Средство для лечения связанных со стрессовыми условиями заболеваний и расстройств у человека и животных, а также способ лечения и/или профилактики с использованием этого средства.

Данное изобретение относится к олигопептидам с положительными фармакологическими свойствами и применению этих олигопептидов для лечения и/или предотвращения связанных со стрессовыми условиями заболеваний и расстройств у человека и животных. Изобретение также охватывает использование этих пептидов для производства фармацевтических композиций.

Настоящее изобретение относится к олигопептидам с фармакологической активностью, которые являются пригодными веществами для терапии и предотвращения возникающих связанных со стрессом патологических изменений, которые относятся к центральной нервной системе (ЦНС), но ей не ограничиваются.

Сокращения

АДГ - антидиуретический гормон

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

ДСИП - дельта-сон индуцирующий пептид

СДСИП - семейство дельта-сон индуцирующего пептида

KND - KN-DSIP, ΚΝ-ДСИП, (что соответствует (Lys,Asn)-DSIP. Согласно однобуквенному коду аминокислот Lys обозначается символом К, a Asn обозначается символом N)

CKND - семейство ΚΝ-пептида

USP = фармакопея США

ЦНС - центральная нервная система

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

МАО - моноаминооксидаза

МДА - малоновый диальдегид

ГАМК - гамма-аминомасляная кислота

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфо сфат Определения

Аналоги пептидов

Аналогами называются пептиды, описанные в общей формуле (I) - см. ниже, отличающиеся от пептида с основной заявляемой аминокислотной последовательностью заменой одних аминокислотных остатков на другие, в том числе и на непротеиногенные остатки, или превращением пептидов общей формулы (I) в соответствующие циклические пептиды или (ретро-инверсо)-аналоги или заменой амидных связей между остатками на соответствующие Ν-алкиламидные или сложноэфирные связи (N- алкилированные и депсипептидные аналоги).

Производные пептидов формулы (I) по сути также являются аналогами пептидов формулы (I). Здесь (и обычно в литературе) производные пептидов химически более соответствуют продуктам модификации основной пептидной цепи или боковых цепей аминокислотных остатков, например, посредством их Ν-ацилирования остатками жирных кислот или путем превращения С-концевых карбоксильных групп пептидов в сложноэфирные, амидные или >Т-алкил(арил)амидные группировки.

Мулътимеры соответствуют структурам, состоящим из нескольких идентичных пептидных единиц, объединенных ковалентными связями в одну конструкцию непосредственно через функциональные группы мономерных единиц или путем использования разного рода известных разветвляющих или мостиковых агентов.

Протеиногенными (белковыми) аминокислотами называются аминокислоты, являющиеся структурными элементами белков живых организмов.

Фармацевтически приемлемыми солями называются соли, приведенные в Фармакопее США или любой другой принятой фармакопее. К этим солям относятся, но не ограничиваются ими, соли минеральных или органических кислот, таких как угольной, соляной, серной кислоты, фосфорной кислоты, а также молочной, бензойной, лимонной, щавелевой кислоты и других кислот.

Носители и вспомогательные наполнители

Соответствующие носители и вспомогательные ингредиенты обеспечивают возможность медицинского использования фармацевтической композиции и при необходимости способствуют сохранности защищаемого(ых) патентом олигопептида(ов) при хранении и производстве готовых лекарственных форм. Подобные вещества хорошо известны специалистам и могут быть найдены в стандартной литературе. Соответствующими, но не ограничивающимися только нижеследующими, являются, например, карбонат/фосфат кальция, различные моно-и дисахариды, полисахариды, жиры, биополимеры, такие как человеческий альбумин, а также биосовместимые полимеры, например, полиэтиленгликоль.

Стресс отнесен ВОЗ к одному из основных угрожающих здоровью человека факторов. Стресс является физиологическим ответом организма на повреждающие факторы различного происхождения или угрозу воздействия таких факторов. Стресс может быть вызван рядом факторов, так называемых стрессоров: кроме физических и психических травм, вызванных тяжелыми несчастными случаями или инфекционными заболеваниями, химические раздражения или радиация также способны способствовать возникновению стресса. Приводимые источники информации (1-26) иллюстрируют как природу стресса, так и являются предшествующим уровнем знаний относительно заявляемых изобретений.

Острый и хронический стресс могут нарушать гомеостаз организма или ослаблять его, что выражается в ухудшении способности поддерживать физиологический баланс жизненно важных функций, например поддержания сердечной деятельности или дыхания.

Потеря организмом способности к поддержанию гомеостаза может приводить к постоянному нарушению функционирования основных органов и систем, таких как нейроэндокринной и сердечно-сосудистой. Типичными последствиями нарушения способности адекватно реагировать на продолжительный стресс могут быть: психосоматические или иммунологические расстройства, и даже повреждения органов, такие как инфаркт миокарда и, например, стресс-индуцированные язвы желудка.

Гомеостаз нервной системы и организма в целом поддерживается в существенной степени за счет нейрорегуляторных факторов - нейрогормонов, нейромодуляторов и нейротрансмиттеров, которые могут непосредственно секретироваться клетками гипоталамуса (1), а также различными секреторными клетками, в том числе и вне пределов ЦНС, например, в тонком кишечнике.

Нейрорегуляторные факторы вызывают изменения функционирования организма млекопитающих, некоторые из них способствуют поддержания гомеостаза. Часто нейрорегуляторные факторы имеют пептидную природу (2).

