制备免疫抑制剂的用途 技术领域

本发明涉及氨基苯丙醇类化合物或其几何异构 体或可药用盐 或水合物， 它们的制备方法， 含有所述化合物的药物组合物。 本 发明还涉及所述化合物作为免疫抑制剂， 用于制备抗器官移植排 斥反应以及治疗和 /或预防某些自身免疫疾病如类风湿、 牛皮癣、 多发性硬化症、 系统性红斑狼疮等疾病的药物的用途。 背景技术

本发明涉及一类具有免疫调节作用的化合物以 及其作为药物 和 /或药物组合物的用途。

免疫失调可以导致一系列自身免疫疾病和慢性 炎症疾病，如， 系统性红斑狼疮、 慢性风湿性关节炎、 I型和 I I型糖尿病、 某些 肠炎、 胆硬化、 多发性硬化症以及其它疾病， 如节段性回肠炎、 溃疡性大肠炎、 大类天疱疮、 类肉状瘤病和哮喘， 等等。 虽然这 些病的发病机制和过程存在差异， 但是它们在自身抗体产生和淋 巴细胞自身活化（self- react ive)等方面是相同的。可能是因为正 常免疫系统平衡被打破所致。 同样地， 在骨髓或器官移植之后， 宿主的淋巴细胞识别外来组织抗原并开始产生 细胞和体液反应， 包括抗体、 细胞因子、 细胞毒淋巴细胞， 导致移植排斥反应。 这 也很可能是正常免疫系统平衡被打破所致。

自身免疫疾病和移植排斥反应的一个最终结果 就是炎症细胞 和它们释放的调节者引起组织损伤。 尽管临床已经有不少免疫抑 制剂在使用， 但是它们各自存在不同的缺点。 如， 早期， 免疫抑 制剂以糖皮质激素和硫唑嘌呤为代表。 二者的联合使用使得器官 移植取得了第一次突破性的进展， 但是， 直到上世纪 70年代末， 二者的联合应用作为维持免疫抑制治疗的腎移 植的 1年存活率只 有 50%左右。 同时， 长期应用糖皮质激素可产生严重不良反应， 如诱发和加重感染， 导致肾上腺皮质功能紊乱等； 长期应用硫唑 嘌呤等细胞毒类的免疫制剂则导致骨髓造血系 统的抑制和胃肠道 粘膜损害。 随后， 环孢素 A (CsA)的应用使得各种器官移植， 包括 肝、 心脏、 心肺联合、 胰、 骨髓等器官的移植取得了长足的发展。 直到 80年代中期，大部分免疫抑制治疗方案仍以环� ��素 A为基础， 但环孢素 A具有明显的毒性， 如腎毒性、 肝毒性、 引发高血糖、 神经损害、 诱发感染和引起肿瘤等。 霉酚酸酯是霉酚酸的酯类衍 生物， 具有较强的免疫抑制作用。 1996年， 临床试验表明， 霉酚 酸酯、 强的松和环孢素 A联合用药组比较， 霉酚酸酯组使腎移植 急性排斥反应发生率降低近 50%, 并显著降低肾移植治疗的失败 率。 同时霉酚酸酯可逆转常规免疫抑制治疗无效的 血管性排斥， 从而避免移植肾失功。 霉酚酸酯具有较低肝毒性、 腎毒性和骨髓 抑制作用， 无高血压、 糖尿病、 胰腺炎、 骨质疏松等副反应， 但 是， 在临床应用中它的一些毒性反应仍然令人无法 忍受。 FK506 的发现使器官移植进入另一个新时代。 与环孢素 A治疗组进行历 史对照， FK506 治疗组的患者存活率明显增高， 并且排斥反应发 生较少， 同时还可以减少类胆固醇的用量， 还有文献显示， 应用 环孢素 A后出现的排斥反应， 有 65%-80%可被 FK506逆转。 此夕卜， FK506 的优点还在于它对肝细胞的增生作用使之对肝 移植更为有 利， 并且不会产生如环孢素 A所致的一些组织增生的副作用。 相 对而言， 应用 FK506具有移植患者生存率和移植物存活率高、 急 性排斥反应发生率低、 对类胆固醇相对无依赖性、 低感染率等优 点， 但是 FK506仍具有腎毒性、 神经毒性、 肿瘤、 感染、 过敏反 应、 高血压及高血糖等副作用。 由此可见， 现有的免疫抑制剂无 法满足临床治疗的需要， 寻找新的高效低毒的免疫抑制剂依然十 分必要。

因此， 本发明的目的在于提供一种更安全， 更有效的免疫抑 制活性化合物。 发明内容

本发明人经过研究已经发现式 I所表示的化合物具有免疫抑 制作用。 其可用于但不限于器官移植中的抗免疫排斥反 应、 预防 和 /或治疗某些自身免疫疾病如类风湿、 牛皮癣、 多发性硬化症、 系统性红斑狼疮、 节段性回肠炎、 溃疡性大肠炎、 大类天疱疮、 类肉状瘤病和哮喘等。

因此， 本发明的一个方面涉及式 I氨基苯丙醇类化合物或其 几何异构体或可药用 其中-.

n为 1、 2或 3， 优选 1，

X为 0、 S、 NH或 Se等， 优选 0，

为氢、 碳数为 1-8， 优选 1-4的烷基或酰基，

R ₂ 为碳数为 2-20， 优选 6-12的烷基或酰基取代基， 该烷基 或酰基取代基， 可以含有或不含有芳香取代基， 各芳香取代基可 以被 1-5个卤素取代， 其中该烷基或酰基取代基中可含有 1-3个 硫、 氮或者氧原子连接烷基与酰基、 烷基与芳香取代基、 酰基与 芳香取代基、 或不同或者相同芳香取代基， 和

