Die Erfindung betrifft den neuen Naturstoff Cyclamenol, ein Nerfahren zu seiner Herstellung aus Mikroorganismen aus der Ordnung der Actinomycetales, insbeson¬ dere aus dem Streptomyces-Stamm MHW 846, chemische Derivate, sowie ihre Ver¬ wendung als Arzneimittel, insbesondere für akute und chronisch entzündliche Erkrankungen in der Human- und Tiermedizin.

Es ist bereits bekannt, daß eine Reihe mikrobiell gewonnener makrocyclischer Lactame, wie beispielsweise Hitachimycin, Nirginiamyc-n oder Myxovirescin eine antibakterielle oder Antitumorwirkung besitzen [vgl. z.B. J. Antibiotics 34, 261 1981), 37; 13 (1984); Biochim. Biophys. Acta 577, 324 (1975)].

Die vorliegende Erfindung betrifft jetzt Verbindungen der allgemeinen Formel (I)

in welcher

A, B, D, E, G, L, M, Q, R, T, U, N, W und X jeweils für die CH ₂ -Gruppe

stehen

und

R ¹ und R ² für Wasserstoff stehen

oder

R ¹ für Wasserstoff steht

und

R ² für Hydroxy steht,

oder

R ¹ und R ² gemeinsam die =O-Gruppe bilden,

oder

A und B, D und E, G und L, M und Q, R und T, U und N und W und X jeweils für die -CH=CH-Gruppe stehen,

R ¹ für Wasserstoff steht

und

R ² für Hydroxy steht (Cyclamenol) oder für die Gruppe der Formel -O-CO-CH ₃ oder -O-Si(CH ₃ ) ₃ steht

Überraschenderweise zeichnen sich sowohl der neue Νaturstoff Cyclamenol als auch seine chemischen Derivate durch eine starke inhibierende Wirkung auf zentrale Vorgänge bei akuten und chronischen entzündlichen Prozessen aus.

Außerdem wurden Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gefunden, wobei zunächst die Gewinnung des Νaturstoffs Cyclamenol der Formel (Ia)

beschrieben wird.

Die Verbindung der allgemeinen Formel (Ia) wird gewonnen, indem man den

Stamm Streptomyces spec. MHW 846 in einem Nährmedium züchtet und anschließend daraus isoliert.

Die erfindungsgemäße Verbindung der allgemeinen Formel (Ia) wird durch die Kultur eines Streptomyceten-Stammes in geeigneten Nährlösungen unter geeigneten physiologischen Bedingungen erzeugt. Sie wird aus der Kulturlösung durch Extraktion oder durch Absorption abgetrennt und durch weitere geeignete Methoden angereichert.

Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung Mikroorganismen der Familie

Streptomycetaceae, die bei der Kultivierung in einem Kohlenstoff- und

Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthaltenden Nährmedium eine Verbindung produzieren, welche die bei der Substanzcharakterisierung im Folgenden unter (1) bis (6) aufgeführten Eigenschaften und Parameter aufweist

Für das Herstellungsverfahren ist der Stamm Streptomyces spec. MHW 846 aus der Ordnung der Actinomycetales, Familie Streptomycetaceae, Gattung Streptomyces oder von ihm abstammende Varianten und Mutanten besonders wichtig. Der Stamm wurde von einer Bodenprobe aus Wahuya, Miyagi in Japan isohert. Eine Kultur dieses Stammes wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen in Braunschweig am 14.12.88 unter der Nummer DSM 4950 hinterlegt

Aufgrund der chemotaxonomischen Untersuchungen auf DL-DAP nach C.S. Cummins und H. Harris, J. Gen. Microbiol. 15, 9-10, 1956 und auf iso/anteiso Fettsäuremuster nach R.M. Kroppenstedt in Chemical Methods in Bacterial Systematics (eds. Goodfellow, M.; Minnikin, O.E.) 173 - 199, 1985 wurde der Stamm der Gattung Streptomyces zugeordnet Es handelt sich um einen Streptomyceten, der auf den Medien nach E.B. Shirling and D. Gottlieb, Int Journal Syst Bact. 16, 313-340, 1966, nur spärlich Luftmycel bildet so daß die Luftmycelfarbe nicht eindeutig feststellbar ist.

Streptomyces spec. MHW 846 bildet auf Pepton-Eisen-Agar und Trypsin-Agar melanoides Pigment. Von den angebotenen C-Quellen wird nur D-Glucose eindeutig verwertet (Tab. 1).

Der Stamm wächst in einem Temperaturbereich von +20°C bis +35°C. Bei +5°C und +45°C ist kein Wachstum zu beobachten.