В качестве примера таковых можно привести нонапептид АДГ (антидиуретический гормон, вазопрессин), который в качестве "гормона жажды" регулирует реабсорбцию воды в почках. К эндогенным регуляторным пептидам модуляторного типа относится так называемый дельта-сон индуцирующий пептид (ДСИП), который является наиболее близким к настоящему изобретению объектом сравнения и отличается от заявляемых в данном патенте молекул, описанных ниже, своей первичной структурой, а именно природой двух аминокислотных остатков молекулы. Структура ДСИП была установлена в 1977 г. Было показано, что у кроликов при низкочастотной электростимуляции таламуса в дельта-фазу сна в церебральной венозной крови обнаруживается нейропептид с аминокислотной последовательностью Trp-Ala-Gly-Gly- Asp-Ala-Ser-Gly-Glu (3-4).

Последующее подробное изучение этого фактора различными группами ученых во всем мире показали, что основным возможным полем его применения явится не только терапия расстройств сна (5-7), а область предотвращения развития стресс- индуцированной патологии организма и терапия последствий развития патологии. Исследования терапевтических свойств ДСИП показали его повышенный терапевтический эффект при эндо-и экзогенных нарушениях гомеостаза ЦНС (8-11).

В ЕР 1949906 А1 (12) ДСИП описывается как средство для лечения и профилактики против стресс-индуцированного массивного повреждения нервных клеток, вызываемого стресс-индуцирующими факторами, такими как радиация, инфекция либо травма. ДСИП стабилизирует базовые функции ЦНС и вследствие этого оказывает корригирующее действие на нарушения гомеостаза организма в целом.

Различные эффекты ДСИП на эндокринную регуляцию организма не ограничиваются улучшением его сопротивления стрессорам: описаны и более фундаментальные свойства пептида, такие как взаимодействие с системой кортикотропина, антиоксидантные, иммуномодулирующие эффекты и мембранотропные свойства (13-15).

Наличие целого семейства пептидов, к которому относится ДСИП, было предположено еще в 1990-е годы, поскольку известно, что эндогенный ДСИП (как иммунореактивный фактор) может обнаруживаться как в исходной, так и в фосфорилированной или гликолизированной форме (16).

Предшествующим уровнем техники относительно данного изобретения являются также патент ЕР 0065747 В1 (23), который описывает ДСИП в качестве агента, пригодного к контролированию симптомов абстинентного синдрома, патент RU 2099078 С1 (24), описывающий медицинское использование антистрессового средства на основе ДСИП и патент RU 2115660 С1 (25), описывающий аналоги ДСИП в качестве антистрессовых и противосудорожных агентов.

Настоящее изобретение было сделано с учетом предшествующего уровня знаний, с целью представить новое семейство пептидов, регулирующих функции организма, с предпочтительно возникающими терапевтическими, в особенности стресс- протективными и адаптогенными свойствами.

Заявляемые средства - семейства пептидов - включают аналоги и производные основного заявляемого пептида, приведенные в общей формуле (I), которая является акронимом нового семейства пептидов:

(I) Χ-Υ'-Υ ² -Υ ³ -Υ ⁴ -Ζ

где Z=Y ⁵ -Y ⁶ -Y ⁷ -Y ⁸ - Y ⁹ -R, или Z=Y ⁵ -Y ⁶ -R, или Z=R;

X = Н или ацильный остаток муравьиной, уксусной, пропионовой или другой жирной кислоты (например, пальмитиновой, стеариновой), а также их алкил- или

(арил)алкил-производное ;

Y ¹ = остаток ароматической аминокислоты Тгр или Туг, Phe или соответствующее их Ν-метильное производное L- или D-конфигурации;

Y ² = аминокислотный остаток Lys или Arg, His, Orn или их Ν-метильное производное L- или D-конфигурации;

Y ³ = Y ⁴ = остаток Gly или Ala, Thr, Ser, Asn L- или D-конфигурации;

Y ⁵ =остаток Asn или Gin, их Ν-алкиламидное производное, Asp, Glu, их сложноэфирное производное, или М ^а -метильное производное указанных остатков L- или D-конфигурации;

Y ⁶ = остаток Ala или остаток β-Ala, Gly, Ser, Thr, Phe, Val, L- или D-конфигурации;

Y ⁷ = остаток Ser или остаток Thr, Asn, Gin L- или D-конфигурации;

Y ⁸ = остаток Gly или остаток Ala, Ser, Thr, Asn L- или D-конфигурации;

Y ⁹ = остаток Glu, Asp, Asn, Gin L- или D-конфигурации;

R = -OH, -ORi , -NH ₂ , -NHR], или -N(Rj) ₂ (где Ri -алкил или арилалкил).

Представлено новое семейство регуляторных пептидов, родственных ДСИП, но неизвестного ранее строения, которые отличаются от настоящего уровня знаний (ДСИП) природой двух аминокислотных остатков пептидной цепи, соответствующей известной структуре ДСИП. Такие изменения в структуре 2 аминокислотных остатков приводят к усилению терапевтического эффекта, в частности, в предотвращении и терапии связанных со стрессом заболеваний у человека и животных. Авторы изобретения показывают в эксперименте с форсированным плаванием на крысах, что предмет изобретения увеличивает стресс-устойчивость животных при сравнении с ДСИП.

Настоящее изобретение относится к профилактике и лечению патологических и связанных со стрессом нарушений гомеостаза организма человека и животных.

Что касается механизма действия CKND, авторы изобретения предполагают, что пептиды оказывают модулирующее влияние на уровень возбуждающих и ингибиторных нейротрансмиттеров, в том числе ГАМК, серотонина или глутамата. Как и СДСИП, предмет настоящего изобретения может также модулировать активность ключевых мембранных митохондриальных ферментов, а также ферментов, контролирующих метаболизм в ЦНС и периферических тканях, таких как: моноаминоксидазы А, гексокиназы, НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы, креатинкиназы, ферментов дыхательной цепи, гипоталамической глутаминсинтетазы, супероксидцисмутазы (8, 9, 13). .

