Extrait alcoolique de fleurs Lys blanc, Lilium candidumL., son procédé d’obtention, et composition cosmétique le contenant

L’invention concerne un extrait de fleurs Lys blanc, Lilium candidum L., son procédé d’obtention, une composition cosmétique le contenant, ainsi que différentes utilisations cosmétiques.

La peau est principalement constituée de trois couches, à savoir, en partant de la plus superficielle, l’épiderme, le derme et l’hypoderme.

L’épiderme contribue largement à assurer la protection de la peau et à en maintenir son bon fonctionnement.

Le vieillissement et le photo-vieillissement de la peau et les altérations qui y sont associées peuvent se manifester de différentes manières, parmi lesquelles on peut citer : la perte de fermeté et d’élasticité dues à une perte tissulaire au niveau de l’épiderme et/ou du derme ; la perte d’éclat due à la réduction de la microcirculation et à un ralentissement du renouvellement cellulaire au niveau de l’épiderme ; l’apparition de taches pigmentaires; et/ou la sécheresse cutanée résultant d’une diminution de la fonction barrière de la couche cornée et d’un ralentissement du renouvellement épidermique.

Il existe, de ce fait, un besoin de fournir un agent actif polyfonctionnel susceptible d’agir sur un ensemble de causes d’altérations de la peau dues au vieillissement et/ou à une modification des mécanismes physiologiques liés au vieillissement.

Or, la Demanderesse a maintenant trouvé qu’un extrait alcoolique de fleurs Lys blanc, Lilium candidum L., obtenu par un procédé particulier, présente, par le biais de stimulation ou d’inhibition de mécanismes physiologiques, des activités intéressantes vis- à-vis du vieillissement cutané, en particulier via des propriétés protectrices contre le stress oxydatif lui conférant un potentiel antioxydant. En effet, comme démontré en exemples, l’extrait alcoolique de fleurs Lys blanc, Lilium candidum L., selon l’invention présente des propriétés cosmétiques intéressantes : il permet une activation de la voie biologique de « réponse au stress oxydatif médiée par NRF2 ». En outre, le vieillissement du derme se caractérise notamment par la différenciation progressive des fibroblastes papillaires en fibroblastes réticulaires conduisant à une rigidification du derme. Or l’extrait alcoolique de fleurs Lys blanc, Lilium candidum L, selon l’invention permet une augmentation de l’expression des marqueurs papillaires CCRL1, NTN et PDPN ainsi qu’une diminution de l’expression des marqueurs réticulaires CDH2, CNN et MGP dans des fibroblastes réticulaires.

L’extrait selon l’invention présente en outre un effet anti-vieillissement de la peau, car il permet d’améliorer la morphologie de l’épiderme, notamment en favorisant son épaississement dans des modèles de peaux âgées reconstruites avec des fibroblastes réticulaires.

L’invention concerne donc, selon un premier aspect, un extrait alcoolique de fleurs Lys blanc, Lilium candidum L., comprenant au moins de la lilidine glycoside et de l’acide hopanténique.

L’invention a également pour objet, selon un second aspect, un procédé d’extraction de fleurs Lys blanc, Lilium candidum L., comprenant au moins les étapes suivantes : a) le broyage des fleurs de Lys blanc, Lilium candidum L., b) au moins une, de préférence au moins deux extractions desdites fleurs broyées en présence d’un solvant alcoolique, chaque extraction étant suivie d’une étape de filtration ; c) le mélange des filtrats liquides issus des extractions de l’étape b) et repos du mélange obtenu pendant au moins 6h, de préférence au moins lOh ; d) filtration du mélange obtenu en c) ; e) élimination du solvant mono-alcoolique du mélange obtenu en d), et dilution finale dans un autre solvant alcoolique.

L’invention se rapporte également à un extrait alcoolique de fleurs Lys blanc, Lilium candidum L. susceptible d’être obtenu par un tel procédé. L’invention se rapporte en outre aussi à une composition cosmétique comprenant, dans un véhicule cosmétiquement acceptable, un extrait alcoolique de fleurs Lys blanc, Lilium candidum L. selon l’invention. Par véhicule cosmétiquement acceptable, on entend un milieu compatible avec la peau, les muqueuses et les phanères. De préférence, la composition cosmétique selon l’invention est adaptée à une application par voie topique.

