DESCRIPCIÓN

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo de la tecnología de anestesiado en animales, en particular se refiere al aturdido y sacrificio de peces de acuicultura y de peces de experimentación, como, por ejemplo, la dorada, la lubina, la trucha, el salmón y el pez cebra. De forma más específica, la presente invención contempla una nueva solución anestesiante para peces, basada en el empleo de aceites esenciales encapsulados en β-ciclodextrinas, formulados con hielo o agua. Asimismo se refiere a un método de anestesiado, aturdido y/o sacrificio de peces de acuicultura y experimentación basado en el empleo de dicha solución anestesiante.

Antecedentes de la invención

Los peces de acuicultura y de experimentación, durante su ciclo de vida, pueden ser sometidos a toda una serie de situaciones de manejo que les puede producir estrés y sufrimiento. Por ejemplo, cuando se les captura con salabres y redes, durante su pesaje, clasificación, vacunación, transporte y, al final, durante su aturdido y sacrificio. Cuando se trata de peces de experimentación e investigación también pueden someterse a procedimientos quirúrgicos más o menos agresivos, como, por ejemplo, cuando son etiquetados, cuando se hace un muestreo, o cuando se hacen pequeñas incisiones o intervenciones más invasivas.

En este sentido, la EFSA (European Food Safety Authority), en su artículo "Scientific Opinión of the Panel on Animal Health and Welfare" (Opinión Científica del Panel sobre Salud y Bienestar Animal) publicado en The EFSA Journal, 2009, 1010, 1-52 como "Question N° EFSA-Q-2008-441" y adoptada el 20 de Marzo de 2009, también establece que las etapas pre-sacrificio, aplicadas inmediatamente antes de la muerte de los peces de acuicultura, tienen un impacto directo y negativo sobre el bienestar de los peces. Por ello, la EFSA pone de manifiesto la necesidad de desarrollar procedimientos adecuados para ser aplicados en esas etapas pre-sacrificio, y también durante el sacrificio, que eviten que los peces sufran un estrés excesivo. También, la EFSA, en la citada Opinión, destaca que todos los métodos de sacrificio utilizados actualmente a nivel comercial, en acuicultura, mantienen los peces durante tiempos excesivos de consciencia, normalmente de varios minutos, de modo que los peces son sometidos a elevados niveles de estrés y sufrimiento.

Tal como establecen los autores Zahl et al (Zahl I.H., Samuelsen O., Kiessling A. (2012). Anaesthesia of farmed fish: implications for welfare. Fish physiology and biochemistry, 38(1): 201-218), en todas las situaciones citadas anteriormente puede ser interesante el tratamiento con agentes anestesiantes con el fin de reducir el sufrimiento y garantizar el bienestar de los peces.

En este sentido, se han utilizado distintos agentes anestesiantes en peces, siendo los más utilizados la benzocaína (etil 4-aminobenzoato), la metacaina o metanosulfonato de tricaina (MS-222) (etil 3-aminobenzoato), el metomidato hidrocloruro o clorhidrato de metomidato (metil 3-(1 -feniletil) imidazol-4-carboxilato hidrocloruro), el isoeugenol (2-metoxi-4-prop-1-enil-fenol), el 2-fenoxietanol y la quinaldina (2-metilquinolina). Al igual que el eugenol, el isoeugenol es uno de los constituyentes del aceite esencial de clavo, que es otro anestésico de peces ampliamente utilizado.

