LIN WENJING (CN)
YANG YOUQIANG (CN)
NIE SHUYU (CN)
| CN103333301A | 2013-10-02 | |||
| CN102702454A | 2012-10-03 | |||
| CN102702453A | 2012-10-03 |
ZHANG, WEIDONG ET AL.: "Sythesis and Aggregation Behaviors of Nonlinear Multiresponsive, Multihydrophilic Block Copolymers", MACROMOLECULES, vol. 44, 2011, pages 3366 - 3373
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| 权 利 要 求 书 1、 一种两亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物， 其特征在于具有公式 （1 ) 或公式 （2) 所示结构： x=17~53, y=10~41 , z=12~29。 2、 根据权利要求 1所述的两亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物， 其特征在于： 所述两 亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物的数均分子量为 30000~54000 g/moL 3、 一种根据权利要求 1或 2所述两亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物的制备方法， 其 特征在于包括以下具体步骤： ( 1 )制备聚己内酯大分子引发剂：将 ε-己内酯、辛酸亚锡及小分子引发剂混合， 110-140 °C下反应 24~48 h， 减压蒸馏、 沉淀、 过滤、 干燥， 得到聚己内酯大分子引发剂； (2) 制备两亲性 pH响应 4/6臂杂臂星型共聚物： 将步骤（1 )制备的聚己内酯大分子引 发剂、 甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、 六甲基三亚乙基四胺、 溴化铜溶于甲苯中， 搅拌后加入 辛酸亚锡， 60-90 °C下反应 5~12 h;再加入甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯连续聚合 5~12 h， 去除催化剂， 过滤， 滤液后处理， 得到两亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物。 4、 根据权利要求 3所述的两亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物的制备方法， 其特征在 小分子引发剂 2.35-13.43份 ε-己内酯 86.51-97.52 辛酸亚锡 0.06-0.13份； 步骤 （2) 中反应物的重量份数配方如下: 聚己内酯大分子引发剂 12.41-26.75份 溴化铜 0.04-0.08份 六甲基三亚乙基四胺 0.24-0.83份 辛酸亚锡 0.42~1.44份 甲基丙烯酸二乙氨基乙酯 17.72-31.03份 甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯 49.09-58.97份 所述甲苯的用量为每 1 g聚己内酯大分子引发剂使用 2〜4 mL甲苯。 5、 根据权利要求 3所述的两亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物的制备方法， 其特征在 于： 步骤（1 )所述的沉淀均指往旋转蒸发后溶液加入 10倍体积的 0 °C体积分数为 50 %的 甲醇水溶液进行沉淀； 步骤（2)所述的去除催化剂指将反应产物溶解于四氢呋喃后， 过中 性氧化铝层析柱， 四氢呋喃洗脱， 除去催化剂； 步骤（2)所述的滤液后处理指将滤液旋蒸 蒸发、 加入 10倍体积的正己烷中沉淀、 过滤、 干燥。 6、 根据权利要求 3所述的两亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物的制备方法， 其特征在 于： 当制备两亲性 pH响应 4杂臂星型共聚物时， 所述小分子引发剂指 2-溴异丁酸季戊四 醇二酯， 由以下方法制备得到： 将摩尔比为 1 :2:2的季戊四醇、 2-溴异丁酰溴、 三乙胺溶解 于四氢呋喃中， 在冰水浴中反应 4~6 h， 然后在室温下反应 16~30 h， 经旋转蒸发、 沉淀、 过滤、 干燥， 得到 2-溴异丁酸季戊四醇二酯； 当制备两亲性 pH响应 6杂臂星型共聚物时， 所述小分子引发剂指 2-溴异丁酸二季戊 四醇三酯， 由以下方法制备得到： 将摩尔比为 1 :3:3的二季戊四醇、 2-溴异丁酰溴、 三乙胺 溶解于四氢呋喃中， 在冰水浴中反应 4~6 h， 然后在室温下反应 16~30 h， 经旋转蒸发、 沉 淀、 过滤、 干燥， 得到 2-溴异丁酸二季戊四醇三酯。 7、 根据权利要求 6所述的两亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物的制备方法， 其特征在 于： 当制备两亲性 pH响应 4杂臂星型共聚物时， 所述四氢呋喃的用量为每 l g季戊四醇使 用 20~25 mL 四氢呋喃； 当制备两亲性 pH响应 6杂臂星型共聚物时，所述四氢呋喃的用量 为每 1 g二季戊四醇使用 10~15 mL四氢呋喃。 8、 根据权利要求 1或 2所述的两亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物在制备装载水难溶 性药物胶束系统中的应用。 9、 根据权利要求 8所述的两亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物在制备装载水难溶性药 物胶束系统中的应用， 其特征在于所述装载水难溶性药物胶束系统由以下方法制备得到： 将两亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物和水难溶性药物溶于有机溶剂中，室温下搅拌 4~6 h， 去离子水透析 24〜48 h， 冷冻干燥， 得到装载水难溶性药物胶束系统。 10、根据权利要求 9所述的两亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物在制备装载水难溶性药 物胶束系统中的应用，其特征在于： 所述的水难溶性药物指在 1 L水中溶解度小于或等于 1 g的药物； 所述的有机溶剂指二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的至少一种。 |
