La présente invention a pour objet la synthèse d'analogues gem-diphosphoniques d'améthoptérine (méthotrexate), et leur utilisation à titre de compositions pharmaceutiques, pour différentes applications thérapeutiques.

L'invention concerne également les voies de préparation de tels composés. Le méthotrexate est un agent antinéoplasique important. On a montré qu'il possède à la fois des propriétés immuno-dépressives et anti-inflammatoires bien que son mécanisme d'action dans ces affections ne soit pas connu de façon précise. A faibles doses, il est couramment employé dans le traitement de rhumatismes psoriasiques rebelles, des polymyosites, de la maladie de Reiter et plus récemment des polyarthrites rhumatoïdes.

A fortes doses, il est également indiqué dans le traitement de certains cancers, notam¬ ment les leucémies de l'enfant, tumeurs trophoblastiques, cancers du sein, de la tête et du cou. Cependant, l'intérêt comme agent anticancéreux est sous la dépendance limitante des importants effets secondaires que son action entraîne sur l'ensemble de l'organisme. Ceci a conduit plusieurs équipes de chercheurs à élaborer de nombreux analogues du méthotrexate dans le but de définir de meilleures relations structure-activité.

Dans cet esprit, le déposant a été amené, il y a quelques années, à développer un concept original de vectorisation pharmacologique d'agents antinéoplasiquesvis à vis de carcinome-, osseux, par des acides diphosphoniques.

Le tropisme osseux des acides diphosphoniques est en effet une caractéristique physiologique connue dans certaines applications thérapeutiques ou de diagnostic médical. (SIRIS,E.S. ; CANFIELS,R.E. ; JACOBS .P. ; STODDART,KE. ; SPECTOR,P.J. Met. Bone Dis. rel. Res. 1981, 4-5, 301).

Outre leur action remarquable dans la maladie de Paget (EISENHUTM-, BARDER,!., TAYLOR,D.M. Appl. radiât. Isot. 1978, 7, 535), ou dans l'arthrite rhumatoïde (BRELIERE .C, EDMONDS-ALT , GARCIA,G. (Sanofi) Eur. Pat. Appl.), certains d'entre eux sont également utilisés en scintigraphie osseuse (GASTRONOVO,F.R; CALLAHAN, R.J. J.Nucl.Med. 1972, 13,823).

Dans le cadre de l'étude de validité de ce concept, le déposant a décrit dans la demande de brevet française n° 2611203 du 20.02.87 (inventeurs cités : STURTZ et VOISIN) la préparation et l'activité biologique des analogues diphosphoniques d'améthoptérine 3a et 3b :

avec :

avec R ⁷ = H, alkyles inférieurs (C ₇ à C ₆ ) 3b : X = H - avec avec R ¹ = H, alkyles inférieurs (C _? à C ₆ )

Les résultats préliminaires des tests biologiques obtenus pour ces composés sur des modèles de cancer des os laissant apparaître un intérêt certain pour ces composés, le déposant a eu l'idée, à l'origine de la présente invention, d'associer ce concept de vectorisationà celui de prodrogue.

D'une manière générale, l'aspect prodrogue est recherché, de façon à favoriser l'atteinte sélective de la cellule cible, en évitant d'éventuels effets toxiques de la substance active sur d'autres sites du corps. A cette fin, et selon l'invention, il a été synthétisé des composés gem-diphospho-

niques d'améthoptérine (méthotrexate) et de déaza-N-lO améthoptérinese présentant sous la forme d'une prodrogue d'améthoptérine dont le groupement gem-diphosphonique est relié au groupement ptéroylglutamiquepar une liaison peptidique.

Ces composés nouveaux présentent ainsi notamment l'avantage que la liaison peptidique peut être facilement rompue par hydrolyse. En conséquence, lorsqu'ils sont utilisés à titre de compositions pharmaceutiques, ces composés combinent l'effet de vectorisationdes composés diphosphoniques avec l'avantage d'obtenir directement l'acide ptéroylglutamiquepar simple hydrolyse de la prodrogue. Ceci favorise ensuite notamment la formation de dérivés polyglutami- ques du méthotrexate, qui interviennent dans les effets cytotoxiques vis à vis des cellules tumorales ciblées.

Les composés diphosphoniques de l'invention répondent à la formule générale

avec : n > 0, préférentiellement n = 0, 1, 2, 3

R étant soit absent, soit constitué par un groupement -

R ⁷ , R ³ , R ⁴ , R ⁵ = H, ou alkyles inférieurs (C ₇ à C _β ) R ² = H, ou alkyles inférieurs (C ₁ à C _g ) et benzyle quand R présent ainsi que les sels et les esters dérivés desdits composés.

