以下、本発明を実施例によって具体的に� ��述する。しかし、これらによって本発明は� ��限されるものではない。

<調製例1:醗酵オタネ人参エキスの製造>
 ラクトバチルス・カゼイ・ハセガワ菌株(FER M BP-10123)を前培養培地(組成:グルコース30g/L� �酵母エキス10g/L、大豆ペプチド5g/L、K ₂ HPO ₄  2g/L、MgSO ₄ ・7H ₂ O 0.5g/L)20mLに1白金耳植菌し、28℃にて48時間� �置培養した。

 上記培養後の培養液2mLを、新たな前培養� ��地120mLに植菌し、28℃にて48時間静置培養し� ��。

 上記培養後の培養液20mlを、高圧蒸気滅菌 (121℃、20分間)した仕込み液(オタネ人参(側根 )粉末130g/L、酵母エキス10g/L、大豆ペプチド5g/ L、炭酸カルシウム10g/L)1Lに植菌し、28℃で10� �間醗酵した。得られた培養液を、水酸化ナ� �リウムでpH5.0に調整し、次いで、噴霧乾燥す ることにより、醗酵オタネ人参エキス145gを� �た。

 得られた醗酵オタネ人参エキス中におけるM 1およびM4の含有量を高速液体クロマトグラフ ィー(HPLC)で測定した。上記醗酵オタネ人参エ キス 1gを、試験サンプルとして精密に量り� �った。該試験サンプルを下記のHPLC移動相20ml を加えて超音波槽で5分間懸濁した後、同HPLC� ��動相で50mLにメスアップした。得られた懸濁 液 約0.5mlをフィルター(DISMIC 13-HP、ADVANTEC社� ��、孔径:0.45μM)で濾過することにより、試料� ��を得た。該試料液を下記条件にて分析した� ��果、上記醗酵オタネ人参エキス中におけるM 1の含有量は0.9重量%であり、M4の含有量は0.1� �量%であった。
[HPLC条件]
  装置:(株)島津製作所製、商品名「紫外吸� �光度計(SPD-M10Avp)」
  測定波長:203nm
  カラム:(株)ワイエムシー製、商品名「YMC-P ack R-ODS-5A(5μM,C18,120A)」(φ4.6×250mm)
  移動相:60%(v/v)アセトニトリル溶液
      (水:ミリQ水、アセトニトリル:関東� �学製)
  流速:1.0mL/min
  カラム温度:40℃
  注入量:10μl

<比較調製例1:非醗酵オタネ人参エキスの製 法>
 調製例1において、ラクトバチルス・カゼイ ・ハセガワ菌株(FREM BP-10123)を植菌しなかっ� �こと以外は、調製例1と同様の操作を行うこ� ��により、当該菌株による醗酵がなされなか� ��た非醗酵オタネ人参エキス150gを得た。

<実施例1:マウスの不安行動に対する効果の 検証>
 被検体として、8週齢のオスのC57BL/6マウス(� ��重19g~24g、日本エスエルシー(株)製)を使用し た。マウスを、2匹ずつ飼育ケージ(17×27×13cm) 内で自由飲水にて飼育した。マウス搬入後、 翌日から8日間、1匹あたり5分間ハンドリング を行った。また、同ケージ内で飼育するマウ スの搬入時の体重差を0g~0.5gとなるように設� �した。なお、飼育室の温度を25±1℃に保持し 、12時間の明暗サイクルを自動制御した(8時� �灯、20時消灯)。

<1-1:試料および摂取方法>
 マウスに与える試料として、上記調製例1で 得られた醗酵オタネ人参エキス、比較調製例 1で得られた非醗酵オタネ人参エキス、およ� �コントロールとしてのマウス飼育用標準粉� �飼料(オリエンタル酵母工業(株)製 商品名「 MF」)を用いた。醗酵オタネ人参エキスおよび 非醗酵オタネ人参エキスについては、摂食予 備試験に基づいて50mg/kg体重/日となるように� ��上記MFと混合することにより濃度調製を行� �た。全ての試料を、マウス搬入直後から全� �定終了まで、自由摂食させた。ただし、摂� �量の計量に伴い、粉末給餌器の外側にプラ� �チック製カバー(オリエンタル酵母工業(株)� � Roden CAFE)を取り付けておき、マウスにはこ のカバーの穴から摂食させた。なお、飼料(� �料)の種類に応じて、マウスを8匹ずつ3群に� �けた。