Figures :

La Figure 1 illustre l’expression relative ( s condition non traitée) de marqueurs papillaires (CCRL1, NTN, PDPN) et réticulaires (CDH2, CNN, MGP) dans des fibroblastes réticulaires (ret) traités par l’extrait de Lys à 0,25% pendant 96h (n=3 donneurs DI à D3).

La Figure 2 illustre la morphologie globale de peaux reconstruites avec des fibroblastes papillaires (à gauche) ou des fibroblastes réticulaires (au centre et à droite), non traitées (contrôle, à gauche et au centre) ou traitées l’extrait de Lys à 0,25% (à droite) sur n=3 donneurs (DI à D3). Les crochets blancs illustrent les différences d’épaisseur d’épiderme vivant observées.

La Figure 3 indique le pourcentage de cellules exprimant le marqueur de prolifération Ki67 dans des peaux reconstruites comportant des fibroblastes papillaires non traitées (contrôle), traitées avec le solvent contrôle (propanediol) ou traitées avec l’extrait de Lys à 0,25% (n=3 donneurs DI à D3).

La matière première mise en œuvre est constituée des fleurs, fraiches ou séchées, de Lys blanc, Lilium candidum L.

Lilium candidum L. est une plante herbacée de la famille des liliacées appelé le lis blanc, lys de la Madone, Lys ou Lys à fleurs blanches (Madonna lily, white lily en anglais).

Le Lys de la Madone est une plante vivace bulbeuse à écailles charnues de la famille des Liliacées, pouvant atteindre 1,8 m de haut.

Le bulbe écailleux produit des feuilles basales, formant une rosette.

Les feuilles, portées par des tiges robustes, sont brillantes, pointues, alternées et de taille décroissante. La floraison spectaculaire offre 5 à 10 fleurs en forme de trompette, d'un blanc immaculé, longues de 15 cm, composées de 6 gros tépales, d'un long pistil et de 6 longues étamines. La floraison a lieu en juin.

Le Lys de la Madone est cultivé en France

L’extrait sec de Lilium candidum L. objet de la présente invention est composé de plusieurs familles de métabolites primaires et secondaires d’intérêt.

L’extrait alcoolique de fleurs de Lys blanc, Lilium candidum L. objet de la présente invention comprend notamment au moins de la lilidine glycoside et de l’acide hopanténique

En particulier, l’extrait alcoolique de Lilium candidum L. de l’invention comprend :

- 40 à 70% en poids de saccharides, de préférence 50 à 60% en poids,

- 1 à 5% en poids de composés dérivés du kaempferol di-0 et tri-O- glycosylé, de préférence 2,5 à 3,2% en poids,

- 8 à 15% en poids de lilidine glycoside, de préférence 10 à 13% en poids, et

- 1 à 5% en poids d’acide hopanténique, de préférence 2 à 3% en poids, les pourcentages étant exprimés en poids, par rapport au poids total de l’extrait. Les dérivés du kaempferol di-0 et tri-O-glycosylé sont des composés de structure I (qui correspond au Kaempferol Tri-O-glycopyranoside) ou II (qui correspond au Kaempferol di-O-glycopyranoside) suivantes :

La lilidine glycoside est un composé répondant à la formule III suivante :

L’acide hopanténique répond quant à lui à la structure IV suivante :

Les saccharides présents dans l’extrait de Lys selon l’invention comprennent de préférence du glucose, du fructose et/ou du sucrose, et notamment 20 à 25% en poids de fructose, 17 à 21% en poids de glucose et 5 à 11% en poids de sucrose.

Il est du mérite de la demanderesse d’avoir réussi à préparer un extrait de Lys comprenant notamment de la lilidine glycoside, de l’acide hopanténique et préférentiellement des dérivés du kaempferol di-0 et tri-O-glycosylé, ce qui en fait sa spécificité.

L’extrait alcoolique de Lilium candi dum de l’invention peut notamment être obtenu au moyen d’un procédé d’extraction des fleurs de Lys blanc, Lilium candidum L. L., comprenant les étapes suivantes : a) le broyage des fleurs de Lys blanc, Lilium candidum L. L., b) au moins une, de préférence au moins deux extractions desdites fleurs broyées en présence d’un solvant alcoolique, chaque extraction étant suivie d’une étape de filtration ; c) le mélange des filtrats liquides issus des extractions de l’étape b) et repos du mélange obtenu pendant au moins 6h, de préférence au moins lOh ; d) filtration du mélange obtenu en c) ; e) élimination du solvant mono-alcoolique du mélange obtenu en d), et dilution finale dans un autre solvant alcoolique.

