【발명의 명칭】

탱자 추출물을 유효성분으로 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물

【기술 분야】

본 특허출원은 2014년 03월 19일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2014-0032356 호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명은 탱자 (/ 2c/ s trifoliata) 추출물을 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물에 관한 것이다.

【배경 기술】

인플루엔자 바이러스는 사람과 동물에서 높은 발병률과 사망률을 나타내는 호흡기 칠환꾀 원인이 된다. -인플루ᅵ엔자 바이러스에는 A—형， B형 및 C형이 있으며 A형에는 그 아종으로 H1N1 , H2N2 , H3N2 , H5N1 , H7N9 , H2N2 , H7N7 , H1N2 , H9N2 , H7N2 , H7N3 , H5N2 및 H10N7이 있다. 조류독감의 경우， 조류와 돼지 사이에서만 전염된다고 여겨져 왔으나， 1997년 홍콩에서 이 바이러스에 감염된 조류와 접촉한 사람들 중 18명이 감염되고 그 중 6명이 사망하는 사건이 발생해 사람도 감염되는 것으로 알려지기 시작했다. 조류독감으로 인해， 2003년에는 흥콩에서 감염자

2명 중 1명이， 네덜란드에서는 83명 중 수의사 1명이 숨졌으며 전 세계적으로 약 300명 이상의 사람이 감염되어 약 60% 이상의 사망률을 보였으며， 흥콩은 H5N1 , 네덜란드는 H7N7 바이러스가 원인이었다. 특히 이 바이러스들 중 고병원성인 H5N1 인플루엔자 A 바이러스는 변이가 매우 빠를 뿐만 아니라 다른 동물에게 쉽게 전이되는 특징을 가지고 있다. 감염된 조류가 다른 닭， 사육 오리와 접촉하거나 배설물올 통해 조류독감을 전파하므로 방역이 쉽지 않다. 특히 문제가 되는 것은 감염된 조류를 통해 인간에게 전염될 수 있다는 사실이다. 인간이 조류독감에 감염되면 변종 바이러스가 발생할 가능성이 더욱 커지고, 돌연변이를 일으킨 변종 바이러스는 인간끼리의 전염올 일으킬 수 있다. 즉， 사람 간에 전염되는 변종 바이러스가 나타날 가능성이 있다 .

2009년 4월에는 인플루엔자 A 바이러스의 새로운 재조합체인 H1N1 바이러스가 최초로 멕시코와 미국에서 94명의 사람에게 전염된 것이 보고되었다 (CDC 2009) . 그 해 4월 이후 이 바이러스는 사람들 간에 계속적으로 전이되어 2009년 6월 11일 에는 세계 보건 기구에서 21 세기의 첫 번째 대유행성 인플루엔자로 분류되었다 (WHO 2009) .

2013년에는 A형 인플루엔자 H7N9 조류 인플루엔자가 발생하여 인체 감염을 시킴으로 중국에서 2014년 2월까지 22명이 사망한 예가 있다.

계절 독감의 경우 H1N1, H3N2 인폴투엔자 A 바이러스가 원인이며, 전세계적으로 매년 250 ,000-500 ,000명이 이 바이러스에 의해 사망한다.

백신은 인플루엔자 바이러스가 동물과 동물, 사람과 사람， 그리고 동물과 인간 간에 확산되는 것을 막는 중요한 역할을 수행하지만, 돌연변이 발생를이 높은 인풀루엔자 바이러스의 특성상 백신은 다음 계절에 유행할 것으로 예상된 변종 인플루엔자 바이러스를 타겟으로 설계되기 때문에 백신이 모든 인플투엔자 바이러스를 예방하는 것은 불가능하다.

인플루엔자 치료제로서 M2 이온 채널 억제제인 아만타딘 (amantadine)과 리만타딘 (r imantadine)， 뉴라미다아제 저해제인 오샐타미비르 (osel tamivi r )와 자나미비르 (zanamivi r )， 및 이노신 모노포스페이트 디하이드로게나아제 억제제인 리바비린 (r ibavi rin) 등과 같은 3 종류의 항 인플루엔자 치료제들이 승인되어 현재 사용되고 있다. 이 치료제들은 임상 증상을 줄이는 데 유용하긴 하지만, 부작용 및 내성 바이러스성 변종 출현으로 인하여 제한적으로만 사용되고 있다. 그러므로 인플루엔자에 대한 효과적인 항바이러스 치료제가 시급하게 필요한 실정이다.