Los protocolos de anestesia de peces normalmente implican el uso de uno solo de estos agentes anestesiantes, pero se pueden usar en combinación con analgésicos. Normalmente, el agente anestésico se dispersa o se disuelve en el agua y el pez lo absorbe principalmente a través de las branquias, aunque también lo puede absorber en pequeñas cantidades a través de la piel (Zahl et al 2012). El efecto anestesiante es generalmente evaluado por medio del tiempo de inducción y el tiempo de recuperación, las reacciones reflejas a estímulos externos, y la capacidad de respuesta a la manipulación. Según el artículo anterior de ZahI et al (2012), el progreso de la inducción y la profundidad de la anestesia generalmente se dividen en distintas etapas y «planos» (véase la Tabla 1 de este artículo, de ZahI et al 2012), que pueden ser caracterizados en animales mediante indicadores clínicos conocidos (comportamiento, actividad, reflejos corneales y tamaño de pupila, tono muscular, reflejos, frecuencia respiratoria, frecuencia cardíaca y presión arterial). Pero, como algunos de estos indicadores son difíciles de evaluar en los peces, puede ser muy complicado distinguir las etapas y "planos" citados anteriormente, sobre todo en situaciones en las que la inducción es rápida. Por ello, estas etapas son generalmente descritas mediante cambios en la actividad de natación, el equilibrio, la frecuencia respiratoria y reacciones a estímulos externos (ver la Tabla 1 del artículo de ZahI et al 2012, sobre las etapas de la anestesia en peces). De esta manera, en la mayoría de las evaluaciones o estudios comparativos de anestesiantes en peces, éstos son anestesiados hasta conseguir una etapa determinada, que se corresponde normalmente con pérdida de equilibrio, actividad natatoria nula, falta de respuesta a estímulos externos y reducción o incluso parada de la respiración (que según la citada Tabla 1 del citado artículo de ZahI et al (2012), se correspondería con la etapa III, plano 3, acercándose incluso a la etapa IV) (Hoskonen P., Pirhonen J. (2004). Temperature effects on anaesthesia with clove oil in six temperate-zone fishes. J Fish Biol 64:1136-1142; Mattson N.S., Ripie T.H. (1989). Metomidate, a better anesthetic for cod (Gadus morhua) in comparison with benzocaine, MS-222, chlorobutanol, and phenoxyethanol. Aquaculture 83:89-94; Mylonas C.C., Cardinaletti G., Sigelaki I., Polzonetti-Magni A. (2005). Comparative efficacy of clove oil and 2-phenoxyethanol as anesthetics in the aquaculture of European sea bass (Dicentrarchus labrax) and gilthead sea bream (Sparus aurata) at different temperatures. Aquaculture 246:467-481; Stehly G.R., Gingerich W.H. (1999). Evaluation of AQUI-S (TM) (efficacy and mínimum toxic concentration) as a fish anaesthetic sedative for public aquaculture in the United States. Aquaculture Research 30:365-372; Sylvester J.R., Holland LE. (1982). Influence of temperature, water hardness, and stocking density on MS-222 response in three species of fish. Progress Fish Cultur 44:138-141).

Según se desprende de los distintos trabajos de investigación citados anteriormente, el tiempo necesario de contacto de los peces con los agentes anestesiantes citados es normalmente de varios minutos (de 2 a 15 minutos), para conseguir un adecuado efecto anestesiante (ver Tabla 2 del artículo de Zahl et al, 2012, sobre dosis y tiempos de exposición recomendados para los distintos agentes anestesiantes de peces). Esto influirá en el estrés sufrido por los peces y en la calidad del producto final obtenido del pescado de acuicultura. En efecto, la bioquímica de la sangre y del músculo post mortem y el inicio del rigor mortis están influenciados por el método utilizado en el manejo pre-sacrificio, el aturdimiento o aturdido y el sacrificio de los peces que, a su vez, puede incidir negativamente en las cualidades organolépticas y comerciales del producto final, como puede ser el fileteado del pescado correspondiente de acuicultura (Zampacavallo G., Parisi G., Mecatti M., Lupi P., Giorgi G., Poli B.M. (2015). Evaluation of different methods of stunning/killing sea bass (Dicentrarchus labrax) bytissue stress/quality indicators. Journal offood science and technology 52(5) : 2585-2597).

Por otro lado, la Normativa de producción ecológica (también denominada orgánica) en acuicultura (véase, por ejemplo, el REGLAMENTO (CE) No. 710/2009 DE LA COMISIÓN, de 5 de agosto de 2009), aunque no indica cuáles son las técnicas concretas que se han de utilizar, sí que establece que las técnicas de sacrificio deberán conseguir que los peces queden inmediatamente inconscientes e insensibles al dolor. Esto se puede interpretar como que son deseables aquellas técnicas que consigan anestesiar (o aturdir) y sacrificar a los peces en el menor tiempo posible, causando el menor estrés y sufrimiento posible. Pero, las técnicas más avanzadas de aturdido/sacrificio de peces, no consiguen tiempos reducidos para estas operaciones, por lo que el nivel de estrés que se produce es relativamente alto. Esto lleva a obtener una vida útil relativamente reducida en la conservación del pescado aturdido/sacrificado con estas técnicas, tal como pone de manifiesto el trabajo de Zampacavallo et al (2015).

En un estudio sobre este tema, tal como se describe en el artículo de Lerfall et al (Lerfall J., Roth B., Skare E.F., Henriksen A., Betten T., Dziatkowiak-Stefaniak M.A., Rotabakk B. T. (2015). Pre-mortem stress and the subsequent effect on flesh quality of pre-rigor filleted Atlantic salmón (Salmo salar L.) during ice storage. Food Chemistry, 175:157-165), se han obtenido resultados excesivos de estrés cuando el aturdido se hace con una mezcla de agua de mar y hielo picado (con una ratio de 1 : 1 en peso, y a una temperatura entorno a -0,3°C). Los citados autores (Lerfall et al, 2015) han puesto de manifiesto que los niveles de metabolitos en plasma y tejidos se ven afectados por el estrés inducido durante el aturdido y el sacrificio, lo que se traduce en un aumento significativo de los niveles de glucosa en sangre.