Les composés diphosphoniques 1,2 suivants ont notamment été préparés :

-NH-R

avec R = H, alkyles inférieurs (C. à C, ) .

L'utilisation de ces composés pourra également aisément être effectuée tant au niveau des esters ou des sels des acides correspondants.

On notera qu'il est attendu notamment une bonne efficacité du composé 1, du fait de la présence du groupement carboxyméthyle, fréquent dans les enchaînements peptidiques, et susceptible de jouer un rôle favorable dans la fragilisation de la liaison peptidique du composé.

Sans exclure que ces composés, et l'ensemble de ceux de la famille générale définie plus haut présentent d'autres applications avantageuses, l'invention vise notamment à leur application en tant que constituants de compositions pharmaceutiques.

De telles compositions sont notamment utilisables en cancérologie, notamment pour le traitement de tumeurs ou métastases notamment osseuses, et/ou en rhumatologie, notamment pour le traitement de rhumatismes psoriasiques rebelles, de polymyosites, de la maladie de Reiter et de polyarthrites rhumatoïdes.

L'invention porte également sur des modes de préparation préférentiels des structures la,b et 2a,b, ainsi que sur les produits intermédiaires intéressants obtenus. Certains de ces produits intermédiaires, référencés ci-après 4a, 4b, 5a, 5b, 6a, 7a, 9 et 10 sont en outre susceptibles de présenter des propriétés intrinsèques intéressantes, hormis leur rôle dans la synthèse des prodro¬ gues de l'invention.

Les molécules de types a et b ont fait l'objet d'une approche synthétique différente dans leur phase finale de préparation et sont donc présentées séparément ci-après. Ils sont obtenus, in fine, sous forme de sels de sodium.

En ce qui concerne les composés la, 2a leur obtention résulte de l'action sur les formes 4a et 5a :

- premièrement soit du bromure de triméthylsilyle suivie d'une méthanolyse, soit encore par exemple d'une action de coupure par l'acide bromhydrique dans l'acide acétique ;

R = H, alkyles inférieurs (C à C ) R ³ = alkyles inférieurs (C, à C, )

2 1 6

R = alkyles inférieurs (C _χ à Cg ) R ² = benzyle pour 4a

R = alkyles inférieurs (C, à C )

1 6

Le dérivé brome intermédiaire 8 est isolé en traitant la 2,4- diamino-6-hydroxyméthylptéridine préparée selon un protocole décrit par ROSOWSKY dans le JoUΛïial o£ Mzdicinal Chein-i&tΛy, 28_, 660-667 (1985) par le bromotriphénylphosphorane selon PIPER et MONTGOMERY (Joauial o HeX.&- uay c Ckmι&&ιy , ϋ . 279-280, (1974).

Ces esters diphosphoniques _a et 5a sont purifiés par re¬ cristallisation dans un mélange chloroforme/éther avec un rendement de l'ordre de 70 %.

L'étape précédente qui, suivant l'invention, permet d'obtenir les composés 6a et --L consiste en la condensation d'un acide p-N(alkylamino) benzoïque sur les dérivés diphosphoniques 9 et J0_, synthons communs aux dérivés 1a,b et 2a,b .

0

' 9

0

10 _.

C

0

2 R = alkyles inférieurs (C. à C.) pour H)

2 R = benzyle pour R = alkyles inférieurs (C. à U

R = alkyles inférieurs (C. à C,).

Le procédé de l'inv ention pour la préparation de composés de types 6a et 7a propose, dans une première étape, de protéger l'acide p-N(alkyi amino) benzoïque par le 2,2,2-trichloroéthoxycarbonyle puis d'activer

sa fonction acide par le chlorure de thionyle pour former intermédiaire- ment les composés :

0

R = H, alkyles inférieurs (C. à C,)

La deuxième étape permet, par condensation de dérivés de types 9_ et U) dans le tétrahydrofurane en présence de triéthylamine, sur le chlo- rure d'acide benzoïque N-protégé, suivie d'une chromatographie sur colonne de gel de silice d'obtenir après libération de la fonction a iné par la poudre de zinc, les dérivés de types 6^ et 7a.

Les dérivés ^_b et 2]D , comme les composés l^î et 2a, sont issus de leurs analogues esters diphosphoniques 4b et ïib , après une hydrolyse des esters phosphoniques par le bromure de triméthylsilyle suivie d'une méthanolyse et une hydrolyse "des esters carboxyliques par action de la soude.