식물은 오랜 진화를 통하여 바이러스에 대한 저항 능력을 발전시켜 왔으므로 인플루엔자에 대한 우수한 항바이러스 효과뿐만 아니라, 바이러스 감염으로 유발되는 염증에 높은 치료 효과를 가지고 있다는 점에서 천연 '생물소재'의 잠재적인 자원으로서 높은 관심을 받고 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다 .

【발명의 내용】

【해결하려는 과제】

본 발명자들은 식물로부터 유래된 천연 추출물로부터 항 인플루엔자 바이러스 효능을 발휘할 수 있는 물질을 발굴하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과， 탱자의 추출물 (구체적으로， 탱자 씨앗 추출물)이 다양한 인폴루엔자 바이러스， 예컨대， 인플루엔자 A형 H1N1 , H3N2 또는 H5N1 바이러스 및 인폴루엔자 B형 바이러스에 대해서 매우 뛰어난 항바이러스 효과를 갖는다는 것을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 항 인플루엔자 바이러스 조성물을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

【과제의 해결 수단】

본 발명의 일 양태에 따르면ᅳ 본 발명은 탱자 추출물을 유효성분으로 포함하는 항 인플투엔자 바이러스 조성물을 제공한다. 본 발명자들은 식물로부터 유래된 천연 추출물로부터 항 인플루엔자 바이러스 효능을 발휘할 수 있는 물질을 발굴하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과， 탱자의 추출물 (구체적으로， 탱자 씨앗 추출물)이 다양한 인플루엔자 바이러스， 예컨대， 인플루엔자 A형 H1N1 , H3N2 또는 H5N1 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스에 대해서 매우 뛰어난 항바이러스 효과를 갖는다는 것을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다. 본 발명의 조성물의 유효성분인 탱자 씨앗 추출물은 탱자로부터 당업계에 공지된 다양한 추출방법을 이용하여 수득할 수 있다. 본 발명에서 이용되는 탱자나무 (/¾;?c/ s trifoliata)는 경기도 이남에서 자라는 낙엽관목으로서 높이가 3~5 센티미터의 굳센 가시가 호생한다- . 잎은 호생하며 3 출엽으로서 엽병에 날개가 약간 있고 소엽은 혁질이며 도란형 또는 타원형이고 둔두 또는 미오목두이며 예저이고 길이 25 밀리미터이다. 꽃은 5월에 피고 백색이며 정생 또는 액생하고 1개 또는 5 2개씩 달리며 꽃받침잎과 꽃잎은 5개가 이생하고 수술은 많으며 자방에 밀모가 있다. 열매는 등글고 지름 3 센티미터로서 향기가 좋으나 먹을 수 없으며 9월에 익고 종자는 긴 타원형으로서 길이가 1—1 .3 센티미터이다. 열매를 약용으로 하며 묘목은 글나무의 대목으로 사용하고 성목은 남부지방에서 산울타리로 환영을 받고 있다 (대한식물도감. 이창복. 경문사. 10 1993) .

본 발명의 일 구현 예에 따르면， 본 발명의 행자 추출물은 탱자나무의 줄기， 뿌리， 잎, 꽃잎, 꽃봉오리로부터 얻을 수 있으며， 보다 바람직하게는 탱자의 열매 또는 탱자 씨앗의 추출물이다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 탱자 씨앗 추출물을 탱자 씨앗에

T5 추―출용매를 —처리하여ᅳ얻는—경우쎄는，—다양한—추 출용매가 -이 -용될 - -수 -다. - 바람직하게는， 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은， ( i ) 물， ( i i ) 알코올 (바람직하게는 메탄올， 에탄을, 프로판을， 부탄을， 노말 -프로판을, 이소 -프로판올， 노말—부탄올， 1-펜탄올,: 2-부록시에탄올 또는 에틸렌글리콜)， ( i i i ) 아세트산， ( iv) DMFO(dimethyl-

20 formamide) 및 (v) DMSOCdimethyl sul foxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤， 아세토나이트릴， 에틸 아세테이트， 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄， 핵산， 2 , 2 , 4-트리메틸펜탄， 데칸， 사이클로핵산， 사이클로펜탄， 디이소부틸렌， 1-펜텐， 1-클로로부탄， 1- 클로로펜탄， ^자일렌， 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판， 를루엔， 1-

25 클로로프로판， 클로로벤젠， 벤젠， 디에틸 에테르， 디에틸 설파이드， 클로로포름, 디클로로메탄， 1 , 2-디클로로에탄， 어닐린， 디에틸아민， 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물， (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄을， 에탄을,

30 프로판올， 부탄올 등)， (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매， (d) 아세톤， (e) 에틸 아세테이트， ( f ) 클로로포름， (g) 부틸아세테이트, (h) 1，3-부틸렌글리콜， ( Π 핵산 및 ( j ) 디에틸에테르를 포함한다. 본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 탱자 씨앗 추출물은 물ᅳ 메탄올， 에탄올 또는 이의 조합을 탱자에서 처리하여 수득한 것이다.