<1-2:行動実験>
 不安の評価として、以下の(1)明暗試験(light- dark test)および(2)高架式十字迷路試験(elevated� �plus-maze test)を採用した。マウス搬入11日後� �ら、(1)および(2)の試験を、この順に1日おき� ��行い、それぞれ13時~18時の時間帯に実施し� �。なお、体重測定は、搬入日、搬入4日後、� ��動実験開始日および最終日に行った。摂食� ��の計量は2日おきに行った。

<1-2-1:明暗試験>
 本評価試験では、23×23×30cmの明領域(light ar ea)と、18×23×30cmの暗領域(dark area)とが隣接す る明暗箱で構成される装置であって、当該箱 の床から5cmほどの境界を通して、マウスが上 記2つの領域を相互に行き来可能となってい� �構造を有する装置を使用した。両領域とも� �井はフタになっており、明領域は透明の壁� �白色の床とで構成されている。暗領域は黒� �の壁および黒色の床で構成されており、フ� �を閉じると内部が真っ暗になる構造を有す� �。本評価試験では、このような装置に、上� �マウスを暗領域側から入れ、その後の行動� �5分間観察および測定した。具体的には、マ� ��スが最初に明領域に入るまでの時間、マウ� ��が明領域で滞在する時間、およびマウスが� ��領域に入った回数を測定した。本評価試験� ��、明るい場所に対するげっ歯類の生得的嫌� ��感と、新奇環境に対する探索行動とに基づ� ��ものである。本評価試験では、明領域に入� ��までの時間が短いほど、また明領域での滞� ��時間が長いほど、そのマウスの不安が低い� ��評価することができる。

<1-2-2:高架式十字迷路試験>
 本評価試験では、不安を測定するための実� ��装置である高架式十字迷路を使用した。当� ��高架式十字迷路は、透明な壁(14cm)を有する2 つのクローズド・アーム(closed arms)と、壁の� ��い2つのオープン・アーム(open arms)と、これ ら4つのアームを接続する中央プラットフォ� �ムとから構成されている。床からアームま� �の高さは70cm、全長は65cmおよびアーム幅は5cm であった。このような装置に、上記試料をそ れぞれ摂取させたマウスを置き、5分間かけ� �以下の測定および解析を行った。すなわち� �当該装置に配置されたマウスの全移動距離� �全移動距離に対するオープン・アーム内で� �移動距離の割合、全時間に対するオープン� �アーム内での滞在時間の割合、およびオー� �ン・アームに入った回数を測定し、これら4� ��の指標を使ってマウスの不安水準を評価し� ��。本評価試験では、全移動距離に対するオ� ��プン・アーム内での移動距離の割合が大き� ��ほど、またオープン・アーム内での滞在時� ��が長いほど、そのマウスの不安が低いと評� ��することができる。なお、当該測定・解析� ��は、ビデオ画像行動解析装置(PanLab社製 商� ��名「Smart」)を使用した。

<1-3:睡眠記録>
(1)手術
 麻酔薬として、ケタミン(ketamine)(20mg/ml)とキ シラジン(xylazine)(5mg/ml)の1:1のカクテルを使用 した。該麻酔薬を体重10gあたり0.1mlの割合で� ��上記試料をそれぞれ摂取させたマウスに腹� ��内投与した。次いで、当該マウスの頭部を� ��度に散髪し、皮膚を円形にカットした後、� ��骨に歯科用ドリルで3ヵ所穴を開けた。該3� �所の穴のそれぞれにテフロン(登録商標)コー トされたステンレスワイヤーに予めはんだ付 けしたステンレス製ビス電極を取り付けた。 その後、筋電図記録のために、同様のワイヤ ーをマウスの両側の肩筋に取り付けた。計5� �のワイヤーをはんだでソケットに接合した� �、ワイヤーを覆うように、歯科技工用即時� �合レジンで頭骨とともに固定した。術後は1� ��間の回復期間をおいた。