R ₃ 为氢原子、 碳数为 1-8， 优选 1-4 的烷基、 酰基或者烷氧 酰基。 本发明进一步表述为式 la 化合物或其几何异构体或可药用 盐或水合物：

为氢、 碳数为 1-8， 优选 1-4的烷基或酰基，

R ₂ 为碳数为 2-20， 优选 6-12的烷基或酰基取代基， 该烷基 或酰基取代基， 可以含有或不含有芳香取代基， 各芳香取代基可 以被 1-5个卤素取代， 其中该烷基或酰基取代基中可含有 1-3个 硫、 氮或者氧原子连接烷基与酰基、 烷基与芳香取代基、 酰基与 芳香取代基、 或不同或者相同芳香取代基， 和

R ₃ 为氢原子、 碳数为 1-8， 优选 1-4的烷酰基或者烷氧酰基。 本发明更进一步表述为式 lb 化合物或其几何异构体或可药 用盐或水合物：

R ₂ 为碳数为 2-20， 优选 6-12的烷基或酰基取代基， 该烷基 或酰基取代基， 可以含有或不含有芳香取代基， 各芳香取代基可 以被 1-5个卤素取代， 其中该烷基或酰基取代基中可含有 1-3个 硫、 氮或者氧原子连接烷基与酰基、 烷基与芳香取代基、 酰基与 芳香取代基、 或不同或者相同芳香取代基； 和

R ₃ 为氢原子、 碳数为 1-8 , 优选 1-4的烷酰基或者烷氧酰基。 本文所用的术语 "芳香取代基"意指碳环或杂环芳族环基团。 碳环芳族环基团为具有一个单环或多个稠合环 的碳数为 5-22 ,优 选 6- 18 , 6-14 , 6-10, 更优选 6的基团。 所述碳环芳族环基团的 典型实例包括但不限于苯基， 萘基和蒽基等。 杂环芳族环基团为 具有一个单环或多个稠合环的 5-14 , 优选 5-10个成员的基团， 其具有一个或多个选自 N、 0和 S的杂原子。所述杂环芳族环基团 的典型实例包括但不限于吡啶基、 吡嗪基、 嘧啶基、 哒嗪基、 咪 唑基、 吡咯基、 吡唑基、 三唑基、 四唑基、 噁唑基、 异噁唑基、 噁二唑基、 噻唑基、 异噻唑基、 噻二唑基、 咔唑基、 苯并咪唑基、 苯并噻吩基、 苯并呋喃基、 吲哚基、 苯并三唑基、 苯并噻峻基、 苯并噁唑基、 异喹啉基、 吲哚基、 异吲哚基、 吖啶基、 苯并异噁 唑基、 嘌呤基、 吡嗪基、 喹啉基和异喹啉基等。

本文所用的术语 "卤素" 意指氟， 氯， 溴或碘。 优选的卤素 为氟， 氯或溴， 更优选为氟或溴。 本发明所述的式 I化合物优选 /但不限于为以下化合物:

本发明的另一方面涉及药物组合物， 所述组合物包含至少一 种式 I化合物或其几何异构体或可药用盐或水合物� �及一种或多 种药用载体或赋形剂。

本发明的再一方面涉及式 lb 化合物或其可药用盐或水合物 的制备通法， 具体包括：

1、 (S) -2-氨基- 3- (4-酰基苯基) -丙- 1-醇类化合物的合成

R=C _n H _2n+1 , n=5-l l 该方法以 L-苯丙氨酸为原料，用 NaBH ₄ /I ₂ 还原羧酸而得到 L- 苯丙氨醇， 再乙酰化、 傅-克酰基化、 脱保护、 成盐等五步反应得 到目标化合物。

2、 (S) -2-氨基- 3- (4-烷基苯基) -丙- 1-醇类化合物的合成 本路线 L-苯丙氨酸为原料， 用 NaBH ₄ /I ₂ 还原羧酸而得到 L- 苯丙氨醇， 再乙酰化、 傅 -克酰基化、 Et ₃ SiH/TFA体系还原、 脱保 护、 成盐等六步反应得到目标化合物。 其还原， 乙酰化以及傅- 克酰基化方法同 2相同。

3、 (S) -2-氨基- 3- (4-取代苄氧基-苯基) -丙- 1-醇类化合物的 合成

本路线以 L-Boc 酪氨酸甲酯为原料， 用苄基保护酚羟基、 LiAlH ₄ 还原、 脱保护、 烷基化、 脱 Boc等反应得到目标化合物。

4、 (S) -2-氨基- 3- (4-取代苯氧基-乙酰苯基) -丙- 1-醇类化合 物的合成

本路线 L-苯丙氨酸为原料， 用 NaBH ₄ /I ₂ 还原羧酸而得到 L- 苯丙氨醇， 再乙酰化、 氯乙酰化、 与酚缩合、 脱保护、 成盐等六 步反应得到目标化合物。

