本发明涉及乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV)检测及乙 型病毒性肝炎临床诊断领域， 更具体地涉及通过定量检测乙型肝炎 病毒核心蛋白抗体 ( Antibodies against hepatitis B core protein, Anti-HBc) ， 监控慢性乙型肝炎患者病情进展， 并有效 预测慢性乙型病毒性肝炎（Chronic hepatitis B) 患者接受抗乙 型肝炎病毒治疗 （特别是基于干扰素的治疗和基于核苷 /核苷酸类 似物抗 HBV药物的治疗）的疗效， 从而指导病人进行合理药物选择 的方法。 背景技术

乙型肝炎病毒感染，尤其是慢性乙型肝炎病毒 感染是全球最为 重要的公共卫生问题之一， 目前全球约有超过 3.5亿的慢性乙型肝 炎病毒感染者。慢性乙型肝炎病毒感染可造成 慢性乙型病毒性肝炎 ( Chronic hepatitis B, CHB) 、 肝硬化 (Liver cirrhosis, LC ) 和原发性肝细胞癌 （Hepatocellular carcinoma, HCC )等肝脏疾 病， 由慢性乙型肝炎病毒感染及其所引起的相关疾 病所导致的死 亡， 全球每年超过 100万人 [1]。

当前针对慢性乙型肝炎病毒感染的治疗药物主 要可分为干扰 素 ( Interferon, IFNs ) 和核苷 /核苷酸类似物 ( nucleoside or nucleotide, NAs)两类。 前者包括普通干扰素 （IFN)和聚乙二醇干 扰素 （Peginterferon, Peg-IFN，又称为长效干扰素） ， 主要通过 整体增强患者免疫能力， 来达到抑制 HBV和治疗 CHB的效果； 后者 主要包括拉米夫定 （ lamivudine , LMV ) 、 阿德福韦酯（adefovir dipivoxi l, ADV) 、 恩替卡韦 (Entecavir, ETV) 、 替比夫定 (Telbivudine, LdT)、 替诺福韦 (Tenofovir)等 5种， 主要通过直 接抑制 HBV的聚合酶活性从而抑制 HBV复制。对慢性乙型肝炎病毒 感染来说，采用上述药物进行慢性乙型肝炎治 疗的最终目标是患者 患者达到乙型肝炎病毒表面抗原 ( Hepat i t i s B surface ant igen, HBsAg ) 血清学阴转或血清学转换 ( HBsAg loss or HBsAg seroconvers ion )。 但由于现有的上述药物实现 HBsAg血清学阴转 或血清学转换的效果十分有限， 常常需要持续治疗数年以上的时 间。 而乙型肝炎病毒 E抗原血清学转换（HBeAg seroconvers ion ) 是慢性乙型肝炎病毒感染自然历史过程中的另 一个重要的里程碑 事件， 通常伴随着临床肝炎病情的緩解和良好的疾病 预后， 因此目 前临床医生和研究者常以 "接受治疗后患者是否发生 HBeAg血清学 转换"作为判断治疗是否有效的主要指标。 除 HBeAg血清学转换之 夕卜， 持续病毒学应答 ( Sus ta ined virologica l response, SVR ) 也是临床判断慢性乙型肝炎治疗疗效的次要指 标 [2， 3]。

以能使慢性乙型肝炎病人达到 HBeAg血清学转换的为治疗终点 来看， IFNs类药物和 s类药物在治疗疗效和药物可接受性上有较 大区别。 IFNs 类药物（主要指 Peg-IFN或长效干扰素）疗效优于 NAs类药物， 前者治疗 1年（ 52周）可使得 30-50%的 HBeAg阳性的 病人实现 HBeAg血清学转换，而后者通常只能使得 10-30%的 HBeAg 阳性的的病人实现 HBeAg血清学转换。 但 IFNs类药物治疗的副作 用较 s类药物更大， 受试者常伴有发热、 头疼、乏力、头发脱落、 白细胞减少等不良反应， 部分患者常无法忍受这些副作用； 相比而 言， 口服 s类药物副作用很小，可接受性较强。在价格� �面， IFNs 类药物（主要指 Peg-IFN或长效干扰素）治疗一年的药物费用约� � 15000RMB以上， 而 Ms类药物通常治疗费用在 10000RMB以下。 鉴 于两类治疗药物的上述区别， 在患者治疗前进行有效评估预测， 进 而选择最优药物进行慢性乙型肝炎治疗， 具有十分重要的意义。

由于患者能否获得实现 HBeAg血清学转换，主要依赖于患者自 身是否具有足够的针对 HBV的特异性免疫能力，或能否通过药物治 疗获得足够的针对 HBV的特异性免疫能力。 因此， 定量测定慢性乙 型肝炎患者针对 HBV特异性免疫能力能够预测慢性乙肝患者接受 治 疗时发现 HBeAg血清学转换几率的大小。 长期以来， 慢乙肝患者血 清 ALT水平被作为衡量宿主抗 HBV免疫能力的间接替代指标。这主 要是因为慢性乙肝患者血清 ALT水平能反映其肝细胞炎症 /坏死程 度， 而 HBV是免疫致病病毒， 其导致肝脏炎症 /肝细胞坏死是由于 抗 HBV T细胞介导的免疫反应， 因此血清 ALT水平与宿主抗 HBV免 疫能力之间存在一定的相关性。 一般认为， 血清 ALT水平大于 2倍 正常值上限 ( The upper norma l l imi t, UL ) 的患者抗 HBV治疗 的疗效（指通过治疗达到 HBeAg血清转换的几率）要显著高于那些 没有肝炎反应， 亦即血清 ALT水平小于正常值上限的慢性乙肝感染 者， 而血清 ALT水平大于 5倍正常值上限的患者抗 HBV治疗的疗效 又要优于那些有肝炎反应但 ALT水平较低的患者。但 ALT水平的测 定， 更多的是反应肝脏炎症的程度， ALT不是一个 HBV特异性的指 标， 易受其他因素的影响 （如共发自身免疫性肝炎、 酒精性肝病、 感染 HCV等其它肝炎病毒）， 而且其半衰期较短， 其预测慢乙肝治 疗疗效并非十分可靠。 除了血清 ALT外， HBV特异性的 T细胞免疫 应答检测方法（如体外刺激细胞因子释放试验 ）等可能也具有预测 慢性乙肝治疗疗效的应用价值， 但其操作比较繁瑣， 临床实践推广 十分困难， 且对检测标本的要求较高 （需要检测新鲜全血标本） ， 应用前景有限。 综上所述， 本领域目前尚缺乏有效的治疗前评估检 测方法。

乙型肝炎病毒核心蛋白抗体 ( Antibodies against hepatitis B core protein, Anti-HBc)是最经典的 HBV感染的血清学指标之 一， Anti-HBc的定性检测 （判断 Anti-HBc是否阳性）迄今已在乙 型肝炎病毒感染的临床诊断中使用超过 35年。血清 Anti-HBc阳性 指示受试者曾经或正被 HBV感染， 同时该抗体在 HBV感染者血清中 常常持续终身存在。 目前已经发明的检测血清 Anti-HBc抗体的方 法主要是基于竟争或抑制免疫检测原理，此类 方法可较好地应用于 Anti-HBc的定性检测，但受技术原理限制，其检� ��动力学线性范围 一般较窄 （通常在 1个数量级范围内） ， 且检测稳定性较差， 不能 4艮好地应用于 Anti-HBc的定量检测。 综述文献可知， 在本发明公 布以前， 尚无有效的 Anti-HBc定量检测方法及试剂； 同时尚不清 楚 Anti-HBc定量检测的临床价值和对应用途。 发明内容

由于乙型肝炎病毒核心蛋白的免疫原性极强， 其血清抗体水平 指示着宿主个体特异性针对 HBV 的体液免疫反应能力 （B cell immune response ) ， 从而反映出宿主抗 HBV的整体免疫能力。 有 鉴于此， 本发明的研究者认为， 精确检测慢性乙肝患者血清 Anti-HBc水平能指示患者针对 HBV的特异性免疫应答强弱，并能预 测其接受药物 （包括干扰素类药物、 核苷 /核苷酸类似物等）治疗 的最终疗效。本发明涉及一种能精确定量检测 乙型肝炎病感染者血 清 /血浆中 Anti-HBc抗体水平的方法， 以及 Anti-HBc定量检测在 监控慢性乙型肝炎患者病情进展和预测慢性乙 型肝炎患者治疗疗 效中的应用。

具体地， 本发明涉及一种能精确定量检测血清 Anti-HBc水平 的免疫学检测方法，该方法可以通过酶联免疫 或者化学发光的检测 方式加以实现。

该方法的性能优势在于其单次检测的线性动力 学范围在 1. 5个 数量级以上， 亦即单次检测准确定量的上限值高于准确定量 的下限 值 32倍以上，这一特征是精确定量检测血清 Ant i-HBc水平的基础， 是本发明之前的 Ant i-HBc检测方法所不具备的。