본 발명의 특정 구현 예에 따르면， 본 발명의 탱자 씨앗 추출물은 에탄올을 탱자 씨앗에 처리하여 _. 수득한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '추출물' 은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물 (crude extract )로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획 ( fract i onat i on)한 분획물도 포함한다. 즉， 탱자 씨앗 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대， 상기 추출물을 일정한 분자량 컷 -오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획， 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등， 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 탱자 씨앗추출물에 ^ᅵ 포함되는ᅳ것—어다 .

본 발명에서 이용되는 탱자 씨앗 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

하기 실시 예에서 확인할 수 있는 바와 같이， 탱자 씨앗 추출물은 MDCK 세포에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 생존율 향상， 인폴루엔자의 예방 및 치료 효과를 나타낸다. 현재 인플투엔자 치료제로 널리 사용되고 있는 타미플루와 동등 이상의 항바이러스 효능을 나타내며 특히 3 mg/ml 이상의 고농도에서도 세포독성에 전혀 영향을 주지 않아 인플루엔자 A형 H1N1 , H3N2 또는 H5N1 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료를 위한 항바이러스제로서 사용될 수 있는 가능성을 확인하였다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 본 발명의 조성물은 인플루엔자 A 형 HlNl , H3N2 또는 H5N1 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스에 대하여 0.07 13.7 //g/m 의 EC ₅₀ 값 (50% ef fect ive concent rat i on)을 갖는다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면， 본 발명의 조성물은 인플루엔자 A형

H1N1 , H3N2 또는 H5N1 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 설명된 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스， 덱스트로스, 수크로스， 솔비를， 만니를， 전분， 아카시아 고무， 인산 칼슘 , 알기네이트， 젤라틴， 규산 칼슴 , 미세결정성 셀를로스， 폴리비닐피롤리돈, 샐를로스， 물， 시럽， 메틸 셀를로스， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트， 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제 습윤제, 감미제， 향미제， 유화제， 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington ' s Pharmaceut i cal Sci ences ( 19th ed .， 1995)에 상세히 기재되어있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식 , 환자와 연령 ,―체중， 성 , 병적 상태 , 음식 , 투여 시간， 투여 경로, 배설 속도 및 반웅감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 비강, 정맥내 주입 피하 주입， 근육 주입， 복강 주입， 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라， 투여경로가 결정되는 것이 바람직하다 .

