Chromatographische Trennmaterialien bzw. Sorbentien, die zur Auftrennung oder Reinigung von Biopolymeren eingesetzt werden, müssen neben guten Trenneigenschaften eine hohe Alkalistabilität aufweisen.

Grund dafür sind insbesondere spezielle Reinigungs-und Sterilisationsverfahren, denen die Sorbentien unterworfen werden.

Beispielsweise wird bei dem sogenannten clean in place Verfahren das Trennmaterial in Abhängigkeit von der Säulendimension über einen Zeitraum von 10 Minuten bis zu drei Stunden mit 1 M Natronlauge behandelt. Um eine Verkeimung zu verhindern, werden die Trenn- materialien für eine Langzeitlagerung in 0, 1 M Natronlauge aufbewahrt.

Nicht alle Trägermaterialien, die zur Auftrennung von Biopolymeren eingesetzt werden, sind unter derartigen Bedingungen stabil.

Trägermaterialien für die Biochromatographie sind beispielsweise natürliche Polymere, wie Dextran, Agarose oder Cellulose, Kieselgel oder synthetische Polymere, wie Polystyrol und Methacrylatester. Um funktionalisierte Trägermaterialien für die lonenaustausch-, hydrophobe Interaktions-oder Affinitätschromatographie herzustellen, müssen die genannten Basismaterialien chemisch modifiziert werden. Dies kann auf zwei verschiedene Arten erfolgen : 1) polymeranaloge Umsetzungen mit niedermolekularen Komponenten 2) Pfropf-und Blockpolymerisationen Bei einer nicht-polymeren Beschichtung erfolgt die Derivatisierung des Basismaterials häufig über Etherbindungen oder sekundäre Amine.

Derartige Bindungen sind alkalistabil. Nichtpolymere Beschichtungen haben jedoch den Nachteil einer geringen Proteinbindungskapazität.

Aus diesem Grund sind polymere Oberflächenbeschichtungen zu bevorzugen. In EP 0 337 144 werden Beschichtungen von Methacrylat- gelen mit ionischen Polyamiden beschrieben. Bekanntermaßen sind jedoch Methacrylate alkalilabil.

In WO 96/22316 bzw. WO 97/49754 wird die Beschichtung von Derivaten des alkalistabilen Basismaterials Polyamid 6 mit Methacrylatestern beschrieben, die durch polymeranaloge Umsetzungen anschließend weiter zu ionischen Derivaten modifiziert werden. Aber auch diese Materialien besitzen aufgrund der Methacrylatbeschichtung nur eine begrenzte Alkalistabilität.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, für die Biochromatographie geeignete funktionalisierte Sorbentien zur Verfügung zu stellen, die sowohl eine hohe Alkalistabilität als auch eine hohe Bindekapazität aufweisen.

Es wurde gefunden, daß bei der Beschichtung von Derivaten des alkalistabilen Basismaterials Polyamid 6 mit Methacrylatestern und anschließender polymeranaloger Umsetzung zu ionischen Derivaten die Basenstabilität stark erhöht werden kann, wenn die polymeranaloge Umsetzung nicht nur mit Separationseffektoren, wie z. B. Diethylamin, sondern nachfolgend zusätzlich mit Ethanolamin durchgeführt wird. Die so erhältlichen Trennmaterialien zeigen neben einer guten Bindekapazität auch eine sehr gute Stabilität gegenüber Alkalibehandlung.

Trotz der bislang als basenlabil einzustufenden Beschichtung aus Methacrylatestern ist das erfindungsgemäß nachbehandelte Material wesentlich stabiler als beispielsweise Materialien aus Glycidylmethacrylat/ Ethylenglycoldimethacrylat, die mit dem basenstabileren Polyacrylamido- (N, N'-diethylaminoethylendiamin) beschichtet sind.

Gegenstand der Erfindung sind daher alkalistabile Sorbentien, die hergestellt werden durch Umsetzung eines Formkörpers, der reaktive Gruppen der Formel I aufweist, mit einer Verbindung der Formel II.