使用该方法在慢性乙型肝炎病毒感染不同时期 的病人标本及 病人病程自然进展的系列标本中所获得的结果 表明，血清 Ant i-HBc 的定量水平与病人的肝炎活动性及宿主免疫状 态高度相关， Ant i-HBc 的定量测定值能有效分辨患者是否处于免疫活 化或肝炎 活动阶段。 这说明在临床上使用本发明公布的 Ant i-HBc定量检测 方法或其他等效方法有助于对慢性乙型肝炎患 者疾病进展情况的 监测和判断。

使用该方法对接受阿德福韦酯和长效干扰素治 疗的慢性肝炎 病人队列标本中所获得的结果表明， 基线 Ant i-HBc水平与患者的 治疗应答率呈正相关。这说明在临床上使用本 发明公布的 An t i -HBc 定量检测方法或其他等效方法， 能在慢性乙型肝炎患者接受阿德福 韦酯、 长效干扰素或其他基于类似原理的药物治疗前 评估预期疗 效， 有利于指导治疗药物和治疗时机的选择， 进而提高治疗效率。

在另一方面，本发明涉及定量检测乙型肝炎病 毒核心蛋白抗体 水平的试剂在制备用于监控慢性乙型肝炎患者 的病情发展和 /或在 慢性乙型肝炎患者接受抗乙型肝炎病毒治疗前 有效预测其治疗效 果的诊断剂中的用途。

在一个具体实施方式中， 乙型肝炎病毒核心蛋白抗体的定量检 测通过如下方法中的一种或者几种方法来实现 ： 酶联免疫吸附法、 化学发光免疫检测法、 时间分辨荧光检测法、 免疫比浊法、 免疫层 析法、 免疫渗滤法。

在一个具体实施方式中， 乙型肝炎病毒核心蛋白抗体水平的单 次检测的线性动力学范围在 1. 5个数量级以上， 亦即单次检测准确 定量的上限值高于准确定量的下限值 32倍以上。

在一个具体实施方式中， 乙型肝炎病毒核心蛋白抗体的定量检 测包括以下步骤：

a) 提供可与乙型肝炎病毒核心蛋白抗体特异性结 合的乙型 肝炎病毒蛋白，该蛋白可以是包含乙型肝炎病 毒核心蛋白的全长氨 基酸序列 （从第 1位氨基酸到第 183位氨基酸）， 也可以是只包含 乙型肝炎病毒核心蛋白的主要免疫优势区的氨 基酸序列 （如从第 1 位氨基酸到第 149位氨基酸） ， 该蛋白被固相化于固相化载体上， 作为固相抗原，用于捕获血清样品中存在的乙 型肝炎病毒核心蛋白 抗体；

b) 提供可与被捕获到固相抗原上的乙型肝炎病毒 核心蛋白 抗体特异性结合的抗原标记物，该蛋白可以是 包含乙型肝炎病毒核 心蛋白的全长氨基酸序列 （从第 1位氨基酸到第 183位氨基酸） ， 也可以是只包含乙型肝炎病毒核心蛋白的主要 免疫优势区的氨基 酸序列 （如从第 1位氨基酸到第 149位氨基酸）， 所标记的信号产 生物可以是辣根过氧化物酶、 碱性磷酸酶或吖啶酯；

c) 提供用于绘制定量标准曲线的已知浓度的定量 标准品，通 常为 3-6份含不同浓度的乙型肝炎病毒核心蛋白抗体 的样品组成。 浓度的单位可以是 IU/mL， PEIU/mL,也可以是其他可以朔源的浓度 或滴度单位；

d) 样品（待测样品或定量标准品）与固相抗原相 互接触， 使 得样品中的乙型肝炎病毒核心蛋白抗体， 如果存在的话， 被捕获， 形成固相抗原-乙型肝炎病毒核心蛋白抗体复� �物； e) 使抗原标记物与步骤 c) 的产物， 即固相抗原-乙型肝炎 病毒核心蛋白抗体复合物相互接触， 从而形成固相抗原-乙型肝炎 病毒核心蛋白抗体 -抗原标记物复合物；

f) 使底物或能激发信号产生的溶液也步骤 e)形成的固相抗 原 -乙型肝炎病毒核心蛋白抗体 -抗原标记物复合物相互接触，从而 生产可测量的信号， 并以相应的测定仪器测定所产生的信号强度； g) 将测量得到的定量标准品（通常为 3-6份）的信号， 与其 对应的浓度值进行线性回归拟合，获得由测量 信号计算样品浓度的 数学公式；

h) 将待测样品测量得到的信号， 引入步骤 g)中得到的公式， 从而计算出待测样品含有的乙型肝炎病毒核心 蛋白抗体浓度；

i) 如果步骤 h)中计算出的乙型肝炎病毒核心蛋白抗体浓度 高于检测方法能准确定量的量值上限， 则需对待侧样品进行稀释， 重复步骤 a)到 h)， 直至测定的浓度值落在相应检测方法能准确定 量的量值上限和量值下限之间。待测样品含有 的乙型肝炎病毒核心 蛋白抗体浓度由稀释后测量值 X对应稀释倍数计算获得。

在一个具体实施方式中，本发明的诊断剂用于 在接受不同治疗 药物的慢性乙型肝炎病人中， 所述药物包括： 长效干扰素（聚乙二 醇化的干扰素， Peginterferon ) 、 普通干扰素 ( Interferon ) 、 拉米夫定 ( lamivudine, LMV )、 阿德福韦酉 (adefovir dipivoxi 1， ADV)、 恩替卡韦（Entecavir, ETV)、替比夫定（Telbivudine, LdT)、 替诺福韦（Tenof ov i r)或其他可用于慢性乙型肝炎治疗的药物。

在一个具体实施方式中，在治疗前预测病人治 疗疗效的通常准 则是： 治疗前患者血清中乙型肝炎病毒核心蛋白抗体 水平高的病人 治疗所获疗效（应答率）高于治疗前患者血清 中乙型肝炎病毒核心 蛋白抗体水平低的病人； 治疗疗效的判定标准可以是乙型肝炎病毒 E 抗原血清转换 （ 即接受治 疗 的慢性 乙肝患者 由 HBeAg (+) /Ant i-HBe (-)的状态改变为 HBeAg (-) /Ant i-HBe (+) ) ， 也可以是病毒学应答（即慢性乙肝患者血清 HBV DNA载量降至 1000 Copies/mL以下） ， 还可以是其他能指示病情緩解或良好预后的临 床指标。

在一个具体实施方式中，监控慢性乙型肝炎患 者病情进展的通 常准则是： 乙型肝炎病毒核心蛋白抗体水平的异常升高指 示病人肝 脏炎症反应的发生和宿主抗乙型肝炎病毒特异 性免疫应答的活化。

在一个具体实施方式中， 本发明涉及 Ant i-HBc用于制备用来 评估慢性乙型肝炎患者接受阿德福韦酯和聚乙 二醇干扰素的治疗 应答情况的试剂盒的用途。

在一个具体实施方式中， 本发明涉及 Ant i-HBc用于制备用来 监控慢性乙肝患者病情发展的试剂盒的用途。

在一个具体实施方式中， 本发明涉及 Ant i-HBc用于制备用来 预测乙肝患者疾病阶段的试剂盒的用途。 附图说明

图 1、 Anti-HBc ELISA定量方法的动力学线性范围

图 2、 Anti-HBc ELISA定量方法的实验内（A)和实验间（B)精确 性

图 3、 104份标本 Anti-HBc ELISA定量检测结果的一致性 图 4、 Anti-HBcCLEIA定量方法的动力学线性范围

图 5、 Anti-HBcCLIA定量方法的动力学线性范围

图 6、不同时期的 HBV感染者血清 Anti-HBc水平的分布情况 ( A ) 、 不同时期的 HBV感染者血清 Anti-HBc水平和 ALT 水平；

( B )、不同时期的 HBV感染者血清 HBV DNA水平和 HBsAg 水平；

( C )、以血清 Anti-HBc水平判别受试者免疫活化状态的 ROC 曲线分析；

( D ) 、 不同 ALT分层病人的平均 Anti-HBc水平； （ E )血 清 Anti-HBc水平与 ALT水平的相关性分析。

缩写注释： PBI, 既往感染者； IT, 免疫耐受期病人； IC, 免 疫清除期病人； LR, 低复制期病人； ENH, HBeAg阴性的肝炎； LC, 肝硬化病人； HCC, 原发性肝癌病人。

