Sector de la técnica

La presente invención se refiere a tres familias de aminas derivadas del S-nitrosndasol [fórmulas (I), (íl) y (lii)j, a su preparación y a su uso en la fabricación de medicamentos para ei tratamiento de parasitosis, particularmente para las provocadas por protozoos de las familias Trypanosomatídae (Trypanosoma, Leishmania) y Trichomonadidae {Tríchomonas). La invención se engloba, por tante, dentro del sector farmacéutico.

Estado de l técnica

Varias de las parasitosis más importantes están causadas por protozoos patógenos; muchas de estas enfermedades tienen una especial prevaíencia en zonas poco desarrolladas de la Tierra, apenas despiertan eí interés de las grandes compañías farmacéuticas, y se consideran "enfermedades tropicales desatendidas". La mayoría de los medicamentos existentes para su tratamiento presentan una serie de inconvenientes como baja eficacia, alta toxicidad, precios elevados, protocolos de administración complejos, etc. , por lo que el desarrollo de nuevos agentes quimíoterapéuticos para la mayoría de estas enfermedades es una necesidad urgente,

El protozoo patógeno Trypanosoma cruzi es el agente eticlógico de la enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana; esta dolencia es endémica de 21 países latinoamericanos, donde provoca más de 7.0ÜO muertes anuales y mantiene alrededor de 25 millones de personas en riesgo de contraer la Infección. En la zona afectada originalmente por la enfermedad, esta es transmitida principalmente a través de ias heces contaminadas de chinches hematófagas, aunque existen rutas alternativas de Infección como la ruta digestiva, la transfusión de sangre contaminada o ía vía congéníta. Como consecuencia de las migraciones internacionales producidas en ias últimas décadas, la enfermedad de Chagas es una patología emergente en países como

Estados Unidos o España, considerándose que en la actualidad afecta a cerca de 7 millones de personas en todo el mundo (WHO, Mvestmg to overeóme ih& global impact oí Neglected Trópicas Diseases. Third WHO report on Negiected Tropical Diseases, 2015). Tras ¡a infección, la fase aguda:: inicial de la enfermedad de Chagas es generalmente, ieve o asinfomáfica y tiene una duración de 1 -2 meses. La infección persiste toda la vida, aunque un 60-70% de ios infectados entran en io que se denomina tas ; indeterminada de la enfermedad, y nunca desarrollan manifestaciones clínicas. Sin; embargo, el 30-40% restante, 10-30 años después de ia infección inicial desarrollan la; fase crónica de ia enfermedad, caracterizada por una gravísima cardiomiopatia y/o: severos problemas digestivos {megacoion y megaesofaga).

No se dispone de vacuna para la enfermedad d ©hagas, y los dos ún-cos fármacos disponibles, los nitrobeferocicfos nifurtimox y benlñidazo!, son bastante efectivos en la fase aguda, pero muestran una eficacia limitada en la fase crónica. Por otra parte _, ambos compuestos pueden producir efectos secundarios severos, a ue el benznidazoi es generalmente mejor tolerado por los pacientes y se considera el tratamiento de elección para esta enfermedad.

Aunque se han Ido describiend en la literatura compuestos con actividad antichagásíca! y diferentes dianas moleculares potenciales de! parásito, no existen actualmente; alternativas terapéuticas que puedan sustituir al nifurtimox y al benznidazoi. Algunos; azoles antifúngicos, inhibidores de la síntesis de esteróles, se han mostrado; especialmente prometedores per su aita eficacia en modelos animales; sin embargo, un; estudio clínico reciente ¡levado a cabo con ppsaconazol ha mostrado que este;

Den "isdazof, al rr¡

ina, I. et al,, N. Engi, J. Med. 2014, 370, 1899-1908). Muy recientemente lambí íen: ha despertado interés la descripción de algunas imidazo- y triazolopirirnidinas eficaces, que actúan a través de la in ibición del proteasoma de varios tripanosom áfldo atógenos {Trypanosoma. Leisfrrnania) ( hare, S. et ai., Naíure 2016, 537.. 228-233

algunos 3-alcoxi~1-ateuilindazoies (Arán, V. J, et al., Bioorg. Med, C em. 2005, 13, 3197- 3207; Boiani, L. et al., Eur. J. Med Chem 2009, 44, 1034-1040; Rodríguez, J. et al , Eur. J. Med. Chem 2009, 44, 1545-1553; Rodríguez, J. et al., Bioorg Med. Chem. 2009, 17, 8186-8198; Muro, B. et ai., Eur. J. Med Chem. 2014, 74, 124-134); estos últimos compuestos, no obstante, presentan ios sustituyelas en posiciones 1 y 3 del anillo ^' indazoí y, por lo tanto, no están relacionados directamente con ios incluidos en invención.

Por otra parte, ia ieishmaniosís es una enfermedad parasitaria causada por diferentes especies de protozoos deí género Leishmania, que se trasmite a través de ia picadura de dípteros hematófagos del grupo de Sos flebótomos. Esta enfermedad está distribuida por la mayor parte deí mundo, en especíaí en áreas tropicales y subtropicales. Aparece en 98 países, muchos de ellos poco desarrollados. Se calcula que cada año aparecen 1 ,3 millones de casos nuevos, 1 millón de leishmaniosis cutánea y 300,000 de Ieishmaniosís viscera!, estimándose que esta última forma es responsable de 20 000 a 50.000 muertes anuales (WHO, ¡nvesiing to overeóme the gÍobal i paet of Negíected Tropical Diseases. Thirrí WHO repetí on N&giected Tropical Diseases. 201 S) En humanos, dependiendo de ia especie concreta de Leishmania implicada, ia enfermedad presenta tres formas clínicas principales: ieishmaniosís cutánea, mucocutái ea y visceral, esta última generalmente mortal sin tratamiento.

Tampoco en este caso existen vacunas efectivas, por lo que ia quimioterapia es el único tratamiento existente. Durante muchos años, y todavía hoy en día, ios derivados de antimonio pentavalente (estibogluconaío sódico y antimoniato de megíumiria) han constituido la primera alternativa de tratamiento en muchos países. Como segunda línea de tratamiento podemos mencionar ia pentamiefína, ia anfotericina B, la milíefosína y la paromomicína, y más recientemente, la sitamaquina (Santos, D. O. et ai., Parásito!. Res. 2008, 103, 1-10; Singh, N. et a!., Asían Pee. J. Trop. Med 2012, 5, 485-497). También parecen muy prometedoras las imidazo- y triazolopirirnidínas inhibidoras del proteasoma mencionadas ai hablar de la enfermedad de Chagas (Khare, S. et al., atare 2016, 537, 229-233).

También en este caso resulta necesario obtener nuevos agentes antileishmaniásieos de menor coste, mayor efectividad y son menores efectos secundarlos adversos. Aunque ios nitroheteroelclos no se usan actualmente para el tratamiento de la leíshmaniosis, se ha descrito recientemente las propiedades leishmanicidas de algunos compuestos de asie grupo como el tnpanoclda fexinldazcl (Wyiíie, S. et al., Sci. Transí. Med 2012, 4, 1 19re1) o el antiparasitario de amplio espectro nitazqxanida y algunos análogos (Chao - Bacab, . J. et al., J. Antimicrob. Chemother, 2009, 83, 1292-1293). En este contexto, se han estudiado en los últimos años las propiedades leishmanicidas de algunos 3- aicoxi-1-aiquiI-5-niíroindaz©ies (Balan!. L et ai. , f¾r. J, Med, Chem. 2009 44. 1034· 1040; Marín, C. et al., Acta Trop. 2015, 148, 170-178). Como se ha mencionado anteriormente, estos compuestos presentan ios sustituyentes en posiciones 1 y 3 del anillo de indazoí y no están relacionados directamente con los incluidos en esta invención.

Otra enfermedad causada por un protozo patógeno es la tricomonosis, cuyo ente etiológico es Trichomonas vaginaiis. Esta infección de transmisión sexual (ITS supone más del 50% de los casos curables de este tipo de dolencias en e! mundo. Dé acu con la GMS, el número de casos en adultos se estimó en más de 278,4 mil 2008 (Harp, D. F.& Cho dhuri, !,, Eur. J. Obstet. Gyneüof. Reprod. Biol. 2011

9; WHO, Global ¡ncidence and pmvalence oí selecieü curable sexualiy transmutad diseases - 2008, 2012).

Esta enfermedad muestra un amplio rango de manifestaciones clínicas; ei ho frecuentemente portador asintomático y potencial transmisor de ¡a infección, mientra que en la mujer suele producir inflamación más o menos grave de los conducto genitourinarios acompañados de una leucor ea car cterística , eritema, prurito, di infertilidad, etc. Se ha asociado con problemas en la gestación y partos prematuros, aumenta el riesgo de desarrollo de neoplasía cervical y de próstata y también de coinfección con otras ITS de origen bacteriano, vírico o fúngico.

El fármaco de referencia para eí tratamiento a tricomonosis es el nitroheterociclo metronidazoi. Este producto y su análogo e azoi, son ios dos únicos medicamentos aceptados por la Food and Drug Admiri stration (FDA) para tratar esta Infección Estos fármacos son, en general, eficaces, pero hay aue buscar alternativas para aquellos Dacientes que sean hipersensíbles o para ira ar infecciones causadas por aislados resistentes a los nitroimidazoles (ca. 10% en la actualidad, pero probablemente en aumento).

En este sentido, se ha descrito recientemente la actividad tricornonicida de diversos derivados de 5-nitroindazol, destacando por su relación con la presente invención, ios 3-alcox!~2~aiqui!inda∑oles (Escario, J. A. et al., P 201500769 (27-10-2015), PCT/ES 2018/0001 19 (27-10-2016); Ibáñez-Escribano, A. et a!,, Parasito!ogy 2016, 143, 34-4Q; Fonseca-Berzal, G. et ai., Eur. J. Med. Chem, 2016, 115, 295-310), Por otra parte, se ha descrito la actividad tricomonídda de otros derivados de índazol que, a! poseer ios sustituyentes en otras posiciones del anillo, no están relacionados directamente con ios incluidos en esta invención: 3-aicox¡-1 -alquiiindazoíes (Arán, V. J. et ai., Bioorg. ed. Chem. 2005, 13, 3197-3207; Ibáñez-Escribano, A. et ai., Parasstobgy 2016, 143, 34- 40), 3-aicoxiindazo!es, inda2GÍ~3-o!es 1 -sustituidos, indazoün-S-onas 2-sustituidas e indazalsn-3-onas condensarías (Marrero - Ponee, Y. eí ai., Gurr. Drug Discov, TecñnoÍ 2005, 2, 245-265; Warrero-Pcnee, Y. et al., Bioorg. Meó. Chem. 2006, 14, 6502-6524).

