mit demselben Grundgerüst wie AdoMet (S-adenosyl-L- methionin), wobei am Schwefelatom anstelle der Methylgruppe ein anderer Rest gebunden ist. AdoMet- Analoga sind beispielsweise in der WO 2006/108678 A2 beschrieben.

Ein Beispiel für einen solchen Rest ist Propenyl CH ₂ =CH-CH ₂ -. Das entsprechende AdoMet- Analogon (5 ^, -[(S)-[(3S)-3-Amino-3-carboxypropyl]prop-2-enylsulfoni o]-5'-desoxyadenosin) mit diesem Rest anstelle von Methyl wird als„AdoPropen" bezeichnet und weist folgende Formel (Ia) auf:

Weitere Beispiele für Reste R sind Propinyl CH=C-CH ₂ -, Butinyl CH=C-CH ₂ -CH ₂ -, Pent-2- en-4-inyl CH=C-CH=CH-CH ₂ -, Benzyl Ph-CH ₂ - (Ph = C ₆ H ₅ ) und Azidobutenyl N ₃ -CH ₂ - CH=CH-CH ₂ -. Im Falle des Propinylrestes CH=C-CH ₂ - wird das AdoMet- Analogon hier als „AdoPropin" bezeichnet, im Falle des Butinylrestes CH^C-CH ₂ -CH ₂ - als„AdoButin", im Falle des Pent-2-en-4-inyl-Restes CH=C-CH=CH-CH ₂ - als„AdoEnYn", im Falle des Benzylrestes„AdoBenzyl" und im Falle des Azidobutenylrestes N ₃ -CH ₂ -CH=CH-CH ₂ - als „AdoAzid". Für den Pent-2-en-4-inyl-Rest wird hier auch der Begriff„Penteninylrest" verwendet.

In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung daher ein isoliertes oder synthetisches Protein bereit, das

a. eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist oder umfasst, oder b. eine Aminosäuresequenz aufweist oder umfasst, die zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 homolog ist, mit der Maßgabe, dass in der homologen Aminosäuresequenz an der Position, die der Position 34 gemäß SEQ ID NO: 2 entspricht, nicht Valin steht, oder c. eine Aminosäuresequenz aufweist oder umfasst, die zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 homolog ist, wobei die Aminosäuresequenz zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ

ID NO: 2 zu mehr als 85%, bevorzugt zu mindestens 90%, besonders bevorzugt zu mindestens 95% identisch ist, mit der Maßgabe, dass in der homologen Aminosäuresequenz an der

Position, die der Position 34 gemäß SEQ ID NO: 2 entspricht, nicht Valin steht, oder d. eine zusammenhängende Teilsequenz von mindestens 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 65, 70, 80, 90 oder mindestens 100 Aminosäuren, bevorzugt mindestens 1 10, 120, 130, 140,

150, 160, 170, 180, 190 oder mindestens 200 Aminosäuren, besonders bevorzugt mindestens 210, 220, 230, 240 oder mindestens 250 Aminsoäuren der Aminosäuresequenz gemäß a, b oder c aufweist oder umfasst, mit der Maßgabe, dass die Teilsequenz die Aminosäure an Position 34 gemäß SEQ ID NO: 2 oder die entsprechende homologe Aminosäure umfasst, und

e. nicht die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: l 1 (GL50581 2635 aus Giardia intestinalis ATCC 50581, GenBank-Nr. EET00120.1) aufweist.

Die Formulierung, dass das Protein„eine Aminosäuresequenz aufweist", bedeutet, dass das Protein aus der Sequenz besteht, d.h. am C- und/oder N-Terminus keine weiteren Aminosäuren vorhanden sind. Die Formulierung, dass das Protein„eine Aminosäuresequenz umfasst", bedeutet, dass das Protein die Sequenz enthält, ohne dass damit eine Beschränkung auf Proteine verbunden ist, die am C- und/oder N-Terminus keine weiteren Aminosäuren haben, wobei dieser Begriff jedoch auch die Formulierung erfasst, dass das Protein eine Aminosäuresequenz „aufweist", d.h. nur aus den in der Sequenz aufgeführten Aminosäuren und in der in der Sequenz gegebenen Reihenfolge besteht.

Der hier verwendete Begriff„Protein" bezeichnet Polymere aus einer beliebigen Anzahl von Aminosäuren, die durch Peptidbindung untereinander verknüpft sind und umfasst die Begriffe „Peptid" und„Polypeptid". Die lineare Abfolge von Aminosäuren in einem Protein wird als „Aminosäuresequenz" bezeichnet. Der Begriff„synthetisch" bedeutet hier„künstlich hergestellt" und umfasst Proteine, die so, d.h. mit der jeweiligen Aminosäuresequenz, nicht in der Natur vorkommen.„Isoliert" bedeutet hier, dass ein Protein aus seiner ursprünglichen bzw. natürlichen Umgebung, z.B. aus einer

Eukaryoten- oder Prokaryotenzelle, herausgelöst worden ist.

Der Begrifft„homolog" in Bezug auf ein Protein bedeutet, dass ein Protein in seiner

Aminosäuresequenz weitgehend mit einem damit verglichenen anderen Protein übereinstimmt, ohne vollständig damit identisch zu sein. Homolog kann hier zum Beispiel bedeuten, dass ein Protein mit Ausnahme von einer Aminosäure eine mit der Trimethylguanosinsynthase von Giardia lamblia identische Aminosäuresequenz aufweist. Das Vorhandensein einer Homologie zwischen zwei Proteinen kann festgestellt werden, indem man jeweils eine Position in der einen Sequenz mit der entsprechenden Position in der anderen Sequenz vergleicht und ermittelt, ob hier identische oder ähnliche Reste vorhanden sind. Zwei miteinander verglichene Sequenzen sind homolog, wenn ein bestimmter Mindestanteil identischer oder ähnlicher Aminosäuren vorliegt. Identität heißt, dass beim Vergleich zweier Sequenzen an äquivalenten Stellen jeweils dieselbe Aminosäure steht. Dabei kann es gegebenenfalls erforderlich sein, Sequenzlücken zu berücksichtigen, um eine möglichst gute Alinierung der Vergleichssequenzen herzustellen. Ähnliche Aminosäuren sind dabei Aminosäuren mit gleichen oder äquivalenten chemischphysikalischen Eigenschaften. Beim Austausch einer Aminosäure durch eine andere

Aminosäure mit gleichen oder äquivalenten chemisch-physikalischen Eigenschaften spricht man von einem„konservativen Austausch". Beispiele für physikalisch-chemische

Eigenschaften einer Aminosäure sind beispielsweise die Hydrophobie oder die Ladung. Als ähnliche Aminosäuren werden insbesondere solche nichtidentischen Aminosäuren angesehen, die anhand der von dem Computerprogramm„Basic Local Alignment Search Tool", abgekürzt BLAST, (S.F. Altschul et al. (1990), Basic Local Alignment search tool, J.Mol. Biol. 215: 403- 410; s. z.B. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) verwendeten BLOSUM62- Substitutionsmatrix (Henikoff, S., und Henikoff, J., Amino acid Substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 89: 10915-10919, 1992) als„positiv" ausgegeben werden, d.h. in der BLOSUM62-Substitutionsmatrix eine positive Punktzahl aufweisen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird davon ausgegangen, dass eine Homologie zwischen zwei Sequenzen vorhanden ist, wenn mindestens 45%, vorzugsweise mindestens 50%, mindestens 55%>, mindestens 60%>, mindestens 65%>, mindestens 70%>, mindestens 75%>, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97%, mindestens 98%, oder mindestens 99% der Aminosäuren identisch oder ähnlich, vorzugsweise identisch, sind. Insbesondere wird vom Vorhandensein einer Homologie zwischen zwei Sequenzen ausgegangen, wenn bei Verwendung des Computerprogramms BLAST (S.F.