Además, de la filosofía de la producción ecológica de alimentos en general (también denominada producción orgánica, que incluye la agricultura y la acuicultura orgánica) se desprende el interés de evitar agentes químicos de síntesis tanto en la producción como en el aturdido y sacrificio. Por tanto, un anestesiante deseable en acuicultura orgánica o ecológica sería el aceite esencial de clavo (AEC). Pero el uso de este anestesiante tiene un problema y es su carácter lipofílico (es un aceite) y se disuelve mal en el agua. Esto lleva a la necesidad de usar elevadas dosis de este anestesiante para que tenga un efecto en un tiempo relativamente corto. Por ejemplo, para el aturdido/sacrificio de lubinas, en el trabajo de investigación de Simitzis et al (Simitzis P.E., Tsopelakos A., Charismiadou M.A., Batzina A., Deligeorgis S.G., Miliou, H. (2014). Comparison ofthe effects of six stunning/killing procedures on flesh quality of sea bass (Dicentrarchus labrax, Linnaeus 1758) and evaluation of clove oil anaesthesia followed by chilling on ice/water slurry for potential implementation in aquaculture. Aquaculture Research, 45(11):1759-1770) se propone una dosis de 105 mg/L de agua en el baño utilizado para el aturdido de estos peces.

Para aumentar la solubilidad en agua y la absorción por parte del pez del aceite esencial de clavo, y mejorar así su efecto anestesiante, se podría utilizar este aceite esencial en combinación con ciclodextrinas, formando un complejo de inclusión. La inclusión de este aceite esencial de clavo en β-ciclodextrinas (β-CD) sí está estudiado, pero nunca se ha ensayado su efecto o su interés en el anestesiado o sacrificio de peces.

Sin embargo, sí que se ha propuesto el uso de agentes anestesiantes para humanos en combinación con β-ciclodextrinas, formando complejos de inclusión. Así, la patente US 8,975,245 B2 (de 2015), de título "Anaesthetic formulation" , pone de manifiesto el interés del uso de agentes anestesiantes esferoides neuroactivos en combinación con ciclodextrinas, formando complejos de inclusión, pero para su uso en humanos, y no analiza el interés del uso del citado aceite esencial de clavo en combinación con β-ciclodextrinas para su uso en el anestesiado de peces. El trabajo llevado a cabo por De Oliveira et al (De Oliveira G.B., Guimaraes A.G., Araújo A.S., Quintans S.S., Santos M.R. V., Quintans-Júnior L.J. (2015). Cyclodextrins: improving the therapeutic response of analgesic drugs: a patent review. Expert opinión on therapeutic patents", 25(8): 897-907) pone de manifiesto que las ciclodextrinas se pueden encontrar en al menos 35 productos farmacéuticos, como agentes anticancerígenos, o como fármacos analgésicos y anti-inflamatorios, de aplicación en humanos. Esto se corresponde con los resultados de varios estudios que han demostrado que los fármacos en forma de complejos de inclusión con ciclodextrinas podrían proporcionar beneficios en humanos en cuanto a solubilidad, estabilidad y también mejorar la respuesta farmacológica en comparación con el fármaco solo.

En la bibliografía está muy estudiada la formación de complejos de inclusión entre las ciclodextrinas y distintas moléculas. De esta manera, se consigue cambiar el comportamiento de estas moléculas, consiguiendo por ejemplo que sean más hidrosolubles. Las ciclodextrinas constituyen un grupo de oligosacáridos cíclicos naturales derivados del almidón con seis, siete u ocho moléculas de glucosa unidas por enlaces glicosídicos a(1-4) formando una estructura de forma cilindrica, que se denominan α, β y γ-ciclodextrinas, respectivamente. La cavidad central de estas moléculas es hidrófoba, mientras que los bordes exteriores de las paredes que rodean esta cavidad son hidrófilas. Esta cavidad hidrofóbica forma complejos de inclusión con una amplia gama de moléculas huésped de tipo orgánico. Tal como establece el trabajo de Marques (Marques H.M.C. (2010). A review on cyclodextrin encapsulation of essential oils and volátiles. Flavour and Fragrance Journal, 25(5) :313-326), las ciclodextrinas pueden ser consideradas como agentes de nano- encapsulación y la formación del complejo ciclodextrina-huésped es equivalente a una encapsulación molecular, ya que las moléculas huésped se aislan unas de otras y se dispersan a nivel molecular en una matriz de oligosacárido.