图 7、 慢性乙型肝炎病毒携带者自然进展过程中血清 Anti-HBc、 ALT, HBV DNA及 HBsAg水平的动态变化

图 8、慢性乙肝病治疗前血清 Anti-HBc水平预测治疗后 HBeAg 血清学转换率

( A ) 、 治疗前 Anti-HBc 水平预测慢性乙肝病人接受阿德福 韦酯治疗后 HBeAg血清转换；

( B )、治疗前 Anti-HBc水平预测' I曼性乙肝病人接受聚乙二醇 干扰素治疗后 HBeAg血清转换；

( C ) 、 以血清 Anti-HBc 水平高低预测病人接受阿德福韦酯 治疗后 HBeAg血清转换发生率；

( D ) 、 以血清 Anti-HBc 水平高低预测病人接受聚乙二醇干 扰素治疗后 HBeAg血清转换发生率；

( E )在基线 ALT水平不同分层的病人中治疗前 Anti-HBc水 平预测 HBeAg血清转换率。 图 9、 基线 Anti-HBc水平不同分层的病人接受阿德福韦酯和 聚乙二醇干扰素治疗后 HBeAg血清学转换发生率

图 10、阿德福韦酯治疗过程中和停药后病人血清� ��志物量化水 平的动态变化 具体实施方式

除非另外定义，本文件中所用的技术和科学名 词都表达的是在 本发明涉及领域的熟练技术人员所理解的通常 含义。

在本发明的实施例 1中， 建立了 Ant i-HBc ELISA (酶联免疫分 析， 微孔板法）定量检测方法， 该方法能较为精确地确定样本血清 中 Ant i-HBc的含量， 其单次检测能准确定量的线性动力学范围达 1. 8个数量级（ 0. 04 -2. 5 IU/mL ) ,上述特征是已经公布的 Ant i-HBc 检测方法所不具备的 [4， 5]。

在实施例 2中，建立 Ant i-HBc CLEIA(酶联化学发光免疫分析， 微孔板法） 定量检测方法， 该方法能较为精确地确定样本血清中 Ant i-HBc的含量，其单次检测能准确定量的线性动� ��学范围达 2. 7 个数量级（ 0. 04 -20 IU/mL )。该方法较实施例 1中描述的 Ant i-HBc ELISA定量检测方法显著提高了单次检测的线性� ��力学范围， 使得 Ant i-HBc高值标本的检测所需的稀释次数大大减少� �� 提高了效率。

在实施例 3中， 建立 Ant i-HBc CLIA (直接化学发光免疫分析， 微粒子法） 定量检测方法， 该方法能较为精确地确定样本血清中 Ant i-HBc的含量，其单次检测能准确定量的线性动� ��学范围达 3. 02 个数量级（ 0. 02 -20. 8 IU/mL ) 。 该方法较实施例 1 中描述的 Ant i-HBc ELISA 定量检测方法显著提高了单次检测的线性动力 学 范围， 使得 Ant i-HBc 高值标本的检测所需的稀释次数大大减少， 提高了效率。 该方法较实施例 2中描述的 Ant i-HBc CLEIA定量检 测方法的区别在于采用单管式检测， 如配以全自动设备， 在临床上 便于实现随到随检。

在实施例 4中， 将上述 Ant i-HBc定量检测方法应用于评估不 同时期的 HBV感染者血清 Ant i-HBc水平的分布情况。 评估结果表 明， 在慢性乙型肝炎感染者中， 血清 Ant i-HBc水平高低与感染者 的肝炎活动性及宿主免疫状况相关。 Ant i-HBc水平可以用于判断 'I 性乙型肝炎感染者是否处于免疫激活状态或肝 炎活动状态，诊断准 确性（AUR0C ) 为 0. 918 ( 95%CI: 0. 888-0. 948 ) ， 判断临界值为 7400 IU/mL。 这一结果表明， 本发明公布的 Ant i-HBc定量检测方 法所获检测结果有助于临床医生对患者疾病阶 段的判断。

在实施例 5中， 将上述 Ant i-HBc定量检测方法应用于评估慢 性乙型肝炎病毒感染者自然进展过程中 Ant i-HBc水平的动态变化 及其与其他指标的联系。 评估结果表明， 慢性乙型肝炎病毒感染者 发生肝炎活动时， Ant i-HBc与 ALT几乎同时升高， Ant i-HBc峰值 通常较 ALT峰值晚 3-8周， 但有时可能早于或与 ALT峰值同时； 在 肝炎恢复期， ALT很快复常， Ant i-HBc则需晚 12-20周才能回到基 线水平。 这一结果进一步表明， 采用发明公布的方法定量测定慢性 乙型肝炎病毒感染者的 Ant i-HBc水平， 可作为 ALT测量的补充指 标， 有助于临床医生判断患者是否正处于肝炎活动 期或在最近 3-4 个月时间内曾经有肝炎活动。

在实施例 6中， 将 Ant i-HBc定量检测方法应用于评估慢性乙 型肝炎患者接受阿德福韦酯和聚乙二醇干扰素 的治疗应答情况。结 果表明， 慢性乙型肝炎患者接受治疗前 Ant i-HBc水平高低与治疗 后 HBeAg血清学转换率正相关： 治疗前 Ant i-HBc水平高 （在本实 施例中为> 29000 IU/mL ) 的患者即使采用价格便宜副作用小但疗 效较差的阿德福韦酯治疗也能达至较为理想的 效果； 而治疗前 Ant i-HBc处于中等水平 （在本实施例中为 9000-29000 IU/mL )或 低水平 （在本实施例中 <9000 IU/mL ) 的患者， 采用阿德福韦酯治 疗疗效显著低于费用高副作用相对较大但强效 的长效干扰素。在治 疗前 Ant i-HBc水平高 （ > 29000 IU/mL ) 的患者中， 阿德福韦酯对 病毒复制的抑制效果显著优于治疗前 Ant i-HBc 水平低（〈29000 IU/mL ) 的患者。 这一结果表明， 采用发明公布的方法定量测定慢 性乙型肝炎病毒感染者接受治疗前的 Ant i-HBc水平， 能够预测其 接受阿德福韦酯、长效干扰素或其他基于类似 原理的药物治疗后的 预期疗效， 有利于指导治疗药物和治疗时机的选择， 进而提高治疗 效率。

下面采用实施例对本发明进行进一步描述和说 明。所述实施例 旨在以举例方式具体阐明本发明， 各实施例中所用试剂、化学品或 生物活性材料浓度、所用病人队列和其他变量 值等只是举例说明本 发明的应用， 而不构成对本发明的限制。 实施例

1、 双抗原夹心法 Ant i-HBc定量的酶联免疫检测（ ELISA )方 法

1. 1 固相化抗原及标记抗原的制备

本方法中采用的固相化抗原及标记抗原是能与 样品中的 Ant i-HBc抗体特异性结合的乙型肝炎病毒核心抗原 （ HBcAg ) ， 该 抗原可以是包含 HBcAg的全长氨基酸序列 （Cpl83 ) ， 也可以是只 包含 HBcAg的主要免疫优势区的氨基酸序列 （Cpl49 ) 。 本发明采 用的 HBcAg抗原均是 E. Col i重组表达纯化所获得的。 Cpl49重组抗 原的表达纯化方法参考 Adam Zlotnick等公布的方法进行制备 [6]， Cpl83 重组抗原表达纯化方法参考 An Li 等公布的方法进行制备 [5]。 在本发明中通常以 Cpl49 重组抗原作为固相化抗原， 而以 Cpl83重组抗原作为标记抗原。

1.2 反应板的制备

( 1. ² · 1 )将 CpM9抗原用 ρΗ ⁹ · 6的 ⁵ 0mM CB緩冲液（ NaHC0 ₃ / Na ₂ C0 ₃ 緩冲液， 终浓度为 50mM， pH值为 9.6)稀释， 终浓度为 3μ g/ml。

( 1.2.2 )在 96孔酶标板每孔加入 100 μ 1的包被液， 2 ~ 8°C 包被 16 ~ 24小时后再 37°C包被 2小时。

( 1.2.3 ) 用 PBST 洗涤液 ( 20mM PB7.4 , 150mM NaCl , 0. l%Tween20 )洗涤 1次。然后每孔加入 200 μ 1的封闭液（含有 20% 小牛血清及 1%酪蛋白的 pH值为 7.4的 20mM Na ₂ HP0 ₄ /NaH ₂ P0 ₄ 緩冲 液溶液）， 放入 37°C封闭 2小时； 弃去封闭液。 干燥后装入铝箔袋 2-8 °C保存备用。

1.3 Cpl83抗原的 HRP标 i己

采用改良过碘酸钠法。 以标记 10mg Cpl83重组抗原为例：

( 1.3.1 )将浓度为 ² mg/L的 Cpl83重组抗原（ 5mL )装入透析 袋， 对 50mM CB緩冲液在 4°C透析 4小时， 中途每 2小时更换透析 緩冲液 1次。

( 1.3.2)准确称取 HRP 40mg, 溶解于 2mL ddH20, 溶解后加 入 20mg/mL的 NaI04溶液 2ml，室温反应 30分钟；加入乙二醇 40uL, 4°C反应 30分钟后制成 HRP活化溶液（ 10mg/mL， 4mL ) 。