In Formel I bedeuten : Ri, R2 und R3 unabhängig voneinander H oder CH3, R4 H, Alkyl mit 1-5 C-Atomen oder Aryl mit 6-12 C-Atomen, U-O-oder-NH- und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5.

A-(CH2)m-B II In Formel II bedeuten A NHR5, B H, OH, SH oder NHR5 mit R5 H, Alkyl mit 1-5 C-Atomen, bevorzugt H, Methyl oder Ethyl und m eine ganze Zahl zwischen 1 und 6, bevorzugt 2 und 3.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Sorbens reaktive Gruppen der Formel I auf, in denen Ri und R2 H, R3 CH3,

R4 H, U-O- und n 1 bedeuten. Diese Gruppen entstehen vorzugsweise durch Block-oder Pfropfpolymerisation von Glycidylmethacrylat auf ein Basispolymer.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird Ethanolamin als Verbindung der Formel II verwendet.

In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Sorbens aus einem Basispolymer aus Polyamid, Polyvinylalkohol oder Copolymeren aus (Meth) acrylatderivaten und Comonomeren mit aliphatischen Hydroxylgruppen.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Sorbens zusätzlich Gruppen der Formel III auf, die Separationseffektoren tragen.

R9 Alkyl mit 1-5 C-Atomen.

In Formel 111 bedeuten : Ri, R2 und R3 unabhängig voneinander H oder CH3, R4 H, Alkyl mit 1-5 C-Atomen oder Aryl mit 6-12 C-Atomen, U-O-oder-NH- n eine ganzen Zahl zwischen 1 und 5, ein Rest X einen Separationseffektor, sowie der andere Rest X OH.

Der Separationseffektor kann insbesondere eine der folgenden Bedeutun- gen aufweisen : a) eine ionische Gruppe, ausgewählt aus-NR7R8 oder-N+R7RsR9 worin R7 und Rs unabhängig voneinander H, Alkyl mit 1-5 C-Atomen und R9 Alkyl mit 1-5 C-Atomen mit der Maßgabe, daß wenn X =-N+R7R8R9, R7 und R8 nicht H sein können, b) eine hydrophobe Gruppierung-OR10 oder-NHR10, wobei Rl 0 Cl-C20- Alkyl, C6-C25-Aryl, C7-C25-Alkylaryl oder C7-C25-Arylalkyl bedeuten, und wobei diese Reste auch mit Nitril oder C1-Cs-Alkoxy derivatisiert sein können, und wobei auch eine oder mehrere nicht benachbarte CH2- Gruppen durch NH oder O oder auch eine oder mehrere CH Gruppen durch N ersetzt sein können ; c) eine Metallchelat-Gruppierung ; d) ein thiophiler Rest ; e) ein chiraler Rest.

Thiophile Reste sind beispielsweise in EP 0 165 912 offenbart.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Separationseffektoren um Anionentauscher.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung alkalistabiler Sorbenzien, dadurch gekennzeichnet, daß Sorbenzien mit reaktiven Gruppen der Formel I mit einer Verbindung der Formel II umgesetzt werden.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen alkalistabilen Sorbens zur chromatographischen Auftrennung von Stoffgemischen, insbesondere Stoffgemischen, die Biopolymere enthalten.

Abbildung 1 ist in Beispiel 2 näher erläutert.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich alle Sorbenzien stabilisieren, die reaktive Gruppen der Formel I aufweisen. Diese Gruppen können bereits in einem Basispolymer vorhanden sein oder, bevorzugt, durch Beschichtung von Basispolymeren entstehen.

Als reaktive Gruppen werden erfindungsgemäß Gruppen bezeichnet, die sich am Ende einer Polymerkette befinden oder Gruppen, die sich in einem Polymer oder einer Polymerkette befinden und von außen, beispielsweise für entsprechende Derivatisierungsreagenzien, zugänglich sind. Im Gegensatz zu diesen reaktiven Gruppen befinden sich beispielsweise im Inneren eines Polymers Gruppen gleicher Funktionalität, die aufgrund ihrer Lage nicht für Reagenzien zugänglich sind. Diese Gruppen fallen erfindungsgemäß nicht unter den Begriff reaktive Gruppen.