R= Br 本发明化合物的可药用盐包括其与无机或有机 酸形成的酸加 成盐或与碱形成的碱加成盐。 其中酸加成盐包括但不限于： 盐酸 盐， 氢溴酸盐， 氢碘酸盐， 硝酸盐， 硫酸盐， 硫酸氢盐， 磷酸盐， 磷酸氢盐， 乙酸盐， 丙酸盐， 丁酸盐， 三甲基乙酸盐， 己二酸盐， 藻酸盐， 乳酸盐， 柠檬酸盐， 酒石酸盐， 琥珀酸盐， 马来酸盐， 富马酸盐， 苦味酸盐， 天冬氨酸盐， 葡糖酸盐， 苯甲酸盐， 甲磺 酸盐， 乙磺酸盐， 苯磺酸盐， 对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐； 碱加 成盐包括但不限于： 铵盐， 碱金属盐如钠和钾盐， 碱土金属盐如 钙和镁盐， 有机碱盐如二环己胺和 N-甲基- D-葡糖胺盐， 以及氨 。

本发明化合物的药物组合物可以以下面的任意 方式施用： 口 服， 喷雾吸入， 直肠用药， 鼻腔用药， 颊部用药， 阴道用药， 局 部用药， 非肠道用药如皮下、 静脉、 肌内、 腹膜内、 鞘内、 心室 内、 胸骨内和颅内注射或输入， 或借助一种外植储器用药。 其中 优选口服、 腹膜内或静脉内用药和局部用药方式。 当口服用药时， 本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂 形式， 包括但不限于片剂， 胶嚢， 水溶液或水悬浮液。 其中， 片 剂一般使用的载体包括乳糖和玉米淀粉， 另外也可加入润滑剂如 硬脂酸镁。胶嚢制剂一般使用的稀释剂包括乳 糖和干燥玉米淀粉。 水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳 化剂和悬浮剂混合 使用。 如果需要， 以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂， 芳 香剂或着色剂。

当直肠用药时， 本发明化合物一般可制成栓剂的形式， 其通 过将药物与一种适宜的非刺激性赋形剂混合而 制得。 该赋形剂在 室温下呈现固体状态， 而在直肠温度下熔化释出药物。 这类赋形 剂包括可可脂、 蜂蜡和聚乙二醇。

当局部用药时，特别是治疗局部外敷容易达到 的患面或器官， 如眼睛、 皮肤或下肠道神经性疾病时， 本发明化合物可根据不同 的患面或器官制成不同的局部用药制剂形式， 具体说明如下： 当眼部局部施用时， 本发明化合物可配制成一种微粉化悬浮 液或溶液的制剂形式， 所使用载体为等渗的一定 pH的无菌盐水， 其中可加入也可不加防腐剂如氯化苄基烷醇盐 。 此外对于眼用， 也可将化合物制成膏剂形式如凡士林膏。

当皮肤局部施用时， 本发明化合物可制成适当的软膏、 洗剂 或霜剂制剂形式，其中活性成分悬浮或溶解于 一种或多种载体中。 这里软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿 物油， 液体凡士林， 白凡士林， 丙二醇， 聚氧化乙烯， 聚氧化丙烯， 乳化蜡和水； 洗 剂或霜剂可使用的载体包括但不限于： 矿物油， 脱水山梨糖醇单 硬脂酸酯， 吐温 60, 十六烷酯蜡， 十六碳烯芳醇， 2-辛基十二烷 醇， 苄醇和水。

当下肠道局部施用时， 本发明化合物可制成如上所述的直肠 栓剂制剂或适宜的濯肠制剂形式， 另外也可使用局部透皮贴剂。 本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药， 包括无菌注射 水或油悬浮液， 或无菌注射溶液。 其中， 可使用的载体和溶剂包 括水， 林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。 另外， 灭菌的非挥发油也 可用作溶剂或悬浮介质， 如单甘油酯或二甘油酯。

除此之外，本发明化合物还可与其它免疫抑制 药物一起施用， 这些物质包括但不限于： 环孢菌素 A、 甾体激素、 FK506、 RPM, 来氟洛米（Lef lunomide) , DSG, SKF105685MZ, RS61443BQR等。

另外需要指出， 本发明化合物针对不同患者的特定使用剂量 和使用方法决定于诸多因素， 包括患者的年龄、 体重、 性别、 自 然健康状况、 营养状况、 化合物的活性强度、 服用时间、 代谢速 率、 病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。 优选的使用剂量 介于 0. 01-300mg/kg体重 /天。 实施例

下面的实施例是将进一步详细说明本发明， 但对本发明不构 成任何限制。

化合物熔点由 RY-1型熔点仪测定， 温度计未经较正。 - NMR 由 ARX- 400 NMR仪测定。 质傳由 Micromas s- ZabSpec MS仪测定。 所有反应用溶剂未注明都经标准化预处理。

实施例 1 : (S) - 2-氨基- 3-苯基-丙- 1-醇的制备

于 1L的三颈瓶中放置 6. 92g (183腿 ol)硼氢化钠和 200mL无 水四氢呋喃， 水浴中冷却下， 分批加入 12. 56g (76mmol) L-苯丙氨 酸， O 下緩慢滴入 19. 30g (76腿 ol)碘的无水四氢呋喃溶液 80mL, 30min滴毕， 加热至回流 18h, 然后冷却至室温， 加入甲醇至反应 液澄清， 室温下搅拌 0. 5h, 旋去溶剂， 随后加入 20%的氢氧化钾 溶液， 搅拌 4. Oh, 用 150mLx 3 乙酸乙酯萃取， 合并有机液， 硫 酸钠干燥， 旋干， 用乙酸乙酯重结晶得到 6.62g无色固体， 收率 75.0%, mp 91-93X (lit. 91-93 ) ₀ ¹ H-NMR(400 MHz, CDC1 ₃ ) δ (ppm)： 2.92 (d, 2H) , 3.40-3.51 (m, 2H) , 3.65-3.7 (q, 1H) , 7.25-7.32 (m, 5H)。