( 1.3.3 ) 经 1.3.2步骤制成的 HRP活化溶液，加入装有 Cpl83 重组抗原的透析袋， 混句后继续对 50mM CB緩冲液在 4°C避光条件 下进行透析， 中途每 2小时更换透析緩冲液 1次， 透析 6-8小时。

( 1.3.4)配制 aBH4溶液 ( 5mg/mL ) 0.4mL, 加入完成 1.3.3 步骤的标记反应溶液， 并混匀， 置于 4°C避光条件下反应 2小时。 (1.3.5)完成 1.3.4步骤后， 再次将标记反应溶液装入新的 透析袋， 对 PBS緩冲液在 4°C透析 4小时。

(1.3.6)完成 1.3.5 步骤后， 用 GE公司生产的 Sephacryl S-300 HR层析柱进行纯化， 分离出 Cpl83-HRP标记物。

(1.3.7)将经 1.3.6步骤分离纯化出的 Cpl83-HRP标记物浓 缩至 2mg/mL，并按照体积比 1: 1加入甘油，混匀后 -20°C保存备用。

(1.3.8)将经 1.3.7步骤制得的 Cpl83-HRP标记物， 按体积 比 1/4000稀释至酶标记物稀释緩冲液（含有 20%小牛血清、 1%酪蛋 白、 10%蔗糖、 0.05%氨基比林的 pH值为 7.4的 20mMNa ₂ HP0 ₄ /NaH ₂ P0 ₄ 緩沖液溶液） ， 制成酶标记物反应液， 混匀后 2-8°C保存备用。

1.4 定量标准品

Anti-HBc 定量检测的定量标准品为含不同浓度的乙型肝 炎病 毒核心蛋白抗体的系列样品组成。 浓度的单位可以是 IU/mL， PEIU/mL, 也可以是其他可以朔源的浓度或滴度单位。 在本发明中 使用通行的国际单位（ IU/mL)为 Anti-HBc定量的单位， 以 NIBSC 公布的 Anti-HBc WHO标准品（Code: 95/522, 50IU/ampoule ) [7]， 倍比稀释至 40 IU/mL, 20 IU/mL, 10 IU/mL, 5 IU/mL, 2.5 IU/mL, 1.25 IU/mL, 0.625 IU/mL, 0.3125 IU/mL, 0.156 IU/mL, 0.078 IU/mL, 0.039 IU/mL, 0.02 IU/mL, 0.01 IU/mL共 13种不同浓度。 稀释标准品用的基质溶液可以为 Anti-HBc 阴性的健康献血者血浆 或血清， 也可以是含 20%新生牛血清的 PBS溶液。

1.5 Anti-HBc的 ELISA定量检测

选取 1份慢性乙型肝炎患者的血清（编号 P1 )按照下列步骤进 行 Anti-HBc的定量检测。鉴于慢性乙型肝炎患者血� �� Anti-HBc水 平通常较高， 我们将该标本以含 20%新生牛血清的 PBS溶液稀释成 1： 500、 1： 2500、 1: 12500、 1： 62500共 4个稀释度进行定量 ELISA 检测。

(1.5.1)样品反应： 取已包被的酶标板一块，每孔加入 90 样品稀释液， 每孔再加入 10 标本或者标准品， 震荡混匀后， 置 于 37°C温箱反应 30分钟。

(1.5.2 )酶标记物反应：完成 1.5.1步骤后，将酶标板用 PBST 洗液（20mM PB7.4, 150mM NaCl, 0. l%Tween20)洗涤 5遍， 每孔 加入 100 L如 1.3.8步骤制备的酶标记物反应液， 置于 37°C温箱 反应 30分钟。

( 1.5.3)显色反应： 完成 1.5.2步骤后， 将酶标板用 PBST洗 液（20mM PB7.4, 150mM NaCl, 0. l%Tween20)洗涤 5遍， 每孔加 入 TMB显色剂（由北京万泰生物药业股份有限公司 提供）各 50 L， 置于 37°C温箱反应 15分钟。

(1.5.4)终止反应及读值测量： 完成 1.5.3步骤后， 在反应 完的酶标板中每孔加入终止液（由北京万泰生 物药业股份有限公司 提供） 50 L， 并于酶标仪上检测各孔的 0D 值。

(1.5.5)定量标准曲线的绘制： 完成 1.5.4步骤后， 对 13个 定量标准品的测量值及其对应浓度进行线性回 归，绘制出如图 1的 定量标准曲线。 由图 1可知， Anti-HBcELISA方法能准确定量的上 限值为 2.5 IU/mL,下限值为 0.04 IU/mL,其线性动力学范围为 1.8 个数量级。由 0D ₄₅ 。 _/63 。测量值计算 Anti-HBc浓度的公式为： Cone. _anti -„ _Bc (IU/mL) = 1.2104xOD _450/63 o - 0.011。

(1.5.6)待测样品 Ant i-HBc浓度的获得： PI血清的系列稀释 样本经 1.5.1-1.5.5的步骤测量后， 其 1: 500稀释的 0D ₄₅ 。 _/63 。测量 值为 3.899、 1: 2500稀释的 OD ₄₅ 。 _/63 。测量值为 3.801、 1: 12500稀 释的 0D ₄₅ 。 _/63 。测量值为 2.988、 1： 62500 稀释的 OD ₄₅ 。 _/63 。测量值为 0.301;将上述测量值代入步骤 1.5.5中获得的 Anti-HBc浓度计算 公式， 其中 1: 500测得的浓度值为 4.71 IU/mL, 1: 2500测得的 浓度值为 4.59 IU/mL, 1： 12500测得的浓度值为 3.61 IU/mL, 1: 62500测得的浓度值为 0.35 IU/mL。 1: 62500稀释度测得的浓度值 落在本 ELISA方法能准确定量的线性动力学范围（ 0.04-2.5 IU/mL ) 内，因此该样本的原始 Ant i-HBc浓度为 0.35 χ 62500=22083 IU/mL。

(1.5.7)检测方法的试验内 （ Intra-assay )精确性评价： 取 已知浓度的 6份标本， 其 Anti-HBc定量值分别为 5 IU/mL, 2.5 IU/mL, 1.25 IU/mL, 0.625 IU/mL, 0.3125 IU/mL, 0.156 IU/mL, 在同次实验中，每份样本按照 1.5.1-1.5.4的步骤重复检测 16孔， 检测完后分别计算各样品 0D _45fl/63fl 测量值的试验内变异系数， 如图 2A所示， 6份样本的试验内变异系数在 2.8%-10.1%之间。

(1.5.8)检测方法的试验间 （ Inter-assay )精确性评价： 取 已知浓度的 6份标本， 其 Anti-HBc定量值分别为 5 IU/mL, 2.5 IU/mL, 1.25 IU/mL, 0.625 IU/mL, 0.3125 IU/mL, 0.156 IU/mL。 对上述 6份样品按照 1.5.1-1.5.4的步骤进行 16次独立的检测实 验，完成全部检测后分别计算各份样品 0D ₄₅ 。 _/63 。测量值的试验间变异 系数， 如图 2B所示， 6份样本的试验间变异系数在 4.4%-10.5%之 间。

(1.5.9) Ant i-HBc定量检测的重现性评估： 随机选择 104份 慢性乙型肝炎患者血清标本（Anti-HBc水平在 2.23 log ₁₀ IU/mL 至 5.37 log ₁₀ IU/mL之间 ) ， 按照 1.5.1-1.5.6的步骤进行 Ant i-HBc 的定量测定，独立重复测量 2次，并对两次测量结果进行回归分析， 如图 3所示， 两次测量结果高度一致， R ² =0.988。

2、 双抗原夹心法 Anti-HBc 定量的化学发光酶联免疫检测 (CLEIA)方法 2.1 固相化抗原及标记抗原的制备

按照本发明中实施例 1第 1.1节所述的方法进行。

2.2 化学发光反应板的制备

按照本发明中实施例 1第 1.2节所述的方法进行， 但采用化学 发光反应板作为抗原固相化载体。

2.3 Cpl83抗原的 HRP标 i己

按照本发明中实施例 1第 1.3节所述的方法和步骤进行。

2.4 定量标准品

同本发明实施例 1第 1.4节所述。

2.5 Anti-HBc的 CLE I A定量检测

选取 1份慢性乙型肝炎患者的血清（编号 P1 )按照下列步骤进 行 Anti-HBc的定量检测。鉴于慢性乙型肝炎患者血� �� Anti-HBc水 平通常较高， 我们将该标本以含 20%新生牛血清的 PBS溶液稀释成 1： 500、 1: 2500、 1: 12500共 3个稀释度进行定量 CLEIA检测。

(2.5.1)样品反应： 取已包被的化学发光反应板一块， 每孔加 入 90 样品稀释液， 每孔再加入 10 标本或者标准品， 震荡混 匀后， 置于 37°C温箱反应 30分钟。