Компьютерный поиск аминокислотных последовательностей, гомологичных предмету изобретения с помощью программы поиска BLAST (PubMed, Basic Local Alignment Search Tool) выявил наличие 100%-ного соответствия участку человеческого ядерного белка 1 В, (называемого «Jumonji domain containing 1В») , локализованного на 5 хромосоме генома человека, и состоящего из 1551 аминокислотных остатков (17).

JMJD1B является членом семейства гистоновых деметилаз типа JHDM1 и JHDM2, включающих домен JmjC. JmjC-домен-содержащие гистоновые деметилазы, способные деметилировать лизиновые остатки гистонов, консервативны у разных видов от дрожжей до человека. Метилирование-деметилирование гистонов является важным механизмом посттрансляционных модификаций и играет исключительную роль в регуляции структуры хроматина и транскрипции генов. Эти ферменты убиквитарно представлены в различных тканях. Первые исследования базового гена JMJ предполагают его важную роль в развитии нервной системы и некоторых органов, таких как печень, селезенка, тимус (18, 19).

ЕР 1950286А1 (22) закрывает использование смеси ферментов домена Jumonji, обладающих деметилирующими свойствами, в особенности для лечения рака предстательной железы .

Данное изобретение сделано с учетом предшествующего уровня знаний, с целью представить новое семейство пептидов, регулирующих функции организма, с предпочтительно возникающими терапевтическими, в особенности стресс- протективными и адаптогенными свойствами.

Новое семейство олигопептидов с длиной пептидной цепи в 4, 6 или 9 аминокислотных остатков, как было указано выше, соответствует следующей общей формуле :

(I), X-Y'-Y ² -Y ³ -Y ⁴ -Z

где Z=Y ⁵ -Y ⁶ -Y ⁷ -Y ⁸ - Y ⁹ -R, или Z=Y ⁵ -Y ⁶ -R, или Z=R;

X = Н или ацильный остаток муравьиной, уксусной, пропионовой или другой жирной кислоты (например, пальмитиновой, стеариновой), а также их алкил- или

(арил)алкил-производное ;

Y ¹ = остаток ароматической аминокислоты Тгр или Туг, Phe или соответствующее их Ν-метильное производное L- или D-конфигурации;

Y - аминокислотный остаток Lys или Arg, His, От или их Ν-метильное производное L- или D-конфигурации;

= остаток Gly или Ala, Thr, Ser, Asn L- или D-конфигурации;

Y ⁵ =остаток Asn или Gin, их Ν-алкиламидное производное, Asp, Glu, их сложноэфирное производное, или М ^а -метильное производное указанных остатков L- или D-конфигурации;

Y ⁶ = остаток Ala или остаток β-Ala, Gly, Ser, Thr, Phe, Val, L- или D-конфигурации;

Y ⁷ = остаток Ser или остаток Thr, Asn, Gin L- или D-конфигурации;

Y ⁸ = остаток Gly или остаток Ala, Ser, Thr, Asn L- или D-конфигурации;

Y ⁹ = остаток Glu, Asp, Asn, Gin L- или D-конфигурации;

R = -OH, -OR} , -NH ₂ , -NHR _1? или -N(Ri)2 (где -алкил или арилалкил).

Предмет изобретения - заявляемый пептид K D из группы пептидов общей формулы (I) имеет следующую структуру : TrpLysGlyGlyAsnAlaSerGlyGlu.

Пептиды вышеприведенной общей формулы (I) можно синтезировать классическими методами синтеза пептидов, как традиционным способом синтеза в растворе, так и твердофазным способом синтеза на полимерном носителе Очистку пептидов проводят хроматографическими методами. Анализ структуры и степени индивидуальности синтетических пептидов осуществляют современными физико- химическими методами. Эти методы хорошо разработаны и описаны в соответствующей литературе (20, 21).

В группу заявляемых пептидов могут входить также приведенные ниже следующие аналоги и производные пептидов семейства (I): 1. циклические аналоги, образуемые с помощью известных методов синтеза циклопептидов путем замыкания (4-16)-членного цикла через N- и С-концевые или боковые функциональные группы, в том числе и при включении в цикл дополнительных низкомолекулярных мостиков массой до 500D.

2. (ретро-инверсо)-аналоги пептидов общей формулы (I), получаемые методами синтеза пептидов из соответствующих D-аминокислотных производных при изменении направления ацилирования , например, следующего вида: A-B-C-D-E-F (некий пептид, все остатки L-конфигурации) и F-E-D-C-B-A (его (ретро-инверсо)-аналог или синоним (ретро-энантио)-аналог, все остатки D-конфигурации). Последние аналоги являются зеркально симметричными первым и могут одинаково распознаваться биологическими мишенями.

3. мультимеры пептидов, соответствующих общей формуле (I), образуемые путем синтеза конструкций, где несколько мономерных единиц (от 2 до 6) через их функциональные группы связаны непосредственно друг с другом ковалентными связями или посредством включения между мономерами низкомолекулярных разветвляющих мостиков аминокислотной или другой природы, например, агентов типа производных лизина или других полиаминов или поликислот.

4. пептиды, присоединенные (в том числе адсорбированные или инкапсулированные) к различным фармакологически приемлемым полимерным носителям, например, полиакрилатам, полилактатам, полисахаридам, желатину и др..