本发明属于生物医药用高分子聚合物材料技术 领域， 特别涉及一种两亲性 pH响应 4/6 杂臂星型共聚物及其制备方法。 背景技术
癌症是 21世纪三大疾病之一， 严重危害着人类的健康。 世界卫生组织的全球癌症报告 显示： 目前每年在全球夺去 700多万人的生命， 随着世界人口日趋老龄化， 预计全世界癌症 死亡人数还将快速上升， 到 2030年可能将超过 1310万。 由于癌症细胞的异质性、 多药耐药 性等， 癌药的治疗仍面临着巨大的挑战。 作为抗击癌症最重要的工具之一， 化疗对于癌症的 治疗起着非常重要的作用。理想的化疗药物应 该只对病变部位的癌细胞发挥作用， 而不会或 少对正常细胞产生毒副作用。 为了降低毒副作用， 提高药物的利用度， 减少药物的降解及损 失， 人们近年来大力开发各种药物载体体系。这些 药物载体体系能改变药物进入人体的方式 和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药 物输送到靶向器官。为了寻找合适的药物载体 ， 人们对各种载体体系如聚合物胶束、 水凝胶、 囊泡、 微球、 脂质体、 微乳液等进行了大量的 研究。 其中， 聚合物胶束以其特有优异性质而成为目前研究 的热点。
可生物降解两亲性聚合物在水溶液中通过自组 装形成核 /壳结构的胶束， 其作为抗癌药 物载体越来越受到各国研究者的普遍关注。 它具有以下优点： （1 )聚合物分子量大， 作为载 体使用时能使药物在病灶部位停留较长时间； 肿瘤部位的细胞透过性处于亢进状态， 抗癌药 物在血液循环中存在的时间越长， 进入肿瘤部位的机会就越多； （2)药物在聚合物胶束内能 通过扩散或聚合物自身的降解达到缓释或可控 释放的目的； （3 )可以把一些具有靶向作用或 控制药物释放的功能性组分通过化学键合的方 式结合到聚合物粒子表面； （4)可生物降解的 聚合物材料， 能够避免药物释放后载体材料在人体器官组织 内聚积和产生毒副作用。
星型聚合物是指一个核中至少引出三个聚合物 臂的聚合物。一般分为两大类： 一类为每 条臂均具有相同化学结构的星型聚合物（AB)， 每条臂上可能是均聚物、 共聚物或者三嵌段 共聚物； 另一类为至少两条臂化学结构不相同的杂臂星 型聚合物， 常见的有 A 2 B 2 、 A 3 B 3 、 A 2 B、 A 3 B、 ABC、 A 5 B、 AB 2 C 2 、 ABCD等。 星形聚合物其独特的化学结构使其具有一些特 殊的物理化学性能， 如流体力学半径小、 特性粘度低、 结晶度低、 易于形成稳定的胶束等， 将在更多的领域里得到广泛的应用。 因为具有与聚合物胶束相似的拓扑结构， 可提高胶束的 热力学稳定性， 星形聚合物非常适用于抗癌药物的控制释放。
作为树枝状聚合物的典型代表， 星形聚合物主要通过先核后臂法 （core-first) 或先臂后 核法 （arm-first) 方式合成。 先核后臂法需要先合成多功能引发剂， 合成的星型聚合物的臂 长一致且臂数确定， 可以精确控制聚合度。 先臂后核法需要先合成单官能活性线性大分子 ， 合成的星型聚合物的臂长一致但臂数难以确定 。
目前已报道的星形嵌段共聚物经自组装所形成 的聚集体的形态有球状、 管状、 囊泡状、 蠕虫状和复合状等，从而促进了星形嵌段共聚 物在诸多领域的潜在应用，如药物缓释、分离 、 光电材料和催化等。在药物缓释方面， Lang等（Journal of Colloid and Interface Science, 2011, 364: 92.) 采用直链聚乙二醇 -b-聚己内酯 （PEG-b-PCL) 和六臂星形聚己内酯 -b-聚甲基丙烯 酸二乙氨基乙酯 （S(PCL-b-PDEAEMA)) 制备了一种混合胶束， 有效提高胶束的稳定性。将 其包载硝苯地平后， 利用 PDEAEMA亲疏水性随 pH值的变化来控制硝苯地平的释放速率。 Cao等 （Biomacromolecules, 2011, 12(7): 2697. ) 制备了一种以聚丙交酯 （PLLA) 为内核， 聚乙二醇 （PEG) 为亲水外壳， 表面偶联叶酸的星形单分子胶束用于阿霉素的 靶向给药， 该 胶束在 pH 7.4 时释放速率很慢， 而在 pH 5.0 时释放速率明显加快。 专利申请 WO2003078489-A1公布了一种制备亲水性两嵌段、 三嵌段及星型聚合物的制备方法， 在惰 性气体保护下， 由至少一种乙烯单体、 大分子可降解性链转移剂及引发剂聚合制备而 得。专 利申请 200810107054.2公布了一种三臂星型共聚物 tri-arm P(NIPAAm-co-DMAEMA)及其自 组装胶束，利用外部的或体内固有的环境变化 实现对药物的控释。专利申请 200910024899.X 公布了一种星型嵌段酸敏性纳米胶束，它是由 笼型八聚硅倍半氧烷引发 D,L-丙交酯活性开环 聚合， 再与 Ν,Ν-二甲氨基乙基-甲基丙烯酸酯（DMAEMA)进行 ATRP反应所合成的， 通过 对温度和 pH敏感实现对药物的控释。 发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足， 本发明的首要目的在于提供一种两亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物。
该星型共聚物结构为： 以季戊四醇或二季戊四醇为核， 分别依次接上疏水性基团， pH 响应基团和亲水性基团形成两亲性 pH响应 4/6杂臂星形共聚物。
本发明另一目的在于提供一种上述星型聚合物 的制备方法。
该方法为先用酰化剂将季戊四醇（或二季戊四 醇）的两个或三个羟基进行酰化得到杂官 能团引发剂，然后进行己内酯的 ROP聚合，再采用连续聚合法依次进行 pH响应单体和亲水 大分子单体的 ARGET ATRP聚合制得两亲性 pH响应 4/6杂臂星形聚合物。