De préférence, les fleurs de Lys blanc mises en œuvre à l’étape a) sont des fleurs fraîches ou des fleurs séchées.

Elles sont notamment broyées ou réduites en morceaux, par exemple à une finesse inférieure à 2 cm, par tout moyen connu de l’homme du métier.

Dans l’étape b), les fleurs de Lys blanc broyées sont soumises à au moins une, de préférence au moins deux extractions par un ou plusieurs solvants alcooliques, par exemple choisis parmi :

- les monoalcools en C1-C4, tels que par exemple le méthanol, l’éthanol ou l’isopropanol ; et - les diols, tels que par exemple le propylène glycol, le 1,3 -propanediol ou le dipropylène glycol.

De préférence, le solvant alcoolique est un monoalcool comprenant de 2 à 4 atomes de carbone, plus préférentiellement l’éthanol.

De préférence, le solvant alcoolique est mis en œuvre en mélange à au moins 90% avec de l’eau, de préférence au moins 95% avec de l’eau. De préférence, le solvant alcoolique est mis en œuvre en mélange entre 90% et 99% avec de l’eau, de préférence entre 95% et 99% avec de l’eau.

De préférence, l’éthanol est mis en œuvre en mélange à au moins 90% avec de l’eau, de préférence au moins 95% avec de l’eau. De préférence, l’éthanol est mis en œuvre en mélange entre 90% et 99% avec de l’eau, de préférence entre 95% et 99% avec de l’eau.

En particulier, l’éthanol est mis en œuvre en mélange à 96% avec de l’eau.

L’extraction est généralement réalisée en immergeant et en agitant doucement les fleurs de Lys blanc dans un ou plusieurs des solvants cités ci-dessus pendant une durée comprise entre 1 et 6 heures, à une température comprise entre 40°C et 60°C, de préférence entre 45 et 55°C.

L’étape d’extraction b) est suivie d’une filtration, par exemple sur un tamis de 50pm, pour éliminer les résidus végétaux.

Selon un mode préféré de réalisation, l’étape b) met en œuvre au moins deux extractions. Dans ce cas, chaque extraction étant suivie d’une étape de filtration.

A l’issue de la ou des étapes d’extraction b), les filtrats liquides sont récupérés et mélangés. Le mélange de filtrat est ensuite laissé au repos pendant au moins 6h, de préférence au moins lOh.

Le filtrat ou le mélange de filtrats obtenu à l’issue de l’étape c) est alors à nouveau filtré afin d’éliminer les substances insolubles : c’est l’étape d). De préférence, la filtration de l’extrait obtenu en c) est effectuée sur un tamis ou une membrane de filtration de 4 pm. On obtient ainsi un filtrat liquide. Enfin, le solvant présent dans le filtrat liquide est éliminé, et le reste de filtrat est dilué dans un autre solvant alcoolique (étape e)).

L’ordre des étapes de d’élimination du solvant et de la dilution du filtrat dans un autre solvant est indifférent. En particulier, le solvant présent dans le filtrat liquide peut être éliminé, puis le reste de filtrat est dilué dans un autre solvant alcoolique. Alternativement, le filtrat liquide est d’abord dilué dans un autre solvant alcoolique, et les solvants sont ensuite éliminés. Encore alternativement, la dilution du filtrat et l’élimination des solvants peut être simultanée. Le solvant alcoolique utilisé dans l’étape e) est appelé « autre solvant alcoolique », car il est différent du solvant alcoolique utilisé dans l’étape a). Tenant compte de cette limitation, le solvant alcoolique est typiquement choisi dans le même groupe que celui de l’étape a), i.e. parmi les monoalcools en C1-C4 et les diols.

De préférence, la dilution finale est réalisée dans un diol, de préférence du 1,3-propanediol. De préférence, l’élimination du solvant de l’étape e) se fait par évaporation, notamment par évaporation sous vide.

De préférence, entre les étapes d) et e), une étape de décoloration du filtrat obtenu en d) est ajoutée. La décoloration peut se faire par adsorption des pigments présents dans le filtrat sur charbon actif. Cette étape de décoloration peut être suivie d’une étape de filtration du filtrat décoloré obtenu, notamment jusqu’à Ipm.