Muchos de ios derivados de 5-nitroindazol comentados al tratar la enfermedad de Ghagas, la lelsbrnanícsis v la tricomonosis son, en general, compuestos iipófilos con escasa solubilidad en agua y con propiedades íarmacoclnétícas poco adecuadas. Este problema se ha intentado solventar anteriormente a través de algunos derivados que contienen grupos carboxilo en su estructura y forman saies hidrosoíubles, pero desgraciadamente, carecen de actividad significativa [Escario, J. A. et al., P 201500769 (27-10-2015), PCT/ES 2016/0001 19 (27-10-2016); Fonseca-Berzal, C. et al., Eúr. J. Med Chem. 2016, 115, 295-310],

Oescripciórí de ía invención

La presente invención se refiere a tres grupos de compuestos derivados de 5- nitro ndazol que poseen actividad biológica frente a protozoos patógenos de diversos géneros como Trypanosoma, Leish ania y Trichomonas. Los compuestos de fórmulas generales (i) y (Si) son estructuraimente muy diferentes de ios fármacos actualmente utilizados para el tratamiento de estas infecciones y resultan significativamente menos citotóxicos; aunque están basados en otros compuestos previamente preparados por el equipo, han sido diseñados para ser solubles en agua y presentar mejores propiedades farmacocinéticas, mediante la introducción de grupos a ino primarios, secundarios o terciarios, capaces de formar sales hidrosoiubles con ácidos inorgánicos u orgánicos apropiados.

Por otra parte, no tenemos constancia de que se hayan descrito propiedades antiparasitarias para los compuestos de fórmuia generai (H!), procedentes de ia transposición de ciertos derivados de fórmula genera! (íi).

Así pues, un primer aspecto de ¡a invención refiere a tres diferentes tipos de compuestos, de fórmulas generales (I), (Si) y (III).

En los compuestos de fórmulas (!) y (Si), N 'R ² puede ser un grupo amina, aiquilamino o dlaiquiiamino, un resto de amina secundaria ciclíca como el grupo pirroiídino, o grupos ftalimido (que se preparan como intermedios sintéticos de los compuestos con grupo NHz final), y n puede ser 2-3; en los compuestos de fórmula (tí!), NR ^¾ R ² puede ser un grupo alqu iarnino, (w-hidroxialquil)amino, o alqui¡^~hidroxiaiquíi)amina. En compuestos de fórmula (í), cuando n - 2, se excluye específicamente ei compuesto en el que NR ^S R ² es un grupo piperidino, por haber sido descrita previamente su actividad frente a epimasiígotes de T. cruzi {Mam, F. et al., J, Spectrosc. Dyn. 2013, 3, articulo 8).

En una realización más preferida, la presente invención se refiere a un compuesto [fórmula (f)] que se selecciona de ia lista siguiente:

^¡ encii-1~[2-(dimeíiiarnino5eíi]]-5-n!tra^ (hidrocloruro)

2-Bencll-5-ní!ro-1 -{2-pirroiidlnoetil)-1 ,2-dih dro~3H-indazol-3-ona (oxafato)

2-Bencil-1 -(3-ftalimidopropll)-5-nitro-1 ,2-dlhidro-3H-índazol-3-ona

2-Bencil-1 -(2-ftalimidoetil)-5-nitro-1 , 2 · d i h id re · 3/·/· ^'■ ■ n c ^: azo ! - 3 ·ο n a

1-(2-Aminoetil)-2-bencll-5-nifro-1 ,2-dihldro--3H--inda20l-3-ona (hidrociortsro)

1- (3-Aminopfopíl)-2-bencÍÍ-5~nitro~1 _i 2sdihídfo-3í/-indazoí~3-ona (h drocioruro)

2- Bencil-1-[3- metílamino)propii]-5-nitro-1 ,2-dihidro~3H~indazol-3-ona (hidrocioruro) 2-Bencil-1-[3-(dimeíilamino)propii3-5-niíro-1 _! 2-dihidro~3H-indazo!-3-ona (hidroc!oruro) 2-Bencil-5-nitro-1 -(3-píperidinapropil}-1 ,2-dihidro-3W-indazoi-3-ona (oxalato) o sus soivatcs o profármacos, u otras sales,

En otra realización más preferida, la presente invención se refiere a un compuesto [fórmula (II)] que se selecciona de la lista siguiente:

2-Bencü~3~(2~ftalimido8toxi)-5-nitro-2H-indazol

2- Benci!~3-{3-ftalimidopropoxi)~5-ríitro-2 -!ndazo!

2-B8ncií-3-[2-(dim8tilam!no)etoxí]-5-nítro-2H-indazol (hidrocloruro)

3- {3-Aminopropoxi)-2--benciS--5-niíro-2H-indazoi (hidrocloruro) o sus solvatos o profármacos, u otras sales. En otra realización más preferida, la presente invención se refiere a un compuesto

[fórmula (H!)] que se selecciona de ia lista siguiente:

2-Bencíl-3-rnetiiamino-5-nítro-2H-indazoi

2~Bencil-3-[(2-hidroxietil)amino]--5--nitro--2H-indazol

2-Bend!-3-[{3-hidroxipropil)am!no]-5-n!íro-2H-indazol

2-Bencil-3-[(2-hídroxietií)nietiíamínoj-5-r!ftrQ-2H-i ndazoi

2-Bencil-3-[(3-hidroxipropll)meti!aminoj-5-nítro-2H-índazo I o sus solvatos o profármaco En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a! procedimiento de obtención de algunos de ios compuestos de fórmula general (!) o (II) por alquliación de ¡a 5- nitroindazoün-3-ona 1 ; debido ai carácter tautómero de esta última, algunos de ios mencionados compuestos se obtienen a la vez ai hacer reaccionar ei producto de partida bajo condiciones diversas con agentes alquilantes, tal como se muestra en el Esquema 1. Como se defalla en Sos ejemplos, la alquilación de ia forma tautómera representada, 1nda∑o!in-3-ona", conduce a los compuestos 2-5 [fórmula general (I)], mientras que la alquliación de la forma tautómera "3-hídroxh2H-lndazoi" conduce a ios compuestos 6 y 7 [fórmula general (Hjj.

2 [CHslj Mej

3 [CHafePrd

4. 6 [CHdjFt

5. 7 CHaJaFi

(F¾ fíaümkte Frd: pírretídína)

Es u&ma 1. Ruta sintética para ia preparación de las 2-bencí¡indazoiin-3-onas 1-sustituidas 2- ffórmula (I)] y de los 3-a!coxi-2-bencSíindazo!es β y 7 [fórmula (I!)].

Otros compuestos de fórmu a general (i) se obtienen por transformación química a partir de precursores conteniendo cadenas convenientemente ω-funcionaiizadas en posición 1 del anillo de indazol, como se detalla, así mismo, en ios ejemplos. Así, ia eliminación del grupo protector ftaloílo de los precursores 4 y 5 origina ¡as aminas primarias 8 y 9 (Esquema 2}, y la sustitución nucieófiia del bromo del compuesto 10 con aminas primarias o secundarias da íugar a ¡as aminas 11-13 (Esquema 3).

2 $ 2

5 3 9 3

Esquema 2. Ruta sintética para la preparación de ¡as 1 -- uj-aniinQalquil)-2-bencí¡inda20iin-3-onss B y 9 [fórmula (í)].

JH.¾Br

18

NHMe

Pip {ptpendino} Esquema 3. Ruta sintética para la preparación ds las 1 -{3-amínopropii)-2-benc!Íinda2o!ín-3-onas 11-13 [fórmula

En un cuarto aspecto, Ía presente invención se refiere al procedimiento de obtención de algunos de los compuestos de fórmula general II (16 y 13) y ill (21 -25) a partir de os correspondientes 3-(uJ-bromoalcoxi}indazoles (14, 1 S) y aminas, o de los 3-{ω- ftalsmidoalcoxi) derivados (8, 7) por e iminación de¡ grupo ftaloflc seguida eje transposición intramolecular de los 3~^-aminoaicoxi)inda20ies (17-20) inieiaímoníe obtenidos (Esquema 4).

Un quinto aspecto de esta Invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula general (I), (IS) o (¡II) para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades causadas por protozoos, preferiblemente tripanosomiasis americana (enfermedad de Chagas), íeishmaniosis y tricomonosis, causadas por parásitos de los géneros Trypanosoma, Leish ania y Tnchomonss, respectivamente.

Un sexto aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprenda un compuesto de fórmula genera! (I), (SI) o (¡H) junto con adyuvantes o vehículos farmacéuticos aceptables; opcionalmente dicha composición puede contener también otros principios activos.

.1. ÜL JL JL

22 2 H 24 3 H

23 2 Me 23 3 !v e

Esquema 4. Rufa sintética para ia preparación de ios 3-{w-aminoalcoxi)~2-benciiindazGies 16 y 1S [fórmula (II)] y de ios 3-alqy¡iaminQ-2-benciiindazoies 21-2S [fórmula (!!!) . Los compuestos incluidos entre corchetes [17, 18 y 20] son intermedios de reacción que no fueron aislados.

½ reanza on de ta mweneson

La presente invención se ¡lustra adicionaímente mediante ios siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitativos de su alcance.