本发明再一目的在于提供上述星型聚合物在制 备装载水难溶性药物胶束系统中的应用。 采用透析法制备内层为疏水基团， 中间层为 pH响应基团、 外壳为亲水基团的纳米级聚 合物胶束， 并包裹抗癌药物。 这种纳米药物载体进入细胞后， 能利用肿瘤细胞内的酸性环境 促使其中间 pH响应层发生质子化， 从而实现药物在肿瘤细胞内的快速可控释放。 这种 pH 响应杂臂星形共聚物结构可以在维持高载药量 的前提下提高胶束的 pH响应灵敏度， 更有效 的控制药物释放， 提高药物的治疗效率。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种两亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物， 具有公式 （1 ) 或公式 （2) 所示结构：
Ri为:
R 2 为: x=17~53, y=10~41 , z=12~29。
所述两亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物的数均分子量为 30000~54000 g/moL 所述两亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物的制备方法， 包括以下具体步骤：
( 1 )制备聚己内酯大分子引发剂：将 ε-己内酯、辛酸亚锡及小分子引发剂混合， 110〜140 °C下反应 24~48 h， 减压蒸馏、 沉淀、 过滤、 干燥， 得到聚己内酯大分子引发剂；
(2)制备两亲性 pH响应 4/6臂杂臂星型共聚物： 将步骤 （1 ) 制备的聚己内酯大分子引 发剂、 甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、 六甲基三亚乙基四胺、 溴化铜溶于甲苯中， 搅拌后加入 辛酸亚锡， 60~90 °C下反应 5~12 h ; 再加入甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯连续聚 合 5~12 h， 去除催化剂， 过滤， 滤液后处理， 得到两亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物。
所述步骤 （1 ) 中反应物的重量份数配方如下：
小分子引发剂 2.35-13.43份
ε-己内酯 86.51-97.52
辛酸亚锡 0.06-0.13份；
所述步骤 （2) 中反应物的重量份数配方如下：
聚己内酯大分子引发剂 12.41-26.75份
溴化铜 0.04-0.08份
六甲基三亚乙基四胺 0.24-0.83份
辛酸亚锡 0.42~1.44份
甲基丙烯酸二乙氨基乙酯 17.72-31.03份
甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯 49.09-58.97份
所述甲苯的用量为每 1 g聚己内酯大分子引发剂使用 2〜4 mL甲苯。
步骤 （1 ) 所述的沉淀均指往旋转蒸发后溶液加入 10倍体积的 0 °C体积分数为 50 %的 甲醇水溶液进行沉淀。
步骤 （2) 所述的去除催化剂指将反应产物溶解于四氢呋 喃后， 过中性氧化铝层析柱， 四氢呋喃洗脱， 除去催化剂。
步骤（2)所述的滤液后处理指将滤液旋蒸蒸发 加入 10倍体积的正己烷中沉淀、过滤、 干燥。
当制备两亲性 pH响应 4杂臂星型共聚物时， 所述小分子引发剂指 2-溴异丁酸季戊四醇 二酯， 由以下方法制备得到： 将摩尔比为 1:2:2的季戊四醇、 2-溴异丁酰溴、 三乙胺溶解于 四氢呋喃 （THF) 中， 在冰水浴中反应 4~6 h， 然后在室温下反应 16~30 h， 经旋转蒸发、沉 淀、 过滤、 干燥， 得到 2-溴异丁酸季戊四醇二酯。
所述四氢呋喃的用量为每 1 g季戊四醇使用 20~25 mL THF。
当制备两亲性 pH响应 6杂臂星型共聚物时， 所述小分子引发剂指 2-溴异丁酸二季戊四 醇三酯， 由以下方法制备得到： 将摩尔比为 1:3:3的二季戊四醇、 2-溴异丁酰溴、 三乙胺溶 解于 THF中， 在冰水浴中反应 4~6 h， 然后在室温下反应 16~30 h， 经旋转蒸发、 沉淀、 过 滤、 干燥， 得到 2-溴异丁酸二季戊四醇三酯。
所述 THF的用量为每 1 g二季戊四醇使用 10~15 mL THF。
上述两亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物在制备装载水难溶性药物胶 束系统中的应用。 所述装载水难溶性药物胶束系统由以下方法制 备得到： 将两亲性 pH响应 4/6杂臂星型 共聚物和水难溶性药物溶于有机溶剂中， 室温下搅拌 4~6 h， 去离子水透析 24~48 h， 冷冻干 燥， 得到装载水难溶性药物胶束系统。
所述的水难溶性药物指在 1 L水中溶解度小于或等于 1 g的药物。
所述的有机溶剂指二甲基甲酰胺和二甲基亚砜 中的至少一种。
所述的装载水难溶性药物胶束系统可控制装载 的药物在正常组织（pH 7.4)时缓慢释放， 在肿瘤细胞弱酸性条件 （pH 5~6) 下快速可控释放。
本发明的机理为：
本发明公开的两亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物是性能优异、 具有 pH敏感性的载药 材料。 聚己内酯 （PCL) 作为胶束的疏水内核， 用于增溶难溶性抗癌药物。 聚合得到的聚甲 基丙烯酸二乙氨基乙酯结构 （PDEAEMA) 为 pH响应中间层， 在生理 pH ( 7.4) 下是疏水 状态， 收缩在 PCL表面共同作为内核， 可以有效防止药物突释现象； 在肿瘤组织弱酸性条 件下侧链的氨基发生质子化作用带正电， 易与带负电的细胞膜发生吸附作用， 进而被胞吞到 细胞内； 进入溶酶体的强酸性环境后， 进一步质子化， 胶束发生溶胀， 将药物释放到细胞质 和细胞核中。 PPEGMA作为亲水外层， 有利于提高胶束壳层密度， 增强胶束表面的亲水性、 抗蛋白和血小板吸附能力， 提高胶束的稳定性， 从而延长胶束在体内的循环时间， 改善胶束 载药体系的控释性能。 可通过调节聚合物分子材料中各基团的含量来 调控药物的释放速率， 满足不同药物的释放要求。 本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益 效果：
( 1 )本发明的制备方法操作简单， 反应条件温和， 易于调控两亲性 pH响应 4/6杂臂星 型共聚物的臂长， 分子量在较宽的范围内可调。