实施例 2: (S)- 2-乙酰氨基- 3-苯基-丙- 1-醇乙酸酯的制备 于 250mL的圆底烧瓶中， 加入 19.66g(130mmol)实施例 1化 合物、 132.72g(l.3mol)醋酐， 于水浴中冷却至 O , 滴入 132滴 硫酸， 自然升温至室温过夜，緩慢倒入 300mL饱和碳酸钠溶液中， 有大量白色固体析出， 过滤， 用适量水洗滤饼， 真空干燥得到 26.3g白色固体,收率为 86.0%„ ^-NMR (400 MHz, CDC1 ₃ ) δ (ppm)： 1.96(s, 3H), 2.10(s, 3H) , 2.82-2.89 (m, 2H) , 4.04-4.07 (m, 2H) , 4.44 (m, 1H) , 5.62 (d, 1H) , 7.20-7.31 (m, 5H)。

实施例 3: (S)- 2-乙酰氨基- 3- (4-辛酰基苯基） -丙- 1-醇乙酸 酯的制备

将实施例 2所得化合物（4.71g, 20mmol)加入到 50mL 1， 2 -二 氯乙烷中， 降温到 O , 加入无水三氯化铝（5.32g, 40mmol) , 滴 加辛酰氯（5.85g, 36mmol) 1， 2-二氯乙烷 20mL, 加毕， 保温反应 4小时， 然后在室温下搅拌 2小时， 将反应液倒入碎水中， 振摇， 分液， 水相用二氯甲烷 50x3提取， 合并有机相， 用水洗两次， 饱和氯化钠溶液洗涤一次， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 旋干， 用石 油醚 /乙酸乙酯重结晶得到白色固体 5.13g, 收率 71.0%。 ¹ H-NMR(400 MHz, CDC1 ₃ ) δ (ppm)： 0.88 (t, 3H) , 1.29-1.34 (m, 8Η) , 1.70-1.74 (m, 2Η) , 1.97 (s, 3Η) , 2.11 (s, 3Η) , 2.90-2.96 (m, 4Η) , 4.07 (m, 2Η) , 4.46 (m, 1Η) , 5.67 (d, 1H) , 7.28-7.30 (d， J = 8.0Hz, 2H) , 7.89-7.91 (d, J = 8.0Hz, 2H)。 实施例 4: (S)- 2-氨基- 3- (4-辛酰基苯基) -丙- 1-醇的制备 于 lOOmL圆底烧瓶中，加入 0.36g (1. Ommol)实施例 3化合物、 0.42g(10腿。1)氢氧化锂、 30mL甲醇、 30mL蒸馏水，加热回流 7h, 用乙酸乙酯萃取 50mLx 3萃取， 合并， 用饱和氯化钠溶液洗涤一 次， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 旋干， 乙酸乙酯重结晶得到白色固 体 0.25g, 收率 91.0%。

实施例 5: (S)- 2-氨基- 3- (4-辛酰基苯基) -丙- 1-醇盐酸盐的 制备

将实施例 4化合物（0.14g, 0.5mmol)加入到乙酸乙酯 5mL中 使其溶解， 加入氯化氢（2.2mol. L ¹ )的无水乙酸乙酯溶液 1. OmL, 室温搅拌 2小时， 有白色固体析出， 减压除去乙酸乙酯， 用乙酸 乙酯 /乙醇重结晶得到白色鳞片状晶体 0. llg, 收率 73.0%， mp 107-108X _o ¹ H-NMR(400 MHz, D ₂ 0) δ (ppm)： 0.68-0.72 (t, 3H) , 1.11-1.17 (m, 8H), 1.52 (m, 2H) , 2.92 (m， 4H) , 3.52 (m, 2H) , 3.67(m, 1H) , 7.31-7.33 (d， J = 8. OHz, 2H) , 7.83-7.85 (d, J =8.0Hz, 2H)。

实施例 6: (S)- 2-氨基- 3- (4-己酰基苯基) -丙- 1-醇盐酸盐的 制备

以（S) -2-氨基- 3- (4-己酰基苯基) -丙- 1-醇为原料，用实施例 5 方法得到标题化合物， 收率 72.25%。 ^- MR (400 MHz, CD ₃ 0D) δ (ppm)： 0.92 (t, 3H) , 1.37 (m, 4Η) , 1.67-1.69 (m, 2Η) , 3.01 (m, 4Η) , 3.50 (m, 2Η) , 3.70 (m, 1Η) , 7.42-7.44 (d， J = 8.0Hz, 2H) , 7.97-7.99 (d, J = 8. OHz, 2H)。

实施例 7: (S)- 2-氨基- 3- (4-庚酰基苯基) -丙- 1-醇盐酸盐的 制备

以（S) -2-氨基- 3- (4-庚酰基苯基) -丙- 1-醇为原料，用实施例 5 方法得到标题化合物, 收率 71.30%。 -腿（400 MHz, CD ₃ 0D) δ (ppm)： 0.90(t, 3H), 1.32-1.33 (m， 6H) , 1.64-1.70 (m, 2H) , 2.98-3.02 (m, 4H) , 3.48-3.51 (m, 2H) , 3.68 (m, 1H) , 7.40-7.42 (d, J = 8.0Hz, 2H) , 7.96-7.98 (d, J = 8.0Hz, 2H)。

