本发明涉及一种干细胞及其制备方法和应用， 尤其涉及一种动物胚胎干 细胞系及其制备方法和应用， 属于细胞生物学和发育生物学技术领域。 背景技术

转基因动物对于现代医学及生物学研究提供了 重要的研究模型，但由哺 乳动物获得转基因动物仍然非常困难。

在现有技术中， 转基因动物主要是通过原核显微注射法， 或者利用胚胎 干细胞和同源重组技术， 对动物进行转基因而获得。 原核显微注射法是将外 源的目的片段导入到雄原核内， 此法一直都被认为是转基因动物研制的经典 方案， 但其有很大的局限性， 突出表现为外源基因整合位点和基因拷贝数的 高度不确定性， 由此往往引起动物后代表型差别很大； 利用胚胎干细胞和同 源重组技术， 通过胚胎干细胞种系嵌合的方案， 可以实现定点敲入或敲除的 基因打靶， 但其局限性在于获得纯种转基因动物的周期长 ， 且效率不高。

并且， 对于啮齿类之外的哺乳动物， 如非人灵长类， 缺乏具有种系嵌合 的胚胎干细胞， 从而缺乏可以传递遗传修饰的载体， 因此很难获得转基因动 物。

因而， 研究设计一种能够高效快速、 应用范围广地制备转基因动物的方 法， 极大地推动转基因动物生产技术在全世界范围 内的推广和应用， 成为一 种必要。 发明内容

因此， 本发明的目的是针对目前转基因动物生产技术 效率低， 不能广范 围地推广和应用的不足， 提供一种动物胚胎干细胞系及其制备方法和应 用， 就可以快速、 直接、 高效地获得转基因动物。 本发明还开创了一种生产转基 因动物的快速而直接的方法， 使疾病模型的转基因动物的生产更加简捷。

针对上述目的， 本发明提供的技术方案如下：

一方面， 本发明提供一种小鼠单倍体胚胎干细胞系， 所述细胞系是保藏 号为 CGMCC No. 6037的孤雄单倍体胚胎干细胞系 N-1-1 (该细胞系的分类 命名为小鼠单倍体胚胎干细胞， 并于 2012年 4月 19 日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （CGMCC ) , 地址： 北京市朝阳区 北辰西路 1号院 3号， 中国科学院微生物研究所； 邮编： 100101 ) 。

优选地， 所述小鼠单倍体胚胎干细胞系可分化为三个胚 层的细胞， 更优 选地， 所述三个胚层的细胞为脑室、 肌肉和腺体。

另一方面， 本发明提供一种大鼠单倍体胚胎干细胞系， 所述细胞系是保 藏号为 CGMCC No. 6038的孤雄单倍体胚胎干细胞系 HD2-2 (该细胞系的 分类命名为大鼠单倍体胚胎干细胞， 并于 2012年 4月 19日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （CGMCC ) , 地址： 北京市朝 阳区北辰西路 1号院 3号， 中国科学院微生物研究所； 邮编： 100101 ) 。

优选地， 所述大鼠单倍体胚胎干细胞系可分化为三个胚 层的细胞， 更优 选地， 所述三个胚层的细胞为脑室、 肌肉和腺体。

还一方面， 本发明提供一种动物转基因胚胎干细胞系， 所述细胞系是通 过将 EFl a启动子连接的 GFP基因的质粒转染于本发明所述的小鼠单倍体 胚胎干细胞系或本发明所述的大鼠单倍体胚胎 干细胞系而获得。

再一方面， 本发明提供一种动物胚胎干细胞系的制备方法 ， 包括以下步 骤：

1 )将核移植的动物精子细胞注入核移植的动物� �母细胞， 或将核移植 的动物精子细胞注入动物卵母细胞后去雌核， 然后再吸出卵母细胞的纺锤 体, 构建成孤雄单倍体胚月台 ( Androgenetic haploid embryonic stem cells, ahESCs );