0 5b

R l ¹ = H, alkyles inférieurs (C. à C,) R ² = = alkyles inférieurs (C. à C.) pour 5ja R = benzyle pour 4b

^* 3 y R = R = alkyles inférieurs (C. à C,).

En ce qui concerne les composés 4b et 51D ci-dessus, l'invention propose de les obtenir par une stratégie de synthèse totalement différente de celle utilisée pour les dérivés aza N-10 diphosphoniques de types a.

Le procédé de l'invention pour la préparation de composés déaza-10 aminoptérine repose en effet sur la condensation peptidique entre l'acide 4-amino-4-déoxy déaza N-10-ptéroïque __ ou de ses dérivés alkyles en 10 _f dont les modes d'accès ont été décrits par exemple par PIPER at al, dans Jσurn. Med. Chem. 1980, 23, 320-321, et les synthons diphosphoniques de for¬ mules générales 9 et 10.

R ^Λ = H, alkyles inférieurs (C. à C.)

R" = alkyles inférieurs (C. à C.) pour 10 et 5b

R ^fc = alkyles inférieurs (C. à C.) pour 9 et 4b

R 4 = alkyles inférieurs r(C- à C.) \

La littérature propose l'utilisation de différents agents de cou¬ plage pour réaliser ce type de condensation peptidique.

La méthode classique dite à "l'anhydride mixte" fait intervenir par exemple le chlorocarbonate d'isobutyle comme agent de couplage.

La réaction a lieu, à 50°C, en présence de triéthylamine dans le N-N-diméthylformamide.

L'invention utilise cette méthode de couplage et l'applique, avec le chlorocarbonate d'isobutyle, à la synthèse des dérivés analogues di¬ phosphoniques et de prodrogues déaza N-10 et déaza N-10 alkyles du Métho¬ trexate. Il est également possible d'utiliser toute méthode connue de l'homme du métier.

On notera que cette méthode de couplage est autant utilisable pour l'obtention des composés b, _5b, que pour l'obtention des composés _4a_, 5a. Dans ce ^' dernier cas, la condensation peptidique est effectuée entre les synthoms diphosphoniques _9_ et J_0 et l'acide 4 amino 4 déoxy aza-ptéroïque ou ses dérivés alkglés en 10.

Pour atteindre les composés de types , la présente invention pro¬ pose de reprendre les travaux de SACHS et BRAND qui obtiennent dans le JouΛnal oi the. Amexican Chemical Society , 7_5, 4610-4611, (1953), l'ester α-benzylique de l'acide glutamique 1_2, après acidolyse sélective, en pré- sence d'acide iodhydrique, du diester benzylique.

Avant de procéder au couplage peptidique de cet amino acide avec les dérivés 2-amino-4,4-bis(dialkylphosphono)butyrate d'alkyles 1_1_ en présence d'un des différents agents de couplage proposés dans la littéra¬ ture, par exemple le dicyclohexylcarbodiimide, la fonction aminé du com- posé X2 _^ est protégée sous forme d'uréthane, par action du dicarbonate de tertiobutyle, par exemple.

STURTZ et VOISIN ont décrit dans le brevet français Fr 87 02449 fév. 1987 la synthèse des 2-amino-4,4-bis (dialkylphosphono) butyrate d'alkyles VL

R ^1* ≈ R ³ = alkyles inférieurs (C _χ à Cg).

La coupure et la décarboxylation du groupement carbamique est réa¬ lisées par acidolyse dans l'acide trifluoroacétique. (TFA)

0

NH ₂ -CH-(CH ₂ ) ₂ C0 ₂ H

C0_Bz

12 19

17 11

TFA

R 2 = R3 = alkyles inférieurs (C. à C.)

Les composés de type 1_0 sont obtenus selon l'invention par addition nucléophile, de type Michaël, de dérivés de la glutamine _3 ^sur les éthy- lidène bis(phosphonates) d'alkyles £, suivie d'une déprotection de la fonction aminé par l'acide trifluoroacétique.

Le composé J_3_ est avantageusement obtenu selon le mode opératoire décrit notamment par TARBELL et al, Proc. Nat. Acad. Sci. 1972, 69, 730.