(2)本发明制备得到的两亲性 pH响应 4/6杂臂星型共聚物应用于制备装载水难溶性药 物胶束系统， 可满足不同药物的释放要求。 附图说明
图 1为实施例 1中 (PCL) 2 (PDEAEMA-b-PPEGMA) 2 的 GPC洗脱曲线。
图 2为实施例 1中 (PCL) 2 (PDEAEMA-b-PPEGMA)2的 NMR谱， 溶剂为 d-CDC13。 图 3为实施例 4中 (PCL) 3 (PDEAEMA-b-PPEGMA)3的 GPC洗脱曲线。
图 4为实施例 4中 (PCL) 3 (PDEAEMA-b-PPEGMA)3的 NMR谱， 溶剂为 d-CDC13。 图 5为实施例 8中 CPCL) 3 CPDEAEMA-b-PPEGMA) 3 的临界胶束浓度测试曲线。
图 6为实施例 9中 (PCL) 3 (PDEAEMA-b-PPEGMA) 3 载药胶束的扫描电镜 （SEM) 图。 图 7为实施例 10中 (PCL) 2 (PDEAEMA-b-PPEGMA)2 (实施例 2产物） 载阿霉素胶束的 体外释放曲线。
图 8为实施 10中 (PCL) 3 (PDEAEMA-b-PPEGMA) 3 (实施例 4产物） 载阿霉素胶束的体 外释放曲线。
图 9为实施 11中 CPCL) 3 CPDEAEMA-b-PPEGMA) 3 空白胶束的体外细胞毒性。
图 10为实施 11中（PCL) 2 (PDEAEMA-b-PPEGMA)2和 (PCL) 3 - (PDEAEMA-b-PPEGMA) 3 载阿霉素胶束的体外细胞毒性。 具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细 的描述， 但本发明的实施方式不限于此。 实施例 1 : 两亲性 pH响应 4杂臂星型共聚物的制备
( 1 )小分子引发剂 2-溴异丁酸季戊四醇二酯的制备： 于 250 mL三口烧瓶中称取 6.08 g ( 0.05 mol) 季戊四醇 （Alfa-Aesar)， 加入 150 mL无水 THF， 通氩气 lO min除氧。 密封烧 瓶后， 注入 10.12 g ( 0.1 mol) 三乙胺 （TEA， AR， 江苏永华）。 0 °C冰水浴中， 逐滴注入 22.98 g ( 0.1 mol) 2-溴异丁酰溴 （ Alfa-Aesar)， 搅拌反应 4 h， 再在室温 25 °C下搅拌反应 30 ho 将反应液转入分液漏斗中， 加入 300 mL乙醚， 并依次用 200 mL水、 200 mL0.5 M的 碳酸氢钠溶液和 200 mL水萃取， 有机相用无水硫酸镁干燥后过滤， 溶液旋蒸得到白色固体 (产率为 56 %)， 乙醚重结晶两次后在 40 °C、 35 mb真空干燥 24 h，合成反应式见公式（3 )， 得到 2-溴异丁酸季戊四醇二酯。
(2) 聚己内酯大分子引发剂 ((PLC) 2 -Br 2 ) 的制备： 将 0.43 g步骤 ( 1 ) 制备得到的 2- 溴异丁酸季戊四醇二酯加入烧瓶中， 橡皮塞密封， 抽真空-通氩气 3次， 氩气保护下加入 6 g ε-己内酯 （ε-CL, Sigma-Aldrich) 和 0.01 g辛酸亚锡 （Sn(Oct) 2 ， 国药集团）， 用液氮进行三 次冷冻-抽气-升温循环后， 在氩气保护下置于 130 °C油浴中反应 24 h后用液氮终止反应。减 压蒸馏后， 用 50 mL THF溶解， 加入 500 mL体积分数为 50 %的冷甲醇水溶液， 沉淀后过 滤， 产物在 40 °C、 35 mb真空干燥 24 h， 得到白色粉末， 合成反应式见公式 （4)。 产率为 83 %， „=5007, PDI=1.49。
(3 )两亲性 pH响应 4杂臂星型共聚物（CPCL) 2 CPDEAEMA-b-PPEGMA) 2 ) 的制备： 取 4.8 g步骤 （2) 制备得到的 (PLC) 2 -Br 2 、 溴化铜 （CuBr 2 ， 上海新宝） 于茄形瓶中， 密封， 抽真空-通氩气 3次， 依次将 18 mL甲苯、 单体甲基丙烯酸二乙氨基乙酯 （DEAEMA, TCI-EP)、配体六甲基三亚乙基四胺（HMTETA, Sigma-Aldrich)注入反应瓶中，搅拌 lO min 使催化剂配合物 Cu/HMTETA形成。 将 Sn(Oct) 2 (0.26 g) 溶于 2 mL甲苯中， 注入反应瓶。 搅拌 5 min后转入 70 °C油浴中反应 7 h ; 再注入甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯（PEGMA „=475, Sigma-Aldrich)进行连续聚合， 反应 7 h后， 冷却至室温， 加入 50 mL THF并搅拌 溶解， 过中性氧化铝柱子， 去除催化剂， 得到反应液浓缩至约 50 mL后加入到 500 mL正己 烷中沉淀， 过滤。 产物在 40 °C、 35 mb真空干燥 24 h， 得到白色粉末， 合成反应式见公式
(5 )， 利用 GPC测定其分子量， 并进行核磁分析， 见图 1和图 2。产率为 93 %， „=28200, PDI=1.28。
其中， 各反应物的重量份数配方如下：
(PCL) 2 -Br 2 19.65份
CuBr 2 0.06份
HMTETA 0.61份
Sn(Oct) 2 1.06份
DEAEMA 19.65份 PEGMA 58.96份
公式 (3 )
公式 （4)
公式 (5 ) 实施例 2: 两亲性 pH响应 4杂臂星型共聚物的制备
( 1 )小分子引发剂 2-溴异丁酸季戊四醇二酯的制备： 于 250 mL三口烧瓶中称取 6.08 g ( 0.05 mol) 季戊四醇 （Alfa-Aesar)， 加入 150 mL无水 THF， 通氩气 lO min除氧。 密封烧 瓶后， 注入 10.12 g (0.1 mol) TEA (AR， 江苏永华）。 0 °C冰水浴中， 逐滴注入 22.98 g (0.1 mol) 2-溴异丁酰溴 （Alfa-Aesar)， 搅拌反应 6 h， 再在室温 25 °C下搅拌反应 16 h。 将反应 液转入分液漏斗中， 加入 300 mL乙醚， 并依次用 200 mL水、 200 mL0.5 M的碳酸氢钠溶液 和 200 mL水萃取，有机相用无水硫酸镁干燥后过滤， 液旋蒸得到白色固体（产率为 56 % )， 乙醚重结晶两次后在 40 °C、 35 mb真空干燥 24 h， 得到 2-溴异丁酸季戊四醇二酯。
