Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung umfassend einen Kanal mit einer zum spezifischen Binden von Analyten geeigneten Abfolge von Kompartimenten mit Molekülen mit spezifischen Bin- dungssteilen.

Eine Vielzahl von analytischen Methoden bedient sich der spezifischen Bindung eines Analyten an ein auf einer festen Substratoberfläche immobilisiertes Moleküls mit spezifischer Bin- dungssteile, z.B. eines Rezeptors. Ein Nachweis und eine Quan ^¬ tifizierung des gebundenen Probemoleküls erfolgt dann in der Regel durch direkte oder indirekte optische Methoden, wie An- färbung oder Fluoreszenzmarkierung, gefolgt von einer kolori- metrischen oder fluoreszenzspektroskopischen Auswertung.

Technologische Plattformmethoden, die es erlauben, solche Assays schnell, kostengünstig, multiparametrisch und quantita ^¬ tiv mit hoher Sensitivität und großem dynamischem Messbereich durchzuführen, sind dabei von größtem Interesse.

Typischerweise werden bei Schnelltestplattformen poröse Materialien verwendet, welche an differenzierbaren Stellen funktiona- lisiert worden sind und dann von der zu analysierenden Probe durchströmt werden. In den klassischen Lateral Flow Tests (LFT) ist der poröse Träger eine Nitrozellulosemembran. Schwachstellen der LFT liegen in deren geringer Sensitivität und Präzision und dem stark limitierten Messbereich begründet.

WO 03/029480 beschreibt die Messung von Analyten unter Verwen- dung von Kryogelen, wobei die Kryogele als Blöcke vorgelegt und in Scheiben zerschnitten werden, um Moleküle, die bereichsweise in die Kryogele eingebracht sind und zum Nachweis von Analyten dienen, zu präsentieren.

WO 2008/145722 beschreibt konventionelle Trennsäulen, die mit unterschiedlichen porösen Materialien in schichtenartigen zylinderförmigen Segmenten gefüllt sind, die durch reflektierende Trennelemente voneinander separiert werden, wobei jeweils je Segment unterschiedliche Bindungsstellen zur affinitätschroma- tographischen Auswertung mittels Lichttransmissionsmessung vorgesehen sind.

X. Qu et al . , Biosensors and Bioelectronics 3_8, 2012, 342-347 beschreibt ein Verfahren zum Bestimmen von (z.B. bei der Produktion von Proteinen in gentechnisch veränderten Mikroorganismen zu findenden) Protein-Einschlusskörpern mittels eines Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA) unter Verwendung von makroporösen Kryogel-Mini-Plättchen/Minisäulen . Weder eine Ver- wendung von Kapillaren noch eine Bindung an eine Säulenwandung noch eine sequentielle Aufeinanderfolge unterschiedlicher Bin ^¬ dungsstellen werden beschrieben.

J. Ahlqvist et al . , Analytical Biochemistry 354 , 2006, 229-237 beschreibt Kapillaren, an deren mit Alkoxyaminosilan und Glutaraldehyd vorbehandelte Wandung durch sequentielle Beschi ^¬ ckung mit unterschiedlichen Lösungen abschnittsweise unterschiedliche Probenmoleküle, die 1 Stunde bis 24 Stunden mit der vorbehandelten Wandung reagieren, kovalent gebunden werden, die dann mittels Bindung von Detektormolekülen z.B. durch Fluoreszenzmessung nachgewiesen werden können. Die Füllung auch mit sequentiell zwischengeschalteten reinen Trägerflüssigkeiten (ohne bindende Moleküle) zur besseren Trennung unterschiedli- eher nachzuweisender Moleküle ist erwähnt. Poröse Trägermaterialien werden nicht erwähnt.

Aufgabe der Erfindung ist vor diesem Hintergrund, Schwachstel- len wie die (insbesondere für LFT) beschriebenen zu minimieren und einen aufwändigen Herstellungsprozess (vorgängige Herstel ^¬ lung und Funktionalisierung der Filterelemente, Aufbau mit re ^¬ flektierenden Trennelementen, um Strahlungsüberlappung zu vermindern, nur begrenztes Miniaturisierungspotential) zu vermei- den.

Die Erfindung beschreibt vor diesem Hintergrund die Herstellung und Verwendung von räumlich getrennten, linear angeordneten, funktionalen Kryogelen in einem transparenten Träger als Assay- Plattform.

In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung daher eine eingangs genannte Vorrichtung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die Moleküle mit spezifischen Bindungsstellen an porösen Kryogelen als Träger gebunden sind und die Kryogele mit der Wandung des Kanals chemisch verbunden sind.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen Vorrichtung, dadurch gekennzeichnet, dass abwech- selnd Volumina von vorgelegten Lösungen, welche einerseits Vor ^¬ läufermoleküle von porösen Kryogelen als Träger und andererseits je Volumen unterschiedliche zu immobilisierende Moleküle mit spezifischen Bindungsstellen zum spezifischen Binden von Analyten, oder deren Vorläufermoleküle beinhalten, wobei ge- wünschtenfalls - zwischen Volumina mit den Kryogelvorläufern und den zu immobilisierenden Molekülen mit spezifischen Bindungsstellen oder deren Vorläufermolekülen - noch Vorläufermoleküle der Kryogele ohne zu immobilisierende Moleküle oder an- dere flüssige oder gasförmige Trennsubstanzen zugeführt werden können, um für eine klarere Trennung der Kryogele mit unterschiedlichen Molekülen als spezifischen Bindungsstellen zu sorgen, je Kanal der Reihe nach zugeführt werden; die befüllte Vorrichtung abgekühlt wird, um die darin enthaltenen Lösungen einzufrieren; und dann die Reaktionen zur Ausbildung der Bildung der Kryogele, deren Bindung an die Wand des Kanals und die Bindung der zu immobilisierenden Moleküle mit spezifischen Bindungsstellen oder deren Vorläufermoleküle durchgeführt werden; und vorzugsweise das Kryogel aufgetaut und gespült wird.