(2.5.2)酶标记物反应： 完成 1.5.1 步骤后， 将化学发光反 应板用 PBST洗液 ( 20mM PB7.4， 150mM NaCl, 0. l%Tween20 )洗涤 5遍，每孔加入 100 如 1.3.8步骤制备的酶标记物反应液，置于 37 °C温箱反应 30分钟。

(2.5.3)发光反应和测量： 完成 2.5.2步骤后， 将化学发光 反应板用 PBST洗液（ 20mM PB7.4， 150mM NaCl, 0. l%Tween20 )洗 涂 5 遍， 每孑加入 Pierce公司生产的 PICO Chemi luminescent Substrate 100 L， 立即采用 Orin II化学发光检测仪读取各反应 孔发光值 (RLU) 。 ( 2. 5. 4 )定量标准曲线的绘制： 完成 2. 5. 3步骤后， 对 13个 定量标准品的测量值及其对应浓度进行线性回 归， 绘制出如图 4的 定量标准曲线。 由图 4可知， Ant i-HBc CLEIA方法能准确定量的上 限值为 20 IU/mL, 下限值为 0. 04 IU/mL, 其线性动力学范围为 2. 7 个数量级。 由 RLU 测量值计算 Ant i-HBc 浓度的公式为： Cone. ant i-HBc (IU/mL) =

1 Q (Log 10 (RLU) x 0. 9337-5. 3006)

( 2. 5. 4 )待测样品 Ant i-HBc浓度的获得： PI血清的系列稀释 样本经 2. 5. 1-2. 5. 4的步骤测量后， 其 1: 500稀释的 RLU测量值 为 12115100、 1： 2500稀释的 RLU测量值为 5067890、 1： 12500稀 释的 RLU测量值为 889610;将上述测量值代入步骤 2. 5. 4中获得的 Ant i-HBc浓度计算公式，其中 1: 500测得的浓度值为 20. 56 IU/mL, 1: 2500测得的浓度值为 9. 114 IU/mL, 1: 12500测得的浓度值为 1. 795IU/mL, 其中 1: 2500和 1: 12500两个稀释度的测量值落在 本 CLEIA方法能准确定量的线性动力学范围 （ 0. 04-20 IU/mL ) 。 据此如以 1: 2500的测量值计算， 该样本的原始 Ant i-HBc浓度为 9. 114 X 2500=22784 IU/mL; 而如以 1: 12500的测量值计算， 该样 本的原始 Ant i-HBc浓度为 1. 795 X 12500=22442 IU/mL。 两个测量 值的平均浓度为 22613 IU/mL, 该浓度值与采用 ELISA方法测得的 该标本的浓度值 22083 IU/mL的误差为 2. 4%，属于正常偏差范围内。

3、 双抗原夹心法 Ant i-HBc 定量的管式微粒化学发光检测 ( CLIA )方法

3. 1 固相化抗原及标记抗原的制备

按照本发明中实施例 1第 1. 1节所述的方法进行。

3. 2 化学发光反应板的制备 ( 3· 2· 1 )取 lmg磁珠， 用 lmL活化緩冲体系 （ 50mM MES 5.0 ) 洗涂 2遍， 弃上清。 加入 lmg EDC和 lmg NHS试剂 （均用 50mMMES 5.0配置成 10mg/mL) ， 混匀后， 室温振荡活化 20分钟；

( 3.2.2 )将活化好的磁珠用 lmL活化緩冲体系（ ⁵ 0mMMES 5.0 ) 洗涤 2遍， 弃上清。 加入 Cpl49抗原 25 g， 混匀后， 室温振荡反 应 3h; 。

( 3.2.3 ) 用 PBST 洗涤液 ( 20mM PB7.4 , 150mM NaCl , 0. l%Tween20 )洗涤 3次。 然后每孔加入 2500 μ 1的保存液（ 20mM ΡΒ7·4、 0.1% BSA、 lOOmM Gly、 0.05% TW-20、 0.1% Proclin) ， 2-8 °C保存备用。

3.3 Cpl83抗原的吖啶酯标记

(3.3.1)取 50μ _δ 蛋白 Cpl83， 加入到 300 μΐ标记緩冲体系 ( 50mM磷酸盐緩冲液，PH8.0 )中，加入 8 μ L吖啶酯（ 5mM NHS-SAE )， 避光室温反应 30min _o

(3.3.2)在步骤（3.3.1) 中反应好的标记物中加入 100 终止緩沖液（含 lOOmM甘氨酸的磷酸盐緩沖液， PH8.0) ， 避光室 温反应 30min。

(3.3.3)将经过步骤（ 3.3.2 )的标记物装入透析袋， 用透析 緩冲液（ 20mM磷酸盐緩冲液， pH 7.4 )在 4°C避光条件下进行透析， 中途每 2小时更换透析緩冲液 1次， 透析 6-8小时。

(3.3.4)将步骤 ( 3.3.3 )所得标记物移入保存管，加入 2%BSA 和 50%甘油， -20 °C保存备用。

( 3.3.5 )将经 3.3.4步骤制得的 Cpl83-SAE标记物， 按体积 比 1/500稀释至吖啶酯标记物稀释緩冲液（含有 20%小牛血清、 1% 酪蛋白、 10%蔗糖、 0.05% J^比林的 pH值为 7.4的 20mM Na2HP04 /NaH2P04緩沖液溶液）， 制成发光记物反应液， 混句后 2-8°C保存 备用。

3.4 定量标准品

取已知浓度的 Anti-HBc 高浓度样本 PI ( Ant i-HBc=22083 IU/mL ) , 以含 20%新生牛血清的 PBS溶液进行系列稀释， 分别稀释 至 4000 IU/mL, 1333 IU/mL 333 IU/mL, 83.3 IU/mL, 20.8 IU/mL, 5.21 IU/mL, 1.30 IU/mL, 0.33 IU/mL, 0.08 IU/mL, 0.02 IU/mL, 0.005 IU/mL作为 CLIA方法的定量标准品。

3.5 Ant i-HBc的 CLEIA定量检测

选取 1份慢性乙型肝炎患者的血清（编号 P2 )按照下列步骤进 行 Anti-HBc的定量检测。鉴于慢性乙型肝炎患者血� �� Anti-HBc水 平通常较高， 我们将该标本以含 20%新生牛血清的 PBS溶液稀释成 1: 500、 1： 2500共 2个稀释度进行定量 CLIA检测。 P2标本经实 施例 1所述的 Anti-HBc EL ISA定量方法检测， 确定其 Anti-HBc浓 度为 8069 IU/mL。

( 3.5.1 )样品反应： 取 50 L磁珠试剂加入反应管， 每孔再 加入 10 标本或者标准品， 震荡混匀后， 置于 37°C温箱反应 15 分钟。

(3.5.2)发光标记物反应： 完成 3.5.1 步骤后， 将化学发光 反应管用 PBST洗液（ 20mM PB7.4， 150mM NaCl, 0. l Tween20 )洗 涤 5遍， 每孔加入 50 μ L如 3.3.5步骤制备的发光标记物反应液， 置于 37°C温箱反应 10分钟。

(3.5.3)发光反应和测量： 完成 3.5.2步骤后， 将化学发光 反应板用 PBST洗液（ 20mM PB7.4， 150mM NaCl, 0. l%Tween20 )洗 涤 5遍， 用 Sirius-L单管式化学发光检测仪通过原位进样注� ��激 发液， 同时进行光强检测。

(3.5.4)定量标准曲线的绘制： 完成 3.5.3步骤后， 对 11个 定量标准品的测量值及其对应浓度进行线性回 归， 绘制出如图 5的 定量标准曲线。由图 5可知， Ant i-HBc管式微粒化学发光检测（ CLIA ) 方法能准确定量的上限值为 20. 8 IU/mL, 下限值为 0. 02 IU/mL, 其 线性动力学范围为 3. 02个数量级。 由 RLU测量值计算 Ant i-HBc浓 度的公式为： Conc. ant i-HBc (IU/mL) ： ^^ ^彻-^"。

( 3. 5. 5 )待测样品 Ant i-HBc浓度的获得： P2血清的系列稀释 样本经 3. 5. 1-3. 5. 4的步骤测量后， 其 1: 500稀释的 RLU测量值 为 1571400、 1: 2500稀释的 RLU测量值为 380560; 将上述测量值 代入步骤 3. 5. 4中获得的 Ant i-HBc浓度计算公式， 其中 1: 500测 得的浓度值为 16. 16 IU/mL, 1： 2500测得的浓度值为 3. 204 IU/mL, 均落在本 CLIA 方法能准确定量的线性动力学范围 （ 0. 02-20. 8 IU/mL )。 据此如以 1: 500的测量值计算， 该样本的原始 Ant i-HBc 浓度为 16. 16 X 500=8078 IU/mL; 而如以 1: 2500的测量值计算， 该样本的原始 Ant i-HBc浓度为 3. 204 X 2500=8010 IU/mL。 两个测 量值的平均浓度为 8044 IU/mL,该浓度值与采用 ELISA方法测得的 该标本的浓度值 8069 IU/mL的误差为 3. 1%，属于正常偏差范围内。