2 )将步骤 1 )制得的孤雄单倍体胚胎培养成桑葚胎； 或将步骤 1 )制得 的孤雄单倍体胚胎培养成嚢胚；

3 )将步骤 2 )培养成的桑葚培或嚢胚先接种于饲养层细胞� �， 再接种于 胚胎干细胞培养液中， 制得原代孤雄单倍体胚胎干细胞；

4 )将所述原代孤雄单倍体胚胎干细胞传代培养� � 4〜5代时， 通过流式 细胞仪分选出孤雄单倍体胚胎干细胞；

5 )重复步骤 4 ), 直至获得单倍体比例为 85%〜100%的孤雄单倍体动物 胚胎干细胞系。

优选地， 在步骤 1 ) 中， 所述精子细胞为去尾后的精子头， 于 M2操作 液中将去尾后的精子头注入卵母细胞中； 优选地， 所述动物精子细胞和动物 卵母细胞来源于小鼠或大鼠。 优选地， 在步骤 1 ) 中， 所述雌核通过 HCG激素超排处理 20小时后去 除。

优选地， 在步骤 2 ) 中， 将孤雄单倍体胚胎在含有 5 μ g/ml细胞松弛素 的 KSOM-AA培养液中激活 5-6h后， 再将激活后的孤雄单倍体胚胎转移至 不含细胞松弛素的 KSOM-AA培养液中进行体外培养 72小时形成桑葚胎。

优选地， 在步骤 2 ) 中， 将孤雄单倍体胚胎移植入 0.5dpc的假孕动物输 卵管中， 96h后形成嚢胚。

优选地， 在步骤 3 ) 中， 所述饲养层细胞由胚胎成纤维细胞制得， 所述 胚胎干细胞培养液包括 N2B27培养液和添加物， 优选地， 当精子细胞和卵 母细胞来源于小鼠时， 所述添加物包括 Knockout血清替代物 （ KOSR )、 白 血病抑制因子、 MEK抑制因子、 GSK3 β抑制因子和细胞周期蛋白 Ρ53的抑 制因子； 或

优选地， 当精子细胞和卵母细胞来源于大鼠时， 所述添加物包括 Υ27632, A83-01、 CHIR99021和 PD0325901 ;

更优选地， 所述添加物还包括生长因子， 最优选地， 所述生长因子为大 鼠生长因子或小鼠生长因子。

又一方面， 本发明提供一种转基因动物的制备方法， 包括以下步骤： 将 EF1 α启动子连接的 GFP基因的质粒转染于本发明所述的动物胚胎干 细胞系 的制备方法制得的动物胚胎干细胞系， 制得动物转基因胚胎干细胞系， 再将 所述动物转基因胚胎干细胞系注射入卵母细胞 胞浆中获得重构胚，再将重构 胚移植入假孕动物体内， 假孕发育后， 获得转基因动物， 优选地， 将重构胚 移植入 0.5dpc的假孕动物输卵管内； 优选地， 所述假孕动物为小鼠或大鼠。

优选地， 将所述动物转基因胚胎干细胞系通过显微操作 注射入预激活的 ΜΠ期的卵母细胞胞质中得到重构胚， 再将重构胚激活后， 体外培养至为 2 倍体；

优选地， 所述 ΜΠ期的卵母细胞通过 SrCl ₂ 预激活 20分钟；

优选地， 当所述假孕动物为小鼠时， 所述重构胚用含 SrCl ₂ 的 CZB激活 液激活 3小时； 或

当所述 4叚孕动物为大鼠时， 所述重构胚用 150μΜ 的丁 内 酯 I(Butyrolactone I, BLI)激活液（购自 BIOMOL公司 )激活 3小时；

优选地， 所述重构胚体外培养 24小时至为 2倍体。

优选地， 所述动物转基因胚胎干细胞系注射入卵母细胞 胞浆中前还包括 将细胞系筛选为 G0/G1 期细胞系或核中期细胞系的步骤， 优选地， 所述

G0/G1期细胞系通过先将所述的动物转基因胚� ��干细胞系进行活体染色， 再 通过流式细胞仪筛选得到； 所述核中期细胞系通过将动物转基因胚胎干细 胞 系用秋水仙素预处理 3小时或用诺考达唑预处理 10小时得到。