Tabelle 1 :

C-Quellen-Verwertung von Stamm Streptomyces spec. MHW 846 DSM 4950.

+ = Verwertung - = keine Verwertung

Die Anreicherung und Isolierung des Stammes erfolgte nach den üblichen Methoden der Actinomyceten-Isolierung durch Ausplattieren von Erdprobensuspensionen auf Petrischalen, vier- bis sechswöchtige Bebrütung und wiederholte Abimpfung von Einzelkolonien [Williams, S.T. and Cross, T. (1971), Actinomycetes, in: Methods in Microbiology 4, 295 - 334, Booth, C. (editor), London - New York: Academic Press].

Es wurde weiterhin gefunden, daß man die erfindungsgemäße Verbindung (Ia) erhält wenn man geeignete Mikroorganismen der Familie Streptomycetaceae in einem Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert und die Verbindung nach üblichen Methoden isoliert.

Für das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung (Ia) verwendet man Nährmedien, die die üblichen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und die notwendigen Salze enthalten. Als Kohlenstoffquelle können verwendet werden:

Kohlenhydrate, insbesondere Polysaccharide, wie z.B. Stärke, Monosaccharide, wie z.B. Glucose. Weiterhin können natürlich vorkommende Gemische, wie z.B. Malzextrakt, sowie Gemische aus den erwähnten Komponenten verwendet werden.

Als N-Quelle können die üblichen stickstoffhaltigen Nährmedienbestandteile Verwendung finden, so z.B. Aminosäuren, Eiweißstoffe, Eiweißhydrolysate, Ammoniumsalze, natürlich vorkommende komplexe Stoffe, wie Sojabohnenmehl, Milchpulver und geeignete Mischungen derselben.

Als Hilfsstoffe werden im Nährmedium Mineralsalze benötigt, z.B. Phosphate, Sulfate oder Chloride des Kaliums, des Natriums, des Calciums, des Magnesiums, Eisens, Zinks und Mangans. Die Konzentration dieser Stoffe kann in weiten Grenzen schwanken, z.T. sind die notwendigen Konzentrationen der Mineralsalze in den o.a. Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen oder im verwendeten Wasser als Verunreinigungen enthalten.

Weiterhin können als Hilfsstoffe noch Antischaummittel der verschiedensten Art Verwendung finden, wie z.B. Polyole oder Silikone.

Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung (Ia) kann mit Hilfe übücher fester, halbfester oder flüssiger Nährmedien durchgeführt werden. Bevorzugt werden wäßrig flüssige Nährmedien.

Die Beimpfung der Nährmedien erfolgt dabei nach allgemein üblichen Methoden, z.B. über Schrägröhrchen oder Kolbenkulturen.

Die Kultur erfolgt unter aeroben Bedingungen und kann gemäß den allgemein üblichen Methoden wie unter Verwendung von Schüttelkulturen, z.B.

Schüttelkolben, von luftbewegten Kulturen oder von Submerskulturen durchgeführt werden. Bevorzugt erfolgt die Kultivierung in aeroben Submersverfahren in belüfteten Fermentern, z.B. in üblichen Submersfermentationstanks. Es ist möglich, die Kultur kontinuierlich oder diskontinuierlich durchzuführen. Vorzugsweise wird diskontinuierlich gearbeitet.

Bei der Durchführung des Herstellungsverfahrens wird unter aeroben Bedingungen gearbeitet; die Kultur kann gemäß üblicher Methoden, so z.B. unter Verwendung von Schüttelkulturen oder von belüfteten Fermenterkulturen, durchgeführt werden. Die Prozentverhältnisse der Nährlösungsbestandteile können in weiten Bereichen schwanken, im allgemeinen machen die Kohlenstoffquellen 0,5 bis 8%, vorzugsweise 0,6 bis 6%, die Stickstoffquellen 0,1 bis 5%, vorzugsweise 0,5 bis 2% aus, die Salze hegen in üblichen Konzentrationen vor, vorzugsweise im Bereich zwischen 0,001 bis 0,5 Gew.-%. Die Antischaummittel hegen in bis zu 0,5%iger Konzentration vor. Die zur Sterilisation angewandten Temperaturen liegen bei +100 bis +140°C, bevorzugt bei +120 bis +130°C:

Der pH-Wert der wachsenden Kultur sollte vorzugsweise zwischen etwa 6 bis etwa 8,5, insbesondere zwischen 6,5 und 8,0 gehalten werden. Ein zu starker pH-Abfall in den sauren Bereich kann durch Zusätze einer organischen oder anorganischen Base,

vorzugsweise von CaCO ₃ vermieden werden. Wie in der Fermentationstechnologie üblich, kann auch eine automatische pH-Regulierung durchgeführt werden, bei der sterile organische oder anorganische Säuren, zB. H ₂ SO ₄ , oder sterile Laugen, z.B. NaOH in Abständen in die Kulturlösung eingespritzt werden.