EJEMPLO 1. Preparación de los eompuesiss 2-5 [fórrauta {\)] y 8, 7 [fórmula SS)] a partir de ia 2~b@ítcsS-S-nitroírsd zollnof¾a 1 ,

Las aminas finales 2 y 3, asi como ios ftaíimido derivados Intermedios 4 y 5 se obtuvieron por alquilación de la 2-bencil-5-niírcindazoiin~3~ona 1 (Arán, V, J. et al. , Ls&bsgs Ann, 1996, 883-891 ) con los correspondientes ha!yros de alquilo funcionalizados (Esquema 1 ); este tipo de reacciones suele conducir a mezclas de indazolinonas 1 2-disustituidas (2-5) y de ¡os 3-alcoxi-2-alquifindazc½s isómeros; estos últimos compuestos son en muchos casos productos minoritarios de reacción (Vega, . C. et al,, Eur. J. Med, Chem. 2012, 58, 214-227; Fonseca-Berzal, C. et al , Eur, J. Meé. Chem. 2016, 115, 295 -310) y, en este caso, soio se aislaron los 3~(ü)-8á!imídoa!coxi) derivados S y 7.

2-BencsÍ- 1 -[2-{dl etMmi )Bt¡l]~S-n m- 1, 2~díhiém~3 ~mdazo 3-ona (hidrodoruro) (2). Rendi-msento: 0,74 g (3Θ%). P. f.286-288 °C (Et0H/H?O). ¹ H RMN [300 MHz, (CD ₃ ) _? SOj: δ 11,34 (s a, 1H, NH ⁺ ), S.SSfd, J= 2,1 Hz, 1H _: 4-H), 8,45 (dd. J = 9,3, 2,1 Hz, 1H, 8-H), 7,81 (d, J ~ 9,3 Hz, H, 7-H), 7,29 (m, 5H, H arorfáí. Bn), 5,29 (s, 2H, CH _? Bn), 4,54 (t, J = 7,5 Hz, 2H, 1'-H), 2,99 (t, J * 7,5 Hz, 2H, 2~H).2,71 (s, 8H, Me); ^' ¾ RMN [75 MHz, (CD ₃ ) ₂ SO]: δ 161,09 (C-3), 149,10 (C-7a), 142,18 (C-5), 135,91 (C-1 Bn), 128,75 (C-3, - 5 Bn), 127,95 (C- Bn), 127,58 (C-6) _! 127,50 (0-2, -68n} ₍ 120,37 (C-4), 116,73 (C-3a), 112,53 (C-7), 50,54 (C-2'), 44,85 (CH ₂ Bn), 42,20 (Me), 41,45 (C-1'); EM (ES ^* ): /z (%} 341 (100) ([M+H ), 703 (26) ([2M+Na} ^* ). Anál. cale, para C18H21CIN4O3 (378,84): G 57,37; H 5,82; N 14,87. Encontrado: C 57,59; H 5,87; N 14,59.

2~BenGii~5~nitro~1~{2~pirrG!kihiQeiii)~i _s 2~d (oxaíalo) (3).

Rendimiento: 1,10 g (48%). P. f.216-218 ^D C ( eOH). H RMN [300 MHz, (CD ₃ ) ₂ SO]: δ 8,53 (d, J = 2,2 Hz, 1 H, 4-H), 8,40 (dd, J = 9,0, 2,2 Hz, 1 H, 6-H), 7,73 (d, J - 9,0 Hz, 1 H, 7-H), 7,35-7,20 (m, 5H, H arornáí. Bn), 5, 18 {s, 2H, CH ₂ Bn), 4,27 (s a, 2H, 1 '-H), 2,79 (s a, 6H, 1 '-H y 2-, 5-H pirroiidino), 1 ,89 (s a, 4H, 3-, 4-H pírrolidíno); ¹³ C RMN [75 MHz, (CDa)2SO]: 5 185,01 (CO oxaiaio), 161 ,21 (0-3), 149,34 (C-7a), 141 ,82 (C-5), 135,93 (C- 1 Bn), 128,75 (C-3, -5 Bn), 127,90 (C-4 Bn), 127,39 (0-2, -6 Bn), 127,33 (0-6), 120,35 (C-4), 1 16,23 (C-3a), 1 12,45 (C-7), 53, 17 (C-2, -Spirro!idsno), 49,39 (C-2 ¹ ), 44,84 (CH ₂ Bn), 43,55 (C-V), 22,83 (C-3, -4 psrroiidino); E (ES ⁺ ): m/z (%) 367 (100) ([M+H] ⁺ ), 755 (10) ([2M+Na] ^* ). Anái. caic. para C22H2 N4O7 (458,45): C 85,78; H 4,42; N 12,27. Encontrado: C 85,99; H 4,21 ; N 12,42.

Ejemplo 1b, Preparación de /as 1-(w~ña!imidosÍqui¡}indazoiinonas 4, S y de ios 3-(ω- ftaii ¡doalcoxi}indazoles 6, 7. Con objeto de obtener los 2-ftaiimidoeíil derivados 4 y 6, una mezcla agitada de la 2~benciiindazol!nona 1 (1 ,00 g, 3.72 mmol), N~(2- bromoetil)ftalimida (1 ,27 g, 5,00 mmoi) y ₂ CO _s (0,55 g, 3,98 mmoi) en DMF (15 mi) se calienta 3 100 °C durante 5 h; a continuación, se añade una cantidad adiciona! de V-(2- bromoetii)ftalimida (1.00 g) y se continúa la calefacción durante 12 h más. El disolvente se evapora a sequedad y, tras la adición de H _a O (50 mL), el precipitado se recoge por filtración, se lava con agua y se seca al aire. El só ido obtenido se suspende en CHCfa (10 mL) y eí producto 6 insoluole (0,32 g) se recoge por filtración, se lava con CHCS ₃ (2 x 5 mL) y se seca a! aire. El filtrado se concentra y se aplica a una columna de cromatografía flash de gel de sílice, que se eluye con mezclas CHCIs/acetona (50/1 a 20/1 ) para suministrar, siguiendo este orden de elución, una cantidad adicional de! compuesto 6 y, a continuación, el compuesto 4.

Los 3-ftalimidopropll derivados S y 7 se preparan siguiendo un procedimiento similar, utilizando la cantidad correspondiente de ft/-(3-bromoprQpil}ftaiirnida (1 ,34 g, 5,00 mmol). La reacción acaba en este caso en 3 h. Después de evaporar la DMF y añadir agua, se extrae la mezcla con cloroformo (3 50 mL). La solución orgánica se seca (MgS04), se concentra y se cromatografía como se ha descrito anteriormente, proporcionando, en este orden úe elución, los compuestos 7 y 5

2~Bencil-1-(2-fta¡imidoetil)~5~nitro~1 _í 2~dihkIrfr (4), Rendimiento: 1 ,07 g

(85%). P. f. 190-192 C (1 -PrOH). H RMN [300 Hz, (CD ₃ ) ₂ SO]: 5 8,33 (d, J = 2,4 Hz, 1 H, 4-H), 7,87 (dd, J = 9,0, 2,4 Hz, 1 H, 6-H). 7,66 (m, 4H, H ftalimido), 7,38 (d, J = 9,0 Hz, 1 H, 7-H), 7,25 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,20 (s, 2H, CH ₂ Bn), 4,36 (t, J = 5,1 Hz, 2H, 1 '-H), 3,83 (t, J = 5.1 Hz, 2H, 2'-H); ¹³ C RMH [75 MHz, (CDs)?SO]: δ 166 _: 99 (CO fta!imido), 161 , 1 1 (C-3), 149,40 (C-7a), 140,93 (C-5), 136,00 (C-1 Bn), 134,32 (C~4, -5 ftalimido), 130,98 (C-1 , -2 ftalimido), 128,68 (C-3, -5 Bn), 127,83 (C-4 Bn), 127,37 (C-2, -8 Bn), 126,39 (C-6). 122,84 (0-3, -8 ftalimido), 120,12 (0-4), 1 16,31 (C-3a), 11 1 ,48 (C- 7), 45,30 (C-1'), 44,72 (CH ₂ Bn), 34,29 (C-2'): EM (ES ⁺ ): m/z (%) 443 (100) ([M*HD, 485 (1 1) ([M+Na] ^* ), 885 (20) ([2M+HJ ^* ), 907 (8) ([2M+Na] ⁺ ). Aná!. cale, para C^H^Os (442,42): C 65.15; H 4, 10; N 12,66. Encontrado: C 85,40; H 3,97; N 12,57. 2-Bencii-1-(3- a!imidopmpii)-5-nitro-1,2-di idro^ (5). Rendimiento:

0,93 g (55%). P. f. 202-204 °C (1 -PrOH). ¹ H RMN [300 MHz, (CD ₃ ) _z SO]: 5 8,48 (d. J ·~ 2,0 Hz, 1 H, 4-H), 8,34 (dd, J = 9.0. 2,0 Hz, 1 H, 6-H), 7,81 (m, 4H, H ftalimido), 7,71 (d, J = 9.0 Hz, 1 H, 7-H), 7,22 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,22 (s, 2H, CH ₂ Bn), 4,13 (t, J = 7,2 Hz, 2H, 1 '-H), 3,49 (t, J = 6,9 Hz, 2H, 3'-H), 1 ,80 (m, 2H, 2'-H); ³ C ^' RMN [75 MHz. (CD ₃ ) ₂ SO]: δ 167,82 (CO ftalimido), 181 ,14 (C-3), 148,93 (C-7a), 141 ,45 (C-5), 136,08 (C-1 Bn), 134,22 (C-4, -5 ftalimido), 131 ,72 (C-1 , -2 ftalimido), 128,83 (C-3, -5 Bn). 127,75 (C~4 Bn), 127,22 (G~8 y C-2, -8 Bn), 122,91 (C-3, ~6 ftalimido), 120,40 (C-4), 1 15,92 (C-3a), 1 12,21 (C-7), 45,02 (C-1 ^* ), 44.98 (CH ₂ Bn), 34,86 (C-3"), 24,82 (G-2'); I ^: (JE): /z (%) 456 (100) ( *), 428 ( 8), 218 (15), 188 (67), 180 (83), 130 (29), 104 (18). Aná!. cale, para (456,45): C 65,78; H 4,42; N 12,27. Encontrado: C 85,50; H 4,87; N 12,51.