(2)24時間睡眠記録
 記録開始3日前に、上記手術を施したマウス を記録用ケージ(30×30×35cm)に移し、生体アン� ��(日本光電工業(株)製 RM-6100)にケーブルで接 続し、慣れさせた。記録当日は、明暗サイク ルに合わせ、8時から24時間、当該マウスの脳 波と筋電図とを記録した。サンプリングした データを、CED社製CED1401 DATAプロセッサにてA/ D変換し、これを生体信号記録・解析システ� �(CED社製 商品名「Spike2」)によって記録・解� ��した。なお、記録は、コントロール群と醗� ��オタネ人参エキス群について、各群3匹ずつ 行った。一度の記録に各群1匹ずつの計2匹を� ��時に記録した。

(3)解析
 記録終了後、6秒ごとに、覚醒、ノンレム睡 眠(徐波睡眠)およびレム睡眠(逆説睡眠)の3つ� ��ステージにデータを視察判定した。

<1-4:活動量測定>
 飼育ケージ(15×22×12cm)に、上記試料をそれ� �れ摂取させたマウスを1匹ずつ入れ、自発運� ��量測定装置(バイオリサーチセンター(株)製� �商品名「ACTIMO」)によって、活動量の24時間� �定を行った。記録・解析は、上記睡眠記録� �同様に、生体信号記録・解析システム(CED社� �� 商品名「Spike2」)によって行った。なお、� ��定中は自由飲水・摂食(各試料)させた。測� �は、コントロール群と醗酵オタネ人参エキ� �群について、各群2匹について実施した。

<1-5:統計解析>
 上記で得られた結果のそれぞれを、図1~図4� ��平均値±標準誤差で示した。有意差検定と� �て、行動実験についてはKruskal-Wallis検定を行 い、post・hoc検定としてMann-Whitney U検定を行� �た。睡眠記録についてはMann-Whitney U検定を� �った。いずれもp<0.05を有意とした。

<1-6:結果および考察>
 実施例1における各行動実験の期間中、各マ ウスには、3つの群間で体重変化に差異が見� �されず、各マウスとも成長は順調であった� �摂餌量についても各群間で差異はなく、摂� �予備試験と同様の結果であることを確認し� �。

 図1(a)に示すように、明暗試験においては 、醗酵オタネ人参エキス群のマウスは、コン トロール群のマウスと比較して、最初に明領 域に入るまでの時間(秒)が有意に低下した(*p& lt;0.05)。すなわち、醗酵オタネ人参エキス群� ��抗不安作用が認められた。

 図2(b)および(c)に示すように、高架式十字 迷路試験においては、醗酵オタネ人参エキス 群のオープンアーム内での移動距離と滞在時 間が、コントロール群のそれらに対して上昇 した。すなわち、醗酵オタネ人参エキス群で 抗不安傾向が認められた。一方、総行動量(� �2(a)参照)およびその経時変化(データは示さ� �)については両群の間に差はなかった。上記� ��暗試験および高架式十字迷路試験の結果は� ��本発明の抗不安抗うつ剤(醗酵オタネ人参エ キス含有試料)の長期摂取が、行動量に影響� �与えることなく抗不安作用を発揮し得るこ� �を示唆する。