También, se pueden formar complejos de inclusión de aceites esenciales con ciclodextrinas (Marques 2010). Por ejemplo, el trabajo de Hernández-Sánchez et al (Hernández-Sánchez P., López-Miranda S., Lucas-Abellán C, Núñez-Delicado E. (2012). Complexation ofEugenol (EG), as Main Component of Clove 0/7 and as Puré Compound, with β- and ΗΡ-β-CDs. Food and Nutrition Sciences, 3:716-723), estudia la asociación molecular entre β-CD, eugenol y aceite esencial de clavo, obteniendo complejos insolubles en agua, no aptos para su aplicación en el anestesiado de peces.

Los autores de la presente invención, a la luz de las necesidades del estado de la técnica en relación con los problemas derivados del anestesiado, aturdido y sacrificio de peces, han desarrollado una nueva formulación basada en el empleo de anestesiantes naturales nanoencapsulados en β-ciclodextrinas, dando lugar a complejos de inclusión solubles en agua. Los complejos de inclusión así formados, se formulan con agua y/o hielo, dando lugar, de forma sorprendente, a soluciones con una concentración de agente anestesiante muy reducida, en comparación con las empleadas en el estado de la técnica, e igualmente efectivas. Estas soluciones, aplicadas al anestesiado, aturdido y sacrificio de peces de acuicultura o experimentación, proporcionan así ventajas muy significativas respecto al estado de la técnica, ya que, además de disminuir la cantidad de agente anestesiante, y por tanto los efectos no deseados derivados del mismo, permite una disminución significativa del sufrimiento animal, dado que el aturdido o pérdida de consciencia del animal se consigue en cuestión de pocos segundos, y el sacrificio se lleva a cabo con un sufrimiento mucho menor en comparación con los procedimientos actuales.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Niveles de lactato en sangre de dorada (mmol/L) en función del tipo de aturdido aplicado: A) agua de mar a temperatura ambiente (28-29°C) con ΑΕΟ+β-CD a distintas concentraciones (20, 40 y 60 mg/L); B) hielo liquido de agua de mar con ΑΕΟ+β-Οϋ a distintas concentraciones, a -5°C. C=Hielo picado y agua de mar (1 :1 en peso) a -0,5 °C, sin AEC; AM-HL = Hielo liquido de agua de mar (sin AEC); AM- HL (20, 40)= Hielo liquido de agua de mar con ΑΕΟ+β-CD (20, 40 mg/L).

Figura 2. Niveles de HCO3 en sangre de dorada (mmol/L) en función del tipo de aturdido aplicado. Se muestran resultados para tratamientos con agua de mar a temperatura ambiente (28-29°C) con distintas concentraciones de ΑΕΟ+β-CD (20, 40 y 60 mg/L); C = Hielo picado y agua de mar (1 : 1 en peso) a -0,5 °C, sin AEC. Figura 3. Niveles de pCÜ2 en sangre de dorada (mmHg) en función del tipo de aturdido aplicado. C=Hielo picado y agua de mar (1 : 1 en peso) a -0,5 °C; AM- HL=Hielo liquido de agua de mar, a -5 °C; AM-HL (20, 40)=Hielo liquido de agua de mar con ΑΕΟ+β-CD (20 o 40 mg/L).

Figura 4. Niveles de glucosa en suero de dorada (ng/ml) en función del tipo de aturdido aplicado: A) agua de mar a temperatura ambiente (28-29°C) con ΑΕΟ+β-Οϋ a distintas concentraciones (20, 40 y 60 mg/L); C=hielo picado y agua de mar con ΑΕΟ+β-Οϋ (1 : 1 en peso) a -0,5 °C, sin AEC; B) hielo liquido de agua de mar con ΑΕΟ+β-CD a distintas concentraciones, y a -5 °C; AM-HL (0, 20, 40)=Hielo líquido de agua de mar con ΑΕΟ+β-CD (0, 20 o 40 mg/L).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a una nueva solución de un anestesiante natural, basado en aceite esencial de clavo (AEC) y β-ciclodextrinas (β-CD), en combinación con agua, agua con hielo picado, o hielo líquido, para la realización del anestesiado, aturdido y sacrificio de peces de acuicultura y experimentación, tales como, por ejemplo, la dorada, la lubina, la trucha, el salmón y el pez cebra.