10

2 3 R = R = alkyles inférieurs (C. à C,),

Dans l'invention, les éthylidènes bis(ρhosphonates) de dialkyles 14 sont issus d'une isomérisation d'ARBUSOV entre un trialkyl phosphite et un 1-bromovinylphosphonate de dialkyle, lui-même obtenu à partir d'un vinylphosphonate de dialkyle suivant le mode opératoire utilisé par BELBEOC'H, Thèse Doctorat Sciences Physiques, Université de Bretagne Occidentale, Brest.

EXEMPLE 1

Synthèse des composés Va et ^b (où R = CH-,)

a) N [(4(N-tertiobutyloxycarbonyl)amino-4-benzyloxycarbonyl) butanoyl ] -2-amino-4,4 bis(diéthylphosphono)butyrate d'éthyle.

Dans un tricol de 100 ml, muni d'un thermomètre à alcool, on place 2 g (5,9 mmoles) d'ester α-benzylique de l'acide N ertio- butyloxycarbonyl)-L-glutamique dans 100 ml de chloroforme.

A cette solution refroidie à 0-5°C est additionné 2,5 g (6.2 mmoles) de 2-amino-4,4-bis(diéthylphosphono)butyrate d'é¬ thyle dilué dans 10 ml de CHCIg.

Le mélange résultant est alors additionné goutte à goutte pendant 15 mn par une solution de 1.2 g (6.2 mmoles) de dicyclo- hexylcarbodiimide dans 20 ml de CHC .

A la fin de l'addition, le bain de glace est enlevé et un important précipité de dicyclohexylurée apparaît.

L'agitation à température ambiante est maintenue pendant 2 heures environ avant que le solvant ne soit évaporé sous pression réduite.

Le résidu est repris dans quelques ml d'acétate d'éthyle puis filtré sur cellite.

Le filtrat est récupéré, dilué puis lavé successivement par

NaOH 5 %, HCI IN et H ₂ O.

La phase organique finale, conduit, après séchage sur Na _? SO _u et évaporation, à une huile visqueuse incolore (3,3 g ; 78 %).

31,

RMN δP = 23.2, s.

b) N-[(4-amino-4-benzyloxycarbonyl )butanoyl]-2-amino-4,4-bis (diéthylphosphono) butyrate d'éthyle.

Une solution de V7 (2.17 g ; 3 mmoles) dans 10 ml de CH-CL sont additionnés goutte à goutte 15 ml d'acide trifluoroacétique, sans que ne soit décelée d'élévation de température.

La fin de la réaction est détectée après 20 mn, par la fin du dégagement de CO_.

Les solvants sont éliminés par évaporation et le résidu repris dans 25 ml d'acétate d'éthyle.

La solution résultante est alors additionnée par une solu- tion aqueuse de NaHCO, (jusque pH = 8-9), décantée puis extraite.

La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur Na-,SO^ et finalement évaporée pour donner le produit déprotégé attendu sous forme d'une huile incolore (1.7 g ; 90 %).

L'absence en RMN du H du singulet à 1.5 ppm (/TMS) correspondant aux protons du groupement tertiobutyloxycarbonyle confirme la forme aminé libre du composé désiré.

RMN ³¹ P : δP = 22.9, d, (J _p _ _p f 2.5 Hz).

c) N [4(N-tertiobutyloxycarbonyl)-amino-4-éthyloxycarbonyl ] -2- amino-1,1-bis ( diéthylphosphono Jéthane 1^

Dans un tricol de 100 ml, muni d'un réfrigérant ascendant et d'un thermomètre à mercure, on dissout à 50°C 0,1 g de tBuOK dans 50 ml de tBuOH. 2.74 g (0,01 mole) du composé 1^3 sont alors ajoutés en un seul pot.

L'agitation est maintenue à 50°C jusqu'à totale dissolution.

On additionne ensuite 3.1 g (0,0103 mole) de ^4 goutte à goutte et l'agitation est conservée pendant 1 heure à cette température.

31 L'évolution de la réaction est contrôlée par RMN du P.

Le pH est enfin ajusté à 7 par addition d'une solution satu¬ rée de chlorure d'ammonium puis extraite par du chlorure de mé ^¬ thylène (2 fois) .

Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur a-,SO _u et évaporées sous pression réduite pour donner 5.2 g (90 % de rendement) d'un solide blanc.

RMN ³¹ P : δP = 18.9, s.

d) N [(4-amino-4-éthyloxycarbonyl)-2-amino-1,1-bis(diéthylphos- phono) éthane J ).

A 2.0 g (3.5 mmoles) de V5_ dissous dans 15 ml de CH-CL sont additionnés goutte à goutte 15 ml de TFA.