4、 不同时期的 HBV感染者血清 Ant i-HBc水平的分布情况 4. 1 横断面病人血清标本的选择

本发明中，为研究不同时期的 HBV感染者血清 Ant i-HBc水平的 分布情况，共收集 350例既往 HBV感染恢复的健康人血清标本和 488 例慢性乙肝携带的病人血清标本， 所有血清标本均分离血清后， 储 存于 -80°C。 488例病人中， 109例为原发性肝癌病人， 63例为肝硬 化病人， 其余 316例为单纯的慢性乙肝病人， 所有的病人均排除了 同时伴有丙型肝炎病毒（HCV )、 人类免疫缺陷病毒（HIV )、 丁型肝 炎病毒（HDV )、 戊型肝炎病毒（HEV )感染的可能性， 也无同时伴有 自身免疫性或代谢性肝脏疾病的临床医学证据 。

依据欧洲肝脏病协会 2009年慢性乙肝临床管理指南，将 316例 单纯的慢性乙肝病人划分为不同感染阶段。其 中 52例病人处于免疫 耐受期（ immune tolerance phase, IT), 其特征是年龄小于 35岁， HBeAg阳性， 血清 HBV DNA载量大于 5 x l0 ⁷ copies/mL， ALT水平在 过去 12个月的时间内的检测均小于正常值上限（ULN, 在本发明中 指 40 U/L ); 104例病人处于免疫清除期 ( immune clearance phase, IC)，其特征是 HBeAg阳性，血清 HBV DNA载量大于 1 χ 10 ⁴ copies/mL, ALT水平大于 2倍 ULN; 75例病人处于低复制期（ low-replicative phase, LR )， 其特征是 HBeAg阴性， 血清 HBV DNA载量小于 Ι χ ΙΟ ⁴ copies/mL, ALT水平在过去 12个月的时间内的检测均小于 ULN; 85 例病人处于 HBeAg阴性的肝炎期，其特征是 HBeAg阴性，血清 HBV DNA 载量大于 2 χ 10 ⁴ copies/mL, ALT水平大于 2倍 ULN。

4.2临床检验方法

病人血清 ALT水平和其他肝功能生化指标在标本采集后 24小 时后测定； 血清 HBV DM载量和 HBV基因型检测采用文献报告的方 法进行； HBsAg定量采用北京万泰生物药业公司的 HBsAg化学发光 定量试剂盒； HBeAg, Anti-HBe 的测定采用美国雅培公司的 Architect化学发光全自动检测系统。

4.3病人血清标本的 Anti-HBc定量

采用如本发明实施例 1、 或实施例 2、 或实施例 3中所述的方 法进行。

4.4 统计学方法

分组连续变量的比较采用 unpaired t-test Kruskal-Wallis ANOVA, 分类变量的组间比较采用 Mante卜 Haenszel x 2 test 或 Fisher确切概率， Pearson test用于相关分析。 诊断精确性分析采 用受试者工作曲线 ( Receiver operating characteristic, ROC ) 并计算诊断效能（ROC曲线下面积， AUR0C；)。 P值小于 0.05被视为 具有显著的统计学差异。

4.4 病人队列的基本特征

4.1节中描述的 HBV既往感染者及慢性 HBV携带者的人口统计 学、 临床病毒学及血液生物化学背景数据如表 1所示。

表 1. 处于不同时期的 HBV感染者的人口统计学、 临床病毒学及血液生物化学背景数据列表。

疾病分期： 既往 HBV 免疫耐受期 免疫清除期 低复制期 E抗原阴性肝炎 乙肝肝硬化 乙肝原发性 病人数目： (n=350) (n=52) (η=104) (η=75) (n=85) (n=63) (η=109)

Age, years, median (range) 36 (1 - 59) 22 (4 - 35) 33 (10 - 65) 46 (11 - 75) 42 (17 - 82) 51 (26 - 77) 51 (35 - 7

Gender, males/females 156/194 26/26 84/20 46/29 70/16 47/16 96/13

Genotype, B/C 36/16 71/33 34/14 ¹ 56/29 24/39 52/57

0

HBeAg-positive, n (%) 52 (100) 103 (100) 0 0 20 (32) 21 (19.2)

266 (81 ~

ALT, U/L, median (range) 14(6-40) 21 (8 ~ 38) 460 (80 - 4093) 56 (11 - 1831) 59 (18 - 13

3525)

ALT- e leva t ion (> 40 U/L), n (%) 0 0 104 (100) 0 85 (100) 39 (62) 80 (73)

HBV DNA- positive, % 0 100 100 100 100 100 100

8.6(7.4- 7.2(3.6- 2.9(0.3 ~

Login copies/mL, median (range) 4.9(0.4-7

9.6) 9.6)) 3.7)

HBsAg-positive, % 0 100 100 100 100 100 100

4.7(3.5 ~ 3.9(0.9 ~ 3.3(0.8 ~

Login IU/mL, median (range) 3.6 (-0.3-5.6) 3.2 (-0.2 ~

6.0) 5.7) 5.2)

Ant i-HBc-pos i t i ve, % 100 100 100 100 100 100 100

0.4 (-0.6 ~ 4.4(2.7- 4.1 (2.3 ~

Login IU/mL, median (range) 4.4(2.0-5.2)

2.5) 5.3) 5.3)

注 . ^a 由于 HBV DNA载量过低， 有 27例处于低复制期（LR) 的病人未能成功测定 HBV基因型。

！

！ 4.5 不同时期的 HBV感染者血清 Anti-HBc水平

图 6A/B展现了横断面病人的血清 Anti-HBc水平、 ALT水平、 HBsAg水平及 HBV DM载量在不同疾病时期的分布状况。 既往感染 者的血清 Anti-HBc水平显著低于慢性 HBV携带者（中位值： 0.4 vs. 4.1 log ₁₀ IU/mL, j O.001, 低超过 1000倍） ； 在处于不同感染时 期的单纯的慢性乙肝病人中， 血清 Anti-HBc的水平显著不同。 处 于免疫耐受期的病人血清 Anti-HBc 水平的中位值为 3.4 log ₁₀ IU/mL, 处于免疫清除期的病人血清 Anti-HBc水平的中位值为 4.4 log ₁₀ IU/mL,处于低复制的病人血清 Anti-HBc水平的中位值为 3.3 log _lfl IU/mL， 处于 HBeAg阴性肝炎期的病人血清 Anti-HBc水平的 中位值为 4.4 loglO IU/mL。 从以上数据分析可知， 处于免疫清除 期和 HBeAg阴性肝炎期的病人血清 Anti-HBc水平显著高于处于免 疫耐受期和低复制的病人（p<0.001 ) ； 免疫清除期和 HBeAg 阴性 肝炎期病人的血清 Anti-HBc水平无统计学差异（ p>0.05) ， 免疫 耐受期和低复制病人的血清 Anti-HBc 水平也无统计学差异 (p>0.05 ) 。 上述结果表明慢性乙肝病人血清 Anti-HBc水平与宿 主免疫状态高度相关。 高水平的 Anti-HBc指示病人处于 Anti-HBV 的免疫活化状态， 如以 Anti-HBc水平来判别受试个体是否处于免 疫活化状态（免疫清除期或 HBeAg阴性肝炎期）， 经过 R0C曲线分 析（如图 6C所示），诊断效能（ AUR0C, 曲线下面积）为 0.918 ( 95% 置信区间： 0.888-0.948 )。 当以 R0C曲线计算出的最优 Cutoff值 7400 IU/mL为临界值时，诊断灵敏度为 87.3%，诊断特异性为 83.5%。

分析乙肝肝硬化病人和乙肝原发性肝细胞癌病 人的血清 Anti-HBc水平， 结果如图 6A/B所示。 在乙肝肝硬化病人中， ALT > UL 的 39例病人（ LC-b组）血清 Anti-HBc水平显著高于 ALKULN 的 24例病人（LC-a组） (中位值为: 4.2 log ₁₀ vs. 3.8 log ₁₀ IU/mL, p=0. 016 )； 而在乙肝原发性肝细胞癌病人中， ALT > ULN的 80例病 人（ HCC-b组）血清 Ant i-HBc水平也显著高于 ALKULN的 29例病 人（HCC-a组）（中位值为： 4. 1 log ₁₀ vs. 3. 8 log ₁₀ IU/mL, p=0. 006 ) ₀ 上述结果进一步证明了慢性乙肝感染者血清 Ant i-HBc水平与 ALT 水平及宿主免疫状态存在显著关联。