 図3(b)に示すように、睡眠記録においては 、明期における醗酵オタネ人参エキス群のノ ンレム睡眠量がコントロール群に対して有意 に増大した。また、図4に示すように、活動� �測定においては、特にマウスにおける活動� �である暗期において、醗酵オタネ人参エキ� �群の活動量が多い傾向が認められた。これ� �の結果は、本発明の抗不安抗うつ剤(醗酵オ� ��ネ人参エキス含有試料)の長期摂取が、活動 期の行動量を抑制することなく、安静期の睡 眠を増加させながら、抗不安作用を発揮し得 ることを示唆する。すなわち、本発明の抗不 安抗うつ剤は、一般的な抗不安薬のように副 作用として鎮静作用を誘発することなく、抗 不安作用を発揮し得るという利点を有する。

<実施例2:ラットの実験的うつ状態に対する 効果の検証>
 被検体として、3週齢の雄のCD(SD)ラット(日� �チャールズリバー社)を使用した。ラットは� ��3匹ずつ飼育ケージ(幅250mm×深さ400mm×高さ200 mm)内で自由飲食にて飼育した。飼育室を湿度 50-60%、室温24±1℃に保持し、12時間の明暗サ� �クルを自動制御した(8時30分点灯、20時30分消 灯)。ラット搬入後10日間は予備飼育期間とし 、その後試料の経口投与を開始した。試料と しては、比較調製例1で得た非醗酵オタネ人� �エキス、および調製例1で得た醗酵オタネ人� ��エキスを用いた。いずれの試料も、経口投� ��当日に目的濃度となるように蒸留水に溶解� ��た。

<2-1:試料の投与方法>
 試料の摂取量が0、1、10mg/kg体重/日となるよ うに、蒸留水または蒸留水に溶解した上記試 料を、毎日13時から15時の間に2週間経口投与� ��た。また、ポジティブコントロールとして� ��抗うつ剤(イミプラミン)を15mg/kg体重/日とな るよう、上記試料と同様に投与した。なお、 試料の種類および摂取量に応じて、ラットを 7匹ずつ7群に分けた。

<2-2:ラット強制水泳試験>
 ラットを用いた強制水泳試験はPorsoltら(Natur e,266,730-732,1977)に従った。以下にその手順を� �す。強制水泳試験の24時間前に、ラットに15� ��間の予備水泳をさせた。その後、強制水泳� ��験の24、5、1時間前に、それぞれ上記各試料 またはイミプラミンを経口投与した。

 逃避不可能な水槽(内径192mm×高さ440mm)に17 cmの高さまで25±1℃の水を入れ、その中で強� �的にラットに水泳をさせた。ラットは最初� �激しい水泳行動を示すが、次第に泳ぐこと� �諦めて泳がなくなる。この強制水泳試験で� �、水泳開始後5分間内の泳いでいない時間(無 働時間)を測定し、該無働時間の短縮を抗う� �作用の指標として、投与した試料の抗うつ� �用を評価した。この試験は、14時から16時ま� ��の時間帯に実施した。結果を図5に示す。

<2-3:オープンフィールド試験>
 強制水泳試験後、さらに1週間上記試料の経 口投与を継続し、オープンフィールド試験に 供した。オープンフィールド試験では、18個� ��等面積に区切られた円形フィールド(直径70c m)中央にラットを静かに置いた後5分間内に、 ラットが跨いだ線の数、後ろ足で立ち上った 回数、および排便数を測定した。これにより 、自発活性を調べた。

<2-4:統計解析>
 上記で得られた結果を、図5に平均値±標準� ��差で示した。有意差検定として、ラット強� ��水泳実験についてはKruskal-Wallis検定を行い� �post・hoc検定としてMann-Whitney U検定を行った� ��p<0.05を有意とした。

<2-5:結果および考察>
 表1に示すように、実施例2における各試験� �間中、所定量の非醗酵オタネ人参エキスま� �は醗酵オタネ人参エキスを経口投与した各� �ットには、2つの群間で体重変化に差異が見� ��されず、各ラットとも成長は順調であった� ��摂餌量についても各群間で差異はなく、摂� ��予備試験と同様の結果であることを確認し� ��。