In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei der eine flüssige oder gasförmige Probe mit Analyten durch eine Vorrichtung der ge- nannten Art geleitet wird und gebundene Moleküle identifiziert und vorzugsweise auch quantifiziert werden.

Anstelle der vorstehenden sowie nachstehender allgemeinerer Begriffe können ein oder mehrere davon durch ein oder mehrere der nachfolgenden spezifischeren Definitionen ersetzt werden, was jeweils zu bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung führt:

Als Vorrichtung kommen insbesondere Mikrofluidikelemente in Frage, wie mikrofluidische Chips (Microchips mit mikrofluidi- sehen Kanälen oder nachfolgend „Mikrokanälen" ) oder vor allem Kapillaren, insbesondere aus Kunststoff oder aus Glas.

Mikrofluidikelemente sind vorzugsweise solche Systeme ein ^¬ schließlich Kapillaren, die einen oder mehrere Kanäle, d.h. Passagen, Kammern oder Leitungen umfassen, welche mindestens eine (1) interne Querschnittsabmessung, z.B. Tiefe, Weite, Länge, oder insbesondere (kleinsten) über Teile oder vorzugsweise die ganze Länge des Mikrokanals vorgesehenen Durchmesser quer zur Längsrichtung, im μιη-Maßstab, vorzugsweise von 1000 oder 800 μιη oder weniger, insbesondere im Bereich von 0,1 bis 750 μτ, z.B. zwischen 5 und 500 μιη, aufweisen. Die Mikrofluidikele- mente gemäß der Erfindung beinhalten mindestens einen Kanal im μιη-Masstab (Mikrokanal) wie angegeben oder mehrere davon, die und in den verschiedensten Formen oder Geometrien vorliegen können, beispielsweise geradlinig, sägezahnförmig, verzweigt, mäanderförmig, spiralig, kreisförmig oder dergleichen. Bevorzugt sind als Mikrofluidikelement ein oder mehrere Kapil ^¬ laren, die jeweils einen Mikrokanal wie vorstehend definiert beinhalten .

Eine Reihe von Materialien können für die Kapillaren oder die mikrofluidischen Chips verwendet werden. Vorzugsweise, wenn die Vorrichtungen mikrotechnisch hergestellt werden, sind die Materialien so ausgesucht, dass sie mit bekannten Mikrofabrikati- ons-Techniken kompatibel sind, z.B. Photolithographie, chemi ^¬ sche Nassätzung, Plasma- oder Laser-Abtragung, Spritzguss oder andere Urformmethoden, Pressung, Prägung, CVD-

Beschichtungstechnik und dergleichen Allgemein sind insbesondere Materialien auf Siliziumbasis, wie Silizium, Siliziumdi ^¬ oxid, Glas, Quartz, Silikon oder Polysilikon, oder anderen Halbleitermaterialien, wie Galliumarsenid, zu nennen. Weitere bevorzugte Materialien sind u.a. Kunststoffe (Polymere), wie Polymethylmethacrylat (PMMA) , Polycarbonat , Polyester,

Polyamide, Polytetrafluorethylen (TEFLON ^® ) , Polyvinylchlorid (PVC), Polydimethylsiloxan (PDMS) , Polysulfon, Polystyrol, Polyolefine, wie Polymethylpenten, Polypropylen oder Polyethylen, Polyvinylidinfluorid, Acrylnitril-Butadien-

Copolymer (ABS) , Blockcopolymere oder Gemische von zwei oder mehr davon. Derartige polymere Mikrofluidische Chips, bei- spielsweise aus einer Substrat- und einer Deckschicht, sind nach bekannten, beispielsweise den oben genannten, Mi- krofabrikationsverfahren herstellbar, oder mittels mikrotechnisch hergestellter Mutterformen unter Verwendung bekannter Formungsverfahren, wie Spritzguss, Prägen oder Stempeln, oder durch Polymerisation des monomeren Vorläufermaterials innerhalb der Form (Urform) . Derartige polymere Materialien sind bevorzugt, da sie leicht herstellbar, preisgünstig und auch wegwerf ^¬ bar sein können. Jedoch sind Kapillaren auf Polymer- oder Glas- basis besonders bevorzugt. Alle genannten Materialien können spezifisch behandelte oder beschichtete Oberflächen oder Oberflächenabschnitte (z.B. innerhalb der Mikrokanäle) enthalten, beispielsweise durch Silanierung (Beschichtung mit einem Silan, an das ein eine Hydroxygruppe tragendes Verbindungsmolekül ge- koppelt wird) , Anätzung von Glas, so dass die Oberfläche viele Hydroxygruppen aufweist, beispielsweise mit Caro ' scher Säure, oder anderweitige Einführung reaktiver Gruppen (z.B. Epoxidgruppen, aktivierte Estergruppen, Dien- oder

Dienophilgruppen oder dergleichen) .