Sorbenzien bestehen, wie dem Fachmann bekannt, aus organischen oder anorganischen polymeren Formkörpern. Unter Formkörpern werden erfindungsgemäß poröse und unporöse polymere Materialien, wie beispielsweise periförmige Formkörper, Membranen, Schläuche, Hohl- fasermembranen oder Schwämme verstanden.

Als Basispolymere können organische oder anorganische Polymere dienen, die entweder selbst reaktive Gruppen der Formel I aufweisen oder in die durch Aufpolymerisation oder sonstige Umsetzungen entsprechende Gruppen eingeführt werden können. Beispielsweise sind dies hydroxylgruppenhaltige Basispolymere, wie Polysaccharide auf

Agarosebasis, Cellulosederivate, Polymere auf Dextranbasis. Bevorzugt sind Polymere auf Polyvinylalkohol-Basis oder Copolymere aus (Meth) acrylatderivaten und Comonomeren mit aliphatischen Hydroxylgruppen. Ein bevorzugtes Basispolymer, das kommerziell erhältlich ist, ist Fractogel'TSK HW 65 (S) (Fa. Merck KGaA).

Diese Basispolymere können beispielsweise nach der in EP 0 565 978 beschriebenen mit Cer (IV) katalysierten Pfropfpolymerisation mit den erfindungsgemäß notwendigen Gruppen der Formel I versehen werden.

Dabei werden (Meth) acrylsäurederivate, die eine Oxirangruppen tragen, kovalent an die Basispolymere gebunden. Es bildet sich eine Beschichtung aus Polymeren, die Gruppen der Formel I enthalten. Besonders bevorzugt erfolgt die Beschichtung durch Propfpolymerisation mit Glycidylmethacrylat.

Ebenso als Basispolymere für die vorliegende Erfindung geeignet sind andere Polymere, wie beispielsweise Polystyrole oder besonders Polyamide. Dem Fachmann sind geeignete Verfahren zur Beschichtung dieser Materialien mit Glycidylmethacrylat oder dessen Derivaten bekannt.

Eine geeignete Methode zur Beschichtung von Polyamiden wird beispielsweise in WO 96/22316 bzw. WO 97/49754 offenbart.

Als Basispolymer geeignete Polyamide sind dem Fachmann bekannt und sind auch kommerziell erhältlich. Dazu gehören z. B. die unter dem Handelsnamen NYLON bekannten Polymere, z. B. NYLON@ 66 und NYLON 6. Poröse oder unporöse Formkörper bestehend aus derartigen Polyamiden sind ebenfalls bekannt und auch kommerziell erhältlich. Die Umsetzung derartiger Formkörper entsprechend WO 96/22316 bzw. WO 97/49754 ist bevorzugt, da unter den dort verwendeten Reaktions- bedingungungen (Reaktionstemperatur unter 60 °C), die Form der Formkörper erhalten bleibt, während andere Verfahren zur Derivatisierung von Polyamid in der Schmelze oder in Lösung ausgeführt werden.

Die üblicherweise verwendeten Polyamide, wie z. B. NYLON 66 oder NYLON 6 enthalten nur endständige freie Carboxyl-und/oder Amino- gruppen. In diesem Fall entsteht bei der Polymerisation mit Monomeren auf das derivatisierte Basispolymer ein Blockpolymerisat. Falls das Basis- polymer neben den endständigen freien Carboxyl-und/oder Aminogruppen noch seitenständige freie Carboxyl-und/oder Aminogruppen enthält, so entstehen zusätzlich seitenständige polymerisierbare Gruppen. Bei einer anschließenden Polymerisation findet dann zusätzlich zur Bildung des Blockpolymers eine Pfropfung statt.