En una realización principal de la invención se contempla una solución anestesiante (de aquí en adelante solución de la invención) que comprende un agente anestesiante natural nanoencapsulado en β-ciclodextrinas, formando un complejo de inclusión soluble en agua. La proporción del anestesiante natural en el complejo de inclusión está comprendida entre el 5 y el 30%, de la masa total del complejo, preferiblemente entre el 10 y el 20%, y la proporción de las β-ciclodextrinas en el complejo de inclusión está comprendida entre el 70 y el 95% de la masa total del complejo, preferiblemente entre el 80 y el 90%.

El agente anestesiante se formula en agua dulce, en agua de mar, en hielo líquido (definido el hielo líquido como se establece en el artículo de Kauffeld, M., Wang, M. J., Goldstein, V., Kasza, K. E. (2010). Ice slurry applications. International Journal of Refrigeration, 33(8), 1491-1505, donde se denomina en inglés como "ice slurry"), o en agua con hielo picado, en una concentración comprendida entre 5 y 60 mg/kg, preferiblemente entre 10 y 40 mg/kg, en función de la temperatura del agua (concentraciones equivalentes a mg de agente anestesiante por kg de agua inicial).

El agente anestesiante natural empleado en la solución de la invención es un aceite esencial, en particular el aceite esencial de clavo, y/o los componentes del mismo, como son el eugenol e isoeugenol.

Las β-ciclodextrinas utilizadas para la formulación anestesiante objeto de esta invención deben ser de uso alimentario, catalogadas como aditivo alimentario que se denomina E-459. Deben tener aspecto de polvo blanco, sin olor, y deben tener una pureza mínima del 98% (en base anhidra), un contenido de humedad no superior al 14% (determinado por el método de Karl Fischer), preferiblemente entre el 1 y el 4%, y un contenido de otras ciclodextrinas no superior al 2% (en base anhidra). Su solución en agua debe ser incolora.

El contenido de humedad inferior al 14% de las β-ciclodextrinas empleadas en la formulación mejora significativamente la solubilidad en agua del complejo de inclusión formado correspondiente. En el rango 1-4% de humedad, la solubilidad del complejo es completa, con ausencia total de precipitados o partículas en suspensión en la solución.

La nanoencapsulación del aceite esencial en las β-ciclodextrinas se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los siguientes métodos empleados en el estado de la técnica: método del amasado, método de co-precipitación (basado o no basado en solubilidad de fase), método de calentamiento en un envase o recipiente sellado, método de interacción gas (o vapor)-líquido, método de liofilización, método de atomización, o usando tecnología de fluidos supercríticos (tal como se describe en Marques et al, 2010).

En realizaciones particulares de la solución de la invención, el agente anestesiante se formula en hielo líquido, donde el hielo se encuentra en una proporción comprendida entre el 20 y 70% en peso del total del peso de la mezcla de agua y hielo. En otra realización particular de la solución de la invención, el agente anestesiante se formula en agua con hielo picado, estando la proporción agua:hielo picado, en peso, comprendida entre 1 : 1 , 1 :2 y 1 :3, o en una proporción intermedia a estas.

En otra realización principal de la invención se contempla el empleo de la solución de la invención para el anestesiado, aturdido y/o sacrificio de peces de acuicultura y de experimentación. El empleo de la solución en estas aplicaciones permite la disminución significativa del sufrimiento animal de estos peces, ya que el aturdido o pérdida de consciencia del animal se puede conseguir en cuestión de segundos, y el sacrificio se lleva a cabo con menos sufrimiento animal.

En base a estas aplicaciones, en otra realización principal de la invención se contempla un método para el anestesiado de peces de acuicultura y experimentación. Dicho método comprende los siguientes pasos:

En primer lugar se prepara la solución anestesiante contemplada en la invención formulada en agua dulce, a una temperatura comprendida entre 0 y 30 °C, en agua de mar, a una temperatura comprendida entre 0 y 30 °C, en hielo líquido, a una temperatura comprendida entre -8 y 0 °C, o en agua con hielo picado, a una temperatura comprendida entre -1 y 0 °C,

Posteriormente, los peces, capturados mediante salabres o mediante bombeo, se sumergen en una de las soluciones preparadas, introduciendo, como máximo, tantos kilogramos de peces como kilogramos de solución.

Se mantienen los peces sumergidos en la solución durante un tiempo comprendido entre 5 y 55 segundos, en función del tamaño y tipo de pez, y del tipo de solución utilizada, hasta que los peces muestran síntomas de estar anestesiados, como son pérdida de equilibrio, actividad natatoria nula, y falta de respuesta a estímulos externos.