Altschul et al. (1990), Basic Local Alignment search tool, J.Mol. Biol. 215: 403-410; s. z.B. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) unter Verwendung von Standardvorgabeparametern („Expect Threshold" = 10,„Word size" = 3,„Existence Gap Costs" = 11,„Extension Gap Costs = 1) und der BLOSUM62-Substitutionsmatrix (Henikoff, S., und Henikoff, J., Amino acid Substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 89: 10915-10919, 1992) eine Identität oder Ähnlichkeit („Positives"), vorzugsweise Identität, von mindestens 45%, vorzugsweise mindestens 55%, mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97%, mindestens 98%, oder mindestens 99% erhalten wird. Vorzugsweise wird dabei von einer Mindestlänge von 20, bevorzugt einer Mindestlänge von 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 80 oder 100, weiter bevorzugt einer Mindestlänge von 120, 140, 160, 180 oder 200

Aminosäuren, oder von einer Mindestlänge von 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder 95% der Aminosäuren der jeweiligen Aminosäuresequenzen ausgegangen. Besonders bevorzugt wird von der vollen Länge des jeweiligen Proteins ausgegangen. Dem Fachmann ist anhand seines Fachwissens ohne Weiteres ersichtlich, welches der verfügbaren BLAST- Programme, z.B. BLASTp, für die Ermittlung der Homologie in Frage kommt. Darüber hinaus existieren noch weitere Programme, die der Fachmann kennt, und die er im Bedarfsfall bei der Beurteilung der Homologie zweier oder mehrerer zu vergleichender Sequenzen heranziehen kann. Solche Programme sind beispielsweise auf den Internetseiten des European

Bioinformatics Institute (EMBL) verfügbar (s. z.B. http://www.ebi.ac.uk/Tools/similarity.html). Insbesondere bedeutet„homolog" in der vorliegenden Anmeldung eine Übereinstimmung, d.h. Identität in der Aminosäuresequenz, von mindestens 60%, bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99%, besonders bevorzugt mindestens 99,5%.„Homolog" kann insbesondere auch bedeuten, dass eine Trimethylguanosinsynthase im Vergleich zu einem anderen Protein an nicht mehr als 60, bevorzugt nicht mehr als 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 oder 11, besonders bevorzugt nicht mehr als 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 Position(en) eine andere, fehlende oder zusätzliche Aminosäure aufweist. Der Begriff„Alkyl" beinhaltet gesättigte aliphatische (nicht-aromatische) Gruppen,

einschließlich geradkettiger Alkylgruppen (z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl und Octyl) und verzweigtkettiger Alkylgruppen (z.B. Isopropyl, tert-Butyl, Isobutyl). Der Begriff umfasst auch O-, N-, S- oder P- Alkylgruppen (z.B. -O-Methyl), d.h. Alkylgruppen, die über ein Sauerstoff-, Stickstoff-, Schwefel- oder Phosphoratom an eine Verbindung gebunden sind.

Der Ausdruck„C _n -C _m ", wobei n und m jeweils positive ganze Zahlen sind und m größer als n ist, bedeutet einen Bereich, der die Anzahl an C-Atomen einer Verbindung oder eines Restes angibt. Der Ausdruck soll hier ausdrücklich sämtliche ganzzahlige Zwischenwerte zwischen den Bereichsgrenzen n und m einschließen, und zwar jeweils unabhängig voneinander. Der Ausdruck„Ci-Cio" (n=l , m=10) bedeutet daher beispielsweise eine Verbindung, eine Gruppe oder einen Rest mit 1-10, d.h. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 C-Atomen.„Ci-Cio" umfasst daher gleichzeitig auch beispielsweise„C2-C ₆ ", d.h. 2, 3, 4, 5 oder 6 C-Atome, oder„C1-C4", d.h. 1, 2, 3 oder 4 C-Atome, oder„C4-C9", d.h. 4, 5, 6, 7, 8 oder 9 C-Atome. Entsprechend bedeutet der Begriff„C ₂ -C 10- Alkyl" beispielsweise eine Alkylgruppe mit 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 C-Atomen und umfasst sämtliche Kombinationen aus den Werten von n und m, die in dem Bereich von n=2 bis m=10 liegen, z.B.„Cs-Cy-Alkyl", d.h. ein Alkyl mit 5, 6 oder 7 C- Atomen.

Der Begriff„Alkenyl" beinhaltet ungesättigte aliphatische (nicht-aromatische) Gruppen mit mindestens einer C-C-Doppelbindung, einschließlich geradkettiger und verzweigtkettiger Alkenylgruppen. Der Begriff umfasst auch O-, N-, S- oder P-Alkenylgruppen (z.B. -O- Propenyl), d.h. Alkenylgruppen, die über ein Sauerstoff-, Stickstoff-, Schwefel- oder

Phosphoratom an eine Verbindung gebunden sind. Der Begriff„C ₂ -C 10- Alkenyl" bedeutet eine Alkenylgruppe mit 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 C-Atomen.

Der Begriff„Alkinyl" beinhaltet ungesättigte aliphatische (nicht-aromatische) Gruppen mit mindestens einer C-C-Dreifachbindung, einschließlich geradkettiger und verzweigtkettiger

Alkenylgruppen. Der Begriff umfasst auch O-, N-, S- oder P-Alkinylgruppen (z.B. -O-Butinyl), d.h. Alkinylgruppen, die über ein Sauerstoff-, Stickstoff-, Schwefel- oder Phosphoratom an eine Verbindung gebunden sind. Der Begriff„C2-Cio-Alkinyl" bedeutet eine Alkinylgruppe mit 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 C-Atomen.

Der Begriff„Alkeninyl" beinhaltet ungesättigte aliphatische (nicht-aromatische) Gruppen mit mindestens einer C-C-Doppelbindung und mindestens einer C-C-Dreifachbindung,

einschließlich geradkettiger und verzweigtkettiger Alkeninylgruppen. Der Begriff umfasst auch O-, N-, S- oder P-Alkeninylgruppen, d.h. Alkeninylgruppen, die über ein Sauerstoff-,

Stickstoff-, Schwefel- oder Phosphoratom an eine Verbindung gebunden sind. Der Begriff„C ₄ _ io-Alkeninyl" bedeutet eine Alkeninylgruppe mit 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 C-Atomen.

Der Begriff„Cycloalkyl" beinhaltet alizyklische Gruppen, d.h. ringförmige gesättigte aliphatische (nicht-aromatische) Gruppen, z.B. Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclo hexyl, Cycloheptyl, Cyclooctyl. Der Begriff umfasst auch O-, N-, S- oder P-Cycloalkylgruppen, d.h. Cycloalkylgruppen, die über ein Sauerstoff-, Stickstoff-, Schwefel- oder Phosphoratom an eine Verbindung gebunden sind. Die Begriffe„Cycloalkenyl",„Cycloalkinyl" und„Cyclo alkeninyl" bedeuten entsprechend ringförmige aliphatische (nicht-aromatische) Alkenyle, Alkinyle oder Alkeninyle gemäß der obigen Definition, wobei die Doppel- und/oder Dreifachbindung(en) innerhalb oder außerhalb des Rings bzw. Ringsystems vorhanden sein kann (können). Der Begriff„Heteroalkyl" bezeichnet Alkylgruppen, bei denen ein oder mehrere

Kohlenstoffatome des Kohlenwasserstoffgerüsts durch andere Atome (Heteroatome), z.B. Sauerstoff-, Stickstoff-, Schwefel- oder Phosphoratome, ersetzt sind. Der Begriff umfasst auch O-, N-, S- oder P-Heteroalkylgruppen, d.h. Heteroalkylgruppen, die über ein Sauerstoff-, Stickstoff-, Schwefel- oder Phosphoratom an eine Verbindung gebunden sind. Der Begriff „Heteroalkyl" umfasst auch Cykcloalkyle, bei denen ein oder mehrere Kohlenstoffatome des Kohlenwasserstoffgerüsts durch andere Atome, z.B. Sauerstoff-, Stickstoff-, Schwefel- oder Phosphoratome, ersetzt sind. Unter den Begriffen„Heteroalkenyl",„Heteroalkinyl", „Heteroalkeninyl" werden entsprechend Alkenyle, Alkinyle und Alkeninyle sowie

Cyclo alkenyle, Cycloalkinyle und Cycloalkeninyle verstanden, bei denen ein oder mehrere Kohlenstoffatome des Kohlenwasserstoffgerüsts durch andere Atome (Heteroatome), z.B. Sauerstoff-, Stickstoff-, Schwefel- oder Phosphoratome, ersetzt sind. Der Begriff„Ci-Cio- Heteroalkyl" bedeutet eine Alkylgruppe mit 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 C-Atomen und mindestens einem Heteroatom. Entsprechendes gilt auch für Heteroalkenyle, Heteroalkinyle und Heteroalkeninyle.