 図5に示すように、抗うつ作用のスクリー ニング方法として広く用いられている強制水 泳試験においては、醗酵オタネ人参エキス群 のラットは、コントロール群のラットと比較 して、無働時間が有意に短縮した。また、醗 酵オタネ人参エキス群の無働時間は、イミプ ラミン投与群よりも短いものであった(図5(a)) 。一方、非醗酵オタネ人参エキス群のラット では無働時間が短縮しなかった(図5(b))。

 上記のような無働時間の短縮作用は、抗� ��つ作用を有する成分以外に、カフェインな� ��の自発活性を高める成分によって発揮され� ��場合がある。しかしながら、自発活性の有� ��を調べるオープンフィールド試験によれば� ��醗酵オタネ人参エキス群では、いずれの投� ��量でも自発活性の上昇は見られなかった(表 2)。すなわち、醗酵オタネ人参エキス群で測� ��された無働時間の短縮は、抗うつ作用によ� ��ものと考えられる。

<調製例2:M1の調製>
 調製例1で得た醗酵オタネ人参エキス25gに50% エタノールを500ml加えて懸濁した後、遠心分� ��を行って、上清分画を回収した。得られた� ��清分画を、水で平衡化した分離精製用樹脂� ��ラム(樹脂:三菱化学社製、(登録商標)ダイヤ イオンHP20、カラム:φ200mm、高さ75cm)に導入し� ��カラム容積の3倍量の50%エタノールを流した 。次に、カラム容積の3倍量の100%エタノール� ��流して吸着物を溶出させた。得られた溶出� ��中の溶媒を減圧留去し、凍結乾燥してM1を� �むサポニン粗分画10gを得た。このサポニン� �分画5gをさらに逆相シリカゲルカラムクロマ トグラフィー(メルク社製、シリカゲルRP-8,250 g、溶出溶媒:80%メタノール)にて分離精製し、 0.5gのM1を得た。得られたM1の純度は、95%以上� ��あった。

<実施例3: 抗不安作用の検証>
 被験体として、C57BL/6マウス(雄性、8~9週齢� �体重27±3g、日本エスエルシー(株))を使用し� �。マウスの飼育は、徳島大学栄養学科棟動� �室(室温23±1℃、8時~20時、20時~8時の明暗サイ クル)で同大学の動物飼育規定に従って行っ� �。飼育の間は、マウス飼育用標準固形飼料(� ��リエンタル酵母工業(株)製 商品名「MF」)の 自由摂食及び自由飲水とした。

<3-1:試料および投与方法>
 1回0.2mlの経口投与で所望の摂取量となるよ� ��に、実験当日に投与試料液を作製し、経口� ��与した。具体的には、M1の摂取量が50または 100mg/kg体重/日となるように、調製例2で得たM1 を溶解した5%アラビアゴム水溶液を経口投与� ��た。ポジティブコントロールとして、抗不� ��薬であるジアゼパム(Diazepam)の摂取量が2mg/kg 体重/日となるように、ジアゼパムを溶解し� �5%アラビアゴム水溶液を経口投与した。さら に、コントロールとして、5%アラビアゴム水� ��液を経口投与した。なお、M1の摂取量が100mg /kg体重/日であるものをM1群、50mg/kg体重/日で� ��るものをM1h群、ポジティブコントロールをD 群、コントロールをV群とした。

<3-2:行動実験>
 elevated-plus maze、marble burying test、light-dark  test、およびopen field testを行い、マウスの情 動(特に不安)行動を評価した。これらの実験� ��、概日リズムを考慮して13:00~18:00の間に行� �た。