Finalmente, los peces se extraen de la solución de anestesiado. En otra realización principal de la invención, se contempla un método para el aturdido y sacrificio de los peces, que comprende los siguientes pasos: en primer lugar, se prepara la solución anestesiante de la invención formulada en hielo líquido, a una temperatura comprendida entre -8 y 0°C, o en agua con hielo picado, a una temperatura comprendida entre -1 y 0°C, posteriormente, los peces, capturados mediante salabres o mediante bombeo se sumergen en la solución obtenida, introduciendo como máximo, tantos kilogramos de peces como kilogramos de solución preparada para conseguir el aturdido de los mismos, los peces se mantienen unos 5-55 segundos, en función del tamaño y tipo de pez, y del tipo de solución utilizada, hasta que los peces muestran síntomas de estar aturdidos o anestesiados, como son pérdida de equilibrio, actividad natatoria nula, y falta de respuesta a estímulos externos, y finalmente, para su sacrificio por hipotermia, los peces se extraen de la solución de aturdido y se introducen en agua con hielo picado (en una proporción agua:hielo, en peso, de 1 : 1 , 1 :2, 1 :3, o en una proporción intermedia entre éstas), y a una temperatura comprendida entre -1 y 0°C, según se utilice agua de mar y hielo picado, o agua dulce y hielo picado o en hielo líquido, donde el hielo se encuentra en una proporción comprendida entre el 20 y 70% en peso del total del peso de la mezcla de agua y hielo, a una temperatura entre -8 y 0°C. Los peces se introducen, como máximo, en una proporción de tantos kilogramos de peces como kilogramos de solución (agua y hielo picado, o hielo líquido) hasta conseguir el sacrificio de los mismos. Una vez sacrificados, los peces se mantienen en el agua con hielo.

A continuación se recogen varios ejemplos, como modos no exclusivos de realización y aplicación de la invención, que ponen de manifiesto que se consigue disminuir considerablemente los tiempos de aturdido o anestesiado y se consigue, por tanto, reducir así el sufrimiento animal durante el aturdido y sacrificio de los peces de acuicultura o experimentación. Ejemplos

Ejemplo 1

Material y metodología seguida

Para la realización de los distintos ejemplos prácticos de realización de la invención, se aplicaron distintos tratamientos de anestesiado o aturdido a un total de 30 doradas de acuicultura con un peso medio de 465.75 ± 102.12 g. Los peces una vez aturdidos fueron sacrificados a continuación en agua de mar con hielo picado (en una proporción 1 : 1 , en peso).

Se analizó el efecto anestesiante de distintas concentraciones de aceite esencial de clavo (AEC) incluido en β-CD (20, 40 y 60 mg/L) formulado: en agua de mar a temperatura ambiente (28-29 °C), en hielo líquido de agua de mar a -5 °C (60% de hielo), o en hielo picado más agua de mar (1 : 1) con una concentración de 20 mg/L de AEC incluido en β-CD, y a una temperatura de -0.5 °C.

El tratamiento control utilizado (denominado tratamiento C en las figuras 1-4) reproduce la técnica utilizada actualmente en la acuicultura industrial, que realiza el aturdido y el sacrificio por hipotermia en agua de mar con hielo picado (en una relación 1 : 1 en peso). Además, se analizó también el aturdido en hielo líquido a -5°C sin aceite esencial de clavo incluido en β-CD.

La nanoencapsulación o preparación del complejo de inclusión correspondiente (como complejo sólido), según una formulación o proporción de 14,28%/85,72% entre el aceite esencial de clavo y las β-CD, se llevó a cabo mediante el método del amasado (tal como describe con detalle Marques, 2010). En cada tratamiento se analizaron un total de 4 peces, determinando parámetros visuales de comportamiento del pez y analíticos en respuesta al aturdido. Después del aturdido (caracterizado porque los peces muestran síntomas de estar anestesiados, como son pérdida de equilibrio, actividad natatoria nula, y falta de respuesta a estímulos externos) se extrajeron muestras de sangre de la vena caudal, utilizando litio heparina como anticoagulante, inmediatamente después del aturdido

0 anestesiado de cada individuo. Se realizó un análisis utilizando cartuchos desechables CG4 y un analizador de sangre i-STAT, midiendo lactato, pCÜ2 (presión parcial de CO2 en sangre), HCO3, y glucosa, de acuerdo con el procedimiento seguido por Lerfall et al (2015).

Todos los tratamientos, experimentos y análisis sobre peces descritos anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con la aprobación de la Comisión de Ética de la Universidad de Murcia.