(2) (PCL) 2 -Br 2 的制备： 将 0.6 g步骤 （1 ) 制备得到的 2-溴异丁酸季戊四醇二酯加入 烧瓶中，橡皮塞密封，抽真空-通氩气 3次，氩气保护下加入 9 g ε-CL ( Sigma- Aldrich)和 0.01 g Sn(Oct) 2 (国药集团）， 用液氮进行三次冷冻-抽气-升温循环后， 在氩气保护下置于 140 °C 油浴中反应 24 h后用液氮终止反应。减压蒸馏后， 用 50 mL THF溶解， 加入 500 mL体积分 数为 50 %的冷甲醇水溶液， 沉淀后过滤， 产物在 40 °C、 35 mb真空干燥 24 h， 得到白色粉 末。 产率为 96 %， „=8633, PDI=1.53。
(3 )两亲性 pH响应 4杂臂星型共聚物（CPCL) 2 CPDEAEMA-b-PPEGMA) 2 ) 的制备： 取 7.2 g步骤 （2) 制备得到的 (PLC) 2 -Br 2 、 CuBr 2 (上海新宝） 于茄形瓶中， 密封， 抽真空-通 氩气 3次， 依次将 18 mL甲苯、单体 DEAEMA (TCI-EP)、配体 HMTETA ( Sigma- Aldrich) 注入反应瓶中， 搅拌 lO min使催化剂配合物 Cu/HMTETA形成。 将 Sn(Oct) 2 (0.32 g) 溶于 2 mL甲苯中，注入反应瓶。搅拌 5 min后转入 60 °C油浴中反应 5 h;再注入 PEGMA(M n =475， Sigma- Aldrich) 进行连续聚合， 反应 12 h后， 冷却至室温， 加入 50 mL THF并搅拌溶解， 过中性氧化铝柱子， 去除催化剂， 得到反应液浓缩至约 50 mL后加入到 500 mL正己烷中沉 淀， 过滤。 产物在 40 °C、 35 mb真空干燥 24 h， 得到白色粉末。 产率为 98 %， „=28524, PDI=1.43。
其中， 各反应物的重量份数配方如下：
(PCL) 2 -Br 2 23.05份
CuBr 2 0.05份
HMTETA 0.29份
Sn(Oct) 2 1.04份
DEAEMA 19.21份
PEGMA 56.36份。 实施例 3: 两亲性 pH响应 4杂臂星型共聚物的制备
( 1 )小分子引发剂 2-溴异丁酸季戊四醇二酯的制备： 于 250 mL三口烧瓶中称取 6.08 g ( 0.05 mol) 季戊四醇 （Alfa-Aesar)， 加入 150 mL无水 THF， 通氩气 10 min除氧。 密封烧 瓶后， 注入 10.12 g (0.1 mol) TEA (AR， 江苏永华）。 0 °C冰水浴中， 逐滴注入 22.98 g (0.1 mol) 2-溴异丁酰溴 （Alfa-Aesar)， 搅拌反应 5 h， 再在室温 25 °C下搅拌反应 24 h。 将反应 液转入分液漏斗中， 加入 300 mL乙醚， 并依次用 200 mL水、 200 mL0.5 M的碳酸氢钠溶液 和 200 mL水萃取，有机相用无水硫酸镁干燥后过滤， 液旋蒸得到白色固体（产率为 56 %)， 乙醚重结晶两次后在 40 °C、 35 mb真空干燥 24 h， 得到 2-溴异丁酸季戊四醇二酯。
(2) (PCL) 2 -Br 2 的制备： 将 0.29 g步骤 （1 ) 制备得到的 2-溴异丁酸季戊四醇二酯加入 烧瓶中，橡皮塞密封，抽真空-通氩气 3次，氩气保护下加入 6 g ε-CL ( Sigma- Aldrich)和 0.01 g Sn(Oct) 2 (国药集团）， 用液氮进行三次冷冻-抽气-升温循环后， 在氩气保护下置于 120 °C 油浴中反应 48 h后用液氮终止反应。减压蒸馏后， 用 50 mL THF溶解， 加入 500 mL体积分 数为 50 %的冷甲醇水溶液， 沉淀后过滤， 产物在 40 °C、 35 mb真空干燥 24 h， 得到白色粉 末。 产率为 96 %， „=5741 , PDI= 1.38 ο
(3 )两亲性 ρΗ响应 4杂臂星型共聚物（CPCL) 2 CPDEAEMA-b-PPEGMA) 2 ) 的制备： 取 4.8 g步骤 （2) 制备得到的 (PLC) 2 -Br 2 、 CuBr 2 (上海新宝） 于茄形瓶中， 密封， 抽真空-通 氩气 3次，依次将 18 mL无水甲苯、单体 DEAEMA (TCI-EP)、配体 HMTETA( Sigma- Aldrich) 注入反应瓶中， 搅拌 lO min使催化剂配合物 Cu/HMTETA形成。 将 Sn( ct) 2 (0.16 g) 溶于 2 mL甲苯中，注入反应瓶。搅拌 5 min后转入 90 °C油浴中反应 10 h;再注入 PEGMA(M n =475， Sigma- Aldrich) 进行连续聚合， 反应 8 h后， 冷却至室温， 加入 50 mL THF并搅拌溶解，过 中性氧化铝柱子，去除催化剂，得到反应液浓 缩至约 50 mL后加入到 500 mL 正己烷中沉淀， 过滤。产物在 40 °C、35 mb真空干燥 24 h，得到白色粉末。产率为 76 %, „=40470, PDI=1.37。
其中， 各反应物的重量份数配方如下：
(PCL) 2 -Br 2 12.41份
CuBr 2 0.04份
HMTETA 0.24份
Sn(Oct) 2 0.42份
DEAEMA 31.03份
PEGMA 55.86份。 实施例 4: 两亲性 pH响应 6杂臂星型共聚物的制备
( 1 )小分子引发剂 2-溴异丁酸二季戊四醇三酯的制备：于 250 mL三口烧瓶中称取 12.72 g (0.05 mol)二季戊四醇 （Alfa-Aesar)， 加入 150 mL无水 THF， 通氩气 10 min除氧。 密封 烧瓶后， 注入 15.17 g (0.15 mol) TEA (AR， 江苏永华）。 0 °C冰水浴中， 逐滴注入 34.48 g
( 0.15 mol) 2-溴异丁酰溴 （Alfa-Aesar)， 搅拌反应 4 h， 再在室温 25 °C下搅拌反应 30 h。 将反应液转入分液漏斗中， 加入 300 mL乙醚， 并依次用 200 mL水、 200 mL0.5 M的碳酸氢 钠溶液和 200 mL水萃取， 有机相用无水硫酸镁干燥后过滤， 溶液旋蒸得到白色固体 （产率 为 43 %)， 乙醚重结晶两次后在 40 °C、 35 mb真空干燥 24 h， 得到 2-溴异丁酸二季戊四醇 三酯。