还一方面， 本发明提供一种本发明所述的小鼠单倍体胚胎 干细胞系或本 发明所述的大鼠单倍体胚胎干细胞系或本发明 所述的动物胚胎干细胞系的 制备方法制备的动物胚胎干细胞系在制备转基 因动物试剂盒中的应用，优选 地， 所述转基因动物试剂盒为转基因小鼠试剂盒或 转基因动物试剂盒。

再一方面， 本发明提供一种本发明所述的小鼠单倍体胚胎 干细胞系或发 明所述的大鼠单倍体胚胎干细胞系或发明所述 的动物胚胎干细胞系的制备 方法制备的动物胚胎干细胞系在制备用于分化 为三个胚层的细胞的试剂盒 中的应用， 优选地， 所述三个胚层的细胞为脑室、 肌肉和腺体。

又一方面， 本发明提供一种转基因动物试剂盒或细胞分化 试剂盒， 包括 本发明所述的小鼠单倍体胚胎干细胞系或本发 明所述的大鼠单倍体胚胎干 细胞系或本发明所述的动物胚胎干细胞系的制 备方法制备的动物胚胎干细 胞系。 本发明所述的孤雄单倍体动物胚胎干细胞系不 仅具有胚胎干细胞的基 本特性， 而且其能够使卵母细胞受精，进而发育形成完 整的动物个体。故而， 从制作转基因动物的角度来讲， 可以对 ahESCs进行基因打靶， 然后通过卵 母细胞胞浆注射的途径获得带有特定基因修饰 的动物后代。本发明涉及的利 用孤雄单倍体胚胎干细胞系研制转基因动物的 方法，一方面，可以对 ahESCs 进行高效地定点打靶， 并且利用干细胞快速自我更新的特点大量扩增 转基因 单倍体干细胞； 另一方面， 利用 ahESCs能够使卵母细胞体外受精发育成动 物个体的能力， 将基因改造的遗传特征遗传至下一代， 并通过杂交一代的自 交， 就可以快速、 直接、 高效地获得转基因动物， 无需胚胎干细胞种系遗传， 这大大缩短了获得纯种转基因动物的周期。 研究表明， 孤雄单倍体胚胎干细 胞系在基因表达上表现出与二倍体胚胎干细胞 相似的特征， 而与圓形精子细 胞差异很大。 所以， 本发明无论是对于基础科学研究， 还是对于研究新型的 转基因动物制作技术， 都具有巨大的理论和应用价值。 本发明通过构建小鼠 和大鼠两类啮齿类动物的 ahESCs, 分别使其能够遗传至下一代， 不仅为开 创新型辅助生殖技术奠定了基础， 同时还开创了一种生产转基因动物的快速 而直接的方法， 使疾病模型的转基因动物的生产更加简捷、 方便。 从转基因 单倍体细胞直接到转基因动物的新方法， 不仅可以帮助大动物的优育优生， 繁育优质新品种， 同时还能从细胞的角度， 改善父源遗传疾病， 甚至加速物 种的进化。 附图的简要说明

以下， 结合附图来详细说明本发明的实施例， 其中：

图 1显示本发明所述的单倍体胚胎干细胞系通过� �式细胞仪进行单倍 体分选的试验结果， 图中， P2表示 G0/G1期的单倍体胚胎干细胞系； 图 2显示小鼠的单倍体胚胎细胞；

图 3显示本发明所述的小鼠单倍体胚胎干细胞系� �

图 4显示本发明所述的孤雄单倍体胚胎干细胞系� �核型； 图 5显示本发明所述的孤雄单倍体胚胎干细胞表� �不同多能性的分 子标记通过免疫荧光染色的试验结果， 其中， 图 5A为表达 Oct3/4通 过免疫荧光染色的试验结果； 图 5B为表达 Nanog通过免疫荧光染色的 试验结果； 图 5C为表达 Sox2通过免疫荧光染色的试验结果； 图 5D为 表达 SSEA- 1通过免疫荧光染色的试验结果；

图 6 显示本发明所述的孤雄单倍体胚胎干细胞系具 有三胚层 的分化潜能， 其中， 图 6A为本发明所述的孤雄单倍体胚胎干细胞 系分化形成的脑室； 图 6B为本发明所述的孤雄单倍体胚胎干细胞 系分化形成的肌肉； 图 6C为本发明所述的孤雄单倍体胚胎干细胞 系分化形成的腺体；