Unter„Azidoalkyl" wird hier ein Alkyl mit einer Azidogruppe -N ₃ verstanden. Der Begriff umfasst auch cyclische Alkyle und Heteroalkyle mit einer Azidogruppe. Unter„Azidoalkenyl", „Azidoalkinyl" und„Azidoalkeninyl" werden entsprechend Alkenyle, Alkinyle und Alkeninyle, cyclische Alkenyle, Alkinyle und Alkeninyle sowie Heteroalkenyle, -alkinyle und -alkeninyle verstanden. Der Begriff„substituiert" bedeutet, dass ein oder mehrere Substituenten vorhanden sind, die ein Wasserstoffatom an einem oder mehreren Kohlenstoffatomen des Kohlenwasserstoffgerüsts ersetzen. Beispiele für solche Substituenten sind Oxo-, Hydroxyl-, Phosphat-, Cyano- und Aminogruppen, aber auch z.B. Halogene (z.B. F, Cl, Br, I), Alkyl, Cycloalkyl, Aryl und Heteroaryl.

Unter einer„Nukleinsäure" wird ein Polymer verstanden, dessen Monomere Nucleotide sind. Ein Nucleotid ist eine Verbindung aus einem Zuckerrest, einer stickstoffhaltigen heterozyklischen organischen Base (Nucleotid- oder Nucleobase) und einer Phosphatgruppe. Der Zuckerrest ist in der Regel eine Pentose, im Falle von DNA Desoxyribose, im Falle von RNA Ribose. Die Verknüpfung der Nucleotide erfolgt über die Phosphatgruppe mittels einer

Phosphodiesterbrücke in der Regel zwischen dem 3'-C-Atom der Zuckerkomponente eines Nucleosids (Verbindung aus Nucleobase und Zucker) und dem 5'-C-Atom der

Zuckerkomponente des nächsten Nucleosids. Der hier verwendete Begriff„Nukleinsäure" umfasst beispielsweise DNA, RNA und DNA/RNA-Mischsequenzen.

Unter einer„Nucleobase" werden organische Basen verstanden, die in RNA oder DNA vorkommen. Bei den Nucleobasen handelt es sich häufig um Purine (R) und Pyrimidine (Y). Beispiele für Purine sind Guanin (G) und Adenin (A), Beispiele für Pyrimidine sind Cytosin (C), Thymin (T) und Uracil (U). Phosphorylierte Nucleoside, beispielsweise

Nucleosidmonophosphate (NMP), Nucleosiddiphosphate (NDP) und Nucleosidtriphosphate (NTP), werden auch als Nucleotide bezeichnet. Die Phosphat-, Diphosphat- (Pyrophosphat-) bzw. Triphosphatgruppe ist in der Regel mit dem 5'-C-Atom der Zuckerkomponente des Nucleosids verknüpft, kann aber beispielsweise auch mit dem 3'-C-Atom verknüpft sein.

Unter einem„Nucleosid" werden hier organische Moleküle verstanden, die aus einem

Zuckerrest (Zuckerkomponente) und einer organischen Base (Basenkomponente), z.B. einer heterocyclischen organischen Base, insbesondere einer stickstoffhaltigen heterocyclischen organischen Base, bestehen, die über eine glykosidische Bindung verbunden sind. Der

Zuckerrest ist häufig eine Pentose, z.B. Desoxyribose oder Ribose, kann aber auch ein anderer Zucker sein, z.B. ein C ₃ -, C ₄ - oder C ₆ -Zucker. Insbesondere wird unter einem Nucleosid daher eine Verbindung der allgemeinen Formel (III)

verstanden, wobei B eine stickstoffhaltige heterocyclische organische Base, z.B. eine

Nucleobase, ist, und R ³ und R ⁴ unabhängig voneinander H oder OH sind.

Unter einem„Nucleosidanalogon" wird hier eine Verbindung verstanden, die im menschlichen Körper natürlicherweise nicht vorkommt, einem natürlicherweise im menschlichen Körper vorkommenden Nucleosid aber strukturell ähnlich ist, so dass es beispielsweise von der Zelle und/oder von viralen Enzymen im Wesentlichen entsprechend dem natürlichen Nucleosid verarbeitet, beispielsweise phosphoryliert und in einen RNA- oder DNA-Strang eingebaut werden kann. Ein Nucleosidanalogon kann selbst ein Nucleosid sein. Es kann aber

beispielsweise auch eine andere Verbindung mit den obigen Eigenschaften sein, beispielsweise eine Verbindung aus einer heterocyclischen Base und einem acyclischen Rest und/oder einem Rest, der kein Zucker ist, oder eine Verbindung aus einer carbocyclischen Verbindung und einem Zuckerrest. Nucleosidanaloga sind entweder selbst Nucleoside im obigen Sinne oder Nucleosiden strukturell und/oder funktionell analog. Da Nucleosidanaloga nicht notwendig eine Zucker- bzw. Basenkomponente im engeren Sinne enthalten müssen, wird hier auch von einer zur Basenkomponente analogen Komponente (Basenanalogon) bzw. einer zur

Zuckerkomponente analogen Komponente (Zuckeranalogon) gesprochen. Sofern hier von einer Zuckerkomponente oder Basenkomponente gesprochen wird, sollen die entsprechenden analogen Komponenten von Nucleosidanaloga mit erfasst sein, sofern sich aus dem Zusammenhang nicht eindeutig etwas anderes ergibt. Beispiele für Nucleosidanaloga sind beispielsweise AZT (3'-Azido-2',3'-didesoxythimidin, Azidothymidin), 2',3'-Didesoxyinosin (Didanosin), 2',3'-Didesoxycytidin (Zalticabin) und 2-Amino-9-((2-hydroxyethoxy)methyl)-lH- purin-6(9H)-on (Acyclovir). Auch Nucleosidphosphonate können Nucleosidanaloga sein.

Unter einem„Nucleotid" werden hier phosphorylierte Nucleoside, beispielsweise

Nucleosidmonophosphate (NMP), Nucleosiddiphosphate (NDP) und Nucleosidtriphosphate (NTP), verstanden. Die Phosphat-, Diphosphat- (Pyrophosphat-) bzw. Triphosphatgruppe ist in der Regel mit dem 5'-C-Atom der Zuckerkomponente des Nucleosids verknüpft, kann aber beispielsweise auch mit dem 3 '-C- Atom verknüpft sein. Unter einem„Nucleotidanalogon" wird entsprechend ein phosphoryliertes Nucleosidanalogon verstanden.

Unter der„Gesamtumsatzzahl" (engl. Total Turnover Number, TTN) wird die Anzahl Mole Produkt verstanden, die pro Mol Kofaktor oder Enzym über die gesamte Reaktionszeit gebildet werden.