Die Mikrokanäle und/oder -kammern der Mikrofluidikelemente wer ^¬ den insbesondere unter Verwendung der üblichen Mikrofabrikati- ons-Techniken hergestellt. Vorzugsweise werden eine Oberfläche einer Deckschicht und die Seite eine Substratschicht, welche Mikrokanäle und/oder -kammern umfasst, miteinander verbunden, beispielsweise durch Klammern, Verklebung oder Verschmelzung, so dass die Deckschicht die Kanäle oder Kammern nach oben vervollständigt und abdichtet. Nach außen führende Zu- und Ableitungselemente für Flüssigkeiten werden durch die Deckschicht oder seitlich oder unten an der Substratschicht geführt. Im Falle von Kapillaren können diese durch Recken von Rohren aus einem (mindestens in der Hitze) dehnbaren Material (wie ei ^¬ nem thermoplastischen Kunststoff oder Glas) gewonnen werden. Beispiele für geeignete Kapillaren sind solche, die von Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co. KG, Hauptstraße 7 - 15, 74246 Eberstadt, Deutschland unter der Bezeichnung minicaps kommerzi ^¬ ell erhältlich sind.

Vorzugsweise ist jeweils das ganze Mikrofluidikelement optisch transparent, d.h. insbesondere in der Lage, UV-, sichtbares oder Infrarotlicht durchzulassen. Z.B. sind Quartz oder Glas oder transparente Polymermaterialien, wie PMMA oder Polycarbo- nat, geeignete optisch durchlässige Materialien. Ein Kanal ist somit insbesondere ein Mikrokanal wie oben be ^¬ schrieben, vorzugsweise mit einem Durchmesser wie oben als bevorzugt angegeben.

Unter einem spezifischen Binden von Analyten (das sind bei- spielsweise Zellen, Zellbestandteile oder -bruchteile, Viren, Virenbruchstücke oder insbesondere Moleküle in einem zu unter ^¬ suchenden Medium) ist insbesondere eine Bindung zu verstehen, die auf einer spezifischen Wechselwirkung wie der zwischen Enzymsubstrat und aktivem Zentrum eines Enzyms, einem Rezeptor und seinem zu bindenden Molekül, Oligo- oder Polynukleinsäuren bei (insbesondere stringenter) Hybridisierung, und insbesondere Antigen-und-Antikörper- , Biotin-Avidin oder Biotin-Streptavidin bindung, beruht, wobei auch kovalente Bindungen denkbar sind (z.B. wie bei Proteinasehemmern, die kovalent binden) . Die Ana- lyten können dabei beispielsweise niedermolekulare organische Verbindungen, wie Arzneistoffe, Lipide, Mono- oder Oligosaccharide, Aminosäuren, Mono- oder Oligopeptide, Mono- oder Oligonucleotide oder Planzenschutzmittel ; Nucleinsäuren; Proteine; Polysaccharide; Glycoproteine ; oder andere in der Na ^¬ tur oder anderweitig vorkommende organische Moleküle, Zellen, Zellbestandteile oder -bruchstücke (z.B. Organellen wie Mitochondrien, Plastide oder dergleichen) , Viren, Virenbruch- stücke, Moleküle (auch Molekülkomplexe), sein.

Moleküle mit spezifischen Bindungsstellen können dabei beispielsweise Enzyme, Rezeptoren, Antigene, Antikörper oder Frag ^¬ mente davon mit der spezifischen Bindungsstelle entsprechender Antikörper, sonstige Proteine, Peptide, Biotin, Avidin, Streptavidin, Aptamere, MIP (Molecularly Imprinted Polymer) oder sequenzspezifische Oligonucleotide oder Polynucleotide sein . Kryogele sind (micro) poröse Polymernetzwerke, die durch Polymerisationsreaktionen oder durch Vernetzen polymerer Vorläufer in moderat gefrorenen Lösungen hergestellt werden. Moderat gefroren bedeutet dabei, dass Mikrophasen-Separation stattfindet und Systeme erhalten werden, die aus kristallisiertem Lösungsmittel (typischerweise auf Wasserbasis) und einer „flüs ^¬ sigen Mikrophase" (Liquid Microphase, LMP) , einem nicht gefro ^¬ renen Anteil der konzentrierten Vorläuferlösungen, bestehen. In solchen Systemen geschehen die Reaktionen, die zur Ausformung der Polymernetzwerke führen, nur in der flüssigen Phase statt. Bei fortschreitender Reaktion wird diese Phase viskoser und schließlich fest. Nach dem Auftauen der Lösungsmittelkristallbereiche bleibt ein Netzwerk miteinander verbundener Poren.