图 7 显示本发明所述的孤雄单倍体胚胎干细胞系注 入卵母胞 浆细胞后得到的单倍体后代；

图 8显示本发明所述的单倍体后代小鼠胎儿的 SSLP遗传学分析结果， 其中，图 8A为 PCR扩增小鼠样品中 D7Mit44的电泳结果； 图 8B为 PCR 扩增小鼠样品中 D8Mit94的电泳结果； 图中 1表示 DNA标记， 2表 示 CD- I 小鼠尾尖细胞样品的 PCR产物， 3表示 C57BL/6小鼠尾尖 细胞样品的 PCR产物， 4为 DB A/2小鼠尾尖细胞样品的 PCR产物， 5为 129Sv/Jae小鼠尾尖细胞样品的 PCR产物， 6为本发明所述的 孤雄单倍体胚胎干细胞系 （N- 1 - 1 )样品的 PCR产物， 7为单倍体后 代小鼠胎儿尾尖细胞样品的 PCR产物； 图 9显示改造后的 Plenti6.0线性化载体的图谱；

图 10 显示本发明所述的小鼠转基因胚胎干细胞系的 绿色荧光 蛋白显色图；

图 11 显示本发明所述的小鼠转基因胚胎干细胞系通 过流式细胞仪 进行单倍体分选的试验结果， 图中， P2表示 G0/G1 期和核中期的单倍体 胚胎干细胞系。

本发明的生物材料的保藏信息：

保藏号为 CGMCC No. 6037的小鼠胚胎干细胞， 该细胞系的分类命名 为小鼠单倍体胚胎干细胞， 并于 2012年 4月 19日保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心 （CGMCC ) , 地址： 北京市朝阳区北辰 西路 1号院 3号， 中国科学院微生物研究所； 邮编： 100101。

保藏号为 CGMCC No. 6038的大鼠胚胎干细胞， 该细胞系的分类命名 为大鼠单倍体胚胎干细胞， 并于 2012年 4月 19日保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心 （CGMCC ) , 地址： 北京市朝阳区北辰 西路 1号院 3号， 中国科学院微生物研究所； 邮编： 100101。 实施发明的最佳方式

可以理解的是， 在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表 示， 其并 不作为对本发明的限制。 在不偏离本发明范围的情况下， 本发明的主要特征 可以用于各种实施方式。 本领域的技术人员将会意识到或能够确认， 仅仅使 用常规实验， 许多等同物都能应用于本文所描述的特定步骤 中。 这些等同物 被认为处在本发明的范围之内， 并且被权利要求所覆盖。 除非特别说明， 以下实施例中所用的试剂均可从常规渠道获得 ， 所用的 方法均为常规试 ^全方法。

以下实施例中所用的试验材料 CD-I ( ICR )、 C57BL/6、 DBA/2、 129Sv/Jae 和 SCID品系的小鼠， DA、 SD品系的大鼠均购自北京维通利华实验动物技 术有限公司。

B6D2F1品系的小鼠由购买的 C57BL/6和 DBA/2品系的小鼠交配所得， 小鼠胚胎成纤维细胞购自中国科学院动物研究 所。 M2操作液（购自 Sigma 公司） ， KSOM-AA培养液和 CZB激活液的配方分别如下： 表 1 配制 lOO ml KSOM (培养液）所需的组分及含量