Das erfindungsgemäße Protein katalysiert vorzugsweise enzymatisch die Übertragung des

Restes R der Verbindung gemäß folgender Formel (I)

auf das N2 des Guanosins von m ⁷ GTP, m ⁷ GpppN oder einer Verbindung der folgenden Formel (II) wobei RNA Ribonukleinsäure bedeutet, R ¹ OH oder OCH ₃ bedeutet, N Nucleosid, Nucleotid, Nucleosid- oder Nucleotidanalogon bedeutet, B für Nucleobase steht, und R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus substituiertem oder unsubstituiertem C ₂ _ ₁₀ -Alkyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₂ _io-Alkenyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₂ _io-Alkinyl,

substituiertem oder unsubstituiertem C4-io-Alkeninyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₃ i ₂ -Cycloalkyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₃ _i ₂ -Cycloalkenyl, substituiertem oder unsubstituiertem C5-i ₂ -Cycloalkinyl, substituiertem oder unsubstituiertem C5-i ₂ -Cycloalkeninyl, substituiertem oder unsubstituiertem Ci_io-Heteroalkyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₂ _io-Heterolkenyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₂ _io-Heteroalkinyl, substituiertem oder unsubstituiertem C4-io-Heteroalkeninyl, substituiertem oder unsubstituiertem Ci_io- Azidoalkyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₂ _io-Azidoalkenyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₂ _io-Azidoalkinyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₄ _ ₁₀ - Azidoalkeninyl, substituiertem oder unsubstituiertem Benzyl, Propenyl CH ₂ =CH-CH ₂ -, Propinyl CH=C-CH ₂ -, Butinyl CH=C-CH ₂ -CH ₂ -, Penteninyl CH=C-CH=CH-CH ₂ - und Azidobutenyl N ₃ -CH ₂ -CH=CH-CH ₂ -. Im Falle von Benzyl ist eine Substitution in paraStellung bevorzugt, besonders bevorzgt eine Subsitution durch ein Alken, Alkin oder Azid.

Dass das erfindungsgemäße Protein die Übertragung des Restes R des AdoMet-Analogons gemäß Formel (I) katalysiert, bedeutet nicht, dass es AdoMet nicht auch als Kofaktor nutzen und eine Methylgruppe auf das N2 der m ⁷ GpppN-Kappe übertragen kann. Vielmehr bedeutet es, dass die Reaktion mit dem AdoMet-Analogon unter physiologischen Bedingungen von dem erfindungsgemäßen Protein zumindest auch katalysiert wird, vorzugsweise im Vergleich zum Wildtypenzym mit höherer Rate, mit größerer Affinität zum Kofaktor, größerem Ertrag und/oder größerer Gesamtumsatzzahl (Total Turnover Number, TTN). Bevorzugt ist die Gesamtumsatzzahl TTN des erfindungsgemäßen Proteins größer 5, bevorzugt >6, >7, >8, >9 oder >10, und/oder beträgt die Gesamtumsatzzahl TTN des erfindungsgemäßen Proteins mindestens das Zweifache der Gesamtumsatzzahl des Wildtypenzyms, jeweils bezogen auf Mittelwerte und dasselbe AdoMet-Analogon, bevorzugt AdoPropen. Weiter bevorzugt ist bei dem erfindungsgemäßen Protein das Verhältnis der Gesamtumsatzzahlen von AdoMet zu AdoPropen, also das Verhältnis TTNAdoMet : TTNAdoPropen, <20, besonders bevorzugt <15, weiter bevorzugt <14, <13, <12, <11 oder <10.

Die von dem erfindungsgemäßen Protein katalysierte Übertragung eines Restes R eines S- Adenosyl-L-Methionin-Analogons auf eine mRNA ist in dem nachstehend wiedergegebenen Schema dargestellt:

Für den Fall, dass das erfindungsgemäße Protein nur eine Teilsequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist oder umfasst, ist es besonders bevorzugt, dass das Protein mindestens eine der obigen Übertragungsreaktionen katalysiert. Bevorzugt ist es, wenn das erfindungsgemäße Protein

a. eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 aufweist oder umfasst, oder

b. eine Aminosäuresequenz aufweist oder umfasst, die zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 homolog ist, mit der Maßgabe, dass in der homologen

Aminosäuresequenz an der Position, die der Position 34 gemäß SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 entspricht, nicht Valin steht, oder

c. eine Aminosäuresequenz aufweist oder umfasst, die zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 homolog ist, wobei die homologe Aminosäuresequenz zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 zu mehr als 85%, bevorzugt zu mindestens 90%, besonders bevorzugt zu mindestens 95% identisch ist, mit der Maßgabe, dass in der Aminosäuresequenz an der Position, die der Position 34 gemäß SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 entspricht, nicht Valin steht, oder

d. eine zusammenhängende Teilsequenz von mindestens 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 65, 70, 80, 90 oder mindestens 100 Aminosäuren, bevorzugt mindestens 110, 120, 130, 140,

150, 160, 170, 180, 190 oder mindestens 200 Aminosäuren, besonders bevorzugt mindestens 210, 220, 230, 240 oder mindestens 250 Aminsoäuren der Aminosäuresequenz gemäß a, b oder c aufweist oder umfasst, mit der Maßgabe, dass die Teilsequenz die Aminosäure an Position 34 gemäß SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 oder oder die entsprechende homologe

Aminosäure umfasst, und

e. nicht die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:l 1 aufweist.

Vorzugsweise steht an Position 34 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 nicht Isoleucin oder Threonin. Besonders bevorzugt steht an Position 34 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 Alanin, Glycin oder Methionin, bevorzugt Alanin. An Position 76 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 steht bevorzugt Asparaginsäure, Threonin, Leucin oder Valin, besonders bevorzugt Asparaginsäure, und/oder an Position 92 der

Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 steht vorzugsweise Arginin oder Alanin. Besonders bevorzugt steht an Position 34 gemäß SEQ ID NO: 2 Alanin, an Position 76 gemäß SEQ ID NO: 2 Asparaginsäure und an Position 92 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 Arginin oder Alanin. Der Rest R ist vorzugsweise Propenyl CH ₂ =CH-CH ₂ -, Propinyl CH=C-CH ₂ -, Butinyl CH^C- CH ₂ -CH ₂ -, Penteninyl CH=C-CH=CH-CH ₂ -, Benzyl Ph-CH ₂ - oder Azidobutenyl N ₃ -CH ₂ - CH=CH-CH ₂ -, besonders bevorzugt Propenyl CH ₂ =CH-CH ₂ -, Benzyl Ph-CH ₂ - oder Penteninyl CH=C-CH=CH-CH ₂ -.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäßes Protein kodiert.

In noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur

Modifizierung der m ⁷ GpppN-Kappe eines RNA-Moleküls, insbesondere mRNA-Moleküls, umfassend den Schritt des Inkontaktbringens eines mit einer m ⁷ GpppN-Kappe versehenen RNA-Moleküls mit einem Protein nach dem ersten Aspekt der Erfindung in Gegenwart eines AdoMet-Analogons gemäß der folgenden Formel (I)

wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus substituiertem oder unsubstituiertem C ₂ _ io-Alkyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₂ _io-Alkenyl, substituiertem oder

unsubstituiertem C ₂ _io-Alkinyl, substituiertem oder unsubstituiertem C4-io-Alkeninyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₃ _i ₂ -Cycloalkyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₃ i ₂ -Cycloalkenyl, substituiertem oder unsubstituiertem C5-i ₂ -Cycloalkinyl, substituiertem oder unsubstituiertem C5-i ₂ -Cycloalkeninyl, substituiertem oder unsubstituiertem Ci_io-Heteroalkyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₂ _io-Heterolkenyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₂ _io-Heteroalkinyl, substituiertem oder unsubstituiertem C4-io-Heteroalkeninyl, substituiertem oder unsubstituiertem Ci_io-Azidoalkyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₂ _io- Azidoalkenyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₂ _io-Azidoalkinyl, substituiertem oder unsubstituiertem C4-io-Azidoalkeninyl, substituiertem oder unsubstituiertem Benzyl Ph-CH ₂ -, Propenyl CH ₂ =CH-CH ₂ -, Propinyl CH=C-CH ₂ -, Butinyl CH=C-CH ₂ -CH ₂ -, Penteninyl CH^C-CH=CH-CH ₂ - und Azidobutenyl N ₃ -CH ₂ -CH=CH-CH ₂ -,

unter Bedingungen, bei denen eine Übertragung des Restes R auf das N2 des Guanosins der m ⁷ GpppN-Kappe erfolgt.