Als poröse Kryogele als Träger für die gebundenen Moleküle mit spezifischen Bindungsstellen kommen insbesondere solche auf Basis von Monomeren oder Comonomeren, oder Präpolymeren, als Vorläufermolekülen in Betracht, die durch Additions- und/oder Radikalreaktion polymerisieren können. Beispiele sind Isocyanate, die mit Polyaminen zu Polyurethanen reagieren können, Epoxide, die mit Polyaminen oder Polyolen zu entsprechenden Polyaddukten reagieren können, Vernetzung aminogruppenhaltiger Moleküle (insbesondere Polymere) mit bifunktionalen Aldehyden (z.B. Glutaraldehyd) oder insbesondere Monomeren, Comonomeren, Präpolymeren oder auch Polymeren, die durch Bestrahlung mit sichtbarem oder ultraviolettem Licht vernetzt werden können. Beispiele hierfür sind Monomer-Moleküle mit ethylenisch unge ^¬ sättigten, radikalisch härtbaren (z.B. Vinyl-) Gruppen, wie Acrylamid, N, -methylen-bis (acrylamid) , Allylglycidylether, Vinylester- oder Vinylurethanvorläufer, oder Monomermischungen von zwei oder mehr davon für Copolymere, oder Präpolymere der genannten Verbindungen, OCT (beispielsweise CryoGel OCT von Instrumedics Inc., Hackensack, NJ) aus WO 03/029480 oder ferner Azide, wie Arylazide oder Azidomethylcoumarine, Benzophenone, Anthrachinone, bestimmte Diazoverbindungen, Diazinine, Psoralen (derivat) e oder dergleichen, insbesondere Copolymere, die vorzugsweise funktionelle Gruppen wie Vinyl-, Epoxy- oder Aldehydgruppem oder insbesondere Benzophenongruppen beinhalten. Die Porosität entsteht dabei durch Einfrieren des jeweiligen Lösungsmittels, wodurch „Lösungsmittelkristalle" (z.B. Eiskris ^¬ talle) entstehen, um die sich bei der Reaktion (z.B. unter Einstrahlung von UV- oder sichtbarem Licht) die Polymeren bilden, wobei durch Schmelzen und damit Entfernen des aufgetauten Lö- sungsmittels die Hohlräume des somit porösen (schwammartigen) Kryogels entstehen.

Generell kann man sich theoretisch eine Vielzahl an Methoden vorstellen. Wichtig ist, dass die Kryogelierung, die Immobili- sierung der Moleküle mit spezifischer Bindungsstelle und die Anbindung an die Wand gemeinsam ablaufen.

Die chemische Verbindung zwischen Kryogel und der Wandung des Kanals beruht in erster Linie auf der direkten Bindung oder ferner der Bindung über einen Brückenbildner, jeweils durch chemische Reaktion, insbesondere bei Einstrahlung mit Gamma ^¬ strahlung, Elektronenstrahlung oder insbesondere UV-Licht oder sichtbarem Licht, erzeugt bzw. erzeugbar.

Chemisch verbunden bedeutet, dass bei den üblichen Wasch- und Reagenzzuführungsschritten keine Dissoziation von der Oberfläche (außer im Falle einer gewollten Ablösung) der Wand des Ka- nals, z.B. Mikrokanals, stattfindet.

Die Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung wie auch deren Herstellung können mit entsprechende Einrichtungen zur Steuerung der Flüsse und Verweildauern von Lösungen, wie Puf- fern, Reagenzien, Enzymen, Enzymsubstraten etc., erfolgen, wie Mitteln zur Erzeugung von Druckdifferenzen, z.B. Zentrifugen oder anderen Zentrifugalkräfte erzeugenden Vorrichtungen, externen vor- oder nachgeschalteten Pumpsystemen (Pumpvorrichtungen) , und/oder Absorptionsmaterialien, wie Superabsorbern, die Flüssigkeiten in reproduzierbarer Weise zuführen bzw. ableiten können, in reproduzierbaren und akkurat kontrollierten Mengen, und auch die Reinheit und gewünschtenfalls die Sterilität von Lösungen aufrechterhalten. Die 205U Multichannel Cassette Pump von Watson Marley, Inc. (USA) ist ein Beispiel für eine derar- tige Pumpe. Alternativ können miniaturisierte meachnische Pum ^¬ pen, basierend auf mikroelektromechanischen Systemen (MEMS) , eingesetzt werden. Diese Miniaturpumpen können intern oder extern in Bezug auf Mikrokanäle und Reaktionskammern oder dergleichen sein. Ein Beispiel für derartige Pumpen sind die von Shoji et al . In Electronics und Communications in Japan, Part 2, 70, 52-59 (1989) beschriebenen, oder Diaphragma-Pumpen, thermische Pumpen oder dergleichen. Beispiele sind insbesondere Schlauchpumpen, wie eine Schlauchquetschpumpe (z.B.IPC ISMATEC von Cole-Parmer GmbH, Futtererstr. 16, 97877 Wertheim, Deutschland), welche mit einem geeigneten Schlauch bestückt wird (z.B. mit ID 0.51 mm) . Andere geeignete Förderungsmittel für Flüssigkeiten durch (Mik- ro) Kanäle umfassen elektro-kinetische Pumpen - basierend auf dem Prinzip der Elektroosmose -, z.B. wie von Dasgupta et al . in Anal. Chem. 66, 1792-1798 (1994) beschriebenen, oder elekt- rophoretische Methoden, welche z.B. die Verwendung inerter Me- tallelektroden (z.B. aus Gold oder Platin), die mit externen oder internen Schaltkreisen oder elektrischen Verbindungen und geeigneten Ansteuerungsgeräten in Kontakt stehen, erfordern (siehe z.B. US 5,858,195). Der Zu- und Abstrom kann auch durch Mikroventile reguliert wer ^¬ den, die auf dem piezoelektrischen Biegungsprinzip, beispielsweise mit Piezoelementen auf der Basis von Polysilikon oder Lithium-Niobat , auf Ultraschallsensorbasis, auf der Basis zun- genförmiger Elemente, die unter dem Einfluss eines externen Magnetfeldes auf Grund magnetorestriktiver Kräfte gebogen werden, Gleitschieber-kontrollierter Ventile oder fluidischer Elemente, bei denen kleine Flüssigkeitsbewegungen große kontrol ^¬ lieren, und dergleichen funktionieren. Derartige Elemente sind z.B. in US 5,837,200 beschrieben.