4. 6 慢性乙型肝炎病毒携带者 Ant i-HBc水平与 ALT水平的相关 性

分析在全部 488例慢性慢性乙型肝炎病毒携带者中 （包括单纯 的慢性乙肝患者、 乙肝肝硬化患者和乙肝原发性肝细胞癌患者， n=488 )， 不同 ALT分层病人的 Ant i-HBc水平， 结果如图 6D所示。 患者平均 Ant i-HBc水平在 ALT < 5 x UL 的病人中，随 ALT水平的增 强而逐渐升高（ ^trend<0. 001 );当 ALT达到 5 x ULN后， Ant i-HBc 水 平达到最高值而不再继续升高（ptrend=0. 63)。 相关分析显示 （图 6E ), 在平均 Ant i-HBc水平在 ALT < 5 x ULN的病人（n=328 ) 中， Ant i-HBc 水平与 ALT 水平呈现正相关 （单因素分析： r=0. 52， p<0. 001;多因素分析： R=0. 53， p<0. 001 )，而与 HBV DNA水平（ ρ=0· 25 ) 或 HBsAg水平 （ p=0. 33 )不具有相关性。 在 ALT < 5 X UL 的病人， Ant i-HBc 水平与 ALT 水平的定量相关性无论在男性患者（r=0. 53， p<0. 001)或女性（r=0. 43， p<0. 001)患者; 在感染 HBV基因型 B的患 者（r=0. 49， p<0. 001)或感染 HBV 基因型 C 的患者（r=0. 53， p<0. 001)； 在 HBeAg阳性的患者 (r=0. 57， p<0. 001)或 HBeAg阴性的 患者（r=0. 50， p<0. 001)中均成立。在 ALT>5 x ULN( n=160 )， Ant i-HBc 水平与 ALT水平不具有统计显著的相关性（p=0. 43)，也不与 HBV DNA 水平 （ p=0. 63 )或 HBsAg水平相关（ p=0. 43 )。

5、 慢性乙型肝炎病毒携带者自然进展过程中 Ant i-HBc水平 的动态变化及其与其他指标的联系

5. 1 病人队列

本实施例中一共研究了 9例未接受 Ant i-HBV治疗的病人自然 进展的纵向观察系列血清标本，平均观察时间 为 103 ± 38周（ 57-168 周） ， 随访 5-17次， 共计 77份血清样本。

5. 2临床检验方法

按实施例 4中 4. 2节的描述进行。

5. 3病人血清标本的 Ant i-HBc定量

按实施例 4中 4. 3节的描述进行。

5. 4统计学方法

纵向数据分析采用广义回归方程 ( Genera l ized es t imat ing equat ions , GEE ) ， 其余统计分析方法按实施例 4中的描述进行。

5. 5慢性乙型肝炎病毒携带者自然进展过程中血� �标志物的动 态变化和彼此间的相互联系

9例病人（ A-G )在随访观察期间的 Ant i-HBc水平、 ALT水平、 HBsAg水平和血清 HBV DNA载量动态变化情况如图 7所示。 病人 A 在随访观察期间处于免疫耐受期， 其血清 HBV DM载量， HBsAg— 直处于艮高的水平， 同时 ALT水平和 Ant i-HBc水平一直处于 4艮低 的水平。 除病人 A外， 其他病人（B-G )在随访观察期间均经历了 1 次或更多的肝炎活动。通过对这些病人的观察 发现， Ant i-HBc水平 的升高总是伴随着 ALT水平的升高， 亦即伴随着肝炎的发生。 多数 情况下， 肝炎急性发作时， 病人血清 Ant i-HBc水平一般比 ALT水 平晚 3-8周达到峰值（图 7， 如病人 C, 病人 D的第一时段， 病人 F 的第一时段， 病人 G和 I的情况所示）； 在某些情况下， 病人血清 Ant i-HBc水平也可能早于或与 ALT同时达到峰值（图 7，如病人 B, 病人 D、 病人 F和病人 H的第二时段， 病人 E的情况所示） 。 在肝 炎恢复期， Ant i-HBc的下降比 ALT复常更为緩^ "曼， Ant i-HBc通常 在 ALT复常后 12-20周方能回到基线水平。

总体而言，多因素纵向数据分析显示血清 Ant i-HBc水平与 ALT 水平独立相关（β =0. 65， ρ<0. 001) , 而与血清 HBV DNA 载量（ β =-0. 006, ρ=0. 98)和 HBsAg水平无统计显著的相关性 ( β =-0. 034, ρ=0· 45)。

6、 Ant i-HBc 定量水平能预测慢性乙型肝炎病人的抗病毒治 疗疗效

6. 1 病人队列

病人队列 A: HBeAg阳性病人 49例，所有患者均接受 adefovir dipivoxi l (阿德福韦酯， 10mg/天） ， 共治疗 96周， 停药后随访 12周。

病人队列 B : HBeAg 阳性病人 48 例， 所有患者均接受 Peginterferon alpha_2a (长效干扰素 a _2a， 180 g/week ) ， 共 治疗 24周， 停药后随访 24周。

上述病人治疗前临床指征均符合 APASL慢性乙肝临床管理指南 推荐的治疗适应症： HBsAg 阳性持续 1 年以上， 均为 HBeAg 阳性 Ant i-HBe阴性， 血清 ALT水平高于 2倍 ULN; 均排除了同时伴有丙 型肝炎病毒（ HCV )、人类免疫缺陷病毒（ HIV )、丁型肝炎病毒（ HDV )、 戊型肝炎病毒（HEV )感染的可能性， 也无同时伴有自身免疫性或 代谢性肝脏疾病的临床医学证据。

6. 2临床检验方法

按实施例 4中 4. 2节的描述进行。

6. 3病人血清标本的 Ant i-HBc定量

按实施例 4中 4. 3节的描述进行。 6. 4治疗终点的定义

主要治疗终点定义为随访终点发生 HBeAg血清学转换。

6. 5统计学方法

所有统计分析方法按实施例 4中的描述进行。

6. 6病人队列的基本特征

如表 2所示。

表 2. 接受阿德福韦酯（队列 A )和 PEG千扰素（队列 B )治疗的 HBeAg阳性的 慢性乙型肝炎病人的基线特征.

队列 A 队列 B P va lue

No 49 48 ―

Treatment s trategy ADV 96-week Pegasys 24-week ―

Age, yrs, median (range) 35 (26 - 48) 35 (15 - 57) 0. 80

Gender, males/females 44/5 35/13 0. 06

Genotype, B/C 11/38 29/19 <0. 001

ALT strata, >5 ULN/ < 5 ULN 12/37 16/32 0. 34

ALT, U/L, median (range) * 110 (44 - 402) 168 (32 - 626) 0. 008

HBV DNA, login copies/ml, median (range) 7. 58 (3. 97 - 9. 29) 7. 55 (3. 44 - 9. 59) 0. 50

HBsAg, login IU/ml, median (range) 4. 44 (2. 35 ~ 5. 47) 4. 06 (1. 53 - 5. 35) 0. 005

Ant i-HBc-IgM, S/CO value, median (range) 2. 10 (0. 31 - 12. 7) 1. 78 (0. 25 ~ 12. 2) 0. 45

Ant i-HBc, login IU/ml, median (range) 4. 29 (3. 08 - 5. 11) 3. 98 (2. 41 - 5. 36) 0. 15 注. ^a 全部病人均为 HBeAg阳性且在治疗前筛选阶段 ALT水平 大于 2 X ULN ， 在开始治疗时， 有 11例病人（队列 A有 5例， 队列 B中有 6列）的 ATL水平下降至 2 X ULN 以下。 ADV, 阿德福韦酯； Pegasys, 聚乙二醇干扰素 a -2a; ULN, 正常值上限.