Der Rest R ist vorzugsweise Propenyl CH ₂ =CH-CH ₂ -, Propinyl CH=C-CH ₂ -, Butinyl CH^C- CH ₂ -CH ₂ -, Penteninyl CH=C-CH=CH-CH ₂ -, Benzyl Ph-CH ₂ - oder Azidobutenyl N ₃ -CH ₂ - CH=CH-CH ₂ -, besonders bevorzugt Propenyl CH ₂ =CH-CH ₂ -, Benzyl Ph-CH ₂ - oder Penteninyl CH^C-CH=CH-CH ₂ -.

Besonders bevorzugt ist es, wenn bei diesem Verfahren ein erfindungsgemäßes Protein zum Einsatz kommt, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist und bei dem an Position 34 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 Alanin, Glycin oder Methionin, bevorzugt Alanin, an Position 76 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2

Asparaginsäure, Threonin, Leucin oder Valin, bevorzugt Asparaginsäure, und an Position 92 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 Arginin oder Alanin steht, und als AdoMet- Analogon AdoPropen, AdoEnYn oder AdoBenzyl eingesetzt wird. Weiter bevorzugt wird ein Protein, bei dem an Position 34 gemäß SEQ ID NO: 2 Alanin steht, an Position 76 gemäß SEQ ID NO: 2 Asparaginsäure steht und an Position 92 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 Arginin oder Alanin steht, in Gegenwart von AdoPropen, AdoEnYn oder AdoBenzyl unter geeigneten Bedingungen mit der RNA, vorzugsweise mRNA, in Kontakt gebracht, um die enzymatische Reaktion ablaufen zu lassen. Im Anschluss an die enzymatische Modifizierung der m ⁷ GpppN-Kappe kann der auf das N2 des Guanosins der übertragenen Restes R weiter modifiziert werden, beispielsweise auf einem enzymatischem oder auf nicht-enzymatischem chemischem Weg.

Eine bevorzugte Möglichkeit besteht darin, eine chemische Modifikation des Restes R mittels einer bioorthogonalen chemischen Reaktion, vorzugsweise einer bioorthogonalen Click- Reaktion, vorzunehmen. Solche Reaktionen sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise Photoclick- Verfahren, Thiol-Ene-Click- Verfahren und Cycloadditionsreaktionen, z.B. die Cu(I)-katalysierte Huisgencycloaddition (s. z.B. H. C. Kolb, M. G. Finn, K. B. Sharpless, 2001, Angew. Chem. 113, 11 , 2056-2075; H. C. Kolb, M. G. Finn, K. B. Sharpless, 2001, Angew. Chem. Int. Ed. 40, 11, 2004-2021; C. N. Bowman und C. E. Hoyle, Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 1540 - 1573; S. S. van Berkel,et al, Angew. Chem. 2011, 123, 8968-8989; E. Lallana et al, Angew. Chem. 2011, 123, 8956-8966; A. H. El- Sagheerab, T. Brown, Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 1388-1405; C. S. McKay, et al, Chem.

Commun. 2010, 46, 931-933; W. Song, et al, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 9654-9655; P. M. E. Grämlich, et al, Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 8350-8358; C. R. Becer, et al, Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 4900-4908; T. R. Chan, et al, Org. Lett. 2004, 6, 2853-2855; C.

Uttamapinant, et al, Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 5852-5856; Y. Wang, et al, Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 5330-5333).

Unter einer„Photoclick-Reaktion" wird beispielsweise die 1,3-dipolare Cycloaddition eines Alkens mit einem Nitril-Imin unter Bildung eines Pyrazolincycloaddukts verstanden. Als grundlegende Voraussetzung für die Bildung des Cycloaddukts werden dabei ähnliche

Grenzorbitalenergien der eingesetzten Edukte angenommen. So konnte für die Photoclick- Reaktion gezeigt werden, dass die Reaktivität durch Änderung der Energie des höchsten besetzten Orbitals im Nitril-Imin beeinflusst wird und diese somit zu Cycloadditionen des Typs I gezählt werden kann (s. Y. Wang, W. Song, W. J. Hu, Q. Lin, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2009, 48, 5330-3). Die Photoclick-Reaktion zeichnet sich nicht nur durch Bioorthogonalität aus, sondern auch durch die Möglichkeit einer Bildung fluoreszierender Produkte aus nicht fluoreszierenden Edukten, was insbesondere zur Vermeindung von Hintergrundsignalen bei Anwendungen in lebenden Zellen vorteilhaft ist. Anhaltspunkte dazu, ob eine Photoclick- basierte Funktionalisierung der mRNA- Kappe möglich ist, kann der Fachmann beispielsweise mittels Kohn-Sham-Dichtefunktionaltheorie-Kalkulationen (KS-DFT-Kalkulationen, s. W. Kohn, L. J. Sham, Phys. Rev. 1965, 140, AI 133-1138) erhalten.

Mit Hilfe dieser bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Kappenstruktur am 5 '-Ende von RNAs, die eine solche Kappenstruktur aufweisen oder mit einer solchen Kappenstruktur versehen werden können, in einem zweistufigen oder

gegebenenfalls auch mehrstufigen Verfahren auf chemo-enzymatischem Wege spezifisch modifiziert werden. Im ersten Schritt wird die Kappenstruktur mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Proteins enzymatisch modifiziert, indem anstelle eines Methylrestes ein Rest R auf das N2 der m ⁷ GpppN-Kappe übertragen wird. In einem zweiten, chemischen Schritt, kann die mit diesem Rest modifizierte RNA dann mit geeigneten Molekülen, beispielsweise mit einem geeigneten Biomarker (z.B. Biotin), beispielsweise mittels bekannter Verfahren der Click-Chemie umgesetzt und weiter modifiziert werden. Zu diesen Molekülen zählen auch Säulenmaterialien, die eine Immobilisierung der RNAs über die Kappenstruktur ermöglichen. Diese Immobilisierung kann beispielsweise direkt oder indirekt über nicht-kovalente

Wechselwirkungen mit einer entsprechenden Matrix erfolgen. Sie kann aber auch über eine kovalente Bindung erfolgen, wodurch die Wechselwirkung z.B. mit der Matrix stabiler wird, was beispielsweise stringentere Waschschritte erlaubt, die es ermöglichen, andere

Komponenten effizienter abzutrennen. Damit kann z.B. mRNA spezifisch aus komplexen Zelllysaten isoliert werden.

In noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Testkit, umfassend ein Protein nach dem ersten Aspekt der Erfindung und ein AdoMet-Analogon gemäß der folgenden Formel

wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus substituiertem oder unsubstituiertem C ₂ _ io-Alkyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₂ _io-Alkenyl, substituiertem oder

unsubstituiertem C ₂ _io-Alkinyl, substituiertem oder unsubstituiertem C4-io-Alkeninyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₃ -i ₂ -Cycloalkyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₃ i ₂ -Cycloalkenyl, substituiertem oder unsubstituiertem C5-i ₂ -Cycloalkinyl, substituiertem oder unsubstituiertem C5-i ₂ -Cycloalkeninyl, substituiertem oder unsubstituiertem Ci_io-Heteroalkyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₂ _io-Heterolkenyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₂ _io-Heteroalkinyl, substituiertem oder unsubstituiertem C4-io-Heteroalkeninyl, substituiertem oder unsubstituiertem Ci_io-Azidoalkyl, substituiertem oder unsubstituiertem C ₂ _ ₁₀ - Azidoalkenyl, substituiertem oder unsubstituiertem substituiertem oder unsubstituiertem C4-io-Azidoalkeninyl, substituiertem oder unsubstituiertem Benzyl Ph-CH ₂ - Propenyl CH ₂ =CH-CH ₂ -, Propinyl CH=C-CH ₂ -, Butinyl CH=C-CH ₂ -CH ₂ -, Penteninyl CH^C-CH=CH-CH ₂ - und Azidobutenyl N ₃ -CH ₂ -CH=CH-CH ₂ -.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testkits ist das AdoMet-Analogon AdoPropen, AdoEnYn oder AdoBenzyl, weist das Protein eine

Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 auf und weist an Position 34 gemäß SEQ ID NO: 2 Alanin, an Position 76 gemäß SEQ ID NO: 2 Asparaginsäure und an Position 92 der

Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 Arginin oder Alanin auf.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen allein zu

Veranschaulichungszwecken näher erläutert.