Общая формула может быть расширена путем добавления дополнительных пептидных фрагментов к одному либо к обоим концам аминокислотной цепи нонапептидов типа (I) , таким образом, чтобы удлиняющие фрагменты с С- и/или N- конца включали от 1 до 5 белковых аминокислотных остатков каждый. N- и С- концы как любых удлиненных пептидов так и всех пептидов формулы (I) могут быть свободными и не иметь заместителей по N- и С-концам аминокислотной цепи либо быть блокированными группами X и/или R.

Также к вышеуказанному семейству пептидов относятся такие пептиды, которое существует полностью либо частично в виде композиций с фармацевтически приемлемыми носителями. ι

Данное изобретение также относится к смесям пептидов настоящего изобретения с другими нейропептидами, например ДСИП, его аналогами и их фармацевтически приемлемыми солями и фармацевтически подходящими растворителями и/или растворами и/или наполнителями, например, дистиллированная вода, физиологический раствор, подходящие буферные растворы, карбонат/фосфат кальция, различные моно-и дисахариды, полисахариды, жиры и пр. Данное изобретение также относится к смесям с другими известными нейропротективными агентами, такими как, например, пирацетам. Можно полагать, что совместное применение пептидов данного изобретения с пирацетамом будет способствовать усилению протективного эффекта каждого компонента в отдельности, как это было описано ранее для смеси ДСИП и пирацетама (26). Эти смеси могут быть использованы в производстве фармацевтических композиций при получении лекарственных форм, подходящих для лечения и/или предотвращения заболеваний, в особенности связанных со стресс-индуцированными заболеваниями и расстройствами функций организма у людей и животных.

Предметом настоящего изобретения являются также другие фармацевтические композиции пептидов семейства KND, указанного в вышеприведенной общей формуле (I) и прочих синергически действующих компонентов, таких как белковые аминокислоты (напр. нейротрансмиттеры глицин, аргинин и прочие аминокислоты), естественные антиоксиданты, напр. карнитин, карнозин, гомокарнозин или их предшественники, например, ацетилпроизводные.

Соотношение основных компонентов вышеуказанных фармацевтических композиций по массе следующее: пептидный компонент: аминокислотный компонент: естественный антиоксидантный компонент 1 : (0-250) : (0-250).

Настоящие композиции также могут включать различные прочие нейропротективные метаболически активные вещества (одно или более), такие как фосфолипиды (лецитин), ненасыщенные жирные кислоты, холин и его дериваты, триметилглицин, витамин С, витамин А и/или его предшественники, никотинамид, витамин Е, витамины группы В, фолиевую кислоту, липоевую кислоту, эйкозапентоеновую и докозагексаеновую кислоты, биофлавоноиды, коэнзим Q 10, таурин, терпены, полифенолы, экстракты растительного происхождения (чеснока, лука, зеленого чая, гингко белуба, женшеня, лакричника, имбиря, готу колы, хвойных растений), янтарную кислоту, рибоксин, макро-и следовые элементы (магний, кальций, калий, хром, селен) и т.д.

Композиции могут включать прочие приемлемые ингредиенты, обычно используемые для приготовления лекарств как наполнители, улучшители вкуса и отдушки, подсластители, консерванты и т.д. Настоящие композиции базируются на природных веществах, которые также могут включаться в парафармацевтические биологически активные добавки, гомеопатические средства и детское питание. Предмет изобретения включает терапевтически эффективное количество пептидов изобретения для применения в диапазоне доз от нескольких мкг/кг до 1-10мг/кг или в гомеопатических дозах в случае гомеопатических лечебных форм.

Известно, что вещества пептидной природы оказывают свое действие не только будучи введенными в виде различных инъекций, но и с использованием других путей доставки, в частности интраназального (11).

Заявляемое средство может вводиться интраназально в форме носовых капель, в виде спрея, распыляемого порошка, аэрозоля, подъязычно в форме рассасывающихся таблеток, капсул и порошков; в виде различных инъекций (внутривенных, внутримышечных, подкожных и внутрикожных); интралюмбально и интрацистернально (интравентрикулярно), чрескожно с помощью приборов для лечебного электрофореза; в виде суппозиториев, мазей, кремов, лосьонов, а также включаться в продукты детского питания.

Предмет изобретения относится также к применению олигопептидов семейства KND в качестве пептидных антигенов для получения специфических анти-антител для медицинских целей, введение которых в организм может приводить к тем же эффектам, что и применение основной исходной субстанции.

Настоящее изобретение относится к средствам, которые обладают фармакологической активностью и являются веществами, пригодными для терапии и предотвращения стресс-индуцированных патологических изменений. Эти изменения относятся, в основном, к ЦНС, но только ей не ограничиваются. Экзогенные и эндогенные факторы, такие как интоксикации, травма, тяжелые заболевания, вызывают стресс и могут провоцировать нарушение гомеостаза организма в целом. В случае, если организм не способен справиться с данными нарушениями гомеостаза, вследствие различных заболеваний или хронических нарушений, как функциональных, так и органических, могут развиваться так называемые стресс-индуцированные заболевания и расстройства.

Часто имеют место не только функциональные, но и морфологически видимые органические повреждения ЦНС, характеризующиеся массивной гибелью нейронов.

Описываемые средство, а в особенности предпочтительная формула, равно как и ее дериваты, аналоги и физиологически приемлемые соли, способно предотвращать развитие дефицита эндогенных регуляторных пептидов, например ДСИП и прочих, которые могут возникать в случае тяжелых либо хронических стрессовых ситуациях. Эксперименты на животных показали сходную направленность действия ДСИП и KND, причем K D даже превосходил ДСИП по эффективности по некоторым параметрам.