Es ist zweckmäßig sicherzustellen, daß die Mikroorganismen ausreichend mit Sauerstoff sowie Nährstoffen in Kontakt gebracht werden. Dies kann nach den allgemein übüchen Methoden wie Schütteln und Rühren erfolgen.

Die Züchtungstemperatur kann zwischen etwa +16°C und +42°C, vorzugsweise zwischen +24°C und +32°C liegen, besonders bevorzugt hegt sie bei etwa +28°C. Die Dauer der Züchtung kann stark variiert werden, wobei z.B. die Zusammensetzung des Nährmediums und die Züchtungstemperatur eine Rolle spielen. Die jeweiügen optimalen Bedingungen können von jedem Fachmann auf dem mikrobiellen Gebiet leicht festgelegt werden.

Es hat sich herausgestellt, daß die Menge der sich in der Kulturbrühe anreichernden erfindungsgemäßen Verbindung im allgemeinen ihr Maximum etwa 1 bis 7, vorzugsweise 1 bis 4 Tage nach Züchtungsbeginn erreicht

Wie allgemein bei mikrobiologischen Verfahren sollten Fremdinfektionen der Kulturmedien vermieden werden. Hierzu werden die übüchen Vorkehrungen getroffen, wie Sterilisation der Nährmedien, der Kulturgefäße sowie der für die Belüftung notwendigen Luft. Zur Steriüsation der Vorrichtung können z.B. Dampf¬ oder Trockensterilisation verwendet werden.

Falls bei der Kultivierung in unerwünschter Menge Schaum entsteht, können die üblichen chemischen Schaumdämpfungsmittel, z.B. flüssige Fette und Öle,

Öl-Wasser-Emulsionen, Paraffine, höhere Alkohole, wie Octadecanol, Siüconöle,

Polyoxyethlyen- bzw. Polyoxypropylenverbindungen zugesetzt werden. Schaum kann auch mit Hufe der üblichen mechanischen Vorrichtungen (welche z.B.

Zentrifugalkräfte benutzen) gedämpft oder beseitigt werden.

Die neue Verbindung (Ia) ist sowohl im Kulturüberstand als auch im Mycel zu finden und kann mit Hilfe von üblichen Extraktions- und/oder Chromatographie¬ verfahren aus dem Fermentationsansatz isoüert und gegebenenfalls gereinigt werden. Die Chromatographie kann in Form der Säulenchromatographie durchge¬ führt werden. Mit Erfolg läßt sich auch die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) einsetzen. Als Absorptionsmittel können die üblichen anorganischen oder organischen Adsorptionsmittel eingesetzt werden, wie z.B. Kieselgel, Magnesium- silikat Aktivkohle, Cellulose, Ceüulosederivate, Kunstharze wie Polyamide, z.B. acetyliertes Polyamid, Dextrangele oder modifizierte Dextrangele. Als Laufmittel können die verschiedensten Lösemittel oder Lösemittelgemische verwendet werden, in welchen die erfindungsgemäße Verbindung löslich ist Bevorzugt werden Essig¬ säureethylester, Chloroform und Methanol oder ihre Gemische (beispielsweise Gemische aus Chloroform und Methanol oder aus Essigsäureethylester und Chloro¬ form) eingesetzt

Bevorzugt werden zur Isolierung der erfindungsgemäßen Verbindung (Ia) Chroma¬ tographie-Verfahren verwendet z.B. unspezifische Adsorption an Sorbentien wie Kieselgel oder Geldiffusionschromatographie. Dies sind die von der Reinigung schlecht wasserlösücher Naturstoffe her bekannten Methoden.

Aus ihren Lösungen kann die erfindungsgemäße Verbindung (Ia) nach den übüchen Methoden, z.B. Verdampfen des Lösemittels, Gefriertrocknung usw. erhalten werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Mycelium aus der Kulturbrühe, vorzugsweise durch Zentrifugation abgetrennt und mit einem weniger polaren Lösemittel mehrfach, vorzugsweise zweimal extrahiert. Als Lösemittel können C ₁ -C ₄ -Alkohole, C _r C ₄ -Ketone oder halogenierte Kohlenwasserstoffe verwendet werden. Die wäßrig-organische Lösung wird im Vakuum, z.B. etwa auf 1/20 des Volumens der Kulturbrühe konzentriert und weiter verarbeitet. Die Kulturbrühe wird nach Abtrennen des Mycels mehrfach mit einem nicht mit Wasser mischbaren Lösemittel, bevorzugt Essigsäureethylester extrahiert und nach Konzentration auf etwa 1/10 des Ausgangsvolumens weiter verarbeitet.