1. Synthese von S-Adenosyl-L-methionin- Analoga

1.1 Synthese von 5'-[(S)-[(3S)-3-Amino-3-carboxypropyl]prop-2-enylsulfonio]-5 '- desoxyadenosin (AdoPropen)

Das AdoMet-Analogon AdoPropen wurde nach einer Methode von Dalhoff et al. (C. Dalhoff, et al, Nat. Chem. Biol. 2006, 2, 31-32) hergestellt. Für die Synthese von AdoPropen wurden 20 mg S-Adenosyl-L-homocystein (52 μιηοΐ) unter Rühren in 3 mL Ameisensäure:Essigsäure 1 : 1 gelöst. Die Lösung wurde durch 10 minütiges Rühren im Eisbad gekühlt, bevor 264 μΙ _^ (3Α2 mmol) 3-Brompropen zugegeben wurde. Anschließend wurde die Reaktionslösung 4 Tage bei Raumtemperatur gerührt und durch Zugabe von 30 mL kaltem, didemineralisertem Wasser gestoppt. Die wässrige Phase wurde 3 Mal mit je 5 mL Diethylether extrahiert und

anschließend das Wasser unter vermindertem Druck entfernt. Der erhaltene Feststoff wurde in 5 mL didemineralisirtem Wasser+0.01 % TFA gelöst und mittels RP-HPLC gereinigt.

1.2 Synthese von 5'-[(S)-[(3S)-3-Amino-3-carboxypropyl]pent-2-en-4-inylsulfon io]-5'- desoxyadenosin (AdoEnYn) Das AdoMet-Analogon AdoEnYn wurde nach Peters et al. (W. Peters, S. Willnow, M. Duisken,

H. Kleine, T. Macherey, K. E. Duncan, D. W. Litchfield, B. Luscher, E. Weinhold, Angew Chem Int Ed Engl 2010, 49, 5170) hergestellt.

Für die Synthese des AdoMet-Analogons AdoEnYn wurde Pent-2-en-4-in-l-ol in einem ersten Schritt zum Methansulfonsäureester umgesetzt. Dazu wurden 240 mg (6.00 mmol)

Natriumhydroxid in 6 mL Dichlormethan resuspendiert, 426 μί (5.50 mmol)

Methansulfonylchlorid hinzugefügt und die Suspension im Eisbad gekühlt. Anschließend wurde ein Gemisch aus (E)- und (Z)-Pent-2-en-4-in-l-ol (472 μΕ, 6.02 mmol) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es erfolgte eine Extraktion mit 50 mL gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der aktivierte Alkohol direkt in 1 mL einer Lösung aus Methansäure und

Ethansäure (1 : 1) gelöst. Diese Lösung wurde zu 7.2 mg (19 μιηοΐ) S-Adenosyl-L-homocystein hinzugegeben und bei Raumtemperatur für 14 Stunden gerührt. Anschließend wurde diese in 30 mL ddH ₂ 0 gegeben und dreimal mit 50 mL Diethylether extrahiert. Die wässrige Phase wurde eingefroren und gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde in 2.5 mL ddH ₂ 0 mit 0.01 % TFA aufgenommen und mittels HR-ESI-MS analysiert. Anschließend erfolgte eine Reinigung mittels präparativer HPLC.

I.3 Synthese von 5'-[(S)-[(3S)-3-Amino-3-carboxypropyl]benzyl]-5'-desoxyadeno sin (AdoBenzyl)

Das AdoMet-Analogon AdoBenzyl wurde analog der Vorschrift von Dalhoff et al. (C. Dalhoff, et al, Nat. Chem. Biol. 2006, 2, 31-32) hergestellt. Für die Synthese von AdoBenzyl wurden 9,2 mg S-Adenosyl-L-homocystein ( 24 μιηοΐ) unter Rühren in 1.38 mL

Ameisensäure: Essigsäure 1 : 1 gelöst. Die Lösung wurde durch 10 minütiges Rühren im Eisbad gekühlt, bevor 171,2 μΐ _^ (1.44 mmol) Benzylbromid zugegeben wurde. Anschließend wurde die Reaktionslösung 4 Tage bei Raumtemperatur gerührt und durch Zugabe von 15 mL kaltem, didemineralisertem Wasser gestoppt. Die wässrige Phase wurde 3 Mal mit je 2,5 mL

Diethylether extrahiert und anschließend das Wasser unter vermindertem Druck entfernt. Der erhaltene Feststoff wurde in 2,5 mL didemineralisirtem Wasser+0.01 % TFA gelöst und mittels RP-HPLC gereinigt. 2. HPLC-gekoppelter Aktivitätsassay

Mit Hilfe eines HPLC-gekoppelten Aktivitätsassays wurde die durch die WT-GlaTgs2 (SEQ ID NO: 1) und die erfindungsgemäßen Proteine gemäß SEQ ID NO: 4-10 enzymatisch katalysierte Übertragung der von synthetisch hergestellten AdoMet- Analoga getragenen Reste Propenyl (AdoPropen), Penteninyl (AdoEnYn) und Benzyl (AdoBenzyl) auf das N2-Atom des

Guanosins von m ⁷ GpppA (A = Adenin) untersucht. Ein typischer Ansatz mit einem Volumen von 8 ist in Tabelle 1 zusammengefasst.

Tabelle 1 : Eingesetzte Komponenten für den Aktivitätsassay unter Verwendung von m ⁷ GpppA.

Komponente Volumen Endkonzentration

GlaTgs2 oder GlaTgs2-Variante 5.6 μΕ 15-50 μΜ

MTAN/LuxS (l : l) 0.16 μΕ 4.1 μM bzw. 3.0 μΜ

m ⁷ GpppA [10 mM] 0.22 μΕ 275 μΜ

AdoMet- Analogon 0.33 - 0.6 μΕ 365 - 740 μΜ

Reaktionspuffer 2 Ad 8 μΕ

Reaktionspuffer 2: 50 mM Tris; 10 mM MgCl ₂ ; 100 mM NH ₄ OAc; pH 8.4

MTAN steht für 5'-Methylthioadenosin/S-Adenosylhomocystein Nukleosidase. LuxS steht für S-Ribosylhomocystein Lyase. Bei größeren Ansätzen von 10 oder 20 μΐ _^ erfolgte eine verhältnismäßige Anpassung. Die eingesetzte Menge des AdoMet- Analogons wurde so angepasst, dass die Fläche des im

Chromatogramm auftretenden Peaks eines Diastereomers des AdoMet- Analogons der Fläche des vom m ⁷ GpppA verursachten Signals entsprach. Die Reaktion wurde in der Regel direkt nach Ansetzen der Reaktion (tO) und nach drei Stunden bei 37 °C (tl80) gestoppt und mittels analytischer HPLC sowie MALDI-TOF untersucht.

Die folgende Tabelle 2 gibt die Aktivität der GlaTgs2-WT im Vergleich mit untersuchten GlaTgs2 -Varianten wieder, wobei AdoPropen als AdoMet- Analogon eingesetzt wurde. Tabelle 2: Aktivität von GlaTgs2-WT und GlaTgs2- Varianten auf AdoPropen

Enzym SEQ ID NO: Aktivität TTN

GlaTgs2-WT 1 + 3±2

GlaTgs2-V34A 4 +++ 10±2

GlaTgs2-V34G 5 ++ 5

GlaTgs2-V34M 6 ++ 6

GlaTgs2-V34A,D76L 7 + 1

GlaTgs2-V34A,D76T 8 + 2

GlaTgs2-V34A,D76V 9 + 1

GlaTgs2-V34A,R92A 10 +++ 8

TTN = Total Turnover Number (Gesamtumsatzzahl). Aminosäureaustausche sind in der dem Fachmann bekannten Weise (Ursprüngliche Aminosäure - Position - neue Aminosäure) angegeben, wobei der Einbuchstabencode für Aminosäuren verwendet wird. V34A bedeutet beispielsweise, dass die ursprüngliche Aminosäure Valin an Position 34 durch Alanin ersetzt wurde.