<3-2-1.elavated-plus maze>
 十文字型の通路(幅:6cm、全長:65cm)を有する� �さ55cmの高架式十字迷路を用いて実験を行っ� ��。十文字型の通路のうち、向かい合う一組� ��通路(close arm)は透明の壁で囲まれており、� ��方の組の通路(open arm)には壁がない。それ� �れの通路が6×6cmのプラットホームでつなが� �て十字型をなしている。上記試料の投与1時� ��後に、プラットホームの中央にマウスを置� ��、1匹ずつ10分間かけて以下の測定および解� ��を行った(M1群、M1h群、D群、V群;n=6)。すなわ ち、当該装置に配置されたマウスの全移動距 離(total distance)、全移動距離に対するオープ� ��・アーム内での移動距離の割合(percent distan ce)、および、全時間に対するオープン・アー ム内での滞在時間の割合(percent time)を測定し た。本実験では、全移動距離に対するオープ ン・アーム内での移動距離の割合が大きいほ ど、またオープン・アーム内での滞在時間が 長いほど、そのマウスの不安が低いと評価す ることができる。なお、当該測定・解析には 、ビデオ画像行動解析装置(PanLab社製 商品名 「Smart」)を使用した。

<3-2-2.marble burying test>
 横15cm、縦25cmおよび深さ15cmのプラスチック� ��ージに、木製床敷(日本クレア株式会社製)� �深さ5cmになるように入れた。上記試料の投� �後すぐに、マウスを該ケージの中に入れ、1� ��間静置した。1時間経過後、該ケージの中に 15個のタブレット状ガラスビーズ(直径1.5cm、� ��色)を、縦3列×横5列の等間隔に並べた。30分 後、マウスをケージから取り出し、床敷によ り3分の1以上隠れたガラスビーズの数を目視� ��より計測した(M1群、M1h群、V群;n=6)。本実験� ��、物体に対して恐怖心を持つと、該物体を� ��そうとするマウスの性質を利用して、不安� ��程度を評価するものであり、ガラスビーズ� ��隠した数が多いほど不安が強いとみなすこ� ��ができる。

<3-2-3.light-dark test>
 本評価試験では、23×23×30cmの明領域(light ar ea)と、18×23×30cmの暗領域(dark area)とが隣接す る明暗箱で構成される装置であって、当該箱 の床から5cmほどの境界を通して、マウスが上 記2つの領域を相互に行き来可能となってい� �構造を有する装置を使用した。両領域とも� �井はフタになっており、明領域は透明の壁� �白色の床とで構成されている。暗領域は黒� �の壁および黒色の床で構成されており、フ� �を閉じると内部が真っ暗になる構造を有す� �。上記試料の投与1時間後に、マウスを暗領� ��に入れ、その後の行動を1匹ずつ5分間観察� �よび測定した(M1群、M1h群、D群、V群;n=9)。具� ��的には、マウスが最初に明領域に入るまで� ��時間(first enter time)、マウスが明領域で滞� �する時間の割合(percent time)および二つの領� �を行き来した回数(number of transitions)を測定� ��た。本実験は、暗所を好むマウスの性質を� ��用して不安を評価するものであり、明領域� ��入るまでの時間が短いほど、また、明領域� ��の滞在時間が長いほど不安が小さいと評価� ��ることができる。

<3-2-4.open field test>
 上記試料の投与1時間後に、直径80cm、深さ50 cmのプラスチック製の円筒内中央にマウスを� ��き、全移動距離(total distance)、底面の中心� �内部分(底面積の30%)を移動した距離の全移動 距離に対する割合(percent distance)および該中� �円内部分での滞在時間の割合(percent time)を10 分間計測した(M1群、M1h群、D群、V群;n=6)。本� �験は、壁際を好むマウスの性質を利用して� �安を評価するものであり、percent distanceおよ びpercent timeが大きいほど不安が小さいと評� �することができる。なお、当該測定・解析� �は、ビデオ画像行動解析装置(PanLab社製 商� �名「Smart」)を使用した。

<3-3.睡眠測定>
(1)手術
 麻酔薬として、ケタミン(ketamine)(20mg/ml)とキ シラジン(xylazine)(5mg/ml)の1:1のカクテルを使用 した。該麻酔薬を体重10gあたり0.1mlの割合で� ��マウスに腹腔内投与した。当該マウスの頭� ��に歯科用ドリルで穴を開け、極小のステン� ��ス製ネジ電極をとりつけた。さらに筋電図� ��録のために、テフロン(登録商標)コートさ� �たステンレスのスチールワイヤーを両側の� �筋に取り付け、歯科用アクリルセメントで� �骨とともに固定した。マウス(M1群、V群;n=6)� �各群一匹ずつペアで、同日内に手術を行っ� �。術後は、10日間の回復期間をおいた。