Préférentiellement, l’extrait alcoolique de fleurs de Lys blanc, Lilium candidum L, selon l’invention est susceptible d’être obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) le broyage des fleurs de Lys blanc, Lilium candidum L., b) au moins une, de préférence au moins deux extractions desdites fleurs broyées en présence d’un solvant alcoolique, chaque extraction étant suivie d’une étape de filtration ; c) le mélange des au moins deux filtrats liquides issus des deux extractions de l’étape b) et repos du mélange obtenu pendant au moins 6h, de préférence au moins lOh ; d) filtration du mélange obtenu en c) pour obtenir un filtrat ; décoloration du filtrat obtenu en d) par adsorption sur charbon actif ; puis - filtration du filtrat décoloré sur une membrane de 1 pm ; et e) élimination de l’éthanol du filtrat obtenu par évaporation, puis dilution finale dans du 1,3-propanediol.

Avantageusement, l’extrait mis en œuvre selon l’invention est de couleur claire.

Egalement, ledit extrait se présente sous une forme suffisamment concentrée pour pouvoir être utilisé sans entraîner les problèmes de formulation habituellement rencontrés aux concentrations nécessaires pour obtenir une activité dans les compositions cosmétiques ou dermatologiques sous forme d’émulsion, et sans présenter une couleur foncée, contrairement aux extraits végétaux obtenus par des procédés usuels, lorsqu’ils sont sous forme concentrée.

En particulier, après évaporation de l’éthanol, l’extrait de fleurs de Lys blanc, Lilium candidum L., comprend 15 à 25% en poids d’extrait sec de Lys et 75 à 85% en poids de 1,3-propanediol, et de préférence, environ 20% en poids d’extrait sec de Lys et 80% en poids de 1,3-propanediol.

De ce fait, l’extrait selon l’invention peut être utilisé directement pour la préparation d’une composition cosmétique.

Selon un autre aspect, l’invention concerne l’utilisation cosmétique d’un extrait alcoolique de fleurs de Lys blanc, Lilium candidum L., selon l’invention, comme agent antioxydant et/ou anti-âge.

Selon encore un autre aspect, l’invention concerne l’utilisation cosmétique d’un extrait alcoolique de fleurs de Lys blanc, Lilium candidum L., selon l’invention, pour la prévention et/ou l’atténuation d’altérations de la peau dues au vieillissement. Et en particulier, en tant qu’ agent d’activation de la réponse au stress oxydatif médiée par NRF2 et/ou agent favorisant l’épaississement de l’épiderme.

En effet, de manière avantageuse, on a trouvé que l’extrait alcoolique de fleurs de Lys blanc, Lilium candidum L., selon l’invention possédait plusieurs activités d’intérêt vis- à-vis de mécanismes physiologiques préventifs ou réparateurs liés aux altérations de la peau, dues notamment au vieillissement. On a notamment trouvé, de manière avantageuse, que l’extrait alcoolique de fleurs de Lys blanc, Lilium candidum L, selon l’invention permettait une augmentation de l’expression des marqueurs papillaires CCRL1, NTN et PDPN ainsi qu’une diminution de l’expression des marqueurs réticulaires CDH2, CNN et MGP dans des fibroblastes réticulaires.

L’extrait selon l’invention présente permet, en outre d’améliorer la morphologie de l’épiderme, notamment en favorisant son épaississement dans des modèles de peaux âgées reconstruites avec des fibroblastes réticulaires.

L‘ invention concerne également, selon encore un autre aspect, une composition cosmétique comprenant, dans un véhicule cosmétiquement acceptable, un extrait alcoolique de fleurs de Lys blanc, Lilium candidum L., selon l’invention. De préférence, ledit extrait est présent dans la composition cosmétique ou dermatologique à raison de 0,001 à 10% en poids, par rapport au poids total de la composition, en particulier à raison de 0,01 à 10% en poids, de préférence de 0,1 à 10% en poids. Ladite composition cosmétique peut notamment, être adaptée à une application par voie topique.

Avantageusement, ladite composition cosmétique peut se présenter sous la forme d’une poudre, d’une émulsion, d’une microémulsion, d’une nanoémulsion, d’une suspension, d’une solution d’une lotion, d’une crème, d’un gel aqueux ou hydroalcoolique, d’une mousse, d’un sérum, d’une solution ou d’une dispersion pour aérosol, ou d’une dispersion de vésicules lipidiques.

Dans le cas d’une émulsion, il peut s’agir d’une émulsion eau dans huile ou huile dans eau.