Aus diesen beiden Rohextrakten kann die erfindungsgemäße Verbindung (Ia) durch übliche chromatographische Methoden, vorzugsweise Chromatographie an Kieselgel isoüert werden.

0 Sie kann außerdem an unspezifischen Adsorberharzen auf Polystyrolbasis (z.B. Amberüte XAD der Firma Roehm und Haas oder Lewapol CA 9221 der Firma Bayer) gebunden werden. Die Desorption wird fraktioniert, durch Mischungen aus Wasser und den oben angegebenen organischen Lösemitteln, insbesondere Wasser / Methanol vorgenommen. 5 Die durch Test ermittelten aktiven Fraktionen werden unter reduziertem Druck bis zur voüständigen Entfernung des organischen Lösemittels bei +30°C bis +35°C konzentriert und gefriergetrocknet

Das Lyophilisat wird erneut in Wasser suspendiert und vorzugsweise mit o Essigsäureethylester oder anderen nicht mit Wasser mischbaren Lösemitteln extrahiert. Aus dem Extrakt wird die erfindungsgemäße Verbindung durch übüche chromatographische Methoden, vorzugsweise Chromatographie an Kieselgel, gewonnen.

5 Die erfindungsgemäße Verbindung (Ia) wird durch folgende Eigenschaften charakterisiert:

1) Der Naturstoff ist ein farbloser bis blaßgelber Feststoff. Er sintert beim Erwärmen und zersetzt sich > 150°C. ₀ Der optische Drehwert beträgt sofort nach dem Lösen [α] ²⁰ ₅₈₉ = + 3840° (c =

0,5% in DMF).

R _f = 0,45 (Fließmittelsystem Chloroform : Methanol (9:1), Fertigplatten Kieselgel 60, F^ (Merck), grüne Farbe mit TDM-Reagens, graubraune Farbe mit Jod). 5

2) UV Spektrum (Abb. 1, s. Anlage)

Die Aufnahme erfolgt in Methanol ( c = 0,1 mg in 1 ml CH ₃ OH).

Saurer bzw. alkaüscher pH werden durch Zusatz von 20 μl 1 N HCl bzw. 1

N Natronlauge pro ml Lösung eingesteUt.

Tabelle 2:

1%

Maxima [λ max.] und Extinktionen [E c^m=—. ] der Verbindung (Ia)

3) Das IR-Absorptionsspektrum der Verbindung (Ia) wird in Abb. 2 wiedergegeben (Abszisse: WeUenzahl in cm" ¹ ; Ordinate: Absorption). Wird die Substanz in KBr-Preßüngen veφreßt so zeigt sie bei folgenden Wellenzahlen (ausgedrückt in cm" ¹ ) Absoφtionsbanden:

Relative Intensitäten: vs = sehr stark s = stark m = mittel w = schwach sh = Schulter

Tabelle 3:

4) Das ^-Kernresonanzspektrum gibt die SignaUage in Teilen pro Milüon (ppm) und Schwingungen pro Sekunde gemäß Abb. 3 an. Es wurde in einer Dimethylsulfoxid-dg-Lösung der Verbindung mit TMS als Standard (intern) mit einem Kemresonanz-Spektrometer der Firma Bruker bei einer Feldstärke von 250 MHz aufgenommen.

Durch HIC-Heteroatom-Korrelationsspektroskopie konnten den Kohlenstoff¬ atomen die an sie gebundenen Wasserstoffatome zugeordnet werden:

Tabelle 4:

Durch H/D-Austausch wurden eine OH-Gruppe bei δ = 5,0 ppm und eine NH-Gruppe bei δ = 7,5 ppm identifiziert.

Die Verknüpfung der C-Atome miteinander und somit die Grundstruktur des Moleküls kann durch Bestimmung der Kopplung der entsprechenden an sie gebundenen Wasserstoff-Atome im zweidimensionalen ^! H, ¹ H-COSY- NMR-Spektrum festgestellt werden. Hierzu wird die chemische Verschie¬ bung jedes H- Atoms im 2D-Plot bestimmt (s. Tabelle 4).

Die Kopplungspartner werden im Korrelationsdiagramm festgelegt. Als Beispiel werden in Abb. 3 die Kopplungspartner des H- Atoms bei δ = 4,1 ppm identifiziert: eine OH-Gruppe bei 5,0 ppm, ein olefinisches H bei 5,2 ppm sowie zwei diastereotope Protonen bei δ = 1,95 und 2,65 ppm.