(2)24時間睡眠記録
 記録開始前日にマウスを記録用ケージ(30×30 cm、深さ35cm、室温23±1℃、8時~20時、20時~8時� �明暗サイクル、飼料および水は自由摂取)に� ��し、コンピュータのデータ解析システム(CED 1401 data processor,Cambridge Electronic Design、CED社 製)に、ケーブルでつなぎ、一晩慣らし期間� �おいた。翌日8時から24時間、脳波と筋電図� �ポリグラフをM1群、V群のマウスを1匹ずつペ� ��で記録した。暗期が開始する1時間前の19時� ��マウスにそれぞれ試料を経口投与した。測� ��終了後、データをoff-lineのコンピューター� �で、5秒ごとに、覚醒、ノンレム睡眠および� ��ム睡眠の3つのステージに視察判定した。

<3-4:統計解析>
 上記実験の結果を図6~10に平均値±標準誤差( mean±SE)で示した。有意差検定としては、Analys is of Variance(ANOVA)を行い、P<0.05を有意とし� ��。

<3-5:結果および考察>
 図6に示すとおり、elevated-plus mazeの結果に� �れば、percent distanceについて、V群およびM1h� �が10%以下であり、M1群およびD群が40%強とい� �有意に高値を示した(p<0.05)。percent timeに� �いても同様に、V群およびM1h群が約10%であり� ��M1群およびD群が約50%という有意に高値を示� ��た(p<0.05)。このように、M1群およびD群が� �percent distanceおよびpercent timeについて有意� �高値を示したことから、M1およびジアゼパム が抗不安作用を有することがわかる。

 図7に示すとおり、marble burying testの結果 では、V群と比較してM1群は、有意に低値を示 した(p<0.01)。該実験は、行動量に影響され� ��ことなく不安を評価する方法として優れた� ��法である。上記実験結果から、M1が抗不安� �用を有することがわかる。

 図8に示すとおり、light-dark testの結果に� �れば、M1群、M1h群、およびD群は、V群と比較� ��てfirst enter timeが短い傾向にある。また、M 1群、M1h群、およびD群は、V群と比較してpercen t timeが高値の傾向にある。このことから、M1 およびジアゼパムの摂取には抗不安傾向の差 が明瞭であることが認められる。

 図9に示すとおり、open field testの結果に� ��れば、percent distance、および、percent timeに� ��いて、M1群が他の群よりも高値の傾向にあ� �。このことから、M1の摂取には抗不安傾向が 認められる。なお、total distanceについては、 各群ともほぼ同等であった。

 上記elevated-plus mazeにおいて、M1群およびM 1h群のtotal distanceが減少していることから、M 1の摂取が自発的運動量に影響を及ぼすとも� �えられる。あるいは、該実験では、マウス� �「高所で壁がない」という特殊な環境に置� �ため、マウスの行動が全体的に抑制されて� �ることが予想される。しかし、心理的影響� �少ないopen field testにおいては、各群間でtot al distanceに差が出ていないことから、M1の摂� ��は自発的運動量に影響を与えないと判断で� ��る。

 図10は、睡眠測定24時間ポリグラフによっ て得られたデータのうち、明期の12時間目か� ��暗期の6時間目までの各7時間について、覚� �量・ノンレム睡眠量・レム睡眠量の変化をV� ��とM1群の間で比較した図である。図10に示す とおり、覚醒量、ノンレム睡眠量について、 各時間において2群間に有意な差は見られな� �った。レム睡眠量について、明期12時間目(� �口投与後1時間)でV群と比較してM1群が有意に 低下していた(p<0.05)。