Zur Darstellung der erfindungsgemäßen basenstabilen Materialien werden, wie z. B. in WO 96/22316 bzw. WO 97/49754 beschrieben, in einem ersten Reaktionsschritt ungesättigte Reste in das Polyamid eingeführt. Dazu wird ein ethylenisch ungesättigtes Derivatisierungsmittel, d. h. eine amino-oder carboxyreaktive Verbindung, die eine polymerisierbare Doppelbindung enthält, mit den Amino-beziehungsweise Carboxylgruppen des Polyamids zur Reaktion gebracht. Aminoreaktive Verbindungen sind grundsätzlich dem Fachmann in großer Zahl bekannt : Dazu gehören beispielsweise Oxiranderivate, Säureanhydride, Säureazide, Azlactonderivate. Besonders bevorzugt wird Glycidylmethacrylat verwendet.

In ähnlicher Weise können Reaktionsfoigen verwendet werden, die bei Peptidsynthesen Verwendung finden, beispielsweise Reaktionen mit wasserabspaltenden Mitteln (z. B. Carbodiimiden) oder die Verwendung von aktivierten Estern (z. B. p-Nitrophenylester). In analoger Weise ist es möglich, die freien Carboxylgruppen von Polyamiden zu derivatisieren, so daß diese ebenfalls als Ansatzpunkte für eine Polymerisation zur Verfügung stehen. Dazu können Verbindungen, die mit Carboxylgruppen reagieren können, und die polymerisierbare Doppelbindungen enthalten, z. B. Allylamin, verwendet werden.

Soweit das Basispolymer sowohl Carboxyl-als auch Aminogruppen enthält, ist es möglich, die Beladungsdichte zu erhöhen, indem vor der Umsetzung mit dem ethylenisch ungesättigten Derivatisierungsmittel eine Umsetzung mit einem bifunktionellen Derivatisierungsmittel erfolgt, d. h. mit einer Diaminoverbindung oder mit einer Dicarbonsäure oder einem Dicarbonsäureanhydrid.

Reaktionsfolgen für die genannten Umsetzungen sind dem Fachmann bekannt bzw. werden in WO 96/22316 und WO 97/49754 und der dort zitierten Literatur beschrieben.

An die eingeführten ungesättigten C=C-Gruppen können anschließend weitere Monomere nach allgemein bekannten Verfahren polymerisiert werden. Geeignete Monomere, die eine polymerisierbare Doppelbindung und einen Oxiranring aufweisen, werden in z. B. WO 96/22316 und WO 97/49754 und den dort zitierten Schriften offenbart. Besonders bevorzugt wird eine Blockpolymerisation mit Glycidylmethacrylat durchgeführt.

Ein Teil der Epoxidgruppen in den so hergestellten beschichteten Basispolymeren kann optional dann in einer polymeranalogen Reaktion weiter umgesetzt werden, wodurch lonentauscher, thiophile Sorbentien oder Sorbentien für die Metallchelat-oder die hydrophobe Chromato- graphie, sowie auch für chirale Trennungen bereitgestellt werden. Es entstehen Gruppierungen entsprechend Formel 111. Dabei werden bei- spielsweise Ammoniak, Diethylamin, Trimethylamin, Komplexbildner wie Iminodiessigsäure, oder chirale Verbindungen, oder auch z. B.

Biotinderivate, an den Oxiranring addiert. Diese Verbindungen werden erfindungsgemäß Separationseffektoren genannt. Beispiele für derartige polymeranaloge Umsetzungen sind in WO 96/22316 und WO 97/49754, und den dort zitierten Schriften offenbart.

Besonders bevorzugt werden die erfindungsgemäßen stabilisierten Formkörper als Anionentauscher eingesetzt. Auch ohne die zusätzliche, vorgeschaltete Einführung ionischer Gruppen als Separationseffektoren entstehen bei der erfindungsgemäßen Stabilisierung selbst ionische Gruppen. Daher können die bevorzugten Anionentauscher sowohl durch Umsetzung eines Teils der Epoxidgruppen mit Aminen und anschließender erfindungsgemäßer Stabilisierung oder aber direkt durch die Umsetzung mit einer Verbindung entsprechend Formel II erzeugt werden.