Ниже в качестве примера описывается действие предмета изобретения. С целью лучшего представления данных производится сравнение между ДСИП, KND и контрольной группой.

Примеры:

1. Материалы и методы.

Проведена экспериментальная оценка биологической активности семейства олйгопептидов KND, а также некоторых вариантов композиций и смесей олигопептидов данного семейства с другими фармацевтическими агентами.

270 крыс-самцов линии Вистар в возрасте 3 месяца были разделены на 18 групп и получали в каждой группе по 5 крыс подкожно в течение 2 периодов введения по 4 суток в течение 2 недель дозы по 100 мкг/кг пептидов семейства и их композиций, кроме двух случаев (см. ниже), в которых пептиды семейства KND вводились в более высоких дозировках (250 и 400 мкг/кг); 100 мкг/кг ДСИП, растворенных в воде для иньекций в объеме 0,2 мл, либо воду для иньекций в объеме 0,2 мл на крысу. Введение осуществлялось утром.

Вводились следующие варианты пептидов семейства KND и их композиций с другими фармакологическими агентами:

KND-1: вещество с аминокислотной последовательностью

TrpLysGlyGlyAsnAlaSerGlyGlu;

KND-2: вещество с аминокислотной последовательностью

TyrLysGlyGlyAsnAlaSerGlyGlu,

KND-3: вещество с аминокислотной последовательностью

TrpMeLysGlyGlyAsnAlaSerGly Glu,

KND-4: вещество с аминокислотной последовательностью

TrpLysGlyGlyAsnAlaSerAlaGlu,

KND-5: вещество с аминокислотной последовательностью

TrpArgAlaGly AsnTyrSerGlyGlu,

KND-6: вещество с аминокислотной последовательностью

TrpLysGlyGlyAspAlaSerGly Glu, KND-7: вещество с аминокислотной последовательностью

TrpLysGlyGlyGluAlaSerGly Glu,

KND-8: вещество с аминокислотной последовательностью

TrpOrn Gly GlyAsnAlaSerGly Glu,

KND-9: вещество с аминокислотной последовательностью

TrpLysAla GlyGlnAlaSerGlyGlu,

KND-10: вещество с аминокислотной последовательностью

TrpHisAlaGlyAspAlaSerGlyGlu,

KND-11 : вещество с аминокислотной последовательностью

TrpLysGlyGlyAsnAlaThrGlyGlu

KND-12: вещество с аминокислотной последовательностью

TrpLysGlyGlyAsnAlaSerGlyGlu в смеси с синергически действующей аминокислотой глицин,

KND-13: вещество с аминокислотной последовательностью

TrpLysGlyGlyAsnAlaSerGlyGlu в смеси с синергически действующей аминокислотой глицин и естественным антиоксидантом карнозином в соотношении 1 : 25 : 30,

KND-14: вещество с аминокислотной последовательностью

TrpLysGlyGlyAsnAlaSerGlyGlu в смеси с синергически действующей аминокислотой глицин и естественным антиоксидантом карнозином в соотношении 1 : 50 : 50,

KND-15: вещество с аминокислотной последовательностью

TrpLysGlyGlyAsnAlaSerGlyGlu в смеси с синергически действующей аминокислотой глицин и естественным антиоксидантом карнозином в соотношении 1 : 100 : 100,

KND-16: вещество с аминокислотной последовательностью

TrpLysGlyGlyAsnAlaSerGlyGlu в смеси с дополнительным нейропротективным метаболически активный компонентом рибоксином,

KND-17: вещество с аминокислотной последовательностью

TrpLysGlyGlyAsnAlaSerGlyGlu, вводившееся в дозе 250 мкг/кг,

KND-18: вещество с аминокислотной последовательностью

TrpLysGlyGlyAsnAlaSerGlyGlu, вводившееся в дозе 400 мкг/кг.

2. Исследование токсичности. Масса тела взрослых грызунов является общепринятым параметром для исследования токсичности различных веществ. Увеличение массы тела между днями первого и последнего введений была сравнимой во всех группах (таблица 1).

KND-1 (см. пункт формулы изобретения 1)

K D-3 (см. пункты формулы изобретения 1,2) Увеличение Контроль ДСИП KND-3 массы тела, г

Среднее 21,20 22,14 20,01 значение

Стандартное 6,70 4,96 4,14 отклонение

N 5 5 5

KND-4 (см. пункты формулы изобретения

KND-5 (см. пункты формулы изобретения 1,2)

KND-6 (см. пункты формулы изобретен]

KND-7 (см. пункты формулы изобретения 1,2)

Увеличение Контроль ДСИП KND-7 массы тела, г

Среднее 20,19 23,02 18,00 значение

Стандартное 6,71 9,90 10,14 отклонение

N 5 5 5

KND-8 (см. пункты формулы изобретения 1,2)

Увеличение Контроль ДСИП KND-8 массы тела, г

Среднее 18,20 19,00 21,00 значение j

Стандартное 7,90 8,60 8,10 отклонение

N 5 5 5

KND-9 (см. пункты формулы изобретения 1,2)

KND-10 (см. пункты формулы изобретения 1,2)

KND-11 (см. пункты формулы изобретения 1,2)

KND-12 (см. пункт формулы изобретения 3) Увеличение Контроль ДСИП KND-12 массы тела, г

Среднее 23,10 22,00 24,00 значение

Стандартное 6,79 3,90 6,13 отклонение

N 5 5 5

KND-13 (см. пункт формулы изобретения 3)

KND-14 (см. пункт формулы изобретения 3)

KND-15 (см. пункт формулы изобретения 3)

iGSiD-16 (см. пункт формулы изобретения 3)

KND-17 (см. пункт формулы изобретения 8)

Увеличение Контроль ДСИП KND-17 массы тела, г

Среднее 20,2 21,4 19,5 значение

Стандартное 2,4 3,5 1,9 отклонение

N 5 5 5

K D-18 (см. пункт формулы изобретения 8)

Таким образом, токсичности ни одного из исследованных веществ не зарегистрировано .