 上記脳波および筋電図ポリグラフによる� ��眠測定から、M1が摂取後1時間でレム睡眠を� ��しく抑制したことがわかる。具体的には、� ��醒量およびノンレム睡眠量については、M1� �とV群との間にほとんど差が見られなかった� ��に対し、M1摂取後1時間でレム睡眠量が著し� ��減少した。レム睡眠期は最大で10%であるが� ��短期間で有意差が認められたことは、M1の� �きな特徴といえる。

<実施例4:マウスの実験的うつ状態に対する 効果の検証>
 被検体として、7週齢の雄のC57BL/6Jマウス(日 本チャールズリバー社)を使用した。マウス� �、5匹ずつ飼育ケージ内で、マウス飼育用標� ��固形飼料(オリエンタル酵母工業(株)製 商� �名「MF」)およびイオン交換水の自由飲食に� �飼育した。飼育室は湿度50~60%、室温23±1℃に 保たれており、8時から20時まで点灯した。マ ウス搬入後7日間を予備飼育期間とし、この� �、十分なハンドリング処置を施した。

<4-1:試料の投与方法>
 投与量が0、0.3、1mg/kg体重/日となるように� �精製水または精製水に溶解した調製例2で得� ��M1を、腹腔内に単回投与した。また、ポジ� �ィブコントロールとして、抗うつ剤(イミプ� ��ミン)を30mg/kg体重/日となるよう、上記試料� ��同様に投与した。投与量は0.5mL/100gとした。 なお、試料の種類・摂取量に応じて、マウス を8匹ずつ4群に分けた。

<4-2:マウス強制水泳試験>
 マウスを用いた強制水泳試験はPorsoltら(Eur.J .Pharmacol.,47,379-391,1978)に従った。以下にその� �順を示す。なお、強制水泳試験は、上記試� �またはイミプラミンを投与した1時間後に行� ��た。

 逃避不可能な水槽(内径114mm×高さ220mm)に12 cmの高さまで25±1℃の水を入れ、その中で強� �的にマウスに水泳をさせた。マウスは最初� �激しい水泳行動を示すが、次第に泳ぐこと� �諦めて泳がなくなる。この強制水泳試験で� �、水泳開始後2分~6分の計4分間の泳いでいな� ��時間(無働時間)を測定し、該無働時間の短� �を抗うつ作用の指標として、投与した試料� �抗うつ作用を評価した。無働時間の解析はIm age J(米国 National Institutes of Healthにおいて� ��成されたフリーウェア;http://rsb.info.nih.gov/ij� ��り入手可能)をもとに作られたImage J PS1 (FZ 1) (O’Hara & Co.,Ltd.)を使用して行った。� �果を図11に示す。

<4-3:オープンフィールド試験>
 Rodriguesらの方法(Rodriguesら、Pharmacol.Toxicol.,79 ,150-156,1996)を参考にして、オープンフィール� ��試験を行った。フィールドとしては、縦50cm ×横50cmであり、高さ50cmの壁面で囲まれてい� �フィールドを用いた。試験中のフィールド� �の照射強度は、50luxに設定した。試料投与の 1時間後、マウスをフィールドの右下の角に� �置し、10分間にマウスが移動した距離を測定 した。解析にはImage Jをもとに作られたImage  J OF1 for Open field test (O‘Hara & Co., Ltd. )を使用した。結果を表3に示す。

<4-4:統計解析>
 上記実験の結果を図11に平均値±標準誤差(me an±SE)で示した。有意差検定としては、Analysis  of Variance(ANOVA)を行い、P<0.05を有意とした 。

<4-5:結果および考察>
 図11に示すように、強制水泳試験において� �、M1を1mg/kg体重/日で投与した群のマウスは� �コントロール群(0mg/kg体重/日)のマウスと比� �して、無働時間が有意に短縮した。また、� �3に示すように、オープンフィールド試験に� ��いて、M1を1mg/kg体重/日で投与した群では、� ��動距離の増加が見られなかった。すなわち� ��この群で測定された無働時間の短縮は、自� ��活性の上昇によるものではなく、抗うつ作� ��によるものと考えられる。