注： *制作微滴用， 因计划使用量可适当增减配液的总体积（储存 时间不可过两周） 实施例 1构建孤雄单倍体胚胎

釆用两种不同的方法获得孤雄单倍体胚胎， 这两者方法在大小鼠中都可 以用于构建单倍体胚胎， 此处分别阐述。

小鼠单倍体胚胎： 通过 Qi Zh0U开创的"一步法 "核移植技术进行孤雄单 倍体胚胎重构 ⁽¹⁾ 。 具体如下， 取用 8周龄的 129Sv/Jae雄鼠以断颈法处死， 取其输精管内的精子。 将精子在超声波震荡仪中断去尾部， 剩下精子头部， 这些精子头部作为核移植的供体细胞。核移植 的卵母细胞取自 8周龄的接受 过超排处理的 B6D2F 1雌鼠。 在 piezo压电式显微操作仪下， 于 M2操作液 中进行显啟操作， 将预处理好的精子头部注入到卵母细胞中， 同时吸出卵母 细胞的纺锤体， 重构好的胚胎称为孤雄单倍体胚胎（ Androgenetic haploid embryo, AHE ) 。 核移植操作后， 重构单倍体胚胎在含有 5 g/ml细胞松弛 素（CB )的 KSOM-AA培养液中激活（精子本身成分即可激活� �母细胞） ， CB的目的是防止极体排出， 以确保胚胎基因组的单倍体特性。 激活 5〜6小 时后， 将单倍体胚胎转移入不含 CB的 KSOM-AA培养液中进行体外培养， 培养箱的条件为 37°C , 5% C0 ₂ 。 孤雄单倍体胚胎在体外培养 72小时后， 部 分胚胎发育至桑葚胚， 这些桑葚胚种植入胚胎干细胞培养液中可建立 单倍体 胚胎干细胞系。

大鼠单倍体胚胎：孤雄单倍体重构釆取受精卵 去雌原核的方法。具体为， 体内冲取 DA、 SD的品系杂交受精卵， 在 HCG激素超排处理 20小时后， 进行去原核操作。 重构后的孤雄大鼠单倍体胚胎移植入 0.5 dpc的假孕母鼠 输卵管中， 96小时后冲取大鼠孤雄单倍体嚢胚。 实施例 2孤雄单倍体胚胎干细胞系 （ ahESCs ) 的建立

利用重构的 AHE桑葚胚， 高效的建立 ahESC细胞系。 建系初期， 将单 倍体胚胎接种在饲养层细胞上， 所述饲养层细胞是利用小鼠胚胎成纤维细胞 制备的。 建立单倍体胚胎干细胞系的培养液由 N2B27基础培养液 (GIBCO) 及各种添加物所组成，其中 N2B27基础培养液参照 Ying QL等的报道 ⁽²⁾ , 添 加物包括 Knockout血清替代物 （KOSR ) ( GIBCO ) 、 白血病抑制因子 (Millipore), MEK抑制因子 (Stemgent)、 GSK3 抑制因子 (Stemgent)、 细胞周 期蛋白 P53的抑制因子 (Calbiochem)等。 胚胎接种后 6天左右挑克隆， 挑克 隆时用 0.25%胰酶进行消化， 消化后继续培养建立单倍体干细胞系， 此时细 胞的代次记为原代孤雄单倍体胚胎干细胞（P1 )。 每隔 2〜3天， 将单倍体胚 胎干细胞传代一次。 在单倍体细胞传至第 4〜5代时， 通过细胞流式纯化细胞 系中的单倍体细胞。流式筛选的方法主要参照 Elling U等人的单倍体纯化办 法 (3) , 本实 3全釆用 ^gml" ¹ Hoechst33342和 50μΜ Verapamil ( Sigma )处理细 胞 30分钟， 然后进行单倍体细胞分选 ⁽³⁾ 。 在细胞培养的过程， 每隔 4〜5代对 细胞系进行单倍体纯化， 获得长期稳定的孤雄单倍体胚胎干细胞系， 即小鼠 单倍体胚胎干细胞系， 结果如图 1所示， 最后得到单倍体比例为 85%以上的 单倍体胚胎干细胞系。 通过活细胞工作站（莱卡）观察该小鼠单倍体 胚胎干 细胞系 （即保藏号为 CGMCC No.6037的小鼠单倍体胚胎干细胞系） ， 结果 如图 3所示， 该小鼠单倍体胚胎干细胞系具有与二倍体小鼠 干细胞（ESCs ) 相似的克隆形态。

大鼠单倍体胚胎干细胞系的建系体系与小鼠相 同， 不同的是在小鼠的培 养基的基础上将小鼠生长因子更换为大鼠生长 因子， 并将添加物更改为 Y27632 ( MERCK ) 、 A83-01 ( Stemgent ) 、 CHIR99021 ( Stemgent )和 PD0325901(Stemgent)四种生长因子，得到大鼠单倍� �胚胎干细胞系， 即保藏 号为 CGMCC No.6038的大鼠单倍体胚胎干细胞系， 具体结果未显示。 实施例 3 ¾ 单倍体干细胞系的干细胞功能^