Es zeigt sich, dass die erfindungsgemäßen Proteine zumindest eine mit dem Wildtypenzym vergleichbare oder höhere Aktivität aufwiesen.

Bei gleicher Enzymmenge wurden beispielsweise von der Variante GlaTgs2-V34A im Falle von AdoPropen 95% des m ⁷ GpppA umgesetzt, im Falle des AdoEnYn 10%. Beispielsweise mit der Variante GlaTgs2-V34A konnte auch eine Übertragung von Benzyl festgestellt werden.

Enzymatische Parameter für die GlaTgs2- Variante gemäß SEQ ID NO: 4 in Bezug auf

AdoPropen sind in Tabelle 3 wiedergegeben:

Tabelle 3: Enzymatische Parameter für GlaTgs2-WT und GlaTgs2-VV34A in Bezug auf AdoPropen Protein K -cat TTN T ₅₀ (15min)

GlaTgs2-WT 151±19 μΜ 0,09±0.08 min 3 39,9±0,2 °C

GlaTgs2-V34A 57±29 μΜ 8±0.08 min 10 40,4±0,2 °C

Die GlaTgs2 -Variante GlaTgs2-V34A (SEQ ID NO: 4) weist im Vergleich zum Wildtypenzym GlaTgs2-WT eine höhere Affinität für AdoPropen und eine höhere Aktivität mit AdoPropen auf. Die Thermostabilität entspricht der des Wildtypenzyms. Die kinetischen Parameter hinsichtlich AdoMet entsprachen denen des Wildtypenzyms (S. Hausmann, S. Shuman, J Biol Chem 2005, 280, 32101-32106.). 3. Thermostabilität

Die Stabilität eines Proteins kennzeichnet seine Fähigkeit denaturierende Einflüsse, wie eine Erhöhung der Umgebungstemperatur, innerhalb gewisser Grenzen zu tolerieren und die native Konformation aufrechtzuerhalten. Als Maß für die Thermostabilität kann der Tso-Wert verwendet werden. ist die Temperatur, bei der ein Enzym nach 15-minütiger Inkubation 50% seiner Aktivität verliert. Zur Bestimmung von T50 wurden die zu analysierenden Proteine für 15 Minuten bei unterschiedlichen Temperaturen im Thermocycler erhitzt, während eine Probe des Proteins auf Eis inkubiert wurde. Im Folgenden wurden Aktivitätstests mit den zuvor erhitzten Proteinen durchgeführt. Dabei wurde die auf Eis inkubierte Probe als Referenz genutzt, die 100 % Aktivität aufwies. Nach erfolgter Normierung der Werte konnte unter Anwendung eines Boltzmann-Fits mit der Software Origin bestimmt werden.

Wie aus Tabelle 4 ersichtlich, wiesen die GlaTgs2-Varianten GlaTgs2-V34A (SEQ ID NO: 4), GlaTgs2-V34G (SEQ ID NO: 5) und GlaTgs2-V34M (SEQ ID NO: 6) eine ähnliche

Thermostabilität auf oder zeigten sogar eine größere Thermostabilität, d.h. größere Stabilität gegenüber höheren Temperaturen. Tabelle 4: Thermostabilität der GlaTgs2-Varianten GlaTgs2-V34A, -V34M und -V34G im Vergleich zum Wildtyp. Variante SEQ ID NO: Thermostabilität, T

WT 1 39.9 ± 0.2

Val34Ala 4 40.4 ± 0.2

Val34Gly 5 44.8

Val34Met 6 49.0

4. Chemische Modifikation von enzymatisch modifizierten RNA-Kappen mittels Click- Chemie

4.1 Biotinylierung mittels Thiol-Ene-Click (TEC) Es wurden 800 μΜ m 1 GpppA enzymatisch zu Propenyl 2 m 1 GpppA 1 (a 2 m 1 GpppA; Propenyl an N2 von m ⁷ GpppA) alkenyliert und die Reaktion wurde durch Zugabe 1/10 Volumen 1 M Perchlorsäure oder 5-minütige Inkubation bei 68 °C gestoppt.

Die Ansätze wurden zentrifugiert und für die Umsetzung mit Biotin-Thiol 2 eingesetzt. Hierfür wurden sie etwa 30 Sekunden mit Argon entgast und unter Luftausschluss mit 1 mM

Radikalstarter VA-044 sowie Biotin-Thiol 2 (ca. 50-facher, molarer Uberschuss) versetzt. Die Ansätze wurden für 8 h bei 44 °C inkubiert und mittels HPLC und MALDI-TOF-MS analysiert.

VA044 = 2,2'-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propan]dihydrochlorid 4.2 Fluoreszenzmarkierung mittels Cu-Click-Reaktion

Die Cu-Click Reaktion wurde nach Tomkuviene et al. (M. Tomkuviene, B. Clouet-d'Orval, I. Cemiauskas, E. Weinhold, S. Klimasauskas, Programmable sequence-specific click-labeling of RNA using archaeal box C/D RNP methyltransferases, Nucleic Acids Research, 2012, 40, 14, 6765) durchgeführt. Hierzu wurden zunächst etwa 100 μΜ Pent-2-en-4-inyl ² m ⁷ GpppA

(p ² m7GpppA oder EnYn ² m ⁷ GpppA) 4 enzymatisch hergestellt und die Reaktion durch Zugabe 1/10 Volumen 1 M Perchlorsäure gestoppt.

Für die Cu-Click-Reaktion wurde eine 300 mM CuBr-Lösung (in DMSO/tBuOH 3: 1) frisch angesetzt und 1 : 10 mit 111 mM TBTA-Lösung (in DMSO/tBuOH 3: 1) verdünnt. Zu 10 der enzymkatalysierten Reaktion wurden dann 8 DMSO/tBuOH, 3 μΐ _^ der 30 mM CuBr-Lösung (in TBTA) sowie 2,5 μΐ, Eterneon-Azid 5 (Eterneon-Azid 480/635, Jena Bioscience GmbH, Kat. Nr. CLK-FA15-1) (2,5 mM in DMSO/tBuOH) gegeben. Die Reaktion wurde unter gelegentlichem Vortexen eine Stunde bei 37 °C inkubiert und gelektrophoretisch analysiert. TBTA = Tris[(l-benzyl-lH-l,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin), DMSO =

Dimethy lsulfo xid

4.3 Fluoreszenzmarkierung mittels Kreuzmetathese

Mittels Kreuzmetathese wurde gemäß nachstehend wiedergegebenem allgemeinem Schema eine Fluoreszenzmarkierung von Allyl-modifizierten mRNA-Kappen unter Verwendung von Flurorescein-o-acrylat 8 oder eines anderen fiuoreszenzmarkierten Acrylats und mit Hilfe eines Hoveyda-Grubbs-Katalysators 10 der 2. Generation vorgenommen.

Hierzu wurde beispielsweise die Allyl-modifizierte mRNA-Kappe 7 mit zwei Äquivalenten des Fluorescein-o-acrylats 8, das in DMSO gelöst war, sowie 2 mol % des Hoveyda-Grubbs-

Katalysators 10, der in 30% tBuOH in Wasser aufgenommen wurde, ebenfalls in 30% tBuOH in Wasser für fünf Stunden bei Raumtemperatur oder 37 °C unter Lichtausschluss inkubiert. Die Analyse erfolgte mittels 20 %iger Polyacrylamidgelelektrophorese sowie in-Gel

Fluoreszenzdetektion.

4.4 Funktionalisierung von Kappenstrukturen mittels Photoclick-Reaktion Im Folgenden ist beispielhaft eine Fluoreszenzmarkierung einer alkenylierten sowie einer alkinylierten mRNA- Kappe mittels Photoclick-Reaktion beschrieben. Hierzu wurden die Nitril- Imine I Ia und 12a der Tetrazole 11 und 12 mit dem Kappen- Analogon m ⁷ GpppA umgesetzt.