(2) (PCL) 3 -Br 3 的制备： 将 0.93 g步骤 （1 ) 制备得到的 2-溴异丁酸二季戊四醇三酯加 入烧瓶中， 橡皮塞密封， 抽真空-通氩气 3次， 氩气保护下加入 6 g ε-CL (Sigma-Aldrich)和 0.01 g Sn(O C t) 2 (国药集团）， 用液氮进行三次冷冻-抽气-升温循环后， 在氩气保护下置于 130 °C油浴中反应 24 h后用液氮终止反应。减压蒸馏后， 用 50 mL THF溶解， 加入 500 mL体积 分数为 50 %的冷甲醇水溶液， 沉淀后过滤， 产物在 40 °C、 35 mb真空干燥 24 h， 得到白色 粉末。 产率为 100 %， „=6090, PDI= 1.28ο
(3 )两亲性 ρΗ响应 6杂臂星型共聚物（(PCL) 3 (PDEAEMA-b-PPEGMA) 3 ) 的制备： 取 4.8 g步骤 （2) 制备得到的 (PLC) 3 -Br 3 、 CuBr 2 (上海新宝） 于茄形瓶中， 密封， 抽真空-通 氩气 3 次， 依次将 18 mL无水甲苯、 单体 DEAEMA ( TCI-EP )、 配体 HMTETA
( Sigma-Aldrich)注入反应瓶中，搅拌 10 min使催化剂配合物 Cu/HMTETA形成。将 Sn(Oct) 2 ( 0.26 g) 溶于 2 mL甲苯中， 注入反应瓶。 搅拌 5 min后转入 80 °C油浴中反应 8 h; 再注 入 PEGMA (M n =475， Sigma-Aldrich)进行连续聚合， 反应 6 h后， 冷却至室温， 加入 50 mL THF并搅拌溶解， 过中性氧化铝柱子， 去除催化剂， 得到反应液浓缩至约 50 mL后加入到 500 mL 正己烷中沉淀， 过滤。 产物在 40 °C、 35 mb真空干燥 24 h， 得到白色粉末， 利用 GPC测定其分子量， 并进行核磁分析， 见图 3和图 4。 产率为 67 %， „=23100, PDI=1.31。
其中， 各反应物的重量份数配方如下：
(PCL) 3 -Br 3 26.75份
CuBr 2 0.08份
HMTETA 0.82份
Sn(Oct) 2 1.44份
DEAEMA 17.72份
PEGMA 53.17份。 实施例 5: 两亲性 pH响应 6杂臂星型共聚物的制备
( 1 )小分子引发剂 2-溴异丁酸二季戊四醇三酯的制备：于 250 mL三口烧瓶中称取 12.72 g (0.05 mol)二季戊四醇 （Alfa-Aesar)， 加入 150 mL无水 THF， 通氩气 10 min除氧。 密封 烧瓶后， 注入 15.17 g (0.15 mol) TEA (AR， 江苏永华）。 0 °C冰水浴中， 逐滴注入 34.48 g (0.15 mol) 2-溴异丁酰溴 （Alfa-Aesar)， 搅拌反应 6 h， 再在室温 25°C下搅拌反应 16 h。将 反应液转入分液漏斗中， 加入 300 mL乙醚， 并依次用 200 mL水、 200 mL0.5 M的碳酸氢钠 溶液和 200 mL水萃取， 有机相用无水硫酸镁干燥后过滤， 溶液旋蒸得到白色固体 （产率为 43 %), 乙醚重结晶两次后在 40 °C、 35 mb真空干燥 24 h， 得到 2-溴异丁酸二季戊四醇三 酯。
(2) (PCL) 3 -Br 3 的制备： 将 0.93 g步骤 （1 ) 制备得到的 2-溴异丁酸二季戊四醇三酯加 入烧瓶中， 橡皮塞密封， 抽真空-通氩气 3次， 氩气保护下加入 12 g s-CL ( Sigma-Aldrich) 和 0.01 g Sn(O C t) 2 (国药集团）， 用液氮进行三次冷冻-抽气-升温循环后， 在氩气保护下置于 110 °C油浴中反应 48 h后用液氮终止反应。 减压蒸馏后， 用 50 mL THF溶解， 加入 500 mL 体积分数为 50 %的冷甲醇水溶液， 沉淀后过滤， 产物在 40 °C、 35 mb真空干燥 24 h， 得到 白色粉末。 产率为 92 %， „=11031 , PDI= 1.36 ο
(3 )两亲性 ρΗ响应 6杂臂星型共聚物（(PCL) 3 (PDEAEMA-b-PPEGMA) 3 ) 的制备： 取 6.36 g步骤 （2) 制备得到的 (PLC) 3 -Br 3 、 CuBr 2 (上海新宝） 于茄形瓶中， 密封， 抽真空- 通氩气 3次， 依次将 18 mL无水甲苯、 单体 DEAEMA ( TCI-EP )、 配体 HMTETA
( Sigma-Aldrich)注入反应瓶中，搅拌 10 min使催化剂配合物 Cu/HMTETA形成。将 Sn(Oct) 2 (0.16 g) 溶于 2 mL甲苯中， 注入反应瓶。 搅拌 5 min后转入 60 °C油浴中反应 12 h ; 再注 入 PEGMA (M n =475， Sigma-Aldrich)进行连续聚合， 反应 5 h后， 冷却至室温， 加入 50 mL THF并搅拌溶解， 过中性氧化铝柱子， 去除催化剂， 得到反应液浓缩至约 50 mL后加入到 500 mL 正己烷中沉淀， 过滤。 产物在 40 °C、 35 mb真空干燥 24 h， 得到白色粉末。 产率为 81 %， „=39270, PDI=1.43。
其中， 各反应物的重量份数配方如下：
(PCL) 3 -Br 3 24.72份
CuBr 2 0.06份
HMTETA 0.36份
Sn(Oct) 2 0.63份
DEAEMA 18.66份
PEGMA 55.58份。 实施例 6: 两亲性 pH响应 6杂臂星型共聚物的制备
( 1 )小分子引发剂 2-溴异丁酸二季戊四醇三酯的制备：于 250 mL三口烧瓶中称取 12.72 g (0.05 mol)二季戊四醇 （Alfa-Aesar)， 加入 150 mL无水 THF， 通氩气 lOmin除氧。 密封 烧瓶后， 注入 15.17 g (0.15 mol) TEA (AR， 江苏永华）。 0 °C冰水浴中， 逐滴注入 34.48 g
(0.15 mol) 2-溴异丁酰溴 （Alfa-Aesar)， 搅拌反应 5 h， 再在室温 25 °C下搅拌反应 24h。 将反应液转入分液漏斗中， 加入 300 mL乙醚， 并依次用 200 mL水、 200 mL0.5 M的碳酸氢 钠溶液和 200 mL水萃取， 有机相用无水硫酸镁干燥后过滤， 溶液旋蒸得到白色固体 （产率 为 43%)， 乙醚重结晶两次后在 40 °C、 35mb真空干燥 24h， 得到 2-溴异丁酸二季戊四醇 三酯。