Zwischen 5,1 und 6,1 ppm liegen 12 teilweise kompliziert miteinander koppelnde Protonen. AUe Signale lassen sich in eine Korrelationsgraphik einordnen (Tabelle 5):

Mit Hilfe eines 600 MHz-Spektrums (Bruker, Karlsruhe) konnten aUe Verschiebungen zugeordnet werden. Demnach weisen 3 Doppelbindungen mit J ³ -Kopplungskonstanten der Protonen zwischen 14,5 Hz und 15,5 Hz trans- und eine mit 11,5 Hz cis-Konfiguration auf.

6) Die Verbindung (Ia) zeigt bei der Massenspektroskopie unter DCI-Bedingungen einen Molpeak bei m/z = 311. Das Massenspektrum im

EI-Modus ergibt für den Molpeak eine Hochauflösung von 311, 1895 (berechnet für C^^NO _, , = 311, 1885).

Die übrigen erfindungsgemäßen Verbindungen, die unter der aUgemeinen Formel (I) erfaßt sind, können durch chemische Derivatisierung des Naturstoffs Cyclamenol der aUgemeinen Formel (Ia) hergesteüt werden, wobei diese dann wiederum einen Beweis für dessen Konstitution darsteUen.

Dabei wird der Naturstoff der Formel (Ia)

[A] im Fall, daß R ² (allgemeine Formel I) für Acetyl steht unter Schutzgasatmosphäre in Pyridin mit Acetanhydrid in Anwesenheit von 4-(N,N-Dimethylamino)pyridin bei Raumtemperatur umgesetzt

[B] im Fall, daß R ² (allgemeinen Formel I) für die Trimethylsilylgruppe steht, in Acetonitril, ebenfaüs unter Schutzgasatmosphäre in Anwesenheit von Pyridin und Trimethylchlorsilan mit N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid bei Raumtemperatur umgesetzt

und

[C] im Fall (R ¹ = H / R ² = H), (R ¹ = H, R ² = OH), (R ¹ + R ² = =O) und A-X jeweils für die -CH ₂ -Gruppe stehen (allgemeine Formel I), in Methanol, in Anwesenheit von Palladium auf Aktivkohle mit Wasserstoff bei 0°C hydriert.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der aUgemeinen Formel (I) und (Ia) können als Wirkstoffe in Arzneimitteln bei akuten und chronischen entzündüchen Prozessen und anderen pathologischen Zuständen, an denen weiße BlutzeUen beteiügt sind, eingesetzt werden. Ihre Wirkungen bestehen in der starken Inhibition der Frei- setzung von Sauerstoffradikalen, hydrolytisch wirksamen Enzymen wie beispiels¬ weise ß-Glucuronidase und Elastase und der oxidativ wirkenden Myeloperoxidase aus humanen polymoφhkernigen Neutrophilen.

Sie sind somit bevorzugt zur Behandlung und Verhütung von akuten und chronischen Entzündungen der Atemwege, wie Allergien / Asthma, Bronchitis, Rheuma, Arteriosklerose, Arthrose, Entzündungen des Gastiointestinaltraktes, Myokarditis und Herzinfarkt geeignet

An wendungs beispiel

L Isolierung der Myeloperoxidase:

Für die Messungen wurde Myeloperoxidase aus humanen polymoφh- kernigen Neutrophilen verwendet Diese wurden aus frischem venösen

VoUblut nach der Methode von D. Engüsh und B.R. Andersen, Journal of Immunological Methods 5, (1974) 249 - 252 isoüert.

10 ⁷ Zellen wurden mit 1 ml 0,5% Cetyltrimethylammoniumbromid in Na- Phosphatpuffer 50 mmol/1 pH 6,0 10 min bei 0°C lysiert, eingefroren und direkt wieder aufgetaut. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt. Nun wurde 10 min bei 40.000 g zentrifugiert Der Überstand wurde entsprechend seiner Aktivität an Myeloperoxidase mit Na-Phosphatpuffer 50 mmol 1 pH 6,0 verdünnt und für die Tests verwendet

Test:

Zur Durchführung der Tests werden 10 μl Testprobe in einer Dimethylsulfoxid-haltigen Lösung (max. V/V 30%) mit 30 μl der o.g. hergesteüten Myeloperoxidaselösung = 1 - 2,5 μg Protein in eine

Microtiteφlatte (Fa. Greiner) mit glattem Boden gegeben. Die Reaktion wird durch Zugabe eines Testgemisches, bestehend aus 250 μl Na-Phosphatpuffer 50 mmol/1 pH 6,0, 10 μl H ₂ O ₂ 0,5 x 10 ^"3 mol/1 und 10 μl ortho-Dianisidin 2,5 x 10 ^"2 mol/I in Dimethylsulfoxid gestartet Die Zunahme der Exinktion wird bei 30°C am Elisa-Reader bei 490 nm gemessen. Es werden 6 Messungen im

Abstand von 2 min durchgeführt und die Extinktionszunahme pro Minute berechnet Eine Kontrolle, die anstatt einer Testprobe nur die entsprechende Menge Dimethylsulfoxid enthält, wird als 100%- Wert angesetzt und darauf die Hemmung durch die Probe berechnet. Alle Messungen werden als 3-fach Bestimmung durchgeführt.