Zunächst wurden 1 mM m ⁷ GpppA in Gegenwart von AdoPropen und GlaTgs2-V34A zu a ² m ⁷ GpppA umgesetzt und die resultierende Mischung wurde anschließend auf 68 °C erhitzt und dialysiert, um nicht umgesetztes AdoPropen zu entfernen. Die Entfernung nicht umgesetzten AdoPropens diente dazu, zu verhindern, dass dieses in der folgenden Photoclick- Reaktion ebenfalls mit dem Nitril-Imin reagiert. Nach diesen Schritten wurde die wässrige Lösung von a ² m ⁷ GpppA mit Acetonitril sowie Tetrazol 11 (617 μΜ) versetzt und nach sorgfältigem Mischen in einer schwarzen Mikrotiterplatte fünf Minuten bei 254 nm bestrahlt. Es zeigte sich dabei, dass die Bestrahlung bei minimalem Abstand von Reaktion und

Lichtquelle essentiell für die erfolgreiche Durchführung war und die Bildung des reaktiven Nitril-Imins bei Vergrößerung des Abstandes scheinbar ausblieb beziehungsweise minimiert wurde. Die in der Probe enthaltenen Komponenten wurde nach einer Inkubation von bis zu 20 Stunden bei 4 °C gelelektrophoretisch getrennt und hinsichtlich des Auftretens fluoreszierender Produkte analysiert. Hierzu wurde das Gel bei einer Wellenlänge von 365 nm beleuchtet und fotografiert. Für die Reaktion, welche in Anwesenheit der alkenylierten Kappe a ² m ⁷ GpppA durchgeführt wurde, konnte dabei ein türkis- fluoreszierendes Produkt nachgewiesen werden. Eine parallel durchgeführte Analyse des Gels mittels UV-Shadowing zeigte, dass das detektierte fluoreszierende Produkt eine geringere Elektromobilität und damit vermutlich ein höheres Molekulargewicht als die Kappe aufwies. Dies steht im Einklang mit der Möglichkeit, dass die entsprechende Bande das erwartete Photoclick-Produkt (P ¹ -Adenosin(5')-P ³ -[N ² -ethyl- 2-(4-(4-Methoxyphenyl)-2-phenylpyrazolin),7-methylguanosin(5 ')]triphosphat; Synonym: N ² - Methoxypyrazolinethyl-m ⁷ GpppA) 14 darstellte, da dieses ein höheres Molekulargewicht als das Kappen- Analogon a ² m ⁷ GpppA 13 bei gleicher Ladung aufweisen würde. In

Kontrollansätzen konnte kein entsprechendes fluoreszierendes Signal nachgewiesen werden. Die Kontrollen beinhalteten die Durchführung der Biokonversion ohne Enzym, ohne

AdoPropen, ohne m7GpppA sowie in Gegenwart von denaturiertem Enzym. In allen diesen Kontrollen konnte daher nachweislich keine alkenylierte Kappe, welche das Substrat für die Photoclick-Reaktion darstellen sollte, gebildet werden. Da somit in Abwesenheit von a ² m ⁷ GpppA kein fluoreszierendes Produkt nach der Photoclick-Reaktion beobachtet werden konnte, ergibt sich, dass dass eine Fluoreszenzmarkierung der alkenylierten Kappe mittels Tetrazol 11 erfolgreich und spezifisch vorgenommen werden konnte. Dies wurde auch durch die massenspektrometrische Analyse mittels HPLC-ESI-TOF-MS verifiziert. Hierbei konnte in der Reaktionmischung die Masse des erwarteten Photoclick- Produkts 14 nachgewiesen werden (ber. [M] ⁺ = 1051,23 m/z; det. [M] ⁺ = 1051,23 m/z). Um die Photoclick-Reaktion des Tetrazols 11 und a ² m ⁷ GpppA 13 auch im Hinblick auf die potentielle Anwendungen in Zellen weiter zu charakterisieren, wurde eine erste kinetische Analyse durchgeführt. Hierzu wurde die Reaktion wie oben beschrieben durchgeführt, jeweils aber ein Teil der Probe bereits nach einer Inkubation von 5, 30, 120 und 240 Minuten durch Detektion fluoreszierender Produkte analysiert. Hierbei zeigte sich, dass das Photoclick Produkt 14 bereits nach 5 Minuten nachgewiesen konnte, wobei auf Basis der detektierten

Fluoreszenzintensität zu späteren Zeitpunkten keine weitere Umsetzung beobachtet wurde. Daraus geht hervor, dass die Reaktion aufgrund ihrer Kinetik auch für die Visualisierung von mRNA in lebenden Zellen geeignet ist, da ein sichtbares Signal bereits kurze Zeit nach der Induktion erhalten werden kann. Die Untersuchung von PC3 -Zellen nach einer fünf minütigen Bestrahlung mit UV-Licht (λ= 254 nm) ergab im Übrigen, dass zwar ein Effekt auf die

Morphologie der Zellen, nicht jedoch auf deren Vitalität zu beobachten war, so dass eine Anwendung ermöglicht wird, ohne dass die Zellen durch die UV-Bestrahlung bei der

Untersuchung absterben. Neben der Bildung eines fluoreszierenden Produkts unter

Verwendung von a ² m ⁷ GpppA als Edukt und der hohen Reaktionsgeschwindigkeit ist somit auch die Dauer der Bestrahlung zur Aktivierung des Tetrazols kompatibel mit Anwendungen in lebenden Zellen.

Die oben beschriebenen Photoclick-Reaktionen wurden auch für die Kombination Nitril-Imin 12a und a ² m ⁷ GpppA 13 erfolgreich durchgeführt, und es wurde das entsprechende Photoclick Produkt (P ¹ -Adenosin(5')-P ³ -[N ² -ethyl-2-(4-(4-Methylbenzoat)-2-phenylpyrazolin),7- methylguanosin(5')]triphosphat; Synonym: N ² -Benzoatpyrazolinethyl-m ⁷ GpppA) 16 erhalten.

Dabei wurde beobachtet, dass sich die Photoclick-Produkte der Tetrazole 11 und 12 mit a ² m ⁷ GpppA in ihren Emissionsmaxima anscheinend unterscheiden. Die Photoclick-Reaktionen können somit unter Umständen auch eingesetzt werden, um auch in vivo bei einer beliebigen Wellenlänge emittierende Fluorophore zu erzeugen.

4.4.2 Fluoreszenzmarkierung einer alkinylierten mRNA-Kappe Es wurde auch eine Photoclick-Reaktion für die Kombination Nitril-Imin I Ia und p ² m ⁷ GpppA 15 durchgeführt.

Hierzu wurde die oben beschriebene Photoclick-Reaktion zur Fluoreszenzmarkierung von a ² m ⁷ GpppA mittels Tetrazol 11 zur Modifizierung des alkinylierte Kappen- Analogons p ² m ⁷ GpppA 15 eingesetzt. Die Biokonversion von m7 GpppA mit AdoEnYn wurde dafür mit GlaTgs2-V34A sowie als Kontrolle in Gegenwart des denaturierten Enzyms durchgeführt. Hierdurch wurde gewährleistet, dass in beiden Ansätzen gleiche Komponenten vorlagen, aber in der Kontrolle die Bildung des Photoclick-Edukts p ² m ⁷ GpppA ausblieb. Nach erfolgter Initiation der Photoclick-Reaktion durch Beleuchtung mit einer Wellenlänge von 254 nm wurden Reaktions- und Kontrollansatz für 20 Stunden bei 4°C inkubiert und nach gelelektrophoretischer Trennung der enthaltenen Bestandteile hinsichtlich der Bildung eines fluoreszierenden Cycloaddukts charakterisiert. Bei der Beleuchtung des Gels mit einer Wellenlänge von 365 nm konnte hierbei in der Reaktionsmischung eine fluoreszierende Bande detektiert werden, die in der Kontrolle nicht auftrat und so dem entsprechenden Pyrazolin (P ¹ - Adenosin(5')-P ³ -[N ² -but-2-en-4-(4-(4-Methoxyphenyl)-2-phenylpyrazolin)yl, 7- methylguanosin(5')]triphosphat; Synonym: N ² -Methoxypyrazolinbutenyl-m ⁷ GpppA) 17 zugeordnet werden konnte.

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