Die erfindungsgemäße Stabilisierung der Formkörper, die reaktive Gruppen entsprechend Formel I enthalten, erfolgt durch Umsetzung mit einer Verbindung entsprechend Formel II. Typischerweise wird der Formkörper dazu mit einer wässrigen 0, 5 bis 5 M Lösung der entsprechenden Verbindung versetzt und bei 20 bis 60°C über 1 bis 6 Stunden umgepumpt.

Besonders bevorzugt ist eine Umsetzung mit Verbindungen der Formel II, in denen m gleich 1 oder 2 ist. Längerkettige Verbindungen erhöhen den hydrophoben Charakter des Formkörpers und sind daher nur im Ausnahmefall für die Aufreinigung von Biopolymeren wie z. B. Proteinen geeignet.

Durch diesen abschließenden Stabilisierungsschritt werden die im allgemeinen basenlabilen Polymere oder aufpolymerisierten Schichten aus Acrylat-Derivaten wesentlich stabiler gegenüber einer Alkalibehandlung.

Somit wird ein wesentlicher Nachteil der durch Block-oder Propfpolymerisation mit Acrylatestern hergestellten Sorbentien, die sich ansonsten durch sehr gute Bindungskapazitäten auszeichnen, behoben.

Sorbenzien aus unterschiedlichen Basispolymeren und mit unterschiedlichen Separationseffektoren können wesentlich stabilisiert werden und so vor allem der Biochromatographie zugänglich gemacht werden.

Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fach- mann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeiner Weise limitierende Offen- barung aufzufassen.

Die vollständige Offenbarung aller vor-und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen, insbesondere der korrespondierenden Anmeldung DE 100 04 565, eingereicht am 02. 02. 2000, ist durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.

Beispiele Im folgenden wird unter Raumtemperatur eine Temperatur zwischen 15 und 30 °C verstanden.

1) Herstellung eines alkalistabilen schwach basischen lonenaustauschers a) Einführung von C=C-Bindungen in ein Polyamid Zur Durchführung der Synthese wird ein Polyamidfaserbündel aus NYLON (Faserbündel aus 64 Fasern, 32 cm lang, etwa 200 um innerer Durchmesser, etwa 2 mm äußerer Durchmesser, mittlerer Porendurch- messer 1-2 um, Oberfläche 97 cm2) auf 30 cm gekürzt und in eine 300-10 mm Chromatographiesäule SUPERFORMANCE (Fa. Merck KGaA) gepackt. An diese Säule wird eine inerte Pumpe angeschlossen.

Für die Umsetzung werden 10 g Glycidylmethacrylat in einer Mischung aus 40 ml Dioxan und 160 ml Wasser gelöst und anschließend 17, 5 g NaOH- Losöung (32 Gew.-%) zugefügt. Diese Lösung wird anschließend in der

Apparatur umgepumpt (Flußgeschwindigkeit 3 ml/min. ; eine Stunde bei 50 C). Anschließend wird die derivatisierte Hohlfasermembran mit 100 ml Wasser, 200 ml Aceton und 100 ml Toluol gespült. b) Blockpolymerisation mit Glycidylmethacrylat Die derivatisierte und gespülte Hohlfasermembran wird in der unter a) be- schriebenen Apparatur mit einer Lösung von 15 g Glycidylmethacrylat und 1 g Azoisobutyronitril (Polymerisationsinitiator) in 200 ml Toluol bei 100 °C eine Stunde umgepumpt (7 ml/min). Die derivatisierte Hohlfasermembran wird anschließend mit Toluol und Aceton gespült. c) Modifizierung und Stabilisierung der Membran Die derivatisierte Membran wird in der unter a) beschriebenen Apparatur zunächst mit Wasser gespült. Anschließend werden 200 mi einer wäßrige Diethylaminiösung (50 Volumen-%) 6 Stunden bei Raumtemperatur durch die Apparatur gepumpt. Es wird mit Wasser gewaschen und danach 3 Stunden mit 1 M Ethanolaminlösung bei 40°C im Kreislauf gefahren. Dann wird 0, 5 M Natriumphosphatpuffer (pH 7) gewaschen bis das Eluat neutral ist.