La composition cosmétique selon l’invention peut comprendre également un solvant choisi en fonction des différents ingrédients et de la forme d’administration.

A titre d’exemples, on peut citer l’eau (de préférence de l’eau déminéralisée ou des eaux florales), un alcool tel que l’éthanol.

Ladite composition cosmétique peut également comprendre, en outre de l’extrait selon l’invention, au moins un additif usuel dans le domaine, tel que par exemple au moins un composé choisi parmi un agent émollient ou humectant, un agent gélifiant et/ou épaississant, un agent tensioactif, une huile, un agent actif, un colorant, un conservateur, un agent antioxydant, un agent actif, une poudre organique ou inorganique, un filtre solaire et un parfum.

- Un ou plusieurs agent(s) humectant(s), tels que les polyols (glycérine, diglycérine, le propylène glycol, le propanediol, le caprylyl glycol, le pentylène glycol, l’hexanediol), les sucres, les glycosaminoglycanes tels que l'acide hyaluronique et ses sels et esters ; et les polyquatemiums tel que le lipidure PMB

Ledit agent humectant sera présent dans la composition à une teneur de l'ordre de 0,1 à 30%, de préférence 0,005 à 10% en poids total de la composition.

- Un ou plusieurs agent(s) émollient(s) qui peuvent être choisi(s) par exemple parmi les esters tels que les esters de jojoba, les esters d'acides gras et d'alcool gras (octyldodecyl myristate, triethylhexanoin, Dicaprylyl carbonate, Isostearyl isostearate, caprylic/capric triglyceride), les beurres tels que les beurres de karité (butyrospemum parkii butter extract, shea butter ethyl esters, commercialisés sous les noms de LIPEX SHEASOFT, LIPEX SHEA-U, LIPEX SHEA, LIPEX SHEALIGHT, LIPEX SHEA TRIS) ou de moringa (moringa oil/hydrogenated moringa oil esters), les cires (acacia decurrens flower wax & helianthus annuus cera seed seed wax, Cl 0-18 triglycerides), les huiles végétales, le phytosqualane, les alcanes (undecane, tridecane)

Ledit agent émollient sera présent dans la composition à une teneur de l'ordre de 0,1 à 30%, de préférence 0,5 à 10% en poids total de la composition.

- Un ou plusieurs agent(s) gélifiants(s) et/ou épaississant(s) de la phase aqueuse, choisi par exemple parmi les dérivés cellulosiques, gommes d'origine végétale (guar, caroube, alginates, carraghenanes, pectines), d'origine microbienne (xanthane), les argiles (laponite), les homo- et copolymères réticulés ou non, hydrophiles ou amphiphiles, d'acide acryloylméthylpropane sulfonique (AMPS) et/ou d'acrylamide et/ou d'acide acrylique et/ou de sels ou d'esters d'acide acrylique (commercialisés sous les noms ARISTOFLEX AVC, Aristoflex AVS, Aristoflex HMB, SIMULGEL NS, Simulgel EG, Simulgel 600, Simulgel 800, Pemulen, carbopol, Sepiplus 400, Seppimax zen, Sepiplus S, COSMEDIA SP)

Ledit agent gélifiant et/ou épaississant sera présent dans la composition à une teneur de l'ordre de 0,1 à 10% en poids total de la composition.

- Un ou plusieurs agent(s) tensioactif(s), notamment

*les tensioactifs anioniques tels que les isethionates, les taurates, les sarcosinates, les glycinates, les glutamates, les phosphates (C20-22 alkyl phosphate commercialisé sous le nom SENSANOV WR)

* les tensioactifs amphotères tel que les dérivés de la bétaïne, les amphoacétates

* les tensioactifs non ioniques tel que les dérivés de polyglycérol, les dérivés de sucre (les dérivés de glucosides ou de xylosides commercialisés sous le nom MONTANOV 68, MONTANOV 202, Montanov 82, MONTANOV L, EASYNOV), les lecithines.

Ledit agent tensioactif, sera présent dans une teneur de l’ordre de 0,1 à 15%, de préférence 0,5 à 10% en poids, par rapport au poids total de la composition.