(2) (PCL) 3 -Br 3 的制备： 将 0.07 g步骤 （1) 制备得到的 2-溴异丁酸二季戊四醇三酯加 入烧瓶中， 橡皮塞密封， 抽真空-通氩气 3次， 氩气保护下加入 12gs-CL (Sigma-Aldrich) 和 0.01gSn(O C t) 2 (国药集团）， 用液氮进行三次冷冻-抽气-升温循环后， 在氩气保护下置于 130 °C油浴中反应 36 h后用液氮终止反应。 减压蒸馏后， 用 50mLTHF溶解， 加入 500 mL 体积分数为 50%的冷甲醇水溶液， 沉淀后过滤， 产物在 40 °C、 35mb真空干燥 24h， 得到 白色粉末。 产率为 88%， „=10500, PDI= 1.45ο
(3)两亲性 pH响应 6杂臂星型共聚物（(PCL) 3 (PDEAEMA-b-PPEGMA) 3 ) 的制备： 取 6.36 g步骤 （2) 制备得到的 (PLC) 3 -Br 3 、 CuBr 2 (上海新宝） 于茄形瓶中， 密封， 抽真空- 通氩气 3次， 依次将 18 mL无水甲苯、 单体 DEAEMA ( TCI-EP )、 配体 HMTETA
(Sigma-Aldrich)注入反应瓶中，搅拌 10 min使催化剂配合物 Cu/HMTETA形成。将 Sn(Oct) 2 (0.32 g) 溶于 2 mL甲苯中， 注入反应瓶。 搅拌 5 min后转入 90 °C油浴中反应 5h ; 再注 入 PEGMA ( „=475, Sigma-Aldrich)进行连续聚合， 反应 12 h后，冷却至室温，加入 50 mL THF并搅拌溶解， 过中性氧化铝柱子， 去除催化剂， 得到反应液浓缩至约 50 mL后加入到 500 mL 正己烷中沉淀， 过滤。 产物在 40 °C、 35 mb真空干燥 24 h， 得到白色粉末。 产率为 45%， „=33410, PDI=1.45。
其中， 各反应物的重量份数配方如下：
(PCL) 3 -Br 3 23.15份
CuBr 2 0.05份 HMTETA 0.42份
Sn(Oct) 2 1.18份
DEAEMA 23.15份
PEGMA 52.05份。 实施例 7: 两亲性 pH响应 6杂臂星型共聚物的制备
( 1 )小分子引发剂 2-溴异丁酸二季戊四醇三酯的制备：于 250 mL三口烧瓶中称取 12.72 g (0.05 mol)二季戊四醇 （Alfa-Aesar)， 加入 150 mL无水 THF， 通氩气 lO min除氧。 密封 烧瓶后， 注入 15.17 g (0.15 mol) TEA (AR， 江苏永华）。 0 °C冰水浴中， 逐滴注入 34.48 g
( 0.15 mol) 2-溴异丁酰溴 （Alfa-Aesar)， 搅拌反应 5 h， 再在室温 25 °C下搅拌反应 24 h。 将反应液转入分液漏斗中， 加入 300 mL乙醚， 并依次用 200 mL水、 200 mL0.5 M的碳酸氢 钠溶液和 200 mL水萃取， 有机相用无水硫酸镁干燥后过滤， 溶液旋蒸得到白色固体 （产率 为 43 %)， 乙醚重结晶两次后在 40 V、 35 mb真空干燥 24 h， 得到 2-溴异丁酸二季戊四醇 三酯。
(2) (PCL) 3 -Br 3 的制备： 将 0.29 g步骤 （1 ) 制备得到的 2-溴异丁酸二季戊四醇三酯加 入烧瓶中， 橡皮塞密封， 抽真空-通氩气 3次， 氩气保护下加入 12 g s-CL ( Sigma-Aldrich) 和 0.02 g Sn(O C t) 2 (国药集团）， 用液氮进行三次冷冻-抽气-升温循环后， 在氩气保护下置于 120 °C油浴中反应 48 h后用液氮终止反应。 减压蒸馏后， 用 50 mL THF溶解， 加入 500 mL 体积分数为 50 %的冷甲醇水溶液， 沉淀后过滤， 产物在 40 °C、 35 mb真空干燥 24 h， 得到 白色粉末。 产率为 86 %， „=10376, PDI=1.59。
(3 )两亲性 pH响应 6杂臂星型共聚物（(PCL) 3 (PDEAEMA-b-PPEGMA)3 ) 的制备： 取 6.36 g步骤 （2) 制备得到的 (PLC) 3 -Br 3 、 CuBr 2 (上海新宝） 于茄形瓶中， 密封， 抽真空- 通氩气 3次， 依次将 18 mL无水甲苯、 单体 DEAEMA ( TCI-EP )、 配体 HMTETA
( Sigma-Aldrich)注入反应瓶中，搅拌 10 min使催化剂配合物 Cu/HMTETA形成。将 Sn(Oct) 2 ( 0.32 g) 溶于 2 mL甲苯中， 注入反应瓶。 搅拌 5 min后转入 80 °C油浴中反应 7 h; 再注 入 PEGMA (M n =475， Sigma-Aldrich))进行连续聚合， 反应 12 h后， 冷却至室温， 加入 50 mL THF并搅拌溶解， 过中性氧化铝柱子， 去除催化剂， 得到反应液浓缩至约 50 mL后加入 到 500 mL 正己烷中沉淀， 过滤。 产物在 40 °C、 35 mb真空干燥 24 h， 得到白色粉末。 产 率为 55 %， „=37295, PDI=1.59。
其中， 各反应物的重量份数配方如下:
(PCL) 3 -Br 3 21.83份
CuBr 2 0.05份
HMTETA 0.63份
DEAEMA 27.29份
PEGMA 49.09份。 实施例 8: 两亲性 pH响应 6杂臂星型共聚物的临近胶束浓度
利用荧光探针法测试实施例 4制备得到的两亲性 pH响应 6杂臂星型共聚物 (PCL) 3 -(PDEAEMA-b-PPEGMA) 3 的临近胶束浓度。
( 1 )芘溶液的配置：用丙酮溶解芘（Sigma-Aldrich)， 配置浓度为 12 X 10- 5 M的芘溶液。
(2) 样品溶液的配置： 称取 10 mg (PCL) 3 (PDEAEMA-b-PPEGMA) 3 溶于 5 mL丙酮中， 逐滴加入到 100 mL去离子水中，挥发丙酮后得到 0.1 mg/mL的溶液，稀释成一系列浓度（浓 度范围为 0.0001-0.1 mg/mL ) 0 取 20支 10 mL容量瓶， 分别加入 0.1 mL步骤（1 )配置的芘 溶液， 然后分别加上上述不同浓度的共聚物溶液定容 ， 摇匀， 得到样品溶液。 样品溶液中芘 的浓度为 12 X 10- 7 M o