Resultados obtenidos

En cuanto a los niveles de lactato en sangre (mmol/L) (Figura 1), se observaron diferencias significativas entre los peces tratados con hielo picado y agua de mar (1 : 1) y agua de mar a 28-29°C a diferentes concentraciones de AEC+ -CD (Figura

1 A). Se obtienen unos valores de lactato superiores en aquellos individuos aturdidos con hielo picado y agua de mar sin anestesiante (9,31-5,60 mmol/l) en comparación con aquellos tratados en agua de mar con distintas concentraciones de ΑΕΰ+β-ΰϋ (1 ,74-1 mmol/l, 3,88-0,36 mmol/l y 4,22-1 ,28 mmol/l en 20, 40 y 60 mg/L de AEC+β- CD). También se apreciaron diferencias significativas entre los individuos aturdidos a distintas concentraciones de AEC+ -CD en hielo líquido a -5 °C (Figura 1 B). Así, se encontraron valores superiores de lactato en individuos que habían sido aturdidos con hielo picado y agua de mar (1 : 1) sin agente anestesiante. Así, se demostró que se alcanzan niveles de estrés más bajos cuando se aturden los peces en hielo líquido de agua de mar con unas concentraciones de anestesiante de 40 mg/L (0,99-0,64 mmol/l).

Cuando se analizaron los resultados de HCO3 en sangre (mmol/L) (Figura 2) se observaron valores significativamente superiores en peces aturdidos con hielo picado y agua de mar (1 : 1), al compararse con aquellos individuos aturdidos con el anestesiante a unas concentraciones de 20 y 40 mg/l, y a temperatura ambiente.

En lo que se refiere a los valores de pCÜ2 en sangre (mmHg) (Figura 3), se observaron diferencias de valores medios obtenidos para aquellos peces aturdidos con unas concentraciones de ΑΕΟ+β-Οϋ de 40 mg/L y en hielo líquido a -5 °C, si se comparan con el procedimiento tradicional de aturdido y sacrificio, que usa hielo picado en agua de mar (1 : 1) sin AEC (Tratamiento C).

Al comparar los niveles de glucosa (ng/mL) en suero de cada uno de los individuos de dorada (Figura 4 A), con tratamiento con ΑΕΟ+β-CD a diferentes concentraciones con agua de mar a temperatura ambiente (28-29 °C), no se observaron diferencias significativas entre ellos (Figura 4 A). No obstante, se observó una cierta tendencia a aumentar el nivel de glucosa al aumentar la dosis aplicada de anestesiante (198,25 ng/mL a 20 mg/L de aceite de clavo; 226 ng/mL a 40 mg/L de aceite de clavo; y 318,5 ng/mL a 60 mg/L de aceite de clavo). En cualquier caso, el nivel de glucosa en sangre en la dorada siempre es menor cuando se utiliza la solución anestesiante objeto de esta patente, si se compara con el aturdido con agua de mar con hielo picado (1 : 1). Por lo anterior, y en este caso, cuando se lleva a cabo el aturdido de dorada en agua de mar a temperatura ambiente, se propone utilizar la concentración más baja de ΑΕΟ+β-CD (20 mg/L). Este sería un método de interés en el anestesiado de peces de acuicultura o experimentación cuando no se quiere que tenga lugar el sacrificio de los mismos. Por otro lado, se aprecian diferencias significativas entre los individuos aturdidos con hielo líquido a -5°C (Figura 4 B) con y sin ΑΕΟ+β-CD, y los peces aturdidos con hielo picado y agua de mar (1 : 1) sin ΑΕΟ+β-CD. Los peces aturdidos con hielo líquido con ΑΕΟ+β-CD sufren menos estrés que los aturdidos en agua de mar y hielo picado (1 : 1).

En estos ejemplos de realización de la invención se observaron niveles significativamente más altos de lactato, pCÜ2, HCO3 y glucosa en los ejemplares de dorada aturdidos con agua de mar y hielo picado (1 : 1) frente a aquellos aturdidos con el anestesiante a base de AEC incluido en β-CD en hielo líquido a -5 °C, o a temperatura ambiente. Los menores valores de estos parámetros, que son indicadores de estrés del pez durante el aturdido, se corresponden con el hecho de que cuando se utiliza la tecnología de aturdido y sacrificio objeto de esta patente, sobre dorada de acuicultura, se consiguen tiempos de aturdido de 10-15 s (en hielo liquido con AEC+ β-CD), o de menos de 55 segundos (en agua de mar con hielo picado, con AEC+ -CD), frente a tiempos de más de 4 minutos obtenidos con agua de mar y hielo picado (1 : 1) sin ΑΕΟ+β-CD (que constituye el método tradicional de aturdido y sacrificio en acuicultura).