6. 7基线 Ant i-HBc水平与治疗后 HBeAg血清学转换的发生率相 关

完成治疗及随访观察后， 队列 A的 49例病人（接受阿德福韦 酯治疗）中有 9例随访终点发生 HBeAg血清学转换， 治疗有效率为 18. 4% ( 95% CI: 8. 8 32. 0%)； 队列 B的 48例病人（接受长效干 扰素治疗） 中有 23例截止随访终点时发生了 HBeAg血清学转换， 治疗有效率为 47.9% ( 95% CI: 33.3 62.8%)。

分析两个队列中治疗有效的病人和无效的病人 在接受治疗前 的各临床指标， 结果如表 3。 无论阿德福韦酯治疗的病人， 还是长 效干扰素治疗的病人， 治疗有效者和无效者的年龄、 男女性别比、 ALT水平、 血清 HBV DNA载量、 HBsAg水平和 Anti-HBc-IgM 水平 均无统计学显著的区别。 但治疗有效者的基线 Anti-HBc水平显著 高于治疗无效者： 队列 A中， 4·58±0·28 vs. 4·15±0·42 loglO IU/mL, p=0.005; 队列 B中， 4.32 ±0.66 vs. 3.81 ± 0.68 loglO IU/mL, p=0.011。 这一结果提示治疗前 Anti-HBc水平可能预测患 者的预期治疗疗效。 R0C分析显示，基线 Anti-HBc水平预测随访终 点 HBeAg血清学转换的 AUR0C值在队列 A中为 0.810， (95% CI: 0.675 0.948, ρ=0· 004，如图 8Α)，最优 Cutoff值为 29000 IU/mL, 此时诊断灵敏度为 77.8%, 诊断特异性为 77.5%; AUR0C在队列 B 中为 0.710 (95% CI: 0.564 0.855， p=0.013， 如图 8B)， 最优 Cutoff值为 9000 IU/mL， 此时诊断灵敏度为 69.6%, 诊断特异性为 60.0%。

表 3. 在接受阿德福韦酯（队列 A )和 PEG千扰素（队列 B )治疗的 HBeAg阳性的慢性乙型肝炎病人中分析基线特征� ��治疗

H Be Ag血清学转换的预测价值

队列 A (阿德福韦酯） 队列 B (聚乙-二醇干扰素 a-2a)

Characteristics Univariate Multivariate Univariate Multivariat

SR(+) SR (-) SR(+) SR (-)

p value p value p value p value

No- 9 40 ― ― 23 25 ― ―

Age, yrs 35±4 36±6 0.87 0.80 34±11 36±10 0.54 0.80

Gender, males/females 7/2 37/3 0.45 0.26 17/6 18/7 0.88 0.85

Genotype, B/C 2/7 9/31 0.99 0.46 15/8 14/11 0.52 0.90

ALT strata, >5xULN/<5xULN 3/6 9/31 0.77 0.45 8/15 8/17 0.84 0.43

ALT, U/L 170±88 137±79 0.28 0.29 198±129 213±149 0.71 0.26

HBV DNA, log ₁₀ copies/mL 7.03±1.40 7.65±1.13 0.16 0.12 7.64±0.92 7.04±1.61 0.12 0.11

HBsAg, log ₁₀ IU /mL 4.32±0.16 4.39±0.65 0.78 0.56 4.01±0.42 3.92±1.07 0.70 0.13

Anti-HBc-lgM, S/CO value 3.13±1.39 2.51±2.49 0.47 0.88 3.38±2.85 2.72±3.43 0.47 0.75

Anti-HBc, log ₁₀ lU/mL 4.58±0.28 4.15±0.42 0.005 0.032 4.32±0.66 3.81±0.68 0.011 0.026 注. 年龄、 ALT水平、 HBVDNA

Mean±SD； SR, HBeAg 血清学转换.

6.8基线 Anti-HBc水平预测治疗后 HBeAg血清学转换的发生率 6.7 节中计算出的 Cutoff 值可用于在治疗前预测病人接受治 疗后 HBeAg血清学转换的发生率。 在队列 A中， 如图 8C所示， 基 线 Anti-HBc水平大于 29000 IU/mL的 16例病人有 7个病人发生随 访终点 HBeAg血清学转换（有效率： 43.8%) ， 而基线 Anti-HBc水 平小于 29000 IU/mL的 33例病人只有 2例病人发生随访终点 HBeAg 血清学转换（有效率： 6.1%)， Anti-HBc高低两组间 HBeAg血清转 换的发生率比 （Risk Ratio, RR)为 7.22 (95% CI: 1.69 30.9, p=0.006)。在队列 B中，如图 8D所示，基线 Anti-HBc水平大于 9000 IU/mL的 25例病人有 16个病人发生随访终点 HBeAg血清学转樹有 效率： 64.0%) ， 而基线 Anti-HBc水平小于 9000 IU/mL的 23例病 人只有 7例病人发生随访终点 HBeAg血清学转换（有效率： 30.4%), Anti-HBc 高低两组间 HBeAg血清转换的发生率比 （Risk Ratio, RR) 为 2· 10(95% CI: 1.06 4.17, ρ=0· 006)。

进一步分析基线 Anti-HBc在不同 ALT水平的病人中预测治疗 后 HBeAg血清学转换的作用， 结果如图 8E所示， 在两个队列中无 论在基线 ALT 水平 <5 x ULN 或>5 111^ 的病人亚组中， 基线 Anti-HBc 水平高的病人治疗后血清转换的发生率均高于 基线 Ant i-HBc水平低的亚组。将接受阿德福韦酯和长效� ��扰素治疗的病 人进行合并分析， 并按照病人基线 Anti-HBc水平分为高（ > 29000 IU/mL ) 、 中 （ 9000-29000 IU/mL ) 、 低（ <9000 IU/mL )三组， 分 析三组病人治疗后 HBeAg 血清学转换率， 如图 9 所示。 在基线 Anti-HBc水平 > 29000 IU/mL的病人中，接受阿德福韦酯治疗的 16 例病人治疗后有 9例发生 HBeAg血清学转换， 应答率为 43.8%, 这 一比例在接受长效干扰素治疗的 15例病人中为 66.7% (10/15) ， 两者间无统计学显著的差异（p=0.82) ； 对基线 Anti-HBc水平在 9000-29000 IU/mL的病人， 接受阿德福韦酯治疗的 19例病人治疗 后仅有 2例发生 HBeAg血清学转换， 应答率为 10.5%, 而这一比例 在接受长效干扰素治疗的 10例病人中为 60.0%(6/10)， 两者间具 有统计学显著的差异（ p=0.018 );对基线 Anti-HBc水平 <9000 IU/mL 的病人， 接受阿德福韦酯治疗的 16例病人治疗后无 HBeAg血清学 转换发生， 而 23 例接受长效干扰素治疗的病人中尚有 7 例发生 HBeAg 血清学转换 （ 30.4%) ， 两者间具有统计学显著的差异 (p<0.001) 。

6.9阿德福韦酯治疗过程中及停药后病人 Anti-HBc水平的动态变化 依据阿德福韦酯治疗病人在治疗过程中及停药 后血清 Anti-HBc的动态变化（图 10A)， 可将整个治疗及观察过程分为三 个阶段： ( 1 )基线至治疗后 60周，在这个阶段，病人血清 Anti-HBc 平均水平随治疗的延续呈线性下降（r=0.99， p<0.001) ， 每 12周 下降 0.20 ±0.05 log ₁₀ IU/mL; (2)治疗后 60周至治疗终点 （96 周） ， 病人血清 Anti-HBc平均水平到达平台期， 不再随治疗的延 续而下降（ρ=0·87)； (3)停药后（108周）， 病人血清 Anti-HBc 平均水平相比于治疗终点（ 96周）有明显反弹，平均上升 0.29 loglO IU/mL (p<0.001) 。 总体上看， 治疗过程中 Anti-HBc水平的下降 较 ALT水平、 HBV DM水平和 HBsAg水平下降的更緩曼， 前者在治 疗 60周以后到达平台期， 而后面三者治疗后 24周即达到平台期。 多因素纵向分析显示， Anti-HBc 水平与 ALT 水平独立相关（β =0.830， ρ<0.001)，而与 HBV DNA水平 ( β =0.003， ρ=0· 94)或 HBsAg 水平无统计显著的相关性（ β =-0.061, ρ=0.52)。

依据本实施例 6.7节划定的临床 Cutoff值，将全部接受阿德福 韦酯治疗的病人划分为 > 29000 IU/mL (n=16， HBc-High)和〈29000 IU/mL (n=33, HBc-Low) 两组， 比较两组病人在治疗过程中和停药 后血清 Anti-HBc、 HBV DM、 ALT, HBsAg 水平的动态变化差异， 结 果显示如图 10B。 HBc-High和 HBc-Low两组病人治疗前 HBV DNA 水 平（7.61士 1.15 vs. 7.50士 1.22 log ₁₀ copies/mL, ^=0.77) 和 HBsAg水平 （4.34 ±0.31 vs. 4· 38 ± 0· 69 log ₁₀ IU/mL, ^=0.83) 无 统计差异； 而 HBc-High组基线 ALT水平高于 HBc-Low组， 但差异 尚不及统计学显著水平。 在治疗过程中， 两组患者的 ALT 水平和 Ant i-HBc水平的下降曲线无论在每个监测点分析或� ��纵向分析中均 无显著差异， 但是停药后， HBc-Low组的 Anti-HBc向比 HBc-High 组有明显反弹（p=0.039 )， ALT 的情况也是如此， 尽管尚不及统计 学显著水平（p=0.09)。 对 HBV DNA水平来说， HBc-High组病人无 论在治疗过程中还是停药后 （除基线外）血清 HBV DNA水平均显著 低于（ p<0.05 ) HBc-Low组。在随访终点时， HBc-High组病人 HBV DNA 平均水平比治疗前下降了 3.48士 2.24 log ₁₀ copies/mL; 而 HBc-Low 组病人 HBV DNA 平均水平比治疗前下降了 1.69 ± 2.051og ₁₀ copies/mL ( p=0.008 )。 两组病人的 HBsAg水平变化无明显差异。 参考文献

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