Die erfindungsgemäße Verbindung (Ia) Beispiel 1 bewirkt in dem oben genannten Test eine Hemmung der Aktivität der Myeloperoxidase, wie in Tabelle 6 dargestellt:

Tabelle 6:

3. An der Hamsterbackentasche (Präparation nach Duling, MVR 5, 423 - 429, 1973) wurde die Leukozytenadhäsion in kleinen Venolen untersucht Eine gesteigerte Adhäsion ist bedingt durch die präparative Vorbereitung der Backentasche. Die Substanz vermindert ab 0,1 mg/kg i.v. die

Leukozytenadhäsion signifikant. In weiteren Versuchen wurden Backeritaschen mit LTB ₄ für 10 min superfundiert Die Bestimmung der Myeloperoxidase-Aktivität als direktes Maß für die Akkumulation von neutrophilen Leukozyten ergibt Anstiege um 80 - 100% gegenüber der Kontrolle. Mit 1 mg kg i.v. verhindert der neue Naturstoff (Ia / Beispiel 1) den Anstieg der MPO-Aktivität

4. In vivo Wirkung von Beispiel 1 (allg. Formel Ia)

Reduktion der Infarktgröße im Ratteninfarktmodell

Methode:

Zur Bestimmung der in vivo Wirkung der Verbindung aus Beispiel 1 narkoti¬ sierten (Trapanal i.p.) Wistar Ratten ein Herzinfarkt durch Ligation der linken Koronararterie experimentell induziert Nach einer 5-minütigen postoperativen Erholungsphase wurde die Verbindung aus Beispiel 1 in einer Dosis von 1 mg/kg gelöst in 100 % DMSO bzw. Lösungsmittel über 6 min in

die katheterisierte Vena jugularis der beatmeten Ratten infundiert und die

Koranararterie für 30 min okkludiert. Zum Zeitpunkt Minute 25 der Okklu- sion erfolgt die zweite Appükation der Verbindung aus Beispiel 1 bzw. Lösungsmittel unter den oben beschriebenen Bedingungen. Nach Ende der Infusion und Okklusionsphase wurde die Ligatur geöffnet und das Herz für 90 min reperfundiert

Bestimmung der Infarktgrösse:

Zur histologischen Färbung des infarzierten Herzgewebes wurde das Harz ex vivo retrograd mit Triphenyltetrazolium Chlorid (TTC. 1,5 %) in 20 mM

Kaliumphosphat Puffer für 15 min und mit 0,9 % NaCl für 10 min bei 37°C und mit einem Perfusionsdruck von 100 mm Hg perfundiert Die Infarkt- grössen wurden in Gewichtsprozent von infarziertem zu nicht infarziertem Gewebe berechnet und als Mittelwerte und deren Standardabweichungen von 11 mit der Verbindung aus Beispiel 1 behandelten und von 11 mit Lösungs¬ mittel behandelten Ratten in Prozent angegeben.

Ergebnis:

Die Applikation von je 1 mg kg der Verbindung aus Beispiel 1 vor Okklu- sion und vor Reperfusion reduzierte die Infarktgrösse von 19,0 + 6,0 % und 12,2 + 4,8 %.

Zur vorüegenden Erfindung gehören auch pharmazeutische Zubereitungen, die neben inerten, nicht-toxischen, pharmazeutisch geeigneten Hufs- und Trägerstoffen eine oder mehrere Verbindungen der aUgemeinen Formeln (I)/(Ia) enthalten, oder die aus einem oder mehreren Wirkstoffen der Formeln (I)/(Ia) bestehen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zubereitungen.

Die Wirkstoffe der Formeln (I)/(Ia) sollen in diesen Zubereitungen in einer Konzentration von 0,1 bis 99,5 Gew.-%, bevorzugt von 0,5 bis 95 Gew.-%, der Gesamtmischung vorhanden sein.

Neben den Wirkstoffen der Formeln (I)/(Ia) können die pharmazeutischen

Zubereitungen auch andere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten.