- Un ou plusieurs agent(s) actif(s) d'origine naturelle, biotechnologique ou synthétique ayant une activité biologique et ayant une efficacité sur la peau via des sites biologiques, par exemple choisi parmi les vitamines tels que la vitamine C et ses dérivés (ascorbyl glucoside, 3-o-ethyl ascorbic acid, le tétraisopalmitate d'ascorbyle), la vitamine A et ses dérivés, la vitamine E et ses dérivés, la vitamine B3 ou Niacinamide, le panthénol, les oligo-éléments, l'allantoïne, l'adénosine, les peptides (Palmitoyl tetrapeptide-7, Palmitoyl Tripeptide-1, Palmitoyl Pentapeptide-4, Acetyl Dipeptide-1 Cetyl Ester, Acetyl Tetrapeptide-5 commercialisés sous le nom NP RIGIN, MATRIXYL 3000, IDEALIFT, EYESERYL), les extraits végétaux (glycyrrhiza glabra extract, centella asiatica leaf extract, secale cereale seed extract), les extraits de levures, les alpha hydroxyacides tels que l'acide glycolique ou lactique, l’acide tranexamique et ses dérivés tel que le cetyl tranexamique ester etc.

Ledit agent actif sera présent dans la composition à une teneur de l'ordre de 0,1 à 10% en poids total de la composition.

D’autres additifs habituellement utilisés en cosmétique peuvent également être présents dans la composition selon l’invention, notamment des conservateurs, des agents antioxydants ou des parfums bien connus dans le domaine technique.

L’homme du métier est en mesure de choisir, parmi l’ensemble de ces éventuels additifs, aussi bien la nature que la quantité de ceux qui seront ajoutés à la composition, de telle sorte que celle-ci conserve l’ensemble de ses propriétés.

L’invention est illustrée de manière non limitative par les exemples ci-dessous. Exemple 1 : Préparation d’un extrait alcoolique de fleurs de Lys blanc, Lilium candidum selon l’invention

Un extrait alcoolique de fleurs de Lys blanc, Lilium candidum L., selon l’invention est préparé par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) le broyage de 200g fleurs de Lys blanc, Lilium candidum L., en poudre b) Extraction de la poudre dans 2000g d’éthanol 96° sous agitation à 50°C pendant 2h ;

Tamisage du mélange 1 obtenu à 50pm : le filtrat 1 est mis de côté ;

Extraction des drêches dans 2000g d’éthanol 96° sous agitation à 50°C pendant 2h ;

Tamisage du mélange 2 obtenu à 50pm : les drêches sont écartées ; c) Ajout du filtrat 2 au filtrat 1 et décantation du mélange pendant une nuit ; d) Filtration du surnageant à 4pm ;

- Détermination de la matière sèche sur 3X5g d’extrait placé 3h à 110°C ;

- Décoloration du filtrat 3h à température ambiante sous agitation après ajout de 20% de charbon actif par rapport à l’extrait sec ;

- Filtrations sur membranes à 4 et Ipm : élimination du charbon actif ; e) Ajout de 180 g de 1,3 -propanediol et agitation une demi -heure ; et évaporation de l’éthanol à l’évaporateur rotatif.

Filtration finale à 4pm.

Exemple 2 : Test des propriétés de l’extrait de Lys selon l’invention contre le stress oxydatif.

Protocole : Des kératinocytes épidermiques humains normaux issus de deux donneurs juvéniles ont été ensemencés en plaque 6 puits et cultivés en milieu complémenté KGM2 (Lonza) pendant 72h à 37°C et 5% de CO2. Les cellules ont ensuite été incubées ou non (condition non traitée) avec 0,25% d’extrait pendant 24h. Chaque condition a été effectuée en duplicat. Les ARNs totaux ont été extraits à l'aide du kit RNeasy 96 Plate Extraction Kit (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. La quantité et la qualité des ARNs ont été évaluées par Multiskan GO (Thermo Fischer). Les ADN complémentaires ont été synthétisés et un transcriptome a été réalisé sur puce Affymetrix GeneChip Human Transcriptome Array 2.0. L'analyse bioinformatique des gènes dont l'expression est modulée a minima par un facteur 2 (FC : fold change, niveau d’expression vs condition non traitée) a été effectuée avec le logiciel Ingenuity Pathway Analysis (IP A®, QIAGEN).

Résultats : à 0,25%, l’extrait est capable de moduler en moyenne l’expression de 158 gènes (dont 59 inhibés et 99 stimulés) dans des kératinocytes humains normaux après 24h de traitement.