利用 G-带核型的方法 ⁽³⁾ 检测实施例 2制得的孤雄单倍体胚胎干细胞系即 小鼠单倍体胚胎干细胞系， 结果如图 4所示， 其染色体核型为 19+X。

纯化后的孤雄单倍体胚胎干细胞系仍然表达多 能性的分子标记， 如 Oct3/4, Nanog, Sox2, SSEA-1等 ⁽⁶⁾ , 首先将细胞用 4%的多聚曱醛固定 20分 钟， 随后加 0.5%的 Triton X-100处理 30分钟， 添加一抗： 抗 - Oct3/4

( anti-Oct3/4 ) (Santa Cruz), 抗 -Sox2 ( anti-Sox2 ) (Santa Cruz), 抗 -SSEA1 ( anti-SSEAl )和抗 -Nanog ( anti-Nanog ) (Millipore) 在 4°C冰箱孵育过夜， 随后用二抗： AlexaFlur 488连接的二抗 ( AlexaFlur 488-conjugated secondary antibody, sigma ) 室温孵育 1小时之后在激光共聚焦显微镜下观察（蔡司� � LSM 780 META). (见图 5 ) 。

将 1 X 10 ⁷ 个孤雄单倍体胚胎干细胞系注射入 6周龄的免疫缺陷 SCID品 系的雄鼠大腿内侧皮下， 三周后长出畸胎瘤， 将畸胎瘤用 4%的多聚曱醛固 定， 石蜡包埋切片， 进行组织学分析发现 ⁽⁶⁾ , 该干细胞系在体外可分化形成 脑室、 肌肉和腺体三个胚层的细胞， 具有三胚层的分化潜能（见图 6, 小鼠 孤雄单倍体胚胎干细胞系的结果， 大鼠孤雄单倍体胚胎干细胞系的结果未显 示） 。

这些结果表明我们所建立的孤雄单倍体胚胎干 细胞系， 与二倍体胚胎干 细胞一样， 具有胚胎干细胞的基本特征。 实施例 4孤雄单倍体胚胎干细胞系注射入卵胞浆中发� �成后代

借鉴卵母细胞胞浆内注射 ( ICSI )实验和圓形精子卵胞浆内注射 ( ROSI ) 实验 ⁽⁴⁾ , 将实施例 2得到的孤雄胚胎干细胞系注射入卵母细胞胞� �中， 通过 人工激活， 并将激活后的胚胎移植入假孕鼠体内， 可以获得该胚胎发育而来 的子代， 此法我们定义为单倍体胚胎干细胞系卵胞浆内 注射

( Introcytoplasmicandrogenetic haploid ES cell injection, ICAI )。 单倍体供体 细胞分为两类： G0/G1期细胞和核中期细胞， G0/G1期细胞通过 Hoechst33342 活体染色， 并通过流式细胞仪精确地筛选得到， 而核中期细胞则通过秋水仙 素预处理 3小时或诺考达唑预处理 10小时得到。 两类供体细胞分别通过显 微操作注射入 SrCl ₂ 预激活 20分钟的 ΜΠ期的 CD-I系小鼠的卵母细胞胞质 中， 再通过含 SrCl ₂ 的 CZB激活液进行激活 3小时。 激活后的重构胚转移入 KSOM-AA培养液中于 37°C , 5%C0 ₂ 进行体外培养。 体外培养 24小时后， 统计卵裂率， 将所有的 2倍体细胞胚胎移植入 0.5dpc ( 0.5天） 的假孕小鼠 输卵管中。假孕小鼠发育 19.5天后分娩或剖腹产，得到单倍体后代小鼠� �儿， 结果如图 7所示。 大鼠的卵母细胞胞浆内注射过程和小鼠相似， 但是激活液 改为终浓度为 150μΜ的丁内酯 I激活液（ Butyrolactonel激活液 ) , 孕期为 21.5天， 能够得到健康后代。

部分的 ICAI出生的小鼠胎儿能存活， 并能成长至性成熟； 将其与野生 型小鼠交配， 可以繁育下一代， 说明单倍体胚胎干细胞系 ICAI动物具有正 常的繁殖功能。 实施例 5单倍体后代小鼠胎儿的 SSLP遗传学分析