2) Untersuchung der Alkalistabilität a) Vergleich mit Fractogel° EMD DEAE Zur Untersuchung der Alkalistabilität wurde die Proteinbindungskapazität eines erfindungsgemäßen, nach Beispiel 1) hergestellten lonentauschers mit der von Fractogels EMD DEAE nach Lagerung in Alkali bestimmt.

Fractogels EMD DEAE : Das Gel wird mit Wasser bis zur Neutralität gespült und anschließend bei Raumtemperatur mit 1 M NaOH gelagert. Nach der Lagerung wird die Probe mit 1 M Phosphatpuffer und Wasser gewaschen und im Trockenschrank bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. 100 ml trockenes Gel werden in 20 mi einer Mischung aus Rinderserumalbumin- (5 mg/ml) und 50 mM Tris-HCI Puffer suspendiert und geschüttelt. Der Gehalt an Protein im Überstand wird photometrisch bestimmt.

Modifiziertes Polyamid : Zur Kapazitätsbestimmung wurde die modifizierte Polyamidhohlfaser in ein dead-end Modul eingebaut. Das Modul enthält 64 Fäden und hat eine Länge von 80 mm und einen Durchmesser von 6 mm. Alle Lösungen können mit einer Spritze aufgegeben werden. Durch Spülen mit einer Lösung aus 20% Ethanol/150 mM Kochsalz wird Luft entfernt.

Anschließend wird mit 100 ml einer 50 mM Tris-HCI Lösung, pH 8, gespült und 15 mi einer Lösung aus 10 mg/ml Rinderserumalbumin in 50 mM Tris- HCI Puffer, pH 8, aufgegeben. Es wird mit 50 ml einer in 50 mM Tris-HCI Lösung, pH 8, gespült. Die Proteinelution erfolgt mit 20 ml einer Lösung aus 1 M NaCI in 50 mM Tris-HCI, pH 8. Diese Lösung wird photometrisch vermessen.

Das Ergebnis der Stabilitätsuntersuchung ist in Abbildung 1 dargestellt. Auf der Abszisse ist die Zeit in Stunden angegeben, auf der Ordinate die Abnahme der Proteinbindungskapazität (Rinderserumalbumin) in %. Die Dreiecke zeigen den Stabilitätsverlauf des erfindungsgemäß stabilisierten Polyamids an, die Kreise den des Fractogels EMD DEAE.

Es zeigt sich, daß die Bindungskapazität des Fractogele EMD DEAE bei der Lagerung in 1 M NaOH stark abnimmt, wohingegen die

Bindungskapazität des erfindungsgemäß stabilisierten beschichteten Polyamids konstant bleibt. b) Vergleich der Alkalistabilität von erfindungsgemäß stabilisierten und nicht stabilisierten beschichteten Polyamiden.

Beide Module werden nach den in Beispiel 1 aufgeführten Reaktionsschritten a) und b) modifiziert. Während das erfindungsgemäß stabilisierte Modul (Modul A) nach Beispiel 1), Schritt c), weiterbehandelt wird, wird das nach dem Stand der Technik gefertigte, nicht stabilisierte Modul (Modul B) wie folgt umgesetzt : Das in Schritt b) erhaltene Blockpolymerisat wird in der unter Beispiel 1), Schritt a), beschriebenen Apparatur zunächst mit Wasser gespült.

Anschließend werden 200 ml einer wäßrige Diethylaminlösung (50 Volumen-%) 6 Stunden bei Raumtemperatur durch die Apparatur gepumpt. Dann wird 0, 5 M Natriumphosphatpuffer (pH 7) gewaschen bis das Eluat neutral ist.

Beide Module werden 1 Woche bei 40°C in 6 M Natronlauge gelagert.

Anschließend wird ihre Proteinbindungskapazität (Rinderserumalbumin in mg/Modul) bestimmt. Die in der Tabelle aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäß stabilisierten Polyamide auch nach einer Woche Alkalibehandlung noch eine nahezu unveränderte Bindungskapazität aufweisen. Startkapazität Kapazität nach Lagerung [mg/Modul] [mg/Modul] Modul A 41 39, 6 Modul B 32, 7 5, 4