Le logiciel IP A a été utilisé pour évaluer les modifications de l’activité biologique après traitement avec l’extrait. Une carte représentant la modulation de l’expression de différentes voies biologiques a été établie (données non fournies). La carte transcriptomique obtenue après 24h de traitement révèle la modulation de nombreuses fonctions biologiques avec 0,25% d’extrait. Le Lys de la Madone est notamment capable de moduler 64 voies de signalisation canoniques.

Parmi les voies biologiques significativement activées par l’extrait de lys à 0,25%, on retrouve la voie de réponse au stress oxydatif médiée par NRF2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2, facteur nucléaire 2 lié au facteur érythroïde 2). NRF2 est un facteur de transcription qui permet, une fois activé, d’augmenter l’expression d’enzymes antioxydantes telles que GCLM, GPX, GST, NQO1, SOD et TXNR. NRF2 active également la transcription de protéines antioxydantes non enzymatiques comme la ferritine composée notamment des sous-unités FTL et FTH1. La stimulation de cette voie biologique de détoxification cellulaire globale dans des kératinocytes normaux après 24h de traitement par l’extrait à 0,25% lui confère des propriétés antioxydantes et anti-âge, le stress oxydatif participant au vieillissement de la peau.

Tableau I : Liste des gènes impliqués dans la voie biologique de « réponse au stress oxydatif médiée par NRF2 » dont l’expression est significativement stimulée par l'extrait de Lys à 0,25%. NRF2 : Facteur nucléaire 2 lié au facteur érythroïde 2, FC : niveau d’expression vs condition non traitée

5 Exemple 3 : Propriétés anti-âge de l’extrait de Lys selon l’invention dans des modèles cellulaires et tissulaires de vieillissement cutané.

Au niveau cellulaire, le derme peut être divisé en deux sous-populations de fibroblastes : les fibroblastes papillaires, situés sous l’épiderme au niveau des papilles et qui présentent un phénotype plus jeune, et les fibroblastes réticulaires, plus

10 en profondeur et plus différenciés montrant un phénotype plus âgé. Ces deux sous- populations expriment des marqueurs spécifiques : CCRL1, NTN et PDPN pour les fibroblastes papillaires et CDH2, CNN et MGP pour les fibroblastes réticulaires. Le vieillissement du derme se caractérise notamment par la différenciation progressive des fibroblastes papillaires en fibroblastes réticulaires conduisant à une rigidification du

15 derme. Ce vieillissement peut être modélisé en laboratoire, au niveau cellulaire, en utilisant des fibroblastes réticulaires et, au niveau tissulaire, en reconstruisant des peaux équivalentes avec un derme synthétisé par des fibroblastes réticulaires. Ces modèles peuvent être ainsi utilisés pour identifier des ingrédients aux propriétés anti-âge capables de reverser le vieillissement dermique.

20 Protocole modèle cellulaire : Des fibroblastes réticulaires dermiques humains normaux issus de trois donneurs ont été ensemencés en plaque 6 puits et cultivés en milieu DMEM supplémenté avec 5% de sérum pendant 72h à 37°C et 5% de CO2. Les cellules ont ensuite été incubées ou non (condition non traitée) avec 0,25% d’extrait pendant 96h dans un milieu DMEM supplémenté avec 2,5% de sérum. Les ARNs totaux ont été extraits à l'aide du kit RNeasy 96 Plate Extraction Kit (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. La quantité et la qualité des ARNs ont été évaluées par Experion (Biorad). Les ADN complémentaires ont été synthétisés (iScript kit, Biorad) puis les réactions de qPCR ont été réalisées avec la méthode SYBR Green (Biorad) suivant ce programme : 5 min à 95°C puis 35 cycles avec 20 secondes à 95°C, 20 secondes à 60°C et 20 secondes à 72°C suivis par la génération de courbes de fusion. Les analyses d’expression ont été réalisées avec le logiciel iQ5 (Biorad) en utilisant la méthode des AACt avec des gènes de référence exprimés de façon stable. L’expression de biomarqueurs spécifiques des fibroblastes papillaires (CCRL1, NTN et PDPN) et réticulaires (CDH2, CNN et MGP) a ainsi été évaluée dans les échantillons.

Résultats : Comme indiqué dans la Figure 1, à 0,25%, l’extrait est capable d’augmenter l’expression des marqueurs papillaires CCRL1, NTN et PDPN ainsi que de diminuer l’expression des marqueurs réticulaires CDH2, CNN et MGP dans des fibroblastes réticulaires après 96h de traitement. L’extrait de Lys présente donc une capacité à reverser le phénotype âgé des fibroblastes réticulaires en un phénotype plus jeune, proche de celui des fibroblastes papillaires.