2-8enG!i-3-(3-fta!imidopropQXÍ}-5-nitro~2H~índami {?}. Rendimiento: 0,88 g (40%) P. f. 183-185 (1 ~PrOH). ¹ H RMH [300 MHz, {CD ₃ ) _s SO, 80 °C|: 5 8,84 (d, J = 1 ,9 Hz, 1 H, 4-H), 7,88 (dd, J - 9,6, 1 ,9 Hz, 1 H. 6-H), 7,82 (m, 4H, H ftalimído), 7,51 (d, J = 9,6 Hz, 1 H, 7-H), 7,30 (m, 5H, H arornát. Bn), 5,44 (s, 2H, CH ₂ Bn), 4,79 (t, J « 5,4 Hz, 2H, 1 '~ H), 3,83 (t, J = 6,3 Hz, 2H, 3 ^! -H), 2,17 (m, 2H, 2 -H); C RMH [75 MHz, (CD ₃ ) ₂ SO|: δ 188,07 (CG ftalimído), 149,62 (C-3), 148,81 (C-7a), 140, 1 1 (C-5), 135,73 (C-1 Bn), 134,26 (C-4, -5 ftalímido), 131 ,76 (C-1 , -2 ftailmido), 128,63 {C-3, -5 Bn), 127,95 (C-2, - 8 Bn). 127,90 (C-4 Bn), 122,98 (C-3, -6 ftalimidp), 121 ,08 (C-4), 119,88 (C-6), 117,99 (C-7), 104,95 (C-3a), 71 ,40 (C-1 '), 51 ,87 (CH ₂ Bn), 34, 1 1 (C-3'), 28,21 (C-2'); E (IE): m/z (%) 456 (1 ) ( *), 368 (2), 188 (100), 180 (84), 130 (16), Anal. cale, para CZSHZO AOS (458,45): C 65,78; H 4,42; N 12,27. Encontrado: C 85,66; H 4,67; N 12,09.

EJEM PLO 2. Preparación de las 1 -|w-amlnoalq índazollrionas 8 9 |fórmu!a (1)] por desprotección de los correspondientes w-ftalsniidoallcf js! derivados 4 y 5. La eliminación del grupo protector ftaloiio de los compuestos 4 y 5 (descritos en el Ejemplo 1 ) con e Hz HsO condujo a las 1-Cto-aminoalqu5l)indazolinonas finales 8 y 9 (Esquema 2).

Para ello, una suspensión de la correspondiente 1 ~(w~ftalimidoaiquil)indazolinona (4 o 5; 2,50 mmol) en MeNH ₂ /H ₂ 0 (40% p/p; 20 mL) se calentó a 80 ^® C durante 4 h. Se dejó enfriar la reacción a temperatura ambiente, se extrajo la amina formada con cloroformo (4 » 50 mL) y la solución orgánica se evaporó a sequedad, En cada caso, el producto obtenido fue disuelto en HCI H (50 mL) y extraído con éter (4 χ 50 mL); la fase acuosa se evaporó a sequedad y el residuo se trituró con éter (20 mL), proporcionando las aminas deseadas como los correspondientes hidrocioruros, que se recogieron por filtración y se secaron.

1~{2-AminQ&tii}~2~b&rtcÍi~5~r!¡tro~ 1, 2~di ittn 3 ~irtdazai~3~orta { sdroc!oruro} (8). Rendimiento: 0,84 g (98%). P. f. 261-283 °C pOH H _a Q). H RMH [300 MHz, (CDsfeSOJ: δ 8,53 (d, J = 2,4 Hz, 1 H, 4-H), 8.41 (dd, J - 9,3, 2,4 Hz, 1 H, 6-H), 8,33 <s a, 3H, NH ₃ *), 7,88 (d, J ^™ 9,3 Hz, 1 H, 7-H), 7,27 (m, 5H, H arornát Bn), 5,29 (s, 2H, CH ₂ Bn), 4,39 (t, J ~ 8,9 Hz, 2H, 1 '-H), 2,80 (t, J = 6,9 Hz, 2H, 2 -H); ¾ R N [75 MHz, (CD ₃ ) ₂ SO]: δ 180,79 (C-3), 148,23 (C-7a), 141 ,84 (C-5), 135,93 (C-1 Bn), 128,77 (C-3, -5 Bn), 127,91 (C-4 Bn), 127,38 (C-6), 127,28 (C-2, -8 Bn), 120,45 (C-4), 1 18,06 (C-3a), 111 ,88 (C-7), 44,63 (CH ₂ Bn), 43,56 (C-1 ') ₍ 35,41 (C-2 ^* ); E (ES*): /z (%) 313 (100) ([M+Hf), 335 (4) ([ +Na]*), 625 (57) ([2 +H]*), 647 (28) ([2 +Na]*). Anal. caSc. para CieHirCIN-j ^' Os

(348,78); C 55,10; H 4,91 ; N 16,06. Encontrado: C 55,37; H 4,76; N 15,85. 1~(3~Ammopmp¡l}-2-bencü-5-nitm-1,2-óMd^ (hidroa'orum) (9).

Rendimiento: 0,86 g (95%). P. f. 202-204 °C (1-PrOH). ¹ H R N [300 Hz, (CD ₃ ) _s SOJ: δ 8,53 (d, J = 2,4 Hz, 1 H, 4-H), 8,40 (dd, J = 9,0, 2,4 Hz, 1 H, 6-H), 8,03 (s a, 3H, NH ₃ ^* ), 7,75 (d, J ~ 9,0 Hz, 1 H, 7-H), 7,27 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,20 (s, 2H, CH ₂ Bn), 4,20 (t, J = 7,2 Hz, 2H, 1 '-H), 2,71 (s a, 2H, 3'-H), 1 ,61 (m, 2H, 2 -H); ¹³ C R N [75 MHz, (CD _s ) ₂ SO]: δ 161 ,22 (C-3), 148,07 (C-7a), 141 ,61 (C-5), 136, 10 (C-1 Bn), 128,89 (C-3, - 5 Bn), 127,85 (C-4 Bn), 127,42 (C-2, -8 Bn), 127,31 (C-6), 120,51 (C-4), 1 16,10 (C-3a), 1 12,36 (C-7), 44,65 (CH ₂ Bn), 44,30 (C-1 ') _t 36,07 (C-3 ^* ), 23,92 (C-2'); EM (ES ^* ): m/z (%) 327 (100) {[M+H]*), 349 (10) ([M+Na] ⁺ ), 653 (25) ([2M+H] ^* ), 675 (18) ([2M+Na]*). Anái. cale, (362,81): C 56,28; H 5,28; N 15,44. Encontrado: C 56, 12; H 4,99; N 15,71.

EJEMPLO 3 Preparación de las 1- 3-am!nopr©p írsda olmonas 11 -13 [fórmute í ] a partir de la l -fS-bromopropIl ndaxoSinona 10.

El tratamiento de la 1 -(3~bromopropi!)indazo!inona 10 (Fonseca-Berzal, C. et al., Eur. J. Med. Chem. 2016, 115, 295-310) con aminas primarias (MeNH ₂ ) o secundarias ( eiNH, piperidina) dio lugar a ios productos finales 11-13 (Esquema 3). Reacciones análogas partiendo del 2~bromoetil análogo de 10 no condujeron a ios productos esperaiós, ya que en estos casos el derivado halogenado sufrió preferentemente una deshidrohalogenación a la correspondiente 1-vinilindazolinona (Fonseca-Berzal, C, et ai., Eur. J. Med. Chem, 2016, 115, 295-310 .

En ei caso del 3-metiíamino (11) y 3-dimetiiamino (12) derivados, una mezcla de la 1- (3~bromopropsi)indazolinona 10 (0,98 g, 2,51 mmoi) y ^ ^a correspondiente amina (MeNHa/EtOH 33% p/p o e ₂ NH/EtOH 33% p/p; 30 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. Se evaporó la mezcla a sequedad, se extrajo la amina formada con cloroformo (4 ^χ 50 mL) y ¡a solución orgániea se evaporó nuevamente. E! producto obtenido se disolvió en HCI N (50 mi) y se extrajo con éter (4 ^χ 50 mL); la fase acuosa se evaporó a sequedad y el residuo se trituró con éter (20 mL), proporcionando las aminas deseadas como Sos correspondientes hidrocioruros, que se recogieron por filtración y se secaron.

En el caso de! 3-piperidino derivado (13), una mezcía del 3-bromoproplí derivado 10 (0,98 g, 2,51 mrnol) y plperidina (0,45 g, 5,28 mmol) en EíOH (50 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 48 h y luego se refluyó durante 3 h. Ls reacción se evaporó a sequedad y el residuo se disolvió en HCI N (50 mL) y se extrajo con éter (4 * 50 mL). La fase acuosa se aicalínizó con K2CO3, y la amina libre se extrajo con cloroformo (4 ^χ 50 mL). El residuo obtenido por evaporación de! disolvente se trató con ácido oxálico (sat.) en etanoi (5 mL) y a continuación se precipitó el oxalato de la amina por adición de éter (100 mL). La sal obtenida se recogió por filtración y se secó.

2-BenGil-1-[3-{meti!amln ^Q }prapsi]~5-nitm-1,2-dihidm ( idrocl&ruro)

(11) . Rend -miento: 0,90 g (95%). P, f. 188-188 °C (1-PrOH). ¹ H RMN [300 MHz, (CD ₃ ) ₂ SO]: δ 8,81 (s a, 2H, NH ₂ ⁺ ), 8,52 (d, J = 2,1 Hz, 1 H, 4-H). 8,40 (dd. J ^« 9,0, 2,1

Hz, 1 H, 6-H), 7,74 (d, J = 9,0 Hz, 1 H, 7-H), 7,27 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,20 (s. 2H, CH ₂ Bn), 4, 19 (t, J = 7,5 Hz, 2H, f -H), 2,81 (t, J - 7,5 Hz, 2H, 3'-H), 2,44 (s, 3H, Me), 1 ,64 (m, 2H, 2'-H); ¹³ C RMN [75 MHz, (CD ₃ ) ₂ SO]: δ 161 ,19 (C-3), 148,96 (C-7a), 141 ,83 (C- 5), 136,07 (C-1 Bn), 128,72 (C-3, ~5 Bn), 127,86 (C- Bn), 127,38 (C-2, -8 Bn), 127,34 (C-6), 120,51 (C-4), 1 16,13 (C-3a). 1 12,28 (C-7), 45,30 (C-3 ¹ ), 44,71 (CH ₂ Bn), 44,20 (C- 1 '), 32,25 (Me), 22,44 (C-2 ^! ); E (ES ^* ): m z (%) 341 (100) ([M+H] ^* ), 681 (18) ([2Μ+ΗΓ). Anál. cale, para Ci ₉ H ₂ ,Cí ₄ 03 (376,84): C 57,37; H 5,62; N 14,87. Encontrado: C 57,20; H 5,87; N 14,77.