Die oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können in übücher Weise nach bekannten Methoden hergesteUt werden, beispielsweise mit dem oder den HUfs- oder Trägerstoffen.

Im allgemeinen hat es sich als vorteühaft erwiesen, den oder die Wirkstoffe der Formeln (I)/(Ia) in Gesamtmengen von etwa 0,01 bis etwa 100 mg/kg, bevorzugt in Gesamtmengen von etwa 1 mg/kg bis 50 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden, gegebenenfalls in Form mehrerer Einzelgaben, zur Erzielung des gewünschten Ergebnisses zu verabreichen.

Es kann aber gegebenenfalls vorteilhaft sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von der Art und vom Körpergewicht des behandelten Objekts, vom individueUen Verhalten gegenüber dem Medikament der Art und Schwere der Erkrankung, der Art der Zubereitung und Applikation, sowie dem Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Verabreichimg erfolgt.

Beispiel 1

Cyclamenol (Ia)

Beispiel I

Herstellung des Impfgutes für die Vorkultur

150 ml sterile, in 1 1-Erlenmeyerkolben befindüche Nährlösung der folgenden

Zusammensetzung:

Glucose 4 g

Malzextrakt 10 g

Hefeextrakt 4 g ad 1000 ml Leitungswasser pH 7,3 werden mit Myzelium des Streptomyceten-Stammes MHW 846 beimpft und drei

Tage auf der Rundschüttelmaschme mit 240 Upm bei +28 °C fermentiert. Die gewachsenen Kulturen dienen als Impfgut für weitere Fermentationsansätze.

Beispiel II

Herstellung der Vorkultur für die Tankfermentation

20 1 Nährlösung der unter Beispiel I beschriebenen Zusammensetzung und 20 ml Entschäumer (SAG 5693, Union Carbide) werden in einem 30 1-Kessel mit Rühr¬ werk, Belüftungs- und Temperierungseinrichtung abgefüllt und bei +121°C 50 min sterilisiert. Nach Abkühlen der Nährlösung auf +28°C wird mit 300 ml der wie unter Beispiel I beschriebenen gewonnenen Schüttelkulturen des Streptomyceten-

Stammes MHW 846 beimpft, mit 10 1 steriler Luft pro min (0,5 VVm) bei 300 Umdrehungen des Rührwerks (Blattrührer) pro Minute belüftet und bei einer Temperatur von +28°C und einem Überlagerungsdruck von 0,5 bar fermentiert. Nach zweitägiger Fermentation wird der Inhalt als Impfgut für einen Ansatz in einem 600 1-Kessel verwendet

10

Beispiel III

Fermentation im 600 1-Kessel

« _c 4001 Nährlösung der folgenden Zusammensetzung: Glucose 5 g

Dextrin 40 g

Hefeautolysat 1,5 g

Müchpulver 10 g o ad 1000 ml Leitungswasser werden in einem 600 1-Kessel auf pH 7,0 eingesetUt, 60 min bei +121 °C steriüsiert, auf +28°C abgekühlt und mit 20 1 des gemäß Beispiel II erhaltenen Impfgutes be¬ impft Die Fermentation von MHW 846 wird bei +28°C, einer Belüftung von 200 1 steriler Luft pro min (0,5 VVm), bei einem Überlagerungsdruck von 1 bar mit 150 5 Umdrehungen (Blattrührer) pro Minute durchgeführt. Wenn nach drei- bis sechs¬ tägiger Fermentation die erfindungsgemäße Verbindung (1) gebüdet worden ist, wird die Kultur geerntet. Produktbüdung: 1 - 2 mg/1.

0 Beispiel IN

Die gemäß Beispiel III erhaltene Kulturbrühe einer 400 1-Fermentation wird bei pH 6,5 - 7,0 mit 200 - 250 1 h in einem Westfalia-Separator separiert.

Das Mycel wird mit dem gleichen Volumen Methanol vesetzt und 10 min gerührt. Danach werden 30 1 Essigsäureethylester zugegeben und weitere 60 min gerührt. Zur Phasentrennung werden 10 - 15 1 Wasser zugegeben und die organische Phase

abgetrennt.

Die organische Phase wird auf ca. 5 1 eingeengt und mittels Chromatographie direkt weiter aufgereinigt

Nach Abtrennen des Mycels werden 400 1 Überstand mit 25 kg Kochsalz versetzt und nacheinander mit 130 1 und 30 1 Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten

Extrakte werden unter reduziertem Druck auf ca. 5 1 eingeengt.

Beispiel V

Weitere Anreicherung durch Mitteldruckchromatographie:

Säule Glassäule 10 x 18 cm

Fließrate: 20 ml/min

Detektion: 280 nm statPhase: Kieselgel Si 60, 70 -230 mesh Laufrnittel: Essigsäureethylester p.a.