L'agitation du mléange réactionnel est maintenue pendant 20 mn à température ambiante puis les solvants sont évaporés.

Le résidu visqueux est repris par une solution aqueuse de

NaHCO- (jusqu'à pH = 8-9) puis cette solution est extraite 2 fois par l'acétate d'éthyle.

Les phases organiques sont séchées puis évaporées pour conduire à une huile visqueuse incolore (1.2 g ; 70 %).

RMN ³¹ P : δP = 19.6, s.

e) Condensation du chlorure de l'acide [N,N [(2,2,2-trichloro- éthyloxycarbonyDméthγl ]-4-amino ] benzoïque avec les composés

9 et U).

Une solution de 9 (9.85 g ; 0.016 mole) dans 100 ml de THF, contenant 25 ml de triéthylamine distillée, est agitée à 0-5°C pen- dant que 6.5 g (0.018 mole) du chlorure d'acide benzoi ^' que N-pro¬ tégé sont ajoutés goutte à goutte durant 15 mn.

A la fin de l'addition, l'agitation est maintenue à température ambiante pendant 1 heure eviron.

Après filtration du mélange réactionnel et évaporation du chloroforme, l'huile visqueuse résultante est extraite par un mé ^¬ lange H ₂ O/CH ₂ CI ₂ .

Après séchage sur Na_SO _u et évaporation, le résidu est pu¬ rifié sur colonne de gel de silice ( solvant d'élution : AE/ E : 20/ 1 ) .

Les fractions intéressantes sont rassemblées et évaporées pour donner un produit sirupeux incolore ( 10.4 g ; 70 % ) .

RMN ³¹ P : δP = 23. 1 ppm, s .

Nous avons repris le même protocole expérimental pour con¬ denser le composé 1J) avec le dérivé benzoïque N-protégé . Après chromatographie sur colonne de gel de silice, le produit désiré est obtenu avec un rendement de 68 %.

RMN ³¹ P : δP = 23.2 ppm, s.

f ) Elimination du groupement protecteur de la fonction aminé .

. Composé 6éi

8.4 g ( 0.0091 mole) du composé résultant de la condensation entre le produit 9_ et le dérivé chloré benzoïque sont dissous dans

80 ml de THF puis 1 .3 g de KH_PO _u dissous dans 13 ml d'eau dis¬ tillée sont additonnés, suivis de 8 g de poudre de zinc ( préalable¬ ment activé par HCI 5 %) .

L'agitation est maintenue à la température du laboratoire pendant une journée .

L'évolution de la réaction est contrôlée par CCM de gel de silice ( solvant d'élution : AE ) .

Après filtration du zinc et évaporation du solvant, le résidu est extrait par un mélange eau/chloroforme .

La phase organique est décantée, séchée sur Na-SO^ et évaporée sous pression réduite pour donner quantitativement une huile incolore.

RMN ³¹ P : δP = 23.7 ppm, , (J _p _ _p = 2.4 Hz).

. Composé 7a

Le mode opératoire est identique à celui décrit ci-dessus.

RMN ³¹ P : δP = 23.1 ppm, s.

g) Préparation des composés 4a et 5a

3.4 g (0.01 mole) de 8 . HBr et 8.3 g (0.011 mole) de 6a sont agités dans 40 ml de DMA à 50°-55°C pendant 4 heures (la solubilisation est obtenue après 1 heure). Après évaporation du DMA, le résidu marron foncé est repris dans l'eau et extrait au chloroforme (2 fois).

Les phases organiques sont rassemblées et séchées sur Na^SO^

Après évaporation du chloroforme, le résidu semi-solide est recristallisé dans un mélange CHC /Et_O pour conduire au composé 4a sous forme d'une poudre jaune clair avec un rendement de 61 %.

RMN ³¹ P : δP = 23.2 ppm, s.

. Composé 5j

Il a été obtenu avec un rendement de 65 % par le même pro¬ tocole expérimental que celui développé ci-dessus.

RMN ³¹ P : δP = 23.5 ppm, d.

Ces 2 poudres jaunes ont été étudiées par CCM de gel de silice (CHCI ₃ /CH ₃ OH : 4/1).

Les analyses spectroscopiques en RMN H, P et C in ^¬ diquent une pureté tout-à-fait satisfaisante pour ces composés et ne nécessitant pas d'étapes supplémentaires de purification.

h) Hydrolyse des composés 4a et 5a

Dans un ballon de 100 ml, on dissout 4,6 g (0.005 mole) de 4a dans 50 ml de CH-C . Après ajout en une seule fois de 5.4 ml (0.04 mole) de BrSi(CH_)_, le mélange réactionnel est agité pen- dant deux jours à température ambiante, puis les solvants sont éliminés.