实施例 8: (S)- 2-氨基- 3- (4-壬酰基苯基) -丙- 1-醇盐酸盐的 制备

以（S) -2-氨基- 3- (4-壬酰基苯基) -丙- 1-醇为原料，用实施例 5 方法得到标题化合物, 收率 69.65%。 -腿（400 MHz, CD ₃ 0D) δ (ppm)： 0.87- 0.90 (t, 3H) , 1.28-1.31 (m, 10H), 1.66- 1.70 (m, 2H) , 2.98-3.02 (m, 4H) , 3.48-3.51 (m, 2H) , 3.68(m, 1H) , 7.40-7.42 (d, J = 8.0Hz, 2H) , 7.96-7.98 (d, J = 8·0Ηζ, 2H)。

实施例 9: (S)- 2-氨基- 3- (4-癸酰基苯基) -丙- 1-醇盐酸盐的 制备

以（S) -2-氨基- 3- (4-癸酰基苯基) -丙- 1-醇为原料，用实施例 5 方法得到标题化合物， 收率 65.45%。 ^- MR (400 MHz, CD ₃ 0D) δ (ppm)： 0.87-0.91 (t, 3H) , 1.28-1.35 (m, 12H) , 1.67- 1.69 (m, 2Η) , 2.99-3.00 (m, 4Η) , 3.48-3.51 (m, 2Η) , 3.70 (m, 1Η) , 7.41-7.43 (d, J = 8.0Hz, 2H) , 7.97-7.99 (d, J = 8·0Ηζ, 2H)。

实施例 10: (S)- 2-氨基- 3- (4-正十一酰基苯基)-丙- 1-醇盐 酸盐的制备

以（S) -2-氨基- 3- (4-正十一酰基苯基) -丙- 1-醇为原料，用实 施例 5方法得到标题化合物，收率 70.19%„ ^-NMR (400 MHz, CD ₃ 0D) δ (ppm)： 0.86-0.90 (t, 3H) , 1.26- 1.38 (m, 14H) , 1.66- 1.70 (m, 2Η) , 2.98-3.01 (m, 4Η) , 3.49-3.50 (m, 2Η) , 3.71(m, 1Η) , 7.40-7.42 (d, J = 8.0Hz, 2H) , 7.96-7.98 (d, J = 8·0Ηζ, 2H)。

实施例 11: (S)- 2-氨基- 3- (4-正十二酰基苯基)-丙- 1-醇盐 酸盐的制备

以（S) -2-氨基- 3- (4-正十二酰基苯基) -丙- 1-醇为原料，用实 施例 5方法得到标题化合物，收率 59.84% ₀ ^-NMR (400 MHz, CD ₃ 0D) δ (ppm)： 0.86-0.90 (t, 3H) , 1.27- 1.36 (m, 16H) , 1.66- 1.70 (m, 2H) , 2.98-3.01 (m, 4H) , 3.49-3.52 (m, 2H) , 3.71(m, 1H) , 7.40-7.42 (d, J = 8.0Hz, 2H) , 7.96-7.98 (d, J = 8· 0Ηζ, 2H)。

实施例 12: (S)- 2-氨基- 3- (4-辛基苯基)-丙- 1-醇盐酸盐的 制备

于 50mL圆底烧瓶中，加入 0.83g (2.3mmol)实施例 3化合物、 5. OmL TFA, 水浴冷却， 緩慢滴入 0.80mL三乙基硅烷， 滴毕， 室 温下搅拌过夜，倒入 10mL饱和的碳酸钠水溶液中，用乙酸乙酯萃 取 50mLx 3萃取， 合并， 用饱和氯化钠溶液洗涤一次， 无水硫酸 钠干燥， 过滤， 旋干， 乙酸乙酯重结晶得到白色固体 0.69g, 收 率 86.0%。

于 lOOmL 圆底烧瓶中， 加入 0.40g(1.2mmol)上述化合物、 0.50g (12腿 ol)氢氧化锂、 30mL 甲醇、 30mL 蒸馏水， 加热回流 7h, 用乙酸乙酯萃取 50mLx 3萃取， 合并， 用饱和氯化钠溶液洗 涤一次， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 旋干， 乙酸乙酯重结晶得到白 色固体 0.31g, 收率 87.0% ₀

将上述化合物（0.31g, 1.2腿 ol)加入到乙酸乙酯 5mL中使其 溶解， 加入氯化氢（2.2mol.L— 的无水乙酸乙酯溶液 l.OmL, 室温 搅拌 2小时， 有白色固体析出， 减压除去乙酸乙酯， 用乙酸乙酯 / 乙醇重结晶得到白色鳞片状晶体 0.25g, 收率 71.0%, mp 107-108X 。 NMR(400 MHz, CD ₃ 0D) δ (ppm)： 0.87-0.90 (t, 3H) , 1.28-1.31 (m, 10H) , 1.57-1.60 (m, 2H) , 2.57-2.59 (t, 2H) , 2.88-2.90 (m, 2H) , 3.42-3.45 (m, 1H) , 3.50-3.53 (q, 1H) , 3.67-3.69 (q, IH) , 7.17(s, 4H)。

实施例 13: (S)- 2-氨基- 3- (4-己基苯基)-丙- 1-醇盐酸盐的 制备

以（S) -2-乙酰氨基 -3- (4-己酰基苯基） -丙- 1-醇乙酸酯为原 料， 用实施例 12方法得到标题化合物， 收率 74.70%。 - NMR(400 MHz, CD ₃ 0D) δ (ppm)： 0.87-0.90 (t, 3H) , 1.30-1.31 (m, 6H) , 1.57-1.60 (m, 2H) , 2.56-2.60 (t , 2H) , 2.90-2.91 (m, 2Η) , 3.45 (m, IH) , 3.50-3.54 (q, IH) , 3.66-3.69 (q, IH) , 7.17(s, 4H)。

