本发明属于医药领域，具体涉及一种眼内手术 用前房灌注液及其用途。

背景技术

随着显微镜技术的发展， 内眼手术日趋成熟，数量逐年上升，挽救了很 多失明 患者。 白内障囊外摘除术、 人工晶状体植入、 玻璃体切除术等眼内手术为了平衡眼 内压均需较长时间的液体灌注。 常规眼内灌注液为眼科平衡盐溶液，该溶液缺 乏营 养物质及抗氧化作用 ，在较长手术过程中 ，与角膜内皮细胞长时间接触，容易使得 细胞失去活性甚至发生大片凋亡脱落，而角膜 移植术后患者的视力恢复与角膜内皮 细胞的活性有很大关系。 谷氨酰胺 ( Glutamine , Gin )是体内含量最丰富的游离氨 基酸，约占人体游离氨基酸总量的 60% ,还是许多生物合成途径的氮源 Gin在肠 外营养中对于调节肠道细胞间紧密连接蛋白和 连接完整性至关重要，能有效保护肠 道屏障功能 ² 。 然而， Gin在储存和加热灭菌过程中性质不稳定，并且 在水溶液中溶 解度低，这限制了它的广泛应用 ³ 。 L-丙氨酰 -L-谷氨酰胺 ( L-alanyl-L-glutamine , Ala-Gin ) ,又名丙谷二肽，属于氨基酸类的化学药剂 ，在体内可以释放谷氨酰胺， 目前主要应用于手术后的肠外和肠内营养补充 、 组织器官缺血再灌注损伤的保护 ， 还没有在眼内手术中作为前房灌注液应用的报 道。

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发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处， 提供了一种眼内手术用前房灌注液 及其用途，在平衡眼内压的作用下，还含有一 定量的 L-丙氨酰 -L-谷氨酰胺，解决了 谷氨酰胺性质不稳定、 溶解度低的缺点；该眼内手术用前房灌注液既 对术中角膜内皮 细胞的机械损伤和缺血缺氧有保护作用 ，又能提供营养，应用于术中灌注，以该灌注 液作用于角膜内皮细胞时，可以预防性的逆转 角膜内皮细胞凋亡剥脱，保护角膜内皮 屏障功能，达到更好的手术效果。 本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一 是：

—种眼内手术用前房灌注液，为含有 0.217〜 1.090 mg/mL的 L-丙氨酰 -L-谷氨酰 胺的眼科平衡盐溶液。

—实施例中 ：为含有 1.085〜 1.087 mg/mL的 L-丙氨酰 -L-谷氨酰胺的眼科平衡盐 溶液。

—实施例中 ：所述眼科平衡盐溶液含有 5.95〜 6.00mg/mL 的氯化钠 ， 0.29〜 0.30mg/mL的氯化钾， 0.19〜0.2011^/11 的氯化钙， 3.05〜 3.15mg/mL的乳酸钠。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二 是：

_种上述的眼内手术用前房灌注液制剂的用途� �

L-丙氨酰 -L-谷氨酰胺分子结构如下：

Ala-Gin性质稳定， 易溶于水， 能耐受高温消毒，在体内可迅速分解释放 Gin发挥 其作用， 生物利用度高、 适用范围广， 弥补了 Gin的不足特别是对突发性创伤的病人 具有重要作用， 已作为肠外营养指南用药。 本发明的眼内手术用前房灌注液，在平衡 眼内压的作用下，还含有一定量的 Ala-Gin。 Ala- Gin作为 Gin的合成二肽，在加热灭 菌后性质稳定，在水中溶解度高，研究表明 ， Ala-Gin 可以预防心肌、 肠、 肝或脑缺 血再灌注引起的损伤 ⁴ _ ⁷ ，此外 Ala-Gin在肠外营养中可以增加紧密连接蛋白的� �达， 并维持肠粘膜厚度和绒毛高度以保留肠屏障功 能 ^8,9 。 此外， Ala-Gin在不同生理环境 下还可以抑制炎性因子的释放，减轻炎症反应 ，促进细胞增殖，并防止细胞凋亡和氧 化损伤 ¹⁰ - ¹³ _o 本发明的眼内手术用前房灌注液应用于术中前 房灌注，既对术中角膜内 皮细胞的机械损伤和缺血缺氧有保护作用 ，又能提供营养物质，并在手术应激的情况 下保护细胞，提高细胞抗氧化、 抗凋亡能力 ，预防性的逆转角膜内皮细胞凋亡剥脱， 保护角膜内皮屏障功能，达到更好的手术效果 。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进_步说明� �

图 1为 TUNEL法检测各体外实验组和对照组角膜内皮细� ��凋亡照片 ，图中 A : 体外正常组； B : lh对照组； C : 2h对照组； D : lh实验组； E : 2h实验组。

图 2为免疫荧光染色法检测各体外实验组和对照� �角膜内皮细胞骨架 F-actin照 片 ，图中 A :体外正常组； B : lh对照组； C : 2h对照组； D : lh实验组； E : 2h实 验组。

图 3为活体共聚焦检测前房灌注后角膜内皮细胞� �形态，图中 A :正常组； B : lh对照组； C : lh实验组。 具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明的内容：

实施例 1眼内手术用前房灌注液的制备：

本实施例的眼内手术用前房灌注液每 lmL含有如下成分：

氯化钠 5.95〜 6.00mg

氯化钾 0.29〜 0.30mg

氯化钙 0.19〜 0.20mg 乳酸钠 3.05〜 3.15mg

L-丙氨酰 -L-谷氨酰胺 0.217〜 1.086mg。

实施例 2灌注液处理角膜实验及前房灌注实验

一、 实验对象

健康清洁级 6~8周龄 ICR小鼠 30只，体重 20〜 25g，雌雄不限。

二、 实验试剂

L-丙氨酷 -L-谷氨酷胺、 Invitrogenä Alexa Fluorä 594 Phalloidin、 Triton X- 100、 牛血清白蛋白（BSA X 磷酸盐缓冲液（PBS）、 戊巴比妥、 丙酮、 复方托吡卡胺滴眼 液、 DAPI染色液。

三、 实验仪器

手术显微镜、 正置多光子激光共聚焦系统 Olympus FV1000MPE-B、、 海德堡共焦 激光角膜显微镜。

四、 实验方法

1. 分离角膜

颈椎脱臼法处死小鼠，摘除眼球。 生理盐水冲洗后，将小鼠角膜沿角膜缘剪下， 除去虹膜、 睫状体等。 分离角膜的操作均在手术显微镜下进行，防止 对角膜的机械损 伤。

2. 处理角膜

2.1体外实验组

将角膜迅速移入装有实施例 1所得灌注液的容器中 ，此时计为 0时，于 1 h和 2h 后取出角膜， 4%多聚甲醛 4 ^° C固定过夜，通过 TUNEL法检测细胞凋亡，免疫荧光染 色法 F-actin染色查看角膜内皮细胞骨架。 2.2体外对照组

按以上步骤分离角膜，将角膜迅速移入常规灌 注液（为眼科平衡盐溶液，即不添 加 L-丙氨酰 -L-谷氨酰胺，其余组分及含量与实施例 1的眼内手术用前房灌注液相同） 中 ，此时计为 0时，于 l h和 2h后取出角膜，4%多聚甲醛 4 ^° C固定过夜，通过 TUNEL 法检测细胞凋亡，免疫荧光染色法 F-actin染色查看角膜内皮细胞骨架。

2.3体外正常组

按以上步骤分离角膜，不经过任何处理，4%多� ��甲醛 4 ^° C固定过夜，通过 TUNEL 法检测细胞凋亡，免疫荧光染色法 F-actin染色查看角膜内皮细胞骨架。

3. 前房灌注

通过 1%戊巴比妥 5mL/kg将小鼠麻醉，在室温下，复方托吡卡胺滴 眼液散曈，开 睑器开睑，在角膜缘 4点方位，用 32G针头以 15°角距角膜缘 2mm处穿刺入前房，置 入 34G的金属灌注针头并固定，避免接触角膜内皮 层及虹膜表面。

3.1体内实验组

迅速将实施例 1所得灌注液与灌注针头相连，以稳定流速进� �前房灌注，每分钟 10滴，此时计为 0时，于 lh后停止灌注，立即采用活体共聚焦拍摄角膜� ��皮细胞照 片。