Auch elektrische Kontrolleinrichtungen sind bei der Verwendung vorzugsweise vorhanden, beispielsweise zum Ansteuern von Pumpen, Lichtelementen und dergleichen. In einer bevorzugten Variante erfolgt der Fluss ausschließlich oder mindestens zum Teil durch die in Mikrofluidikkanälen wirkenden kapillaren Kräfte. Vorzugsweise kann dabei durch Kopp ^¬ lung an ein den Mikrofluidikkanälen nachgeschaltetes oder an deren Ende vorgelegtes saugfähiges Material, wie insbesondere ein Superabsorber-Material , die nötige Flüssigkeitsbewegung verursacht oder unterstützt werden, insbesondere das Durchflie ^¬ ßen über das Mikrofluidikkanalvolumen hinausgehender Flüssig- keitsmengen.

Bei der Herstellung geltend vorzugsweise ein oder mehrere der folgenden Definitionen: In Volumina (Flüssigkeitsportionen = Flüssigkeitskompartimen- ten) von vorgelegten Lösungen, welche Vorläufermoleküle von porösen Kryogelen als Träger beinhalten und andererseits je Volumen (Flüssigkeitsportion) unterschiedliche zu immobilisierende Moleküle mit spezifischen Bindungsstellen zum spezifischen Bin- den von Analyten, oder deren Vorläufermoleküle, beinhalten, können die vorgelegten Lösungen beispielsweise wässrige Pufferlösungen sein, wie Barbital-Acetat-Puffer nach Michaelis (pH 2,6 bis 9,2), Essigsäure-Acetat-Puffer (pH 3,7 bis 5,7), Good- Puffer, darunter z. B. HEPES: 4- (2-Hydroxyethyl) -1- piperazinethanesulfonsäure (pH 6,8 bis 8,2), HEPPS: 4- (2- Hydroxyethyl) -piperazin-l-propansulfonsäure (pH 7,3 bis 8,7) oder MES: 2- (N-Morpholino) ethansulfonsäure (pH 5,2 bis 6,7), Kohlensäure-Silicat-Puffer (pH 5,0 bis 6,2; schwach sauer), Phosphatpuffer: NaH ₂ P0 ₄ + Na ₂ HP0 ₄ (pH 5,4 bis 8,0), ggf. ergänzt um Natriumchlorid (Phosphate Buffered Saline = PBS), Kohlensäu- re-Bicarbonat-Puffer (pH 6,2 bis 8,6; neutral), TRIS: Tris (hydroxymethyl ) -aminomethan (pH 7,2 bis 9,0), Ammoniakpuffer: NH ₃ + H ₂ 0 + NH ₄ C1 (pH 8,2 bis 10,2) oder Citronensäure- oder Citratpuffer, ohne oder ferner beispielsweise mit darin gelösten Detergentien, wie Polysorbate ( (Polyoxyethylen-sorbat) 20, 21, 40, 60, 61, 65, 80, 81, 85, 120, z.B. Tween®) .

Trennsubstanzen können entsprechende Lösungen ohne die Vorläu- fermoleküle der Kryogele sein, oder andere Flüssigkeiten, bei ^¬ spielsweise auch mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeiten, wie Kohlenwasserstoffe (linear, verzweigt, cyclisch, gesättigt oder ganz oder teilweise ungesättigt ) mit 3 bis 40 Kohlenstoffatomen, z.B. Pentan oder Hexan, superflüssiges CO ₂ oder Gase. Sie er ^¬ lauben eine klare räumliche Trennung von Kryogelabschnitten im Kanal mit unterschiedlichen immobilisierten Molekülen mit unterschiedlichen spezifischen Bindungsstellen. Sie können bei der Herstellung jedoch auch weggelassen werden, so dass in Randbereichen durch die unterschiedlichen Lösungsportionen leichte Mischeffekte auftreten können - die Messungen finden dann vorzugsweise in Bereichen ohne Mischung statt.

Die Zuführung der Reihe nach erfolgt dabei vorzugsweise mittels wie oben beschriebener Steuerung der Flüsse und Verweildauern von Lösungen mit dort genannten Vorrichtungen.

Das Abkühlen einer befüllten Vorrichtung, um die darin enthaltenen Lösungen einzufrieren, erfolgt vorzugsweise mittels eines kalten Gases, z.B. kalter Luft, eines Kühlbades, z.B. flüssige Luft oder flüssiger Stickstoff, bei Temperaturen unterhalb des Schmelzpunktes der jeweiligen Lösungen, z.B. im Bereich von 0 bis minus 80 °C, beispielsweise von -10 bis -30 °C. Die Reaktionen zur Ausbildung der Bildung der Kryogele, deren Bindung an die Wand des Kanals und die Bindung der zu immobili ^¬ sierenden Moleküle mit spezifischen Bindungsstellen oder deren Vorläufermoleküle erfolgt vorzugsweise durch Einstrahlung von UV- und/oder sichtbarem Licht, um die Polymerisation und/oder (insbesondere im Falle von eingesetzten ( Prä- ) Polymeren) Vernetzung (insbesondere als radikalische Vernetzung der Kryogel- vorstufen, die Anbindung der zu immobilisierenden Moleküle und die Anbindung der Kryogelmatrix an die Wand des oder der Kanäle zu erreichen.