Le résidu solide orangé est repris dans 100 ml de méthanol puis agité durant 30 mn.

Après évaporation du solvant, le résidu est dissous dans quelques ml de méthanol puis précipité par ajout d'éther.

Après refroidissement, la poudre jaune est filtré, lavé à l'éther puis séché sur P-O- à 50°C (rendement : 90 %).

. L'hydrolyse du composé 5a est réalisée dans les mêmes con¬ ditions opératoires.

L) saponification des composés 4a et 5a.

. Composé I î

A une solution méthanolique du composé 4a portée à reflux est additionnée goutte à goutte une solution aqueuse de soude

(4 éq.).

Un précipité jaune clair apparaît dès que le pH atteint une valeur de 7.

L'agitation est ensuite conservée pendant 4 heures à cette température.

Après une nuit de réfrigération, le précipité est filtré, lavé par de petites quantités de méthanol, et d'éther pour être finale¬ ment séché sur O ₅ à 50°C.

RMN ³¹ P : δP = 22.2 ppm, s.

. Composé 2§

Même mode opératoire que pour le composé Ija.

RMN ³¹ P : δP = 22.7 ppm, d, (J _p _ _p = 12.2 Hz).

EXEMPLE 2

Synthèse des composés IJa et 2b (où R = H ) .

a) Couplage peptidique entre les composés 9 et ^0 et l'acide déa- zaptéroi ^' que ^6.

Dans un tricol de 100 ml , muni d'une agitation magnétique, on place 1 .55 g ( 0.005 mole) d'acide déazaptéroi ^' que 1 b, 1 .4 ml (0.01 mole ) d'E N franchement distillée dans 50 ml de DMA anhydre.

On additionne dans un premier temps, 0.65 ml ( 0.005 mole ) de chloroformate d'isobutyle pour former l'anhydride mixte. Après 15 mn d'agitation à température ambiante, on ajoute 3. 1 g ( 0.005 mole) d'aminoester 9 et une minute plus tard à nouveau 0.33 ml de chloroformate d'isobutyle.

Au bout de 15 mn, 1 .6 g (0.0025 mole) de 9_ sont additionnés, suivis de 0.16 ml de chloroformate d'isobutyle. Après un délai de 15 mn, on ajoute à nouveau 0.8 g de 9 puis une minute plus tard

0.16 ml de réactif de couplage. 0.8 g d'ester 9 sont finalement a- joutés au bout d'un quart d'heure.

Un suivi de la réaction par chromatographie sur couches minces de gel de silice ( solvant d'élution : CHCU/CH ₃ OH : 4/1 ) montre l'apparition quasi-immédiate d'un pic différent de l'acide déazaptéroi ^' que introduit.

La solution marron foncée est agitée à 50°C pendant 4 heures environ avant que le DMA ne soît évaporé, sous pression réduite

( P < 1 mmHg ; T° < 50°C ) .

Le résidu marron sirupeux est repris dans l'eau ( 50 ml ) et extrait par du chloroforme (2 x 100 ml ) . Lés phases organiques sont rassemblées, séchées sur Na _? SO _u puis évaporées.

Le semi-solide résultant est recristallisé dans un mélange chloroforme/éther .

Après quelques heures de refroidissement, les cristaux jaunes sont filtrés, lavés à l'éther puis séchés sur P^O-. à l'étuve sous vide à 60°C pour donner le composé désiré 4b avec un rende¬ ment de 65 %.

RMN ³¹ P : δP = 23.4, s .

. Composé 5b

Le couplage peptidique du composé Jj> avec l'amino ester _K) est réalisé dans les mêmes conditions opératoires que celles déve¬ loppées ci-dessus .

Le composé 5b est obtenu avec un rendement de 60 % sous forme d'une fine poudre ocre claire.

b ) Hydrolyse des fonctions esters carboxyliques et phosphoniques des composés 4b et 5b

Le bromotriméthylsilane est utilisé pour hydrolyser les esters phosphoniques (voir EXEMPLE 1 ; h ) et la saponification est réa¬ lisée par une solution de soude dans le méthanol ( voir EXEMPLE 1 ; i ) .

. Composé 1 b_

RMN ³¹ P : δP = 21 .4, s .

Composé 2b

31 ,

RMN δP = 19.8, s .