731 (7) ([2M+Na] ⁺ )- Anái. cale, para CisH _S3 C!N„Q ₃ (390,86): C 58,38; H 5,93; 14.33. Encontrado: C 58,09; H 5,98; N 14,57.

2-Bencii-5-nilro- 1-(3-pip& d opíop! ~1 _l 2 ^« dihidro~3 ~indazol~3~ona (oxalato) (13). Rendimiento: 1 ,03 g (85%). P. f. 178-180 ^C C (MeOH). ¹ H RMN [300 MHz, (CD ₃ J ₂ SO}: δ 8,52 (d, J = 2, 1 Hz, 1 H, 4-H), 8,45 (s a, 1 H, NH ⁺ }, 8,38 (dd, J = 9,3, 2, 1 Hz, 1 H, 6-H), 7,68 (ó. J = 9,3 Hz, 1 H, 7· Η) _: 7,28 (m, 5H, H aromát Bn), 5,18 (s, 2H, GH ₂ Bn), 4,09 (t. J = 7,2 Hz, 2H, 1 '-H), 2,86 (m a, 8H, 3 ^: ~H, 2-, 6-H piperidino), 1 ,63 (s a, 8H, 2"-H, 3-, 5- H piperidino), 1 ,44 (s a, 2H, 4-H piperidino); ¹³ C RMH [75 MHz, (CDaJaSOJ: δ 164,79 (CO oxaiato), 161 ,04 (C-3), 148,85 (C-7a), 141 ,58 (C-5), 138, 1 1 (C-1 Bn), 128,78 (C-3, -5 Bn), 127,85 (C-4 Bn), 127,33 (C-2, -8 Bn), 127,28 (C-6), 120,44 (C-4), 116, 11 (C-3a), 1 12,23 (C-7), 52.82 (C-3'), 51 ,93 (C-2, -8 piperidino), 44,75 (CH ₂ Bn), 44,37 (C-1 '), 22,58 (C-3, -5 piperidino), 2142 (C-4 piperidino), 20,86 {C-2'); EM (ES*): /z {%) 395 (100) (ÍM+HD, 417 (8) {[ +Na]*), 81 1 (4) ([2 +Naj*). Anal. cate, para C ₂ 4H _2S N ₄ G? {484.50): C 59,50; H 5,83; N 1 1 ,56. Encontrado: C 59,75; H 5,57; N 1 1 ,57.

EJEMPLO 4. Preparación del 3-|2- dsmelf¾amia©)etoxi]!nda oi 16 [fórmula !)l a partir del 3-{2-bromoeío»)indazoí 14.

El tratamiento de! 3~{2~brornoetoxi)indazoí 14 (Fonseca- Berzal, C. eí al., Eur. J. Meó. Ch@m. 2018, 115, 295-310) con una amina secundaria como la e ₂ NH dio fugar ai 2- (dimetifamsno)etoxi derivado esperado 18 (Esquema 4).

Con este fin, una mezcía del 3~{2~bromoefoxi)indazol 14 (0.94 g, 2,50 mmoS) y e ₂ NH/EtGH {33% p/p; 20 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. Se evaporó la mezeia a sequedad y el residuo se extrajo con cloroformo (4 * 50 mL), evaporada la fase orgánica, eí residuo se disolvió en HCi N (50 mL) y ia solución se extrajo con éter (4 * 50 mL). La fase acuosa se evaporó a sequedad y el residuo se trituró con éter (20 mL), proporcionando el hidrocloruro de ¡a amina deseada, que se recogió por filtración y se secó.

2~Benci!~3~[2~{dim&ii!am!no)eloxij'5-niim^ { idrodoruro) (16). Rendimiento:

0,87 g (92%). P. f. 177-179 ⁸ C (2-PrOH). RMN [300 MHz, (CD ₃ ) ₂ SO]: δ 1 1 ,39 (s a, 1 H, NH*), 8,94 (d, J = 2.1 Hz, 1 H, 4-H), 7,91 dd, J = 9,8, 2, 1 Hz, 1 H, 6-H), 7,55 (d, J = 9,6 Hz, 1 H, 7-H), 7,30 (m, 5H, H aromát. Bri| 5,85 (s, 2H, CH ₂ Bn), 5, 19 (i, J™ 4,2 Hz,

EJEMPLO 5. Preparación daS 3~|3~aminopropoxi)indazol 19 [(fórmula {¼}]. del 3- {metiiamu*o)indazoi 21 [fórsrsuia (Μ y de los 3j ( jo-hldroxía! y )arr!ino]¾nda2: 3fes 22 y 24, [fórmula (Hi)] a partir de los S-loj-ftanmÍdoafcox ) derivados 8 y 7.

La eliminación del resto ftaloilo de los compuestos 6 y 7 (Ejemplo 1 ) con MeNt- /H ₂ 0 dio lugar a las aminas 17 y 19; estos compuestos fueron fácilmente detectados por cromatografía en capa fina (GCF) en las mezclas de reacción e incluso 19 pudo ser aislado con bajo rendimiento: estos productos, sin embargo, no resultaron estables, experimentando una transposición intramolecular a los correspondientes 3-[(u¡- hidroxia!qui!)amino]indazoies 22 y 24. En ambos casos, también se pudo aislar de estas reacciones el 3-(metílamino}ín.dazoí 21 , procedente de la sustitución nucieófila intermoiecular del grupo 3-aicoxilo de 6/17 y de 7/19 por el resto de eNH ₂ presente en el medio de reacción (Esquema 4).

Con este objetivo, una suspensión del correspondiente 3-(fta!irnído3icoxi)¡nd32oí (6 o 7) (2,50 mmo!) en eNH ₂ /H ₂ Q (40% p/p. 20 mi) se calentó a 80 °C durante 4 h (para 22} o 20 h (para 24). Se dejó enfriar la reacción a temperatura ambiente, se extrajo con cloroformo (4 ^χ 50 mL) y la solución orgánica se evaporó a sequedad. Partiendo de 6, el residuo se cromatografio en columna flash de ge! de sílice eluyendo con mezclas cloroformo/acetona {30/1 a 5/1 ) para conducir, en este orden de elución, a los compuestos 21 {49 mg, 7%) y 22, Partiendo de 7, la columna se eluyó con mezclas de cloroformo/etanol (50/1 a 10/1) para obtener los compuestos 21 (0,28 g, 37%) y 24 y, a continuación, con cloroformo/metano! (20/1 a 5/1 } para obtener el 3-(3- aminopropoxijindazoi 9; este último se aisló como el correspondiente hidrocioruro por disolución en HCI N (15 mL), seguida de evaporación a sequedad.

3~{3~AmmoprQpQxi)-2-bencii-5~nitra~2H-indazQi (hidrocioruro) {19}. Rendimiento- 36 mg (4%). P. f. 194-198 °C (reblandecimiento previa) (2-PrOH). ¹ H R N [500 fVIHz, (CDafeSOJ: ¡58,91 (d, J = 2,1 Hz, 1H, 4-H), 8,03 (s a, 3H, NH ₃ ⁺ ), 7,91 (dd, J = 9,8, 2,1 Hz, 1H, 6-H), 7,55 (d, J ~ 9,6 Hz, 1H, 7-H), 7,33 (rn, 5H, 8n aromat. H), 5,47 (s, 2H.8n CH ₂ ), 4.88 (í, J- 5,9 Hz, 2H, 1'~H), 3,01 (t, ./= 6,0 Hz, 2H, 3'-H), 2,10 (m, 2H, 2'-H); ¹ C RMN [125 MH∑, (CD ₃ ) ₂ SOJ: δ 149,54 (C-3), 146,81 (C-7a), 140,17 (C-5), 135,79 (Bn C- 1), 128,88 (Bn C~3, -5), 127,92 (Bn C~2, -4, -6), 121,15 (C-4), 119,94 (C-6), 118,07 (C- 7), 04,90 (C-3a), 70,59 (C-1 '), 51,72 (Bn CH ₂ ), 35.78 (C-3'), 27,24 (C-2 ¹ ); MS (ES ⁺ ): /z (%) 327 {100} {[ +H] ^* ), 349 (13) ([M+Na] ⁺ ). Anál. cale, para (362,81): C 56,28; H 5,28; N 15,44. Encontrado: C 56,01; H 5,57; N 15,17. 2~Ber!til-3-me am¡no~5~niÍro-2 -¡r¡dazQÍ (21). P. f.185-187 °C (2-PrOH). H RMH [300 Hz, (CD ₃ ) ₂ SO}. δ 8,79 (d, J = 2,1 Hz, 1H, 4-H}, 7,79 (dd, J = 9,6, 2,1 Hz, 1H, 6-H), 7,40- 7, 14 (m, 7H, 7-H, H, H aramát. Bn), 5,38 (s, 2H, CH ₂ Bn), 3,23 (d, J = 4,8 Hz, 3H, Me); C RMH [75 MHz, (CDa.hSQ]: δ 147,72 (C-7a), 146,51 (C-3), 137,18 (C-5), 136,17 (C-1 Bn), 128,50 (C-3, -5 Bn), 127,51 (C-4 Bn), 127,25 (C-2, -8 Bn), 123,65 (C-4), 120,32 (C- 6), 115,78 (C-7), 107,40 (C-3a), 51,04 (CH ₂ Bn), 31.13 (Me); E (SE): rn/z (%) 282 (100) ( ⁺ ), 236 (5), 191 (21), 163 (3), 145 (6), 117 (11), 102 (11). Anál. cale, para C15H14N4O2 (282,30): C 63,82; H 5,00; N 19,85. Encontrado: C 63,57; H 5,27; N 19,67.