Hierfür werden geeignete Strahlungsquellen, wie Laser, Halogenlampen, Glühlampen, Plasmalampen, LEDs oder dergleichen, ver- wendet. Die Strahlungsdosis (ergibt sich aus Intensität und Dauer der Bestrahlung) wird derart gewählt, dass eine hinrei ^¬ chende Umsetzung gewährleistet wird, z.B. im Bereich von 0,1 bis 500, wie von 1 bis 50 J/cm ² . Schließlich können der oder die Kanäle der erhaltenen Vorrichtung nach dem Auftauen vorzugsweise mit einer Spüllösung (die auch unspezifische Bindungsstellen absättigende Verbindungen, wie Serumalbumin z.B. von Rind, beispielsweise mit einer wie oben beschriebenen Lösung ohne zu immobilisierende Moleküle oder einer der Trennflüssigkeiten, gespült werden.

Die Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei der eine flüssige oder gasförmige Probe mit Probemolekülen durch eine Vorrichtung der genannten Art geleitet wird und gebundene Mole- küle identifiziert und vorzugsweise auch quantifiziert werden, erfolgt unter üblichen Bedingungen, die eine spezifische (in der Regel nicht-kovalente) Bindung der Probenmoleküle (Analy- ten) ermöglichen, wie oben für das spezifische Binden von Ana- lyten beschrieben.

Mögliche biologische Proben, die zu prüfende Analyten beinhal ^¬ ten, sind beispielsweise: Zellsuspensionen (z.B. tierische, pflanzliche, Protisten-, Bakterien-, Pilzzellen oder Mischungen davon) , Wasserproben aus Gewässern, wie Pfützen, Teichen, Seen, Bächen, Flüssen oder dem Meer, Grundwasser, biologische Flüssigkeiten wie Pflanzensaft, Blut, Blutprodukte, Urin, Schweiß, Tränen, Speichel, Amniocenteseproben, Sperma, Schleimhaut, oder dergleichen . Die optisch (auch für UV-Licht) durchlässigen (transparenten) Bereiche der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind insbesondere geeignet zur Überwachung und Kontrolle. Geeignete Detektions- Systeme hierfür sind beispielsweise solche, die kolorime- trische, fluorometrische oder radioaktive Signale oder Chemilu- mineszenzsignale erfassen können, oder ferner Änderungen des Brechungsindex oder der Dichte, z.B. mittels photoakustischer Einrichtungen. Beispiele für geeignete Detektoren sind Spektro- photometer, Photodioden, Photomultiplier, Mikroskope,

Szintillationszähler, Kameras, gekühlte Charge-Coupled Device- Kameras (CCD), Filme und dergleichen. Bevorzugt sind insbeson ^¬ dere optische Detektionssysteme ; so werden fluoreszenzbasierte Signale beispielsweise mittels Laser-aktivierter Fluoreszenz- Detektionssysteme gemessen mit Lasern, welche eine geeignete Wellenlänge haben, um den Fluoreszenzindikator innerhalb des Systems zu aktivieren. Die Fluoreszenz wird dann beispielsweise mittels einer Photomultiplier-Röhre gemessen. Für die kolorime- trische Detektion werden vorzugsweise spektrophotometrische De- tektionssysteme verwendet, die eine auf die Probe gerichtete Lichtquelle detektieren und eine Messung der Absorbanz oder der optischen Durchlässigkeit ermöglichen (vgl. The Photonics De ^¬ sign and Applications Handbook, Bücher 1, 2, 3 und 4, jährlich von Laurin Publishing Co., Berkshire Common, Pittsfield, MA, USA mit Quellen optischer Komponenten) .

Auch nicht-optische Detektionssysteme können verwendet werden, beispielsweise Temperatursensoren (nützlich bei endothermen oder exothermen Reaktionen), Leitfähigkeit, Impedanz (z.B. durch ISFETS) , Potentiometrie (pH, Ionen) oder Amperometrie (bei Einsatz oxidierbarer oder reduzierbarer Reagenzien, wie Sauerstoff oder organische oxidierbare oder reduzierbare Rea ^¬ genzien) . Beispiele für nützliche Detektionssysteme sind immu- nologische Systeme, beispielweise solche, die eine Detektion von doppelsträngiger DNS ermöglichen, oder insbesondere solche auf Basis interkalierender Verbindungen, die über Fluoreszenz, Fluoreszenz-Quenching oder photometrische Messungen die Messung der Länge synthetisierter Polynucleotid-Moleküle ermöglichen.

Besonders bevorzugt sind auch Varianten, bei denen erst die zu messenden Probenmoleküle an den Kryogelen mit den immobilisierten Molekülen mit spezifischen Bindungsstellen gebunden werden, gefolgt von Molekülen, die an die dann gebundenen Probenmoleküle binden, z.B. Antikörper, die beispielsweise konjugiert sind mit spezifischen Bindermolekülen wie Streptavidin, Avidin oder vorzugsweise Biotin, oder frei sind, und nachfolgende Bindung von Fluoreszenz- oder anderen Farbstoffen tragenden für die an die Probenmoleküle gebundenen Moleküle spezifischen Verbindungen (Detektionsmoleküle) , wie Biotin oder vorzugsweise Streaptavidin oder Avidin, oder mit entsprechend markierten Antikörpern, welche die schweren Ketten der zuerst gebundenen Antikörper spezifisch binden und die an Enzyme wie Meerrettich- Peroxidase oder Grün fluoreszierendes Protein gebunden sind und durch Enzymreaktion oder fluoreszenz- oder photospektroskopisch nachgewiesen werden können , mit anderen Worten, Methoden analog dem Sandwich-ELISA. In einer besonders effizienten (und raschen) Methode werden Detektionsmoleküle (z.B. Fluoreszierender Detektionsantikörper und ggf. andere erforderliche Reagenzien) am Anfang des mikro- fluidischen Kanals (z.B. in der Kapillare) vorgelegt. Anschlie ^¬ ßend kann der Test in einem Schritt durchgeführt werden (siehe z.B. Fig. 2 und die Beschreibung im Beispiel) . Der Stofftrans ^¬ port erfolgt in diesem Fall vorzugsweise passiv (z.B. kapillare Befüllung gefolgt von kontinuierlichem Stofftransport durch Kopplung an Superabsorber . Besonders bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung finden sich auch in der Beschreibung, der Zusammenfassung und den Ansprüchen, die alle hier durch Bezugnahme in die Beschreibung aufgenommen werden.