(3 ) 荧光光谱测试： 以 373 nm作为发射波长， 测试样品溶液在 300~350 nm的激发光 谱， 取波长为 339 nm和 336 nm的强度比值 （/ 339 // 336 ) 对浓度对数 logC作图， 见图 5， 曲 线转折点即为临界胶束浓度值。 测得实施例 4制备得到的 (PCL) 3 — (PDEAEMA-b-PPEGMA) 3 的临近胶束浓度为 3.4 mg/L。 实施例 9: 两亲性 pH响应 6杂臂星型共聚物载药胶束的制备
采用透析法制备载药胶束： 称取 20 mg阿霉素 （DOX， 北京华奉联博） 溶于 20 mL二 甲基甲酰胺 （DMF) 中， 加入 2倍摩尔量的 TEA 20 μί， 搅拌 12 h。 称取 40 mg实施例 4制 备得到的两亲性 pH响应 6杂臂星型共聚物 （PCL) 3 (PDEAEMA-b-PPEGMA) 3 溶于 20 mL二 甲基亚砜 （DMSO) 中， 将两种溶液混合， 搅拌 4 h， 去离子水透析 24 h， 前 12 h每 4 h换 一次水， 随后 6 h换一次水。 经 0.45 m过滤头过滤后冻干， 即得到 D0X载药胶束粉末。 采 用 SEM观察其形貌为球形， 粒径范围为 100~180 nm， 见图 6。 实施例 10: 载药胶束的体外释放
按照实施例 9制备方法， 利用实施例 2制备得到的两亲性 pH响应 4杂臂星型共聚物 (PCL) 2 (PDEAEMA-b-PPEGMA) 2 制备得到 DOX载药胶束 I。 实施例 9制备得到 DOX载药 胶束 II。
体外释放试验： 分别称取 5 mg DOX载药胶束 I和 DOX载药胶束 II分散于 5 mL缓冲 液中 （醋酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液）， 缓冲液 pH值分别为 5.0、 6.5和 7.4。 将上述分散于 置于透析袋中， 转入 40 mL相同 pH值的缓冲液中， 置于药物溶出仪， 在 37 °C， llO rpm转 速下进行体外释放。 定时取样 3 mL进行紫外分析， 并同时补加 3 mL新鲜缓冲液。 用紫外 分光光度法测定不同时间释芳液中 DOX浓度， 绘制体外释放曲线， 见图 7和图 8。
由图 7可见， 在正常组织的 pH 7.4环境下， DOX的释放速率非常慢， 24 h的累积释药 量只有 22 %左右， 96 h的累积释药量为 35 %。 当 pH降低至 6.5 (即肿瘤组织附近条件）时， DOX的释放速率加快， 24 h以及 96 h的累积释放量与 pH 7.4相比分别增加了 5 %和 10 %左 右。 而在肿瘤细胞内涵体的 pH 5.0环境下， DOX的释放速率明显加快， 24 h累积释放量增 力口至 IJ 50 %， 48 h达至 lj 62 %， 96 h释放了 91 %。
同理， 由图 8可见， 在正常组织的 pH 7.4环境下， DOX的释放速率非常慢， 24 h的累 积释药量只有 25 %左右， 96 h的累积释药量为 38 %。 当 pH降低至 6.5 (即肿瘤组织附近条 件） 时， DOX的释放速率加快， 24 h以及 96 h的累积释放量与 pH 7.4相比都增加了 10 % 左右。 而在肿瘤细胞内涵体的 pH 5.0环境下， DOX的释放速率明显加快， 24 h累积释放量 增加到 65 %， 48 h达到 80 %， 96 h释放了 96 %。 实施例 11 : 两亲性 pH响应 6杂臂星型共聚物胶束的细胞毒性测试
( 1 ) 空白胶束制备： 按照实施例 9的方法， 不添加阿霉素， 制备得到实施例 4共聚物 的空白胶束。
(2) 毒性测试： 取 96孔平底组织培养板， 将四周孔板中分别加入 200 细胞培养基 (DMEM)作为空白组。中间 60个孔中每孔以 lxlO 4 细胞 /孔（200 μί)的细胞浓度接种 HepG2 细胞 （购买于 ATCC)， 其中第 2列作为对照， 将 96孔板放置到 37 °C， 饱和湿度， 5 %C0 2 培养箱中培养 48 h。
随后将游离阿霉素、空白胶束、 DOX载药胶束粉末 I和 DOX载药胶束粉末 II用 DMEM 稀释成不同的聚合物浓度 （空白胶束 l~400 mg/L) 或药物浓度 （游离阿霉素或载药胶束， 0.1-20 mg/L)。 在移走 96孔板中从第 2列到第 11列所有孔中的细胞培养介质后， 在第 2列 中加入新鲜的培养介质， 作为对照。 从第 3列到第 10列， 向所有的孔中分别加入 200 的 样品溶液， 每个浓度的样品加入到 6个孔中进行重复。
在经过 48 h的培养后， 吸走所有含有细胞的孔中的上清液， 加入 200 μL的 PBS润洗细 胞， 然后吸走 PBS。从第 2列到第 11列， 分别向每个孔中加入 20 μL的 MTT溶液和 180 μL 的培养介质， 然后将 96孔板放置于培养箱中培养 4 h。 随后吸走未还原的 MTT溶液和培养 介质。 每个孔用 200 的 PBS洗一遍， 并吸走 PBS。 向每个孔中加入 200 的 DMSO溶 解 ΜΤΤ结晶。 整个 96孔板放在 37 °C摇床中振荡 10 min， 然后利用酶标仪测定 490 nm处 每个孔的吸光度， 进而计算细胞存活率。
图 9 是空 白 胶束 （ 实施例 4 产物 ） 的毒性结果 ， 从 图 中可知 ， (PCL) 3 (PDEAEMA-b-PPEGMA) 3 对 HepG2细胞基本无毒， 在 400 mg/L的高浓度下细胞存活 率仍然高达 90 %。
图 10是游离 DOX、 DOX载药胶束 I和 DOX载药胶束 II的细胞毒性结果。从图中可知， 经过 48 h培养后， 低浓度 （0.1 mg/L) 的载药胶束就可以杀死细胞， 有明显的增强作用；在 高浓度 （20 mg/L) 时， 载药胶束和游离 DOX杀死细胞的效果是相似的， 有超过 80 %的细 胞被杀死。 实施例 4产物制备的 DOX载药胶束 I与游离阿霉素有相近的细胞毒性， 说明阿 霉素经包载后可以有效的保持其抗癌活性。 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发 明的实施方式并不受上述实施例的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下 所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应 为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。