2-Bencil~3~[(3~hidmxipropil)amino}~5-nitro-2 -indazo! (24). Rendimiento: 0,44 g (54%). P. f.154-158 °C (2-PrOH). Ή RMN [300 M z. (CD ₃ ) ₂ SOJ: δ 8,81 (d, J - 2,1 Hz, 1H, 4- H), 7,80 (dd, J = 9,8, 2,1 Hz, 1H, 6-H), 7,38-7,10 (m, 7H, 7-H, H, H aromát. Bn), 5,42 {s, 2H, ΟΗ ₂ Βη),4,83 (X,J- 5,1 Hz, 1H, OH), 3,86 (m, 2H, 1'-H),3,52 (m, 2H, 3"-H), 1,80 (m.2H, 2 ^! -H); ³ C RMN [75 MHz, (CD ₃ ) ₂ SO]: δ 147,77 (C-7a), 145,71 (C-3), 137,42 (C- 5), 136,23 (C-1 Bn), 128,51 (C-3, -5 Bn), 127,51 (C-4 Bn), 127,28 (C-2, -6 Bn), 123,46 (C-4), 120,28 (C-6), 1 15,98 (0-7), 107,05 (C~3a), 58,02 <C-3"), 51 , 17 (CH ₂ Bn), 41 ,46 (G-

V), 32,37 (C-2'); EM (!E): m z (%) 326 (100) (M ^* ), 281 (24), 235 (18), 205 (8), 191 (18), 102 (10). AnáS. cale, para CirHigNíOs (326,35): C 82,57; H 5,58; N 17, 17. Encontrado: C 62,83; H 5,77; N 18,93.

EJEMPLO 8. Preparación del 3~{metiiamin.o}iridazaE 21 y los 3-[(ω- hsdroxlalqull)mets¡amino]iiidazoles 23 y 25 [fórmula | i I i >5 a partir de Sos 3-(ω- bromoalcoKs)sndazoles 14 y 15.

Tanto el compuesto 14 como su 3-bromopropoxi análogo 15 (Fonseca-Berza!, C. eí ai., Eur. J. Meó. Chem. 2016, 115, 295-310), tratados con una amina primaria como la MeNHz condujeron inicíalmente a los correspondientes 3-(w-aminoaicoxi) derivados 18 y 20 que, corno se ha descrito para los análogos 17 y 19 (Ejemplo 5), se transpusieron rápidamente a Sos 3-[(w-hídro.xialquil)metflamino]sndazoles 23 y 25, respectivamente; el 3-(nrt8tilamino)indazol 21 también pudo ser aislado de estos proceso (Esquema 4).

2-Bencil-3-[(2~hidrQxieti!}mettíamino]-5-nitro^ (23). Rendimiento: 0,70 g (88%). f. 1 1 1 -1 13 ^C C (2-PrOH). ¹ H RMN [300 MHz, (CD ₃ ) _a SOJ: δ 8,88 (d, J ~ 2,4 Hz, 1 H, 4-H), 7,93 (dd, J = 9,6, 2,4 HE, 1 H, 6-H), 7,60 (d, J = 9,6 Hz, 1 H, 7-H), 7,38-7,20 (m, 5H, H aroma!. Bn), 5,61 (s, 2H, CH ₂ Bn), 4,78 (t, J = 5,4 Hz, 1 H, OH), 3,54 (ni, 2H, 2 - H), 3,32 (t, J - 4,5 Hz, 2H, 1 '-H), 3,02 (s, 3H. Me); ¹³ C RMN [75 MHz, (CDsJaSO]: ΰ 148,1 1 (C-3), 147,63 (C-7a), 140,33 (C-5), 136,44 (C-1 Bn), 128,51 (C-3, -5 Bn), 127,69 (C-2, -8 Bn), 127,80 (C-4 Bn), 120,73 (C-4), 1 19.84 (C-8), 1 18,28 (C-7), 1 12,81 (C-3a), 58,47 (C-2 ^! ), 58,29 (C-1 ¹ ), 52,24 (CH ₂ Bn), 41 ,26 (Me); EM (IE): /z (%) 328 (42) ( ^* ), 295 (100), 249 (13), 235 (21), 205 (11 ), 192 (7), 181 (7), 1 16 (1 1), 91 (49). Anáí. cale, para C ₁₇ Hi _g N ₄ 0 ₃ (326,35): C 62,57; H 5,56; W 17, 17. Encontrado: C 82,30; H 5,77; N 17,01. 2~BenciÍ~3~[(3- idroxspropii)meti!a mo]~S-ni o-2 -ír¡dazoÍ {25}, Rendimiento: 0,85 g (76%). Aceite que solidifica con el tiempo; p. f. 87-89 ^B C, ^" Ή RMN [300 MHz, (CDs^SG]: 5 8,83 (d, J = 2, 1 Hz, 1 H, 4-H), 7,93 (dd, J = 9,3, 2,1 Hz, 1 H, 6-H), 7,82 (d, J = 9,3 Hz, 1 H, 7-H), 7,38-7,12 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,55 (s, 2H, CH ₂ Bn), 4,45 {t, J = 5,1 Hz, 1 H, OH), 3,37 (rr¡, 2H, 3'-H), 3,32 (t, J = 6,9 Hz, 2H, 1 '-H), 2,94 (s, 3H, Me), 1 ,62 (m, 2H, 2'- H); "C RMN [75 MHz, (CD ₃ } ₂ SOj: δ 147,94 (C-7a), 147,62 (C-3), 140,51 (C-5), 136,31 (C-1 Bn), 128,55 (C-3, -5 Bn), 127,66 (C-4 Bn), 127,52 (C-2, -6 Bn), 120,53 (C-4), 119,68 (C-6), 118,43 (C-7), 1 12,58 (C-3a), 58,04 (C-3 ^* ), 52,83 (C-1 ^: ), 52,38 £CH ₂ Bn), 41 ,46 (Me), 30,58 (C-2'); EM (IE): m/z {%) 340 (81 ) {M ^* ), 295 (100), 249 (48), 205 (51 ), 174 (10), 159 (7), 130 (7), 1 16 (21 ), 102 (6). Aná¡. cale, para C1SH20N4O3 (340,38); C 83,52; H 5,92; N 18,48. Encontrado: C 63,24; H 5,77; N 18,71 .

EJEN!FLO 7. Estudio m vitro de ¡a actividad e Indis© de selectividad de los derivados de indazoi sobre Trypanosama cruzL

Estos estudios se realizan siguiendo un protocolo secuencia! de cribado in vitro publicado en la literatura y seguido anteriormente por los inventores (Fonseea-Berzai, C. et a!., Bioorg, Med. Chem. Lett. 2013, 23, 4851 -4856; Fonseca-Barzal, C. at ai., Eur. J. Med. Chem, 2016, 115, 295-310). En primer lugar, se evalúa simultáneamente la actividad de ios productos frente a epimasíigotes de 7. cruzi (forma exíraceiuiar presentes en ei insecto vector) y su toxicidad ínespecífica frente a fibroblastos L929 (células hospedadoras de los amastigotes). Los compuestos que presentan una selectividad en epimasíigotes igual o superior a la del fármaco de referencia, eí benznidazoi, se seleccionan para un estudio posterior en amastigotes, más significativos desde el punto de vista de ía enfermedad humana al ser las formas infraceluíares del parásito presentes en mamíferos.

Ejemplo 7a, Actividad frente a spimastígoíes de T. cruzi.

Para determinar la actividad in vitro sobre epimasíigotes se utilizaron cultivos axénicos de T. cruzi, cepa CL don B5 transfectadj de manera estable con e¡ gen de la B- galactosidasa (ÍacZ) de E. cali. La actividad se obtiene a partir de un método coforimétrico que determina el rojo de clorofeno! liberado a partir de su β-D- gaiactopiranósido CPRG) por los parásitos que permanecen vivos tras ei tratamiento. Los compuestos, disueitos en suifóxido de dirnetiio (D! lSG), se ensayaron a concentraciones finales en el medio de cultivo de 258-0, 125 μ siguiendo un procedimiento descrito (Fonseca-Ber al, C. el al.., Bioorg. Metí Chem. Lstí. 2013, 23, 4851 -4858), A partir de las correspondientes curvas dosis-respuesta se estimó par cada compuesto la concentración necesaria para _: inhibir el 50% del crecimiento de ios epimasíigotes (Cfsa epimasíigotes), Los resultados de actividad, mostrados en ía Tafia 1 , se expresan como la media de la Oso en epimastigoles ± desviación estándar (DS), a partir de los valores obtenidos en tres experimentos realizados de manera independiente.

Puede observarse que siete indazoiinonas 1 ,2-dí sustituidas [fórmula (I); 2, 3, 8, 9 y 11- 13], un 3-aminoaicoxi~2~bencilindazol [fórmuia (II); 19] y tres 3~aiquilamíno-2- bencilindazoles [fórmula {!!!); 21 , 22 y 24] muestran valores de actividad del mismo orden o superiores al del benznidazoi. Merecen especial atención las aminas primarias 8 y 9 y la secundaria 11 , mucho más activas (CÍSG≤ 0,5 μ ) frente a ep mastigotes de T. cruzi que eí fármaco de referencia benznidazoi (C o - 28,6 μΜ) y o-^e una amina terciaria relacionada, derivada de piperidina, descrita previamente (Ciso - 9,0 μ ) (Mura, F. et ai., J. Spectrosc. Dyn, 2013, 3, articulo 8),

16 41 76 ± 6,59 126,59 ± 17,32 3,03

19 14,07 ± 2,67 102,32 ± a, 12 7,27

21 17,55 ± 6,90 1 13,00 ± 18,47 6,44

22 22,46 ± 1 ,91 > 258 > 1 1 ,40 1.37 ± 0,26 >18B,86

23 53,47 ± 2,12 159,29 ± 2,61 2,72

24 13,43 ± 8,24 200,85 ± 27,70 14,94 5,52 ± 0,04 36,35

25 31 ,78 ± 1 ,32 100,58 ± 13,70 3, 17

■enznidaz

26,55 ± 4,53 > 256 > 9,64 0,50 ± 0,03 > 512 el

índices de selectividad para epimastigotes (!S - CLsa L929/Ci«Q epimastigotes).

lndices de selectividad para amasíigotes {fS = CL5s L929/C o amastígotes).