3. Тест форсированного плавания

Через два часа после последнего введения KND 1-18, ДСИП или воды крысы прошли исследование в тесте форсированного плавания, который позволяет оценивать как физическую силу и выносливость животного, так и психоэмоциональное состояние.

Тест проводился в бассейне с водой, температура которой контролировалась термометром и составляла на протяжении всего эксперимента 30±1 °С. К шее крыс на мягком, не стесняющем движений животного и не затрудняющем приток воздуха ошейнике крепился вес, состоящий из металлических элементов, который рассчитывался исходя из веса крысы, и всегда составлял 20% от него, крыса взвешивалась и вес металических элементов рассчитывались непосредственно перед погружением животного в воду.

После погружения крысы в воду оценивалась продолжительность плавания, которая фиксировалась секундомером и измерялась в секундах. За конец времени плавания принимался момент, когда крыса переставала плавать, опускалась на дно бассейна и в течение как минимум 10 секунд не предпринимала дальнейших попыток всплыть. В этот момент животное извлекалось из воды для дальнейшего исследования.

В то время как в группе, получавшей ДСИП, наблюдалось только немногим большее время плавания, чем в группе контроля, в группах KND 1-18 время плавания было чаще всего значительно большим, чем в группах ДСИП и контроля (таблица 2). Табица 2: показатели крыс в Тесте форсированного плавания

KND-1 (см. пункт формулы изобретения 1)

KND-4 (см. пункты формулы изобретения 1,2) продолжительность контроль ДСИП KND-4 плавания, с средняя 314,02 353,09 457,00 стандартное 76,87 83,74 47,55 отклонение

N 5 5 5

KND-5 (см. пункты формулы изобретения 1,2)

KND-6 (см. пункты формулы изобретения 1,2)

KND-7 (см. пункты формулы изобретения , плавания, с средняя 318,09 317,53 469,07 стандартное 100,50 129,02 98,78 отклонение

Ν 5 5 5

KND-8 (см. пункты формулы изобретения 1,2)

KND-9 (см. пункты формулы изобретения 1,2)

KND-10 (см. пункты формулы изобретения продолжительность контроль ДСИП KND-10 плавания, с

ICND-11 (см. пункты формулы изобретения 1,2) продолжительность контроль ДСИП KND-11 плавания, с средняя 392,45 321,41 399,09 стандартное 122,56 107,43 97,06 отклонение

N 5 5 5

KND-12 (см. пункт формулы изобретения 3) продолжительность контроль ДСИП KND-12 плавания, с средняя 356,21 344,40 418,04 стандартное 100,21 132,12 88,86 отклонение

N 5 5 5

KND-13 (см. пункт формулы изобретения 3) продолжительность контроль ДСИП KND-13 I плавания, с средняя 314,00 300,52 388,03 стандартное 110,41 87,52 74,44 отклонение

N 5 5 5

KND-14 (см. пункт формулы изобретения 3)

KND-15 (см. пункт формулы изобретения 3) продолжительность контроль ДСИП KND-15 плавания, с средняя 299,12 292,20 319,03 стандартное 91,31 127,99 77,73 отклонение ;

N 5 5 5

KND-16 (см. пункт формулы изобретения 3)

KND- 17 (см. пункт формулы изобретения 8)

KND-18 (см. пункт формулы изобретения 8)

Исходя из полученных результатов, можно констатировать, что при применении KND в различных вариациях и смесях в основном не только не наблюдалось ухудшения физической силы, выносливости и психоэмоционального состояния, но имело место явное улучшение этих параметров по сравнению как с группами контроля, так и с группами, получавшими ДСИП. Не все аналоги KND и смеси его с различными фармакологическими агентами проявили одинаковую активность, однако направленность ее во всех случаях была сходной.

3. Оценка влияния стресса и вводившихся веществ на состояние антиокислительной системы организма.

Непосредственно после окончания теста форсированного плавания животные сакрифицировались путем гильотинирования и проводилась аутопсия. Кровь забиралась на анализ содержания малонового диальдегида (МДА). Показано, что применение как ДСИП, так и KND 1-16 не приводило к достоверному изменению уровня окислительного стресса в организме крыс в условиях теста форсированного плавания (Таблица 3).

Таблица 3: Уровень МДА в крови

KND-1 (см. пункт формулы изобретения 1)

K D-2 (см. пункты формулы изобретения 1,2)

KND-3 (см. пункты формулы изобретения 1,2)

KND-4 (см. пункты формулы изобретения 1,2)

KND-5 (см. пункты формулы изобретения 1,2)

Активность Контроль ДСИП KND-5 МДА, ед средняя 9,98 9,87 11,23 стандартное 0,85 0,98 0,42 отклонение

N 5 5 5 KND-6 (см. пункты формулы изобретения 1,2)

KND-9 (см. пункты формулы изобретения 1,2)

KND-10 (см. пункты формулы изобретения 1,2)

KND-11 (см. пункты формулы изобретения 1,2)

K D-12 (см. пункт формулы изобретения 3) Активность Контроль ДСИП KND-12 МДА, ед средняя 9,91 10,04 10,91 стандартное 0,82 1,98 0,23 отклонение