实施例 14: (S)- 2-氨基- 3- (4-庚基苯基)-丙- 1-醇盐酸盐的 制备

以（S) -2-乙酰氨基- 3- (4-庚酰基苯基） -丙- 1-醇乙酸酯为原 料， 用实施例 12方法得到标题化合物， 收率 74.55%。 - NMR(400 MHz, CD3OD) δ (ppm)： 0.87-0.90 (t, 3H) , 1.30-1.32 (m, 8H) , 1.59-1.61 (m, 2H) , 2.57-2.59 (t , 2H) , 2.88-2.90 (m, 2Η) , 3.41-3.45 (m, IH) , 3.50-3.54 (q, IH) , 3.67-3.69 (q, IH) , 7.17 (s, 4H)。

实施例 15: (S)- 2-氨基- 3- (4-壬基苯基)-丙- 1-醇盐酸盐的 制备

以（S) -2-乙酰氨基- 3- (4-壬酰基苯基） -丙- 1-醇乙酸酯为原 料， 用实施例 12方法得到标题化合物， 收率 66.42%。 - NMR(400 MHz, CD3OD) δ (ppm)： 0.87-0.90 (t, 3H) , 1.28-1.31 (m, 12H) , 1.59 (m, 2H) , 2.57-2.61 (t, 2H) , 2.87-2.89 (d, 2H) , 3.42-3.46 (m, IH) , 3.49-3.52 (q, IH) , 3.65-3.70 (q, IH) , 7.17(s, 4H)。

实施例 16: (S)- 2-氨基- 3- (4-癸基苯基)-丙- 1-醇盐酸盐的 制备

以（S) -2-乙酰氨基- 3- (4-癸酰基苯基） -丙- 1-醇乙酸酯为原 料， 用实施例 12方法得到标题化合物， 收率 65.88%。 ^- MR (400 MHz, CD ₃ 0D) δ (ppm)： 0.87-0.91 (t, 3H) , 1.27-1.31 (m, 14H) , 1.57-1.59 (m, 2H) , 2.57-2.58 (t , 2H) , 2.88-2.90 (d, 2Η) , 3.42-3.45 (m, 1Η) , 3.49-3.51 (q, 1H) , 3.66-3.69 (q, 1H) , 7.17 (s, 4H)。

实施例 17: (S)- 2-氨基- 3- (4-正十一烷基苯基)-丙- 1-醇盐 酸盐的制备

以（S) -2-乙酰氨基- 3- (4-正十一酰基苯基）-丙- 1-醇乙酸酯 为原料， 用实施例 12 方法得到标题化合物， 收率 56.66%。 'H-NMR (400 MHz,CD ₃ OD) δ (ppm)： 0.87-0.91 (t, 3H) , 1.27-1.31 (m, 16H) , 1.57-1.61 (m, 2H) , 2.57-2.61 (t， 2H) , 2.88-2.90 (d, 2H) , 3.41-3.44 (m, 1H) , 3.48-3.50 (q, 1H) , 3.66-3.69 (q, 1H) , 7.17(s, 4H)。

实施例 18: (S)- 2-氨基- 3- (4-正十二烷基苯基)-丙- 1-醇盐 酸盐的制备

以（S) -2-乙酰氨基- 3- (4-正十二酰基苯基）-丙- 1-醇乙酸酯 为原料， 用实施例 12 方法得到标题化合物， 收率 70.58%。 'H-NMR (400 MHz,CD ₃ OD) δ (ppm)： 0.87-0.91 (t, 3H) , 1.27-1.31 (m, 18H) , 1.57-1.61 (m, 2H) , 2.57-2.60 (t， 2H) , 2.88-2.90 (d, 2H) , 3.42-3.45 (m, 1H) , 3.48-3.50 (q, 1H) , 3.66-3.70 (q, 1H) , 7.17(s, 4H)。

实施例 19: (S)- 3- (4-苄氧基 -苯基 )-2-叔丁氧基甲酰氨基- 丙 -1-醇的制备

于 500mL圆底烧瓶中 ,加入 16.0g (54.2腿 ol) (S) -3- (4 -羟基 苯基） -2-叔丁氧基甲酰氨基-丙- 1 -酸甲酯、 10.19g(59.6腿 ol)溴 化苄、 22.4g(162.6mmol)碳酸钟， 200mL 丙酮， 加热回流至原料 消失， 过滤， 用 50mL乙酸乙酯洗涤滤饼， 旋干， 乙酸乙酯重结晶 得到白色固体 16.90g, 收率 81.0%。