ND: no determinado.

»: No evaluado en amastigotes por no alcanzar en epimastigotes eí mínimo de selectividad establecido por el fármaco de referencia (IScompiiesto

Ejemplo 7b, Citotoxicidad inespecífica sobre fibroblastos murinos L929 y determinación de índices de selectividad (!S).

Con eí fin de determinar si la actividad anü-T, cruzi de los indazoies estudiados es específica y que no son tóxicos para células de mamífero, se evaluó su citotoxicidad inespecífica en fibroblastos por fiuorimetría utilizando resazurina, indicador redox que sufre un cambio de coior y emite fluorescencia en presencia de células meta bélicamente activas {Fonseca-Berzai, C. et al. , Bioorg. Metí. Chem. Lett. 2013, 23, 4851 -4856).

Los compuestos estudiados se añadieron al medio de cultivo a concentraciones finales 258-0,125 μΐνΐ, y se calculó para cada uno de ellos la concentración necesaria para inhibir e! 50% del crecimiento celular (CLso L929) a partir de la correspondiente curva dosis-respuesta. Los resultados de actividad, mostrados en la Tabla 1 , se expresan como la media de la CL ₅ o ± DS, a partir de los valores obtenidos en tres experimentos independientes. A partir de estos datos, se calcularon los correspondientes índices de selectividad (IS = CLso L929/C ¾ epimastigotes).

Puede observarse que ios compuestos m s activos frente a epimastigotes (8, 9, 11 y 12) presentan IS (1 10,5-877,7) muy superiores al del fármaco de referencia {> 9,8). Otros compuestos con actividad anti-spimastigote interesante (2, 3, 13, 19, 21 , 22 y 24) resultaron, sin embargo, bastante tóxicos para ios fibroblastos, por io que sus IS (8,4 a > 24, 1 } no resultaron tan satisfactorios.

E-jempio 7c. Actividad frente a a asiigotes de T. cruzi.

Estos ensayos se realizaron sobre la misma cepa utiiizada ai estudiar la actividad frente a epimastigotes, usando asi mismo el sustrato cromogénico CPRG, siguiendo protocolos previamente descritos (Fonseca-Berzai, C. et al. , Parásito!, Res. 2014, 113.. 1049-1056). Para ello se infectaron células L929 con tripomastigoíes derivados de cultivo celular (TDC), que rápidamente se transformaron intracelularmeníe en amastígotes. Este estudio se llevó a cabo con los compuestos que mostraron frente a epimastigotes un !S similar o superior al del fármaco de referencia (benznidazo!), determinándose, tal como se ha descrito anteriormente (Ejemplo 7a), ia concentración necesaria para inhibir eS 50% del crecimiento de los amastígotes (C o amastígotes) a partir de las correspondientes curvas dosis-respuesta. Los resultados de actividad se expresan como la media de la Clso ± DS, a partir de los valores encontrados en tres experimentos independientes. Las actividades obtenidas, asi como los correspondientes SS para amastígotes se recogen en la Tabla 1 .

Puede observarse que la mayoría de ios compuestos efectivos frente a epimastigotes muestran también una actividad similar (8, 9, 11-13) o, como ocurre con el benznldazoi, superior (2, 22 y 24) frente a amastígotes. Destacan los compuestos 8 y i (Clso ~ 0,29 y 0,25 μΜ, respectivamente), con actividad superior a la del benznidazol (Cis ~ 0 50 μΜ) y unos valores excelentes de ÍS {> 845). Estos resultados son especialmente Interesantes desde el punto de vista de la enfermedad humana teniendo en cuenta ei relevante papel que juegan en su desarrollo ios amastígotes, formas intracelulares presentes en las células de mamífero.

En este sentido, muchos compuestos cumplen los requisitos de actividad e iS frente a amastígotes de una cepa de 7 ^" . crun del tipo TcVi necesarios para ser considerados buenos puntos de partida (hits) para el desarrollo de nuevos fármacos aníiehagáslcos (Clso≤ 10 μΜ o < 5 μ e IS > 10; Don, R. & ¡ose!, J.-R., Parasitoiogy 2014, 141, 140- 148; Chateiaín, E„ J. Biomoi. Semen. 2011, 20, 22-35). Los resultados aquí descritos confirman nuestra hipótesis de que ia introducción de grupos ω-aminoaiquilo en posición 1 de las 2-benciiindazo!inonas [fórmula (i)} conduce a compuestos que mantienen una elevada actividad tripanocida, a! misrno tiempo que confieren, a través de las sales de amonio correspondientes, una alta solubilidad en agua. Por otra parte, resulta muy interesante la actividad mostrada por el compuesto 19 [fórmula (H)j, dado que otros 3-aicQxi-2~aiquiiindazs!es análogos descritos previamente, con sustítuyentes de otra naturaleza, presentan escasa actividad antichagásica. Finalmente, la notable actividad tripanocida de algunos 3-(aíquiíamino)índazoles. e. g. , 22 y 24 [fórmula {íif)j, especialmente frente a amastigotes, no ha sido descrita con anterioridad, por lo que este tipo de estructura constituye un nuevo esqueleto prometedor de cara ai desarrollo posterior de nuevos fármacos anfíchagásicos derivados de indazoi. m vnro de ÍÜ derivados de ít da os frente <

de Leis msnia amaion&ns y determinación de índices de selectividad (IS).

Dado ei estrecho parentesco entre los géneros Tn/panosoma y Leish ania, pertenecientes ambos a la familia Tr panosomatídae, algunas de ¡as indazolinonas 1 ,2- disustituidas [fórmula (i): 2, 8, 9, 11 y 12] y 3-{aíqu!Íamind ^: 5índazQles [fórmula {III): 21 22 y 24] activos frente a T, cruzi fueron ensayados también frente a L amazonens siguiendo un procedimiento publicado con anterioridad (Sifontes-Rodr guez, S. et ai., Me/Tí. i ^' nst. Oswalúo Cruz 2015, 1 10, 186-1 73). Para eüo, los promastsgotes de L amazonesis ( HO /BR/77 LTB0016) fueron cultivados a 28 °C en medio de Schneider suplementario con suero fetal bovino al 10%, penicilina sódica (200 UÍ/mL) y estreptomicina (200 pg/mL), Los compuestos a ensayar fueron previamente dlsueitos en suifóxido de dimetilo y luego se ¡levaron a cabo diluciones seriadas con medio de cultivo en placas de 96 pocilios a las que se agregaron cultivos frescos de promastigotes para lograr una densidad final de 5 χ 10 ^s promastigotes/mL. Se ensayaron ocho concentraciones de cada producto y cada concentración se ensayó por cuadruplicado. Después de 72 h de incubación a 28 se agregó a cada pocilio 20 pl de resazurina 3 mM y se incubó per otras 3 h en iguales condiciones. Posteriormente se leyeron las placas en un lector de fluorescencia, se calcularon ios valores de inhibición del crecimiento asociados a cada concentración y se estimaron las concentraciones Inhibitorias medías (Ciso) mediante ajuste no lineal a curvas sigmoides. Cada producto fue ensayado cuatro veces. Simultáneamente se probó la actividad de la anfofericina B {desoxicoiato), usada como fármaco de referencia. Por otra parte, con objeto de determinar los correspondientes índices de selectividad (IS) frente a células de mamífero, se usaron ios valores de ciíotoxicidad inespecífica obtenidos previamente para fibroblastos murinos L929 (Ejemplo 7b, Tabla 1 ). Los valores de actividad obtenidos, asi como ¡os correspondientes SS, se relacionan en la Tabla 2.

Puede destacarse la elevada actividad (CS*e < 4 μΜ) de las índazoünonas 1 ,2- disustituidas 8, 9 y 11 [fórmula {!)] y de ¡os 3~(alquilamino)indazoles 21 , 22 y 24 (fórmula {!!!)] frente a promastigotes de L amazonensis. Estos valores son muy superiores a los encontrados para la anfoterieina B, fármaco leishmanicida muy efectivo pero también muy tóxico y de elevado coste en sus formulaciones liposomales. Los valores de Clss obtenidos para nuestros compuestos son, por otra parte, del mismo orden que los descritos para otros dos fármacos de referencia (miltefosina y pentamidina) frente a promastigotes de esta especie. Para la miltefosina se han publicado valores de G! _so de 16,8 uM (Trincan!, C. T, et ai., J. Antimicrob. Ch&moíher, 2018, 71, 1314-1322) y 3,4 μ (Santa-Rita, R. M. et al., J. Antimicrob. Gbemother. 2004, 54, 704-710), mientras que para la pentamidina han sido de 29,9 μ (Dutra, L. A. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 201 , 58, 4837-4847) y 4,8 μ (de Melos, J. L. R. et ai., Eur. J. Med. Chern, 2015, 103., 409-417). Esta notable actividad leishmanicida de algunas indazolinonas 1 ,2- disustituidas, e. g.„ 8, 9 y 11 [fórmula (!)] y 3-{alquilamino)indazoles, e. g., 21 , 22 y 24 [fórmula (!!!)], no ha sido descrita con anterioridad, por lo que ambos tipos de derivados de indazoi resultan prometedores de cara al desarrollo de nuevos fármacos leishmanicidas.

TabSa 2. Actividad in vitro frente a formas sxtraceluiares (promastigotes) de L smaiortesis (MHOM/BR/77/LTB0016), ciíotoxicidad inespecífica en fibroblastos murinos LS2S, expresadas como Ciso y CLsfi. respectivamente, a índices ds selectividad (IS).