Protocole modèle tissulaire : Des fibroblastes papillaires ou réticulaires dermiques humains normaux issus de trois donneurs ont été ensemencés et cultivés en milieu DMEM supplémenté avec 5% de sérum (HyClone) pendant 5 jours à 37°C et 5% de CO2. Les cellules ont ensuite été incubées ou non (condition contrôle) avec 0,25% d’extrait ou avec 0,25% de solvant propandiol (condition diluant seul) pendant 4 jours. Des dermes équivalents ont été générés avec les cellules traitées ou contrôles puis ils ont été incubés de nouveau ou non avec 0,25% d’extrait de Lys ou de propandiol en milieu DMEM supplémenté avec 5% de sérum et 1% de pénicilline-streptomycine (Invitrogen) à 37°C et 5% de CO2, pendant 7 jours. Des kératinocytes épidermiques humains normaux ont ensuite été ensemencés sur les dermes équivalents et les cultures maintenues en milieu DMEM/Ham’s F 12 (3 : 1) supplémenté avec 5% de sérum, 1.1 pM hydrocortisone, 1 pM d’ isoproterenol, 0.1 pM d’insuline (Sigma-Aldrich) et 1% de pénicilline-streptomycine (Invitrogen), pendant 2 jours. Les peaux reconstruites avec des fibroblastes papillaires (Pap) ou réticulaires (Ret) ont été placées à l’interface air/liquide et de nouveau traitées ou non selon les conditions précédemment décrites pendant 14 jours avant d’être fixées, déshydratées puis incluses en paraffine. Des coupes histologiques ont ensuite été réalisées et utilisées pour une coloration hématoxyline safran éosine (HSE) ou un immunomarquage Ki67.

La coloration hématoxyline safran éosine (HSE) a été réalisée afin d’observer leur morphologie globale et notamment l’épaisseur de l’épiderme qui s’affine dans les modèles de peaux âgées réticulaires ( s peaux « jeunes » papillaires) ⁶ . Un immunomarquage de Ki67, un marqueur de la prolifération cellulaire, a aussi été réalisé afin de dénombrer les cellules positives dans les peaux reconstruites avec des fibroblastes papillaires. Un démasquage antigénique a été effectué en tampon citrate à pH6, avant incubation dans une solution de blocage empêchant la fixation aspécifique des anticorps. Les coupes sont ensuite incubées sur la nuit à 4°C avec un anticorps primaire ciblant spécifiquement Ki67 (MIB-1, Dako) puis avec le système avidine- biotine-peroxydase en suivant les recommandations du fournisseur (GE Healthcare). Le marquage a été visualisé par ajout d’AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) et les coupes ont été contre-colorées à l’aide d’ hématoxyline.

Résultats : Comme le montre la Figure 2, à 0,25%, l’extrait de Lys selon l’invention est capable d’améliorer la morphologie de l’épiderme, notamment en favorisant son épaississement (à droite), dans des modèles de peaux âgées reconstruites avec des fibroblastes réticulaires par rapport aux conditions non traitées (au centre). Les peaux traitées avec l’extrait retrouvent ainsi une morphologie plus jeune, proche de celles obtenues avec des peaux reconstruites avec des fibroblastes papillaires non traitées (à gauche).

Comme indiqué dans la Figure 3, à 0,25%, l’extrait est également capable d’augmenter le nombre de cellules exprimant le marqueur de prolifération Ki67 dans la couche basale des peaux reconstruites avec des fibroblastes papillaires. Il favorise donc le renouvellement cellulaire.

Ainsi, l’extrait de Lys à 0,25% est capable de ralentir le vieillissement dermique en modifiant un phénotype réticulaire en un phénotype papillaire plus jeune dans des modèles cellulaires et tissulaires. Il présente donc de fortes propriétés anti-âge. Exemple 4 : compositions cosmétiques

Les compositions suivantes peuvent être préparées de façon classique pour l'homme du métier. Les quantités indiquées ci-dessous sont exprimées en pourcentages pondéraux. Les ingrédients en majuscules sont identifiés conformément à la dénomination INCI.

A — émulsion huile/eau gel

b — émulsion huile/eau crème

Ces compositions peuvent être appliquées tous les jours, matin et/ou soir, sur la peau.