通过微卫星标记分子 D7Mit44、 D8Mit94( ⁵ )进行 SSLP遗传学分析， 鉴定 孤雄单倍体胚胎干细胞系与其 ICAI得到的后代小鼠。

取 CD-I ( ICR ) , C57BL/6, DBA/2、 129Sv/Jae品系的小鼠的尾尖细胞, 实施例 2制得的单倍体小鼠单倍体胚胎干细胞系， 实施例 4获得的单倍体小 鼠胎儿的尾尖细胞， 提取 DNA, 进行 PCR扩增， 引物来自

MGI(htt ://www. informatics.j ax. org/searches/probe_form. shtml) , 由生工生物 (上海）有限公司合成， 具体如下述表 3所示： 表 3 引物

扩增条件为 94°C 30秒， 55°C 30秒， 72°C 30秒， 扩增 35个循环， 进 行 PCR扩增， 并将 PCR产物电泳后， 进行显色分析， 图 8A为扩增样品中 D7Mit44的试验结果， 图 8B为扩增样品中 D8Mit94的试验结果， 表明后代 小鼠同时具有孤雄单倍体胚胎干细胞系 （129Sv/Jae )和卵母细胞（CD-I ( ICR ) )两套基因组， 说明孤雄单倍体胚胎干细胞系 ICAI后代小鼠确实来 源于相对应的单倍体胚胎干细胞。 实施例 6对 单倍体胚胎干细胞系进行转基因修饰

以 GFP荧光蛋白为例对孤雄单倍体胚胎干细胞系进 行转基因标记。 按 常规的方法将 Plenti6.0载体（购买自 Invitrogen公司 )携带的 CMV启动子 替换为可以在胚胎干细胞中表达的 EFla启动子 （SEQ ID NO:5 ) (上游引 物： GAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGT ( SEQ ID NO:6 ) ； 下游引物： AATTCCTCACGACACCTGAAATGG ( SEQ ID NO:7 ) , 由生工生物（上海） 有限公司合成； 扩增条件： 95 °C 30秒； 59°C 30秒； 72°C 1分 30秒； 35 循环） ， 并在其后多克隆位点处连接上绿色荧光蛋白基 因 （GFP ) ( SEQ ID NO:8 ) (上游引物： ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC ( SEQ ID NO:9 ) ； 下游引物： TTACTTGTACAGCTCGTCCATG ( SEQ ID NO: 10 ) , 由生工生 物 （上海）有限公司合成； 扩增条件： 95 °C 30秒； 61 °C 30秒； 72°C 1分 30秒； 35循环） ， 还连接有抗性选择基因抗性杀稻瘟菌素基因 （Blasticidin 基因） ， 进行载体的构建。 改造后的质粒可以在胚胎干细胞中表达表达绿 色 荧光蛋白和抗性杀稻瘟菌素基因 （Blasticidin基因） 。 然后将 8 g改造后的 Plenti6.0线性化载体（图 9 )通过电转分别转染于 10 ⁶ 个实施例 2制得的小 鼠单倍体胚胎干细胞系和大鼠单倍体胚胎干细 胞系，经 10 g/ml杀稻瘟菌素 筛选后挑取抗性绿色荧光（如图 10所示， 为小鼠转基因单倍体胚胎干细胞 系的结果， 大鼠转基因单倍体胚胎干细胞系的结果未显示 )表达克隆扩增成 系。 获得的 GFP阳性细胞系通过 Hoechst33342活细胞染色法 ⁽⁶⁾ , 通过流式 细胞仪进行筛选得到既维持单倍体又表达外源 GFP蛋白的动物转基因胚胎 干细胞系， 结果如图 1 1所示， 为小鼠转基因单倍体胚胎干细胞系的结果， 大鼠转基因单倍体胚胎干细胞系的结果未显示 。 实施例 7转基因动物的获得

按照实施例 4描述的方法和条件将实施例 2得到的孤雄胚胎干细胞系替 换为实施例 6获得的动物转基因胚胎干细胞系，从而获得� �基因小鼠和转基 因大鼠。

参考文献

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