_™

CIso promasCLso L929

Comp. prornas- tigotes (μ ) (μΜ)

:igotas

2 35,82 ± 1,91 > 256 > 7,15

8 1 ,04 ± 0, 18 237,21 ± 27,93 228,09

9 1 _S S2 181 ,38 ± 22,55 47, 18

11 2,34 ± 0,39 242,91 ± 6,23 103,81

12 12,83 ± 0,72 103,86 ± 31 ,97 8,10 21 1 .82 ± 1 ,33 1 13,00 ± 18,47 82,09

22 1 ,61 ± 1 ,12 > 258 > 159,01

24 1 ,34 ± 0,71 200,6§ ± 27,70 149,74

A otencina _{0)044 ± 0[01}

Indices de selectividad para promastigoies (IS - CLso L929/Císo romasti oíss),

EJEMPLO 9, Estudio in viira de la actividad e ndice de selectividad de los derivados d® Inda ^g ! sobre Tri homanas vagáis.

Estos estudios encaminados a la búsqueda de nuevos agentes friccmonicidas están basados en un modelo secuencia! de cribado compuesto por varias fases que, actuando como filtro, permiten pasar al siguiente nivei de estudio solo a aqueüos productos que muestran valores significativos de actividad (Ibáñez-Escribano, A. et ai., J. Microbio!. Methods 2014, 105, 162-187). En primer lugar, los derivados de indazo! son evaluados frente a trofozoiíos de un aislado de T. vagmaüs sensible al metronidazoi (fármaco de referencia) y, simultáneamente, frente a células Vero para detectar su posible toxicidad inespedfica. Los compuestos que muestran una actividad relevante frente al aislado sensible ai fármaco de referencia son sometidos después a evaluación frente a un aislado de 7. vagmaüs metronidazol-resistente.

Ejemplo 9a, Actividad frente a Irofozoííos de T, vag naiis.

En primer lugar, los derivados de indazo! fueron evaluados frente a trofozoftos del aislado JH31 A4 de 7. vaginaiis (ATCC), sensible al fármaco de referencia metronidazoi. El cribado in vito se lleva a cabo evaluando ei porcentaje de crecimiento de un cultivo controlado tras 24 h en contacto con distintas concentraciones del compuesto a evaluar, siguiendo un procedimiento previamente descrito (ibáñez Escribano, A. et ai., Mem, insí, Oswaldo Cruz 2012, 107, 837-843). Para determinar las correspondientes Ciso, se prepara una solución stock de los compuestos a evaluar en sulfóxído de dimetilo (DMSO) y se ensayan en un rango de seis concentraciones finales distintas en diluciones dobles seriadas sucesivas, partiendo de una concentración máxima de 300 μΜ. Las células viables tras ei tratamiento se determinan aprovechando su capacidad de reducir el colorante redox resazurina a resorufina, tai como se ha comentado en ei Ejemplo 7b (Ibáñez Escribano, A. et a!., Mem. inst. Oswaldo Cruz 2012, 107, 837-643). Los valores de C! ₅ c se calculan a partir de la media obtenida a partir de, al menos, dos experimentos independientes. Todos los compuestos son evaluados por triplicado en cada ensayo, obteniéndose una DS por debajo del 10%,

Los valores de Ciso obtenidos para el aislado de T, vaginaiis JH31 A4 sensible a rnetronidazol, así como los intervalos de confianza del 95%, se recogen en la Tabla 3. Los compuestos que pasaron el primer filtro de evaluación en T. vaginalis, presentando valores de G! ₅ Q < 50 μϊνΐ, fueron las indazolinonas 1 ,2-disustituidas 8 y 11 -13 [fórmula (I)], ios 3-aminoa!cGxÍ~2~benciiindazoles 16 y 19 [fórmula (SI)], y los 3-a!quilarnino-2- bencilinda oies 21 -23 y 25 [fórmula {!!!)]. Cabe destacar los compuestos 19 [fórmula {11}], y 23 y 2S [fórmula (!H)j que, aunque menos activos que el metronidazo! (Clse " 1 ,4 μ ). presentaron actividades relevantes frente al parásito con valores de Clso de 5,8, 8,5 y 10,0 μ , respectivamente.

Algunos de los compuestos que mostraron una actividad relevante frente al aislado JH31 A4 (19, 22, 23 y 25) se sometieron también a evaluación frente a trofozo fías del aislado metranidazoi-resisíente IR 78, siguiendo un procedimiento de cribado ¡n vitro idéntico al descrito anteriormente.

Los resultados obtenidos frente al aislado IR 78 se recogen en la Tabla 4. Los valores de Cisc correspondientes a ios compuestos 19 y 25 (8,5 y 1 1 ,0 μ , respectivamente) son similares a los obtenidos en el aislado ensi le a metronidazo!, lo que pone en evidencia la falta de resistencia cruzada entre estos compuestos y el fármaco d referencia. De este modo, los esqueletos de 3 -Ciü -amínoalccxj)-2~beneiiinda:Ksl [formula (!!)] y de 3-[{w-hidroxialquil)amino3-2~benciiindazoi [fórmula (III)] de los compuestos 19 y 25, respectivamente, presentan Interés para el desarroíio de fármacos para el tratamiento de infecciones causadas por aislados de T. vaginaiis resistentes a 5- nitroimidazoles.

Tabla 3, Actividad in vitro frente a trofozoítos de T, mginaiis JH31 A4, citotoxi&dad inespeeifica frente a células Vero, expresadas como Ciso y CCse, respectivamente, e índices de selectividad {!$).

Comp. (¾ (μΜ ³ ^¾ IS ^Ü

278,2 [200,2-540,7]

ND 4 61,9 [49,4-78,5]

5 ND

6 ND

7 93,1 [71,4-126,5] -

8 49,4 [29,8-101,3] > 300 >6,1

9 170,9 [148,0-205,7] - -

11 48,9 [38,8-81,4] > 300 >6,1

12 40,8 [30,2-55,6] > 300 > 7,4

13 41,3 [26,5-71,6] > 300 > 7,3

16 413 [26,5-71,6] > 300 > 7,3

19 5,6 [4,7-6,4] 104, 18,7

21 45,4 [38,6-53,3] > 30Ü > 8,6

22 15,7 [11,7-20.3] > 300 > 19,1

23 8,5 [8,4-10,8] > 300 > 35,2

24 52,7 [46,8-59.2] - -

25 10,0 [9,1-11,0] > 300 > 18,2

letronidazol 14 [1,1-18] > 600 > 419,6

ND: No determinado por ausencia de actividad aníiparasitaria.

~: No evaluados frente a céulas Vero debido a los bajos valores de C! ₅ o.

³ Entre corchetes, intervalos de confianza del 95%.

^■ Indices de selectividad (IS - C!sstrof020Ítos/CC _S e células Vero).

'Intervalo de confianza del 95%: 78,5-138,5.

TabSa 4, Actividad in vitro frente a 7 ^" . vaginaiis IR 78 y citotoxicidad inespecífica frente a células Vero, expresadas como Ctao y GCse, respectivamente,

Com Ct sa {μΜ)* CCSG (μΜ) ¡s

19 8,5 [7,6-9,6] 104,1 ^S > 12,2

22 34,8 ! [30,7-39,3] > 300 > 8,6

23 49,3 ! [34,3-71,0] > 300 >6,1

25 1,0 [6,5-14,4] > 300 > 27,4

>

¡tronidazol 2,6 > 800 ^a Entre corchetes, intervalos de confianza de! 95%.

intervalo de confianza dsi 95%: 78,5-138,5. Eje pio 9b. Ciiotoxicidad inespecífica sobre células Vero y determinación de índices de selectividad (IS).

Este ensayo se llevó a cabo utilizando 3a línea celular Vero CCL-S1 (ATCC) y únicamente para aquellas moléculas que hablan mostrado una actividad significativa ¡n viiro frente a trofozoítos de T. vaginaiis (Ciso < 50 μΜ). Su objeto es determinar si los indagóles estudiados presentan una actividad especifica sobre el protozoo, careciendo de toxicidad inespecífica para las células de mamífero. El método utilizado para determinar las concentraciones de ios productos capaces de producir un 50% de eilotoxieidad (CCso) está basado en la reducción de la resazurina, tal como se ha descrito en ios Ejemplos 7b, 8 y 9a. Los valores de CCsc se calculan a partir de la media obtenida tras !a realización de al menos dos experimentos independientes. Cada concentración se evalúa por triplicado obteniéndose una DS por debajo de! 10%, existiendo además un control de crecimiento a! que se le asume un 0% de actividad citotoxíca inespecífica.

Los valores de CCso obtenidos en este estudio, asi como los índices de selectividad (IS) se recogen en ¡a Tablas 3 y 4. La mayor parte de los compuestos ensayados (8, 11 -13, 16, 21 -23 y 25) mostraron una actividad citütóxica inespecífica baja fCC ₅₀ > 300 μΜ) y. en el caso del aislado sensible JH31 A4, unos valores del IS razonables (> 8,1 a > 35,2). El compuesto 19 resuitó algo más tóxico, pero debido a su elevada actividad todavía alcanzó un notable IS (18,7). Los valores del iS obtenidos para el aislado metrcnidazol- resistente IR 78 son del mismo orden {> 8, 1 a > 27,4).

Los resultados descritos en esta invención confirman nuestra hipótesis de que ios 2- alquil-3-{üJ-aminoalcoxi}indazoíes. e. g,, 19 [fórmula (ii)], mantienen la actividad íricomonicida descrita para algunos análogos conteniendo en posición 3 grupos alcoxilo sencilios (Ibáñez-Escribano, A. eí al., Parasitology 2018, 143. 34-40; Fonseca-Berzai. C. et al., Eur. J, Med. Chem. 2016, 115, 295-310), pero poseen la ventaja de presentar mejores propiedades farmacocinéticas debido a los grupos amino básicos que permiten la preparación de sales ídrcsolubies. Por otra parte, la notable actividad de algunos 3- {a!qui!amino)indazoies, e. g. _: 22, 23 y 25 [fórmula {111)3, no habla sido descrita con anterioridad, por lo que este tipo de estructura constituye un nuevo esqueleto pro-metedor de cara al desarrollo de nuevos tricomonícídas derivados de indazoí