3.2体内对照组

迅速将常规灌注液与灌注针头相连，以相同流 速进行前房灌注，此时计为 0时， 于 lh后停止灌注，立即采用活体共聚焦拍摄角膜� ��皮细胞照片。

3.3体内正常组

不经过任何灌注处理，采用活体共聚焦拍摄角 膜内皮细胞照片。

4. TUNEL法检测细胞凋亡 将上述步骤得到的角膜放置在 1.5mL离心管内 内皮细胞面朝上 ，1XPBS冲洗后 ， 用冷丙酮固定 3min ;1XPBS冲洗后 用 1%TD-Buffer室温透膜 lOmin，重复 3次；1XPBS 冲洗后 ，与 Equilibration Buffer 4 ^° C卿育 lh，再与试剂盒配制的 rTDT溶液 4 ^° C避光卿 育 4h ;与 2XSSC溶液 4 ^° C避光孵育 40min终止反应 ， 1XPBS冲洗后 DAPI封片。

5. 全角膜平铺片的免疫荧光染色

将上述步骤得到的角膜放置在装有 4%多聚甲醛的 1.5mL离心管后 ， 内皮细胞面 朝上 ， 4°C过夜， 1XPBS冲洗后 ，用冷丙酮固定 3min ; 1XPBS冲洗后用 1%TD-Buffer 透膜 3次，每次 lOmin ;在常温下 ，将角膜放入 2% BSA溶液中封闭处理 1小时。 对 于鬼笔环肽染色，将封闭后的角膜与 F-actin(l:150)染色液室温孵育 90min : 1XPBS冲 洗后 DAPI封片 ， 随即使用激光共聚焦显微镜扫描记录。

五、 实验结果

1. TUNEL法检测细胞凋亡

如图 1 ，镜下观察凋亡角膜内皮细胞的细胞核被染成 绿色 ， 正常内皮细胞核呈蓝 色。 lh时 ， 实验组和对照组的仅有少量凋亡细胞， 随着实验时间的延长，在 2h时 ， 对照组角膜内皮内可见大量的凋亡细胞核， 实验组仅有少量荧光。

2. 免疫荧光染色检测细胞骨架

如图 2A，镜下观察正常角膜内皮细胞排列规则紧密 ，细胞骨架呈规则双轨样结 构。 lh时 ，对照组存在散在的角膜内皮细胞丢失，实验 组角膜内皮完整，细胞骨架排 列规则。 随着实验延长，对照组在 2h时角膜内皮细胞骨架重排， 大量内皮细胞脱落， 角膜内皮的完整性以及屏障功能被破坏， 实验组在 2h 时角膜内皮细胞骨架未见明显 改变。

3. 活体共聚焦检查结果 如图 3 ， 正常组角膜内皮细胞呈六边形 ， 大小均等 ，细胞间连接紧密 ；实验组在 前房灌注后 ，角膜内皮细胞多形性增加 ，细胞边界清晰，未见内皮细胞剥脱，细胞间 连接完整；对照组在前房灌注后 ，角膜内皮细胞丧失正常六边形 ，细胞间间隙扩大 ， 边界不清 ，细胞核高反光。

本发明中的眼内灌注液既保持了原有灌注、 平衡眼内压的作用 ，对眼内组织无毒 副作用 ，加入一定浓度的 Ala-Gin , 又能对手术过程中缺血缺氧起保护作用 ，还能提 供营养物质 ， 可以预防性的减少角膜内皮细胞凋亡剥脱，能 够很好的维持角膜内皮细 胞形态 ，保护角膜内皮的完整性和屏障功能，从而得 到更好的手术效果， 是一种良好 的新型眼内手术用前房灌注液。

以上所述 ，仅为本发明较佳实施例而已 ，故不能依此限定本发明实施的范围 ， 即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效 变化与修饰， 皆应仍属本发明涵盖的 范围内。 工业实用性

本发明公开了 _种眼内手术用前房灌注液及其用途 ，在平衡眼内压的作用下 ， 还含有 _定量的 L-丙氨酰 -L-谷氨酰胺。 白内障囊外摘除术、 人工晶状体植入、 玻璃 体切除术等眼内手术均需较长时间的液体灌注 ， 而常用眼科灌注液为平衡盐溶液， 缺乏营养物质及抗氧化作用 ，对角膜内皮细胞的影响不容忽视。 本发明提供的眼内 手术用前房灌注液应用于术中灌注 ，既对术中角膜内皮细胞的机械损伤和缺血缺 氧 有保护作用 ， 又能提供营养物质 ， 可以预防性的逆转角膜内皮细胞凋亡剥脱 ，保护 角膜内皮屏障功能，达到更好的手术效果，具 有良好的工业实用性。