En estudios de otros autores (como el de Lerfall et al 2015) se han obtenido resultados similares de estrés cuando el aturdido se hace con agua de mar y hielo picado. Estos autores comprobaron que los niveles de metabolitos en plasma y tejidos se ven alterados por el estrés inducido en el salmón sacrificado con agua de mar y hielo picado (1 : 1), lo que se traduce, por ejemplo, en un aumento significativo de los niveles de glucosa en sangre, y en mayores niveles de lactato en sangre. También, los efectos del estrés observados por Lerfall et al (2015) en salmón relacionan la hipercapnia inducida con los altos niveles de pCÜ2 y HCO3 en los ejemplares aturdidos y sacrificados con el método tradicional de aturdido y sacrificio que usa agua de mar y hielo picado.

Con estos ejemplos de realización de la formulación y métodos de aplicación de la nueva solución anestesiante natural, objeto de esta patente, se demuestra que se consiguen tiempos de aturdido muy inferiores (de 10 a 55 segundos) en comparación con el método tradicional actual utilizado en acuicultura (agua con hielo picado, en una proporción 1 : 1 en peso). Por tanto, esta solución de anestesiante natural y su método de aplicación del mismo para aturdido y sacrificio de peces también consigue menor sufrimiento y menos estrés en los peces, por lo que también contribuye a una mejora significativa de su bienestar animal.

Ejemplo 2

Ensayos de solubilidad

Para el desarrollo de estos ensayos de solubilidad se prepararon soluciones acuosas con tres concentraciones diferentes de aceite esencial de clavo (de 5, 10 y 15 mg/L) formando complejos de inclusión con dos tipos de β-CDs (nativas, no modificadas, y de uso alimentario) que se caracterizan, entre otras cosas, por tener diferente contenido de humedad:

A. β-CDs comercial, con un contenido de humedad del 14,5 %

B. β-CDs de la invención, con un contenido de humedad del 4 %

Las β-CDs (B) con un 4% de humedad muestran una textura más pulverulenta que las de 14,5 % (A), siendo estas últimas de textura más granulosa.

El complejo de inclusión del aceite esencial de clavo con las β-CDs se preparó siguiendo el método del amasado indicado por H.M.C. Marques [Marques H.M.C., 2010, "A review on cyclodextrin encapsulation ofessential oils and volátiles", Flavour and Fragrance Journal, 25(5), 313-326]. El complejo de inclusión se obtuvo incorporando el aceite esencial de clavo (AEC) a las β-CDs según una relación equimolecular. Se empleó una relación peso:peso de 1 g de AEC por cada 6,90 g de β-CDs. Se realizaron los ensayos de solubilidad de estos complejos en 1 L de agua, utilizando las siguientes cantidades del complejo de inclusión formado:

Para 5 mg/L de AEC en 1 L de agua se ensayó la disolución de 39,5 mg de complejo β-CD+AEC,

Para 10 mg/L de AEC en 1 L de agua se ensayó la disolución de 79 mg de complejo β-CD+AEC, y

Para 15 mg/L de AEC en 1 L de agua se ensayó la disolución de 1 18,5 mg de complejo β-CD+AEC.

Los ensayos de solubilidad se realizaron en laboratorio, a temperatura ambiente (20 °C), utilizando matraces con 1 L de agua, añadiendo las cantidades indicadas anteriormente de los complejos de inclusión obtenidos de AEC con las β-CDs (A y B), y con agitación magnética continua. La disolución de todos los complejos se realizó a la vez, en distintos matraces, manteniendo la agitación desde su adición a cada matraz con agua durante un tiempo de 2 horas.

Los resultados de solubilidad obtenidos, independientemente de la concentración de AEC establecida, fueron dependientes de la cantidad de humedad inicial de las β- CDs utilizadas.

Tras los 30 minutos iniciales se pudo observar a simple vista una mejor disolución del complejo de inclusión β-CD+AEC con las β-CDs de la invención (B) con respecto a las comerciales (A). Transcurridas las 2 horas, se apreció a simpe vista una disolución completa del complejo β-CD+AEC que utiliza β-CDs con un máximo del 4% de humedad (B), mientras que en los matraces con los complejos formados con β-CDs con un 14,5% de humedad (A) se observaron pequeñas partículas en suspensión. Cuando se detuvo la agitación y se dejó en reposo los matraces durante 5 horas, se pudo observar que las soluciones con los complejos con β-CDs de 14,5 % de humedad tenían precipitados en la base del matraz, mostrando una clara insolubilidad del complejo, para las tres concentraciones estudiadas de aceite esencial de clavo. Sorprendentemente, la solución que contenía el complejo de inclusión β-CD+AEC formado con β-CDs con un 4 % de humedad (B) no presentó ningún precipitado en el fondo de matraz, ni partículas en suspensión, lo que es indicativo de una adecuada solubilidad para las tres concentraciones ensayadas de aceite esencial de clavo (de 5, 10 y 15 mg/L) formando complejos de inclusión con las β-CDs.