Der Rohextrakt aus Beispiel IN wird weiter aufkonzentriert auf einen Wirkstoffgehalt von ca. 1 mg/kg (nach analyt HPLC).

Das Säuleneluat wird fraktioniert aufgefangen und einer analytischen Hochdruckflüssigkeitschromatographie gemäß folgenden Parametern unterworfen: Fließmittel: 45% wäßriges Methanol LiChroSolv

Fließrate: 1 ml/min

Detektion: 285 nm und 220 nm

StatPhase: Chrompack 3 x 10 ODS 2

Fraktionen, die den Wirkstoff enthalten, werden vereinigt und der Wirkstoff als ca. 60 - 80%iges Präparat aus konzentrierter Lösung mit Petrolether ausgefällt und im Vakuum getrocknet.

Beispiel VI

Isolierung der Reinsubstanz:

Aus dem angereicherten Produkt aus Beispiel IN wird mittels HPLC die

Reinsubstanz isoliert.

Säule: Latek 5 x 25 cm ODS 2 5μ

Fließmittel: 55% wäßriges Methanol

Füeßrate: 30 ml/min

Detektion: 285 nm

Beispiele 2, 3 und 4

45 mg der Nerbindung aus Beispiel 1 werden in 10 ml Methanol bei 0°C gelöst und unter Rühren nach Zugabe von einer Spatelspitze 10%igem Palladium auf

Aktivkohle mit Wasserstoff hydriert Nach 20 min wird abgebrochen, filtriert, eingedampft und durch Chromatographie an Kiesel 60 gereinigt Man erhält 20 mg nach HPLC und -NMR einheitliches Produkt der Verbindung des Beispiel 2; R _f

(Kieselgel, CHC- ₃ /Methanol 9:1) 0,47, grasgrüne Farbe mit TDM-Reagens (wird violett), UV-inaktiv, farblose Kristaüe, Schmp. 84°C.

Das ¹³ C-NMR-Spektrum der Verbindung aus Beispiel 2 zeigt die vollständige

Hydrierung des Doppelbindungssystems.

Das hochaufgelöste EI-MS zeigt den Molpeak bei m/z = 325,2966 (ber. für

C ₂₀ H ₃₉ NO ₂ : 325,2981).

Die Elementaranalyse hat folgendes Ergebnis:

C H N

Ber. (%) 73,8 12,1 4,3

Gef.:(%) 73,9 10,7 4,3

Außerdem zeigt die Abb. 6 in der Anlage das IR- und Η-NMR-Spektrum der Verbindung aus Beispiel 2.

Neben der Verbindung aus Beispiel 2 entstehen noch geringe Mengen des Deoxygenierungsproduktes der Verbindung aus Beispiel (3) und des Ketons der Verbindung aus Beispiel (4).

Beispiel 5

90 mg der Verbindung aus Beispiel 1 werden unter Argon in ca. 2 ml Pyridin gelöst. Man gibt 2 KristaUe 4-(N,N-Dimethylamino)-pyridin (DMAP) und 40 Tropfen Acetanhydrid hinzu und rührt eine Stunde bei RT. Man gibt 220 ml Wasser hinzu und extrahiert 5 x mit Essigester. Die organische Phase wird mit Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt Man erhält 40 mg nach HPLC und Η-NMR eüiheitüches Produkt

Cyclamenol-Monoacetat, R _F (Kieselgel, Chloroform / Methanol 9:1) 0,84; grüne Farbe mit TDM-Reagens, UN-aktiv (254 nm), farblose KristaUe (Nadeln), Schmp. 260°C, FT-IR-Spektrum (KBr):

Tabelle 8: IR-Spektrum

Beispiel 6

140 mg der Verbindung aus Beispiel 1 werden in 5 ml abs. Acetonitril gelöst. Man gibt bei RT unter Rühren (Argon) eine Lösung von 500 mg N,O-Bis(trimethylsüyl)- acetamid in wenig Acetonitril, 0,3 ml trockenes Pyridin und 10 Tropfen Trimethylchlorsüan hinzu. Nach 30 min wird bei RT eingedampft und bei 0,1 Torr getrocknet. Man reinigt durch präp. Dünnschichtchromatographie an Kieselgel mit Dichlormethan / Methanol 9:1 und erhält 40 mg farblosen, amoφhen Feststoff Cyclamenol-(Mono)trimethylsüylether,R _f (Kieselgel, CHC1 ₃ / Methanol 9:1) 0,81, grüne Farbe mit TDM-Reagens, UV-aktiv, FT-IR (KBr):

Tabelle 9: IR-Spektrum