N 5 5 5

KND-13 (см. пункт формулы изобретения 3)

Активность Контроль ДСИП KND-13 МДА, ед средняя 10,80 12,00 11,37 стандартное 2,07 1,91 1,31 отклонение

N 5 5 5

KND-14 (см. пункт формулы изобретения 3)

KND-15 (см. пункт формулы изобретения 3) Активность Контроль ДСИП KND-15 МДА, ед средняя 9,90 11,52 10,81 стандартное 1,11 1,97 0,94 отклонение

N 5 5 5

KND-16 (см. пункт формулы изобретения 3) ^'

KND-17 (см. пункт формулы изобретения 8)

KND-18 (см. пункт формулы изобретения 8) Активность Контроль ДСИП KND-18

МДА, ед средняя 9,13 10,13 09,99 стандартное 1,76 1,73 1,12

отклонение

N 5 5 5

Сравнивались средние значения по группам для демонстрации тенденций.

Как было показано в описанном примере, крысы, получавшие по 100 мкг/кг средства, чаще всего имели большую выносливость по показателю плавания в воде, чем контрольные животные. Это указывает на большую физическую силу, а равно и лучшую стресс-устойчивость.

Сходную тенденцию с ДСИП показали и показатели изменения веса иммунокомпетентных органов, а также активность МДА.

В целом увеличение активности МДА может рассматриваться как последствие хронического стресса. Однако проведенные в прошлом эксперименты продемонстрировали, что ДСИП в первые минуты после введения, равно как и в первые минуты после стрессового воздействия, оказывает легкое прооксидантное действие, затем сменяющееся достоверным антиоксидантным 14).

Результаты теста форсированного плавания впечатляющим образом демонстрируют потенциал предмета изобретения по поддержке физической силы при стрессе, чрезвычайно важной характеристики при тяжелых заболеваниях.

Также очевидно превосходство KND по этому показателю не только над контрольной группой, но и над ДСИП.

Кроме основной группы экспериментов, была проведена дополнительная оценка эффективности KND в различных дозировках, либо в смеси с синергически действующей аминокислотой глицином при гипокинетическом стрессе.

Опыт проводили на белых крысах обоего пола массой 150-200 г. Гипокинетический стресс вызывали помещением крыс в специальные камеры, ограничивающие подвижность животных сроком на 6 часов. За 1 час до начала стресса вводились KND в различных дозировках либо в смеси с глицином, либо физиологический раствор.

Об уровне стресса судили по накоплению в мозге животных МДА. Были получены следующие результаты (Таблица 4):

Таблица 4 (см. пункты формулы 3 и 8).

* - достоверность отличий по сравнению с контролем р< 0.01

Проведена также дополнительная группа экспериментов по оценке детоксикационного действия KND в различных дозах на мышах, получавших полулетальную дозу цитотоксического препарата «цисплатин». K D вводился внутрибрюшинно в разовой дозе 60 мкг/кг или 120 мкг/кг за 24 ч до и после введения цитостатика.

Цитостатик цисплатин вводился однократно внутривенно в разовой дозе 15 мг/кг, вызывающей 50% гибель животных. Исследования проведены на 50 мышах, гибридах BDF1, самках.

Регистрировали гибель животных от острой токсичности цитостатика. Введение KND приводило к двукратному снижению гибели животных от острой токсичности цисплатина.

Полученные в дополнительных экспериментах результаты свидетельствуют о том, что применение KND не снижает активности системы антистрессорной защиты организма, а также подавляет вызываемую гипокинетическим воздействием интенсификацию окислительных процессов. Показано выраженное антистрессорное и антитоксическое действие KND.

В целом, результаты указывают на то, что заявляемое средство может влиять на соотношение в организме возбуждающих и тормозных нейространсмиттеров, таких как ГАМК, глутаминовая кислота, аспартатовая кислота и серотонин, а также проявляет антиоксидантное и антитоксическое действие.

Среди возможных объектов воздействия KND могут быть митохондриальные ферменты, контролирующие метаболизм ЦНС и периферических нервных тканей, например МАО А, гексокиназа, НАДФ-зависимая малатдегидрогеназа, креатинкиназа, а также ферменты дыхательной цепи, гипоталамическая глутаминсинтетаза, СОД, каталаза и т.д.

Средства - семейство пептидов - вследствие этого подходит для терапии широкого круга связанных со стрессом, в особенности неврологических патологических процессов. CKND вследствие этого может применяться при заболеваниях как в виде монотерапии, так и в комбинации с различными лекарственными препаратами, травяными препаратами, пищевыми добавками, а также для терапии различных проявлений и последствий нарушенного гомеостаза.

Таковые включают в себя, но не ограничиваются нейрогуморальными и эндокринными расстройствами, вызванными внешними и внутренними нарушениями. Механизм действия предлагаемых пептидов может быть описан, например, как стресс- протективный, адаптогенный, нейропротективный, иммуномодулирующий, геропротективный, антиоксидантный, противосудорожный, антитоксический.

Также KND, очевидно, подходит для терапии и предотвращения первичной тяги к наркотическим веществам, абстинентного синдрома, нарушений сна, энцефалопатий, неврозов, вегетативных расстройств, когнитивных нарушений, дефицита внимания, эпизодов депрессии, сердечно-сосудистых заболеваний, заболеваний мозговых сосудов, аутоиммунных и эндокринологических заболеваний.

Хорошо известно, что активные ингредиенты пептидов, вследствие быстрого ферментного разрушения в ЖКТ только относительно пригодны для перорального приема. Предпочтительной формой применения предмета изобретения вследствие этого становится интраназальное или подъязычное введение.