Die Figuren zeigen:

Schematische Darstellung einer Kapillare während des Herstellungsverfahrens einer erfindungsgemäßen kapil ^¬ larbasierten Vorrichtung. Der obere Teil zeigt eine Kapillare nach der Befüllung mit unterschiedlichen Polymerlösungen, welche durch Luftpolster voneinander getrennt sind. Die untere Aufnahme zeigt dieselbe Ka ^¬ pillare nach dem Einfrieren und der Belichtung mit UV-Strahlung sowie Waschen, wie im Beispiel beschrie ^¬ ben .

Fig. 2: Schematische Darstellung eines Versuchsaufbaus zur

Durchführung einer Anreicherung und Bindung von Probenmolekülen bei der Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Fig. 3: Schematische Darstellung einer ausgewählten Kapillare als Mikrofluidikelement nach dem gemäß dem Bespiel durchgeführten Sandwich-Immunoassay zur Detektion von Analyten samt (hier exemplarisch) Fluoreszenzleser.

Fig. 4: Gemessene Fluoreszenzintensitäten (= mittlerer Grau- wert T - mittlerer Grauwert NC) für die im Beispiel eingesetzten IL- 6-Konzentrationen . Für jede Konzentration sind zwei Datenpunkte (zwei Kapillaren) aufge ^¬ tragen. Die Blankmessung wurde fünfmal durchgeführt zur Ermittlung des Detektionslimits (LOD-Signal = Blank + 3σ) über der Kalibrierungsgeraden (gestrichelte Linie, R ² = 0.997). LOD = 26 pg/ml . Das nachfolgende Beispiel dient der Illustration der Erfindung, ohne ihren Umfang einzuschränken, stellt jedoch auch besondere Ausführungsformen der Erfindung dar.

Der entsprechende Versuchsaufbau wird durch die nachfolgend auch hinsichtlich der Bezugszeichen im Detail beschriebenen Figuren rein exemplarisch belegt (die entsprechenden Bezugszeichen können auch in der allgemeineren Beschreibung und den Ansprüchen bei den korrespondierenden Merkmalen eingesetzt werden) :

Um sowohl den Herstellungsprozess als auch die bioanalytische Anwendbarkeit der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu demonstrieren, wurden kommerzielle Glaskapillaren als Beispiel für Mikro- fluidikelemente 1 (Minicaps 5 μΐ, Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co. KG, Hauptstraße 7 - 15, 74246 Eberstadt, Deutschland) mit einem Durchmesser von 450 ym erst mit einem benzophenonhaltigen Silan (Triethoxybenzophenonsilan, siehe 0. Prucker, C. A. Naumann, J. Rühe, W. Knoll and C. W. Frank, J. Am. Chem. Soc, 1999, 121, 8766-8770) behandelt und anschließend mit Hilfe ei- ner peristaltischen Pumpe (IPC ISMATEC von Cole-Parmer GmbH, Futtererstr. 16, 97877 Wertheim, Deutschland) mit drei verschiedenen Flüssigkeitskompartimenten 2, 3, 4, welche jeweils durch ein Luftpolster als Trennsubstanz 5 voneinander abgetrennt wurden, befüllt (siehe Fig. 1). Die Flüssigkeitskompar- timente waren:

1. 60 mg/1 eines benzophenonhaltigen Co-Polymers (PDMAA- 5%MABP-2.5%SSNa, siehe M. Rendl et al . , Langmuir, 2011, 27, 6116) gelöst in PBS (= NC) (Flüssigkeitskompartiment 2 in Fig. 1)

2. NC + 0,05 mg/ml eines Antikörpers gegen humanes Interleukin 6 (IL-6) (= T) (MAB206-100, R&D Systems, Bio- Techne GmbH, Borsigstraße 7a, 65205 Wiesbaden-Nordenstadt,

Deutschland) (Flüssigkeitskompartiment 3 in Fig. 1)

3. NC + 0,01 mg/1 biotinyliertes BSA (= PC) (A8549, Sigma- Aldrich Chemie GmbH, München, Deutschland) (Flüssigkeits ^¬ kompartiment 4 in Fig. 1) .

Es wurden jeweils 0.45 μΐ Flüssigkeit (A, B oder C) bzw. Luft als Trennsubstanz 5 eingefüllt.