于 250mL三颈瓶中， 加入 0.34g(8.9mmol)四氢锂铝、 10mL 无水四氢呋喃， 加热到 滴加 4.26g(ll. lmmol)上述化合物 无水四氢呋喃溶液 40mL, 滴毕， 保温反应过夜， 緩慢倒入 lOOmL 的水水中， 分出有机层， 水层滴入 10%的硫酸至沉淀消失， 用乙 酸乙酯萃取 100mLx 3萃取， 合并， 用饱和氯化钠溶液洗涤一次， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 旋干， 用柱层析进行分离（石油醚：乙酸 乙酯 = 5: 1), 得到 3. lg白色固体， 收率 78.0%。 ¹ H-NMR(400 MHz, DMSO-^) δ (ppm)： 1.28-132 (s , 9H) , 2.47-2.51 (q , 1Η) , 2.71-2.75 (q, 1Η) , 3.24-3.34 (m, 2H) , 3.50 (m, 1H) , 4.66-4.69 (t, 1H) , 5.05 (s, 2H) , 6.56-6.58 (d, 1H) , 6.89-6.91 (d, J = 8.0Hz, 2H) , 6.89-6.91 (d, J = 8.0Hz, 2H) , 7.09-7.11 (d, J = 8.0Hz, 2H) , 7.32-7.429 (m, 5H)。 ESI— MS m/z (M+H+) 358.13。

化合物（S) -3- (4-苄氧基-苯基) -2-叔丁氧基甲酰氨基-丙- 1- 醇在三氟乙酸中回流， 即得到（S)- 3- (4-苄氧基 -苯基 )-2-氨基-丙 - 1 -醇三氟乙酸盐。

ESI-MS m/z (M+H ⁺ )371.16。

实施例 20: (S) -3- [4- (3,4-二氟-苄氧基) -苯基 ]-2 -氨基-丙 -1 -醇的制备

250mL的圆底烧瓶中，加入 7.15g (20腿 ol)实施例 19化合物、 7.63g (120腿 ol)甲酸铵、 0.72g钯碳、 200mL无水乙醇， 加热回 流 4. Oh, 过滤回收钯碳， 旋干得到 4.38g固体， 收率 82.0%。

于 lOOmL 圆底烧瓶中， 加入 0.89g(3.0腿 ol)上述化合物、 0.58g (3.6mmol) 3， 4 -二氟-氯化苄、 1.66g (12腿 ol)碳酸钾、 0. lg(0.6mmol)碘化钾， 50mL丙酮， 加热回流至原料消失， 过滤， 用 10mL乙酸乙酯洗涤滤饼， 旋干， 白色固体 1.12g, 收率 95.0%。 收率 60.0% ₀ ^-NMR (400 MHz, CD ₃ 0D) δ (ppm)： 2.56-2.61 (q, 1H) , 2.77-2.82 (q, 1H)， 3.44-3.52 (m, 2H) , 4.00-4.03 (m, 1H) , 4.92 (s, 2H) , 6.80-6.82 (d, J = 8.0Hz, 2H) , 7.03-7.05 (d, J = 8.0Hz, 2H) , 7.12— 7.27 (m, 3H)。

实施例 21: (S)- 3- [4- (2, 6-二氟-苄氧基)-苯基] -2-氨基-丙 -1 -醇的制备

以 2, 6-二氟氯化苄代替 3, 4-二氟氯化苄为原料， 用实施例 20 方法得到标题化合物， 收率 58.0%。 -腿（400 MHz, CD ₃ 0D) δ (ppm)： 2.67-2.72 (q, 1H) , 2.87-2.92 (q, 1H) , 3.54-3.62 (m, 2H) , 4.10-4.12 (m, 1H) , 5.08 (s, 2H) , 6.88-6.90 (d, J = 8.0Hz, 2H) , 6.98-7.05 (m , 2H) , 7.13-7.15 (d , J = 8.0Hz , 2H) , 7.38-7.44 (m, 1H)。

实施例 22: (S)- 2-乙酰氨基- 3- (4-氯乙酰基苯基）-丙- 1 -醇 乙酸酯的制备

将实施例 2化合物（9.4g, 40腿 ol)加入到 lOOmL 1， 2-二氯乙 烷中， 降温到 加入无水三氯化铝（17.07g， 128mmol) , 滴加 氯乙酰氯（5.42g, 48腿 ol) 1, 2-二氯乙烷 20mL, 加毕， 保温反应 4小时， 然后在室温下搅拌 2小时， 将反应液倒入碎水中， 振摇， 分液，水相用乙酸乙酯 lOOmLx 3提取，合并有机相，用水洗两次， 饱和氯化钠溶液洗涤一次， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 旋干， 得到 9.35g淡黄色固体，收率 73.0%„ ^-NMR (400 MHz, CDC1 ₃ ) δ (ppm)： 1.97(s, 3H) , 2.11 (s, 3H) , 2.87-2.98 (m, 2H) , 4.03-4.13 (m, 2H) , 4.47 (m, 1H) , 4.71 (s, 2H) , 5.70—5.73 (d, 1H) , 7.34-7.36 (d, J = 8.0Hz, 2H) , 7.90-7.92 (d, J = 8.0Hz, 2H)。

实施例 23: (S)- 2-氨基- 3- [4- (4-溴-苯氧基 -乙酰基） -苯 基] -丙 -1-醇的制备

lOOmL圆底烧瓶中， 加入 1.56g(5. Ommol)实施例 22化合物、 1.72g(6mmol)对溴苯酚、 2.07g (15mmol)碳酸鉀、 0. lg(0.5mmol) 碘化钾， 80mL丙酮， 加热回流 4h, 过滤， 用 10mL乙酸乙酯洗涤 滤饼， 旋干， 用柱层析进行分离（石油醚：乙酸乙酯 = 1: 3), 得到 1.77g白色固体， 收率 79.0%。