Данные формы введения предоставляют возможность избежать интестинально- кровяного барьера, таким образом, позволяя существенно снизить дозу вводимого вещества. Кроме всего прочего, при использовании по данному пути исключается риск возникновения инфекции, введение безболезненно, а также не требует наличия специально обученного медицинского персонала.

Однако средство может вводиться любым из путей введения.

Убеждением изобретателей является то, что вещество, так же, как и ДСИП, способно легко пересекать ГЭБ.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ Vale W., Rivier C, Brown M, Regulatory Peptides of the Hypothalamus. Ann. Rev. Physiol. 39, 473-527 (1977).

Annals of the New York Academy of Sciences. Vol.739. Models of Neuropeptide Action. Ed. by F.L. Strand, B. Beckwith, B. Chronwall, C.A. Sandman. New York Academy of Sciences, New York, 1994, pp. 1-349.

Monnier M., Hosli L., Dialysis of Sleep and Waking Factors in Blood of the Rabbit. Science 146, 796-798 (1964)

Schoenenberger G.A., Monnier M. Characterization of a delta- electroencephalogram (6-sleep)-inducing peptide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 1282-1286 (1977)

Schneider-Helmert D., Graf M., Schoenenberger G.A. Synthetic Delta Sleep- inducing Peptide Improves Sleep in Insominacs. Lancet 1, 1256-7 (1981)

Schneider-Helmert D., Gnirss F., Monnier M., Schenker J., Schoenenberger G.A. Acute and delayed effects of DSIP (delta sleep-inducing peptide) on human sleep behavior. Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. Toxicol. 19, 341-5 (1981)

SchoenenbergerG.A. 1984, Characterization, properties and multivariate functions of Delta-Sleep-Inducing Peptide (DSIP). Eur. Neurol. 23, 321-345

Khvatova, E.M., Rubanova, N:A. Prudchenko, I. A., Mikhaleva, I. I. Effects of delta-sleep inducing peptide (DSIP) and some analogues on the activity of monoamine oxidase type A in rat brain under hypoxia stress. FEBS Letters 368, 367-369 (1995)

Khvatova E. M., Samartzev V. N., Zagoskin P. P. Delta sleep inducing peptide (DSIP): effect on respiration activity in rat brain mitochondria and stress protective potency under experimental hypoxia. Peptides, 24, 307-311 (2003).

Stanojlovic O., Ivanovic D., Mirkovic S., Mikhaleva I. Delta sleep-inducing peptide and its tetrapeptide analogue alleviate severity of metaphit seizures. Pharmacology Biochemistry and Behaviour, 77, 227-234 (2004).

И.И. Михалева, Б.О. Войтенков Пептид дельта-сна и дельтаран: от химико-биологических исследований к медицине. Новые лекарственные препараты, вып. 3 стр. 6-20, (2007).

ЕР 1949906 А1 А61К 38/08,38/07,45/06, опубл. 30.07.2008

Прудченко И.А, Сташевская Л.В.,.Шепель Е.Н., Михалева И.И., Иванов В.Т., Шмалько Ю.П., Чалый А.П., Уманский В.Ю., Гринжевская С.Н. Синтез и биологические свойства аналогов пептида дельта-сна (ДСИП). П. Антиметастатическое действие. // Биоорган, хим., 1993. Т.19, N12, С.1177- 1190.

Рихирева Г.Т., Маклецова М.Г., Менджерицкий A.M., Вартанян Л.С., Гуревич СМ., Лозовская Е.Л., Копыловский С.А., Рылова А.В., Михалева И.И., Прудченко И.А. Изменение интенсивности свободнорадикальных реакций в органах крыс при гипокинетическом стрессе и защите дельта-сон индуцирующим пептидом и его тирозинсодержащим аналогом. // Известия PAH, JYo2, 243-256, (1993).

Mikhaleva 1. 1., Rikhireva, G. Т., Prudchenko, I. A., Golubev, I. N. Interaction of delta sleep-inducing peptide and its analogues with cellular membranes: A structure- function analysis. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 32, 160-165 (2006).

Прудченко, И.И. Михалева. Проблема эндогенности пептида дельта-сна. Успехи современной биологии т.114, стр. 728-740, (1994).

Strausberg R.L. et al., Generation and initial analysis of more than 15,000 full- length human and mouse cDNA sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002).

Tsukada Y, Fang J, Erdjument-Bromage H, Warren ME, Borchers CH, Tempst P, Zhang Y. Histone demethylation by a family of JmjC domain-containing proteins. Nature 2006;439:811-816

Kim, T.G., Kraus, J.C, Chen, J and Lee, Y., Jumonji, a Critical Factor for Cardiac Development, Funtions as a Transcriptional Repressor. The Journal of Biological Chemistry, 278, 43, pp. 42247-42255 (2003)

The Peptides. Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 1, Ed. by E. Gross, J. Meienhofer, Academic Press New York. 1979, pp. 2-383.

J. M. Stewart, J. D. Young. Solid Phase Peptide Synthesis. Second Edition. Pierce Chemical Company. Rockford, Illinois, 1984, pp. 1-167.

ЕР 1950286A1, C12N9/02; A61P35/00; A61K38/44; опубл. 30.07.2008.

ЕР 0065747B1, A61K37/2: опубл. 15.10.1986.

RU 2099078 CI A61 К 38/08; опубл. 20.12.1997.

RU 2115660 CI A61 К 38/08 опубл. 28.01.1997. Лысенко A.B., Альперович Д.В., Узкова Н.И., Менджерицкий A.M. Биохимия, 64 (6), 652-657 (1999).