(Anmerkung: Die Formel des verwendeten Polymers unter 1. kann wie folgt dargestellt werden:

5% MABP 92,5% DMAA 2,5% SSNa

Die Verteilung der einzelnen Monomere im Polymer ist statistisch gegeben.) Die eingefüllten Flüssigkeitskompartimente A, B, C wurden an- schließend durch Abkühlen der Kapillaren auf -25 °C eingefro ^¬ ren. Nach dem Einfrieren wurden die Kapillaren mit UV-Licht (365 nm) für 15 min (entsprechend einer Energiedosis von rund 30 J/cm ² ) belichtet (VL-UVA 135. M, 365 nm, 28 mW/cm ² , Vilber Lourmat, Deutschland) , um die Benzophenongruppen photochemisch anzuregen. Dabei laufen durch unspezifische, radikalische Reak ^¬ tionen (C-H-Insertionsreaktionen) drei Prozesse gleichzeitig ab : · Vernetzung der Polymerstränge (Ausbildung der Kryogel- matrix)

• Anbindung der Probenmoleküle (Antikörper und BSA) an die Kryogelmatrix

• Anbindung der Kryogelmatrix an die silanisierte Glaskapil- larwand (räumliche Fixierung der Inhaltsstoffe der Flüs- sigkeitskompartimente als Kompartimente) .

Nach dieser Methode hergestellte Kryogele wiesen Porengrößen im tiefen ym-Bereich auf (typischerweise 5 - 25 ym) .

Resultierende Mikrofluidikelemente 1 sind in Fig. 1 unten dar ^¬ gestellt. 6 bezeichnet dabei die Bereiche ohne Moleküle mit spezifischen Bindungsstelle (Bereiche der Trennsubstanz 5 in Fig. 1 oben), hier beinhaltend den zum Waschen verwendeten Waschpuffer. 7, 8 und 9 bezeichnen an das Fluidikelement 1 ge ^¬ bundene Kryogelabschnitte entsprechend den oben unter A, B und C genannten Flüssigkeitskompartimenten 2, 3, 4.

Fig. 2 neben den Kryogelabschnitten 7, 8 und 9 zeigt exemplarisch einen Teil des Versuchsaufbaus , wobei weiter neben be ^¬ reits beschriebenen Merkmalen aus Fig. 1. Eine gasförmige oder hier flüssige Probe mit Analyten 11 aus einer Mikrotiterplatte 10 wird durch das Mikrofluidikelement 1 - hier mittels einer Pumpvorrichtunge 13 gezogen. Parallel werden weitere (nicht dargestellt) derartige Mikrofluidikelemente 1 aus unterschied ^¬ lichen Löchern mit unterschiedlichen flüssigen Proben mit Ana- lyten 11 gespeist werden - jedes Mikrofluidikelement 1 kann dann an eine beispielsweise peristaltische Multikanal-Pumpe als Pumpvorrichtung 13 angeschlossen sein. Anschließend werden die Assay-Komponenten, welche in einer Multiwell-Platte (Mikrotiterplatte) vorgelegt werden, nacheinander durch die Ka- pillaren gezogen. (12 zeigt - anders als im nachfolgenden Beispiel - eine mögliche Stelle für ein alternativ mögliches Vor ^¬ legen von Detektionsmolekülen) .

Gemäß Beispiel wird wie folgt vorgegangen: Nach der Belichtung wurden die Kapillaren (als Mikrofluidikelemente 1) aufgetaut und an eine peristaltische 12-Kanal-Pumpe als Pumpvorrichtung 13 (IPC ISMATEC von Cole-Parmer GmbH, Futtererstr. 16, 97877 Wertheim, Deutschland) angeschlossen. Die Kapillaren wurden für ca. 2 Stunden mit PBS-0.1% BSA mit einer durchschnittlichen Flussrate von 2 μΐ/min gewaschen. Anschließend wurde mit ver ^¬ schiedenen IL-6-Standards (0 bis 1000 pg/ml in PBS-0.1 % BSA) ein klassischer Sandwich-Immunoassay (mit optischer Detektion eines fluoreszenzmarkierten Detektionsantikörpers ) durchge ^¬ führt. Dazu wurden schrittweise folgende flüssige Proben mit Analyten 11 und Reagentien/Lösungen für die angegebene Zeit durch die Kapillaren gepumpt:

1. IL- 6-Standards für 90 min

2. PBS-0,1 % Tween für 10 min

3. Biotinylierter Detektionsantikörper BAF206, R&D Systems,

Bio-Techne GmbH, Borsigstraße 7a, 65205 Wiesbaden- Nordenstadt, Deutschland) (1 yg/ml in PBS-0,1% BSA) für 40 min 4. PBS-0.1% Tween für 10 min

5. Streptavidin-Cy5 (1 yg/ml in PBS-0.1% Tween) für 20 min

(PA45001, GE Healthcare Europe GmbH, Oskar-Schlemmer-Str .

11, 80807 München, Deutschland)

6. PBS-0,1% Tween für 15 min.

Die aus den in Fig. 1, Fig. 2 gezeigten Kryogelabschnitte 7, 8, 9 hervorgehenden Abschnitte 14, 15 und 16 in Fig. 3 weisen die entsprechend spezifisch gebundenen Probenmoleküle auf, an die biotinylierter Detektionsantikörper und Streptavidin-Cy5 gebunden sind. Mittels einer Lichtquelle 17 wird die Fluoreszenz an ^¬ geregt und mittels eines optischen Detektors 18 (der an belie ^¬ biger Stelle, z.B. an den zwei gezeigten Positionen, angeordnet sein kann) detektiert .

Im konkreten Beispiel wurden die Kapillaren in einem kommerziellen Fluoreszenzleser (Fluorescent Array Imaging Reader, Sensovation AG, Markthallenstraße 5, 78315 Radolfzell, Deutsch ^¬ land) analysiert.

Die mit unterschiedlichen Mengen an IL-6 enthaltenen Resultate werden in Fig. 4 gezeigt. Die Linearität erlaubt eine Kalibrie ^¬ rung, mit der dann IL6-Proben quantifiziert werden können.

/ Ansprüche