于 250mL 圆底烧瓶中， 加入 1.77g(4.0腿 ol)上述化合物、 1.68g (40mmol)氢氧化锂、 80mL 甲醇、 80mL 蒸馏水， 加热回流 7h, 冷却至室温， 旋甲醇， 水相用乙酸乙酯萃取 100mLx 3萃取， 合并， 用饱和氯化钠溶液洗涤一次， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 旋 干， 乙酸乙酯 /甲醇重结晶得到白色固体 0.93g, 收率 63.0%。 ^- MR (400 MHz, DMS0- ） δ (ppm)： 1.36 (s, 2H) , 2.48-2.51 (q, 1H) , 2.76-2.81 (q, 1H) , 2.89-2.92 (m, 1H)， 3.21-3.36 (m, 2H) , 4.66 (s， 1H)， 5.58 (s, 2H) , 6.93—6.96 (m， 2H) , 7.40-7.46 (m, 4H) , 7.92-7.94 (m, 2H)。

实施例 24: (S)- 3-[4- (4-曱氧基 -苄氧基)-苯基] - 2-氨基-丙- 1- 醇三氟乙酸盐的制备

实验步骤同实施例 19， 以化合物（S) -3- (4-羟基苯基） -2-叔丁 氧基甲酰氨基-丙 -1-酸甲酯和 1- (溴甲基) -4-甲氧基苯为原料， 反应得产物。 收率： 75.5%。

ESI-MS m/z (M+H ⁺ )401.14。

实施例 25: 采用 EGFP- S1P1-U20S细胞模型筛选本发明实施例 5 - 21和 23 - 24化合物

一、 材料与仪器：

1.1 仪器： IN Cell Analyzer 1000活细胞成像系统（美国 GE 公司） 1. 2 细胞株： 表达 EGFP-S1P1 融合蛋白的 U20S 细 (美国 Thermo公司 Biolmage子公司）

1. 3 试剂配制：

细胞培养液： 含 0. 5mg/ml G418和 10% FBS的 DMEM高糖培养 液

分析培养液： 含 l OmM HEPES、 0. 1%脱脂 BSA的 F12培养液 3 固定液： 12%甲醛溶液（ PBS配）

染色液： 含 Ι μ Μ Hoechs t 33342 (美国 Invi trogen公司 ) 的 PBS

1. 4 化合物的配制：

以含 4%。DMS0的分析培养液作为 4 X对照工作液， 终浓度 1% DMS0。

激动剂鞘氨醇 -1-磷酸 S1P(天然配体， Sigma, MW=379. 5, EC ₅ 。 ~ 25nM, 下文中有时简称为 S1P )用 1 OmM NaOH水溶液配成 3mM母液， 使用时用含 4%。DMS0 的分析培养液配成 4 χ工作液， 给予终浓度 10nM、 250nM和 1 μ Μ。

本发明实施例 5 - 21和 23 - 24化合物用 DMS0配成 30mM的母 液， 使用时用 DMS0倍比稀释成连续浓度梯度的 1000 X母液， 再用 分析培养液配成 4 工作液。 选用 100nM和 3 μ M两个终浓度，

二、 实验方法：

将稳定表达 EGFP-SlPi融合蛋白的 U20S细胞， 5% C0 ₂ 培 养于含 0. 5mg/ml G418和 10% FBS的 DMEM高糖培养液中。 按照细 胞 0. 8xl 0 ⁴ 个 /Ι ΟΟμΙ/孔种于 96孔黑色底透细胞培养板中， 37 5% C0 ₂ 培养 18- 24h。细胞用 200μ1/孔分析培养液洗一次，加入 150μ1/ 孔分析培养液， 37 5% C0 ₂ 孵育 60min。 配制激动剂和本发明实施 例 5 - 21和 23 - 24化合物工作液， 加入 50μ1/孔 4 激动剂或 4 x化合物或 4 x对照工作液， 37 5% C0 ₂ 孵育 60min, 化合物每个 浓度平行重复 3孔。加入室温预暖的 3 固定液 ΙΟΟμΙ/孔混匀 , 室 温孵育 20min。 细胞用染色液 200μ1/孔洗三次， 并留在 200μ1/孔 染色液中室温染色 lh。 细胞在 IN Cel l Analyzer 1000活细胞成 像系统上进行测定， 测定条件为： 20倍物镜， 激发波长 Ex=460nm， 发射波长 Em=535nm，曝光 300ms检测细胞核通道蓝色荧光；激发波 长 Ex=475nm, 发射波长 Em=535nm, 曝光 800ms检测细胞质通道绿 色荧光 EGFP,每孔 5个视野连续拍照。使用 GE公司 IN Cel l Analyzer 1000 Mul t i Target Analys is Module 软件分析细胞质中的颗粒形 成， 计算化合物激动 SlPi受体内吞的活性。

化合物激动强度= (化合物处理组平均每细胞所含颗粒的总面 积-对照处理组平均每细胞所含颗粒的总面积� � /对照处理组平均每 细胞所含颗粒的总面积。

2. 6 数据统计与分析：

在化合物每个受试浓度点平行测定的 3孔中，取 15个视野（每 孔 5个）数据的平均值， 计算激动强度。

三、 实验结果

EGFP-S1P1-U20S细胞为美国 Thermo公司用于筛选对 SlPi受体具有 影响的化合物的商品化细胞株， SlPi受体激活后内吞， 表现为绿色 荧光蛋白报告基因在胞质形成颗粒聚集。 因此， 对 S1P1受体具有 激动活性的化合物在此细胞株能够引起报告分 子 EGFP-S1P1的变 化。

采用 100nM和 3 μ Μ两个终浓度进行了筛选， 实验结果如表 1。 表 1

本发明实施例 15和 23的化合物具有明显激动活性。