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액 또는 유화액 형태이거나 액스제， 분말제, 과립제, 정제 또는 갑셀제 형태일 수도 있으며， 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분인 탱자 씨앗 추출물 이외에도 기존에 항바이러스 효과를 갖는 것으로 공지된 다른 약리 활성성분과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물은 아만타딘 (amantadine), 리만타딘 (r imantadine)， 오샐타미비르 (oseltamivir) , 자나미비르 (zanamivir), 리바비린 (ribavirin) 등을 추가로 포함하거나， 이들과 병용하여 사용함으로써 항바이러스 효능을 보다 향상시킬 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 따르면， 본 발명의 조성물은 인플루엔자 A 형 H1N1, H3N2 또는 H5N1 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스에 의한 질환의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우， 유효성분으로서 탱자 씨앗 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며， 예를 들어 , 단백질， 탄수화물， 지방， 영양소， 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당， 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스， 슈크로스， 을리고당 등; 및 폴리사카라이드， 예를 들어 덱스트린， 사이클로텍스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리를， 소르비를， 에리트리를 등의 당알콜이다.향미제—로서— ^ᅭ —천안ᅳ—향마제 ― [타우마틴 ₇ ―—스—테바아——추출물—― (-예를 ―들어- 레바우디오시드 k, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제 (사카린， 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대， 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 탱자 씨앗 추출물 이외에 구연산 액상과당, 설탕， 포도당, 초산 사과산, 과즙， 두층 추출액, 대추 추출액， 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 인플루엔자 A 형 H1N1, H3N2 또는 H5N1 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스에 의한 질환의 예'방 또는 개선을 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 의약 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 바람직하게는， 음료류， 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다. 예컨대， 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 같은 음료류로 제조되는 경우 탱자 씨앗 추출물 이외에도 구연산， 액상과당， 설탕, 포도당, 초산， 사과산, 과접， 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 인플루엔자 A 형 H1N1, H3N2 또는 H5N1 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스에 의한 질환의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란， 탱자 씨앗 추출물을 음료류， 차류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화， 분말화 현탁액 등으로 제조한 식품으로， 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나， 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강식품에 있어서의 탱자 씨앗 추출물의 첨가량은， 대상인 건강식품의 종류에 따라 달라 일를적으로 규정할 수 없지만, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량 %， 바람직하기로는 0. 1 내지 20 중량 %의 범위이다. 또한， 과립, 정제 또는 캡술형태의 식품의 경우에는 통상 0. 1 내지 100 중량 > 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량 ¾의 범위에서 첨가하면 된다. 본 발명의 일 구현 예에 따르면 본 발명의 건강기능식품은 음료의 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 식품 조성물 또는 건강기능식품은 아만타딘 (amantadine) , 리만타딘 ( r iiriantadine) , 오셀타미비르 (osel tamivi r ) 자나미비르 (zanamivi r ) , 리바비린 (r ibavi rin) 등 항바이러스 치료제의 투여 전후에 또는 동시에 복용하는 보조식품으로 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 본 발명의 조성물은 인플루엔자 A형 H1N1 , H3N2 또는 H5N1 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스에 의한 질환의 예방 또는 개선을 위한 동물 사료 첨가용 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 동물 사료 첨가용 조성물은 인폴루엔자 A형 H1N1 , H3N2 또는 H5N1 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스에 대해 항 인플루엔자 바이러스 효능을 가지므로 가축의 사료에 첨가하면 이들 바이러스에 의해 발생되는 질환의 예방 또는 개선 효과를 기대할 수 있다. 본 명세서에서. 사료는 가축의 생명을 유지하고 젖， 고기， 알， 털가죽 등올 생산하는 데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 의미한다. 사료는 영양가， 주성분， 유통， 수분함량 배합상태 및 가공형태 등에 따라 여러 가지로 분류할 수 있으며 본 발명에서 사료는 조사료, 농후사료, 보충사료， 단백질사료, 녹말사료, 지방질사료, 섬유질사료를 포함하나， 이에 한정되지 않는다.

상기 사료 첨가제에 포함되는 탱자 씨앗 추출물은 고농축액， 분말 또는 과립 형태일 수 있다. 본 발명의 사료 첨가용 조성물에는 탱자 씨앗 추출물 이외에도 구연산, 후말산, 아디픽산， 젖산， 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨， 인산 칼륨， 산성피로인산염， 폴리인산염 (중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀， 카테킨 (catechin) , 알파 -토코페롤， 로즈메리 추출물 (rosemary ext ract ) , 비타민 C , 녹차 추출물， 감초 추출물, 키토산， 탄닌산， 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물에는 아미노산, 무기염류, 비타민， 항생물질， 항균물질, 항산화, 항곰광이 효소， 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들면 분 또는 파쇄된 밀， 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료， 예를 들면 평지， 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 돌면 혈분， 육분， 골분 및 생선분; 당분 및 유제품， 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보층제， 소화 및 흡수향상제， 성장촉진제， 질병예방제와 같은 첨가제가 포함될 수 있다. 본 발명의 사료 첨가용 조성물은 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며， 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 사료 첨가용 부형제로는 예를 들어, 제을라이트, 옥분 또는 미강 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물은 하나 이상의 효소 제제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 리파제와 같은 지방 분해효소, 피틴산 (phyt i c aci d)을 분해하여 인산염과 이노시를인산염을 만드는 파이타제 (phytase) , 녹말과 글리코겐 등에 포함되어 있는 알파ᅳ1，4- 글리코시드 결합 ( a -l , 4-glycos i de bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제， 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제 (phosphatase) , 샐를로스를 분해하는 카르복시메틸셀롤라제， 자일로스를 분해하는 자일라나제， 말토오스를 두 분자의 글투코스로 가수분해하는 말타제 및 사카로스를 가수분해하여 글루코스-프룩토스 흔합물을 만드는 전환효소 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 동물 사료 첨가용 조성물은 동물에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있으며， 또한 이들은 항 인플루엔자 바이러스 효과를 나타내거나， 인플루엔자를 포함한 호흡기 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선에 유용한 것으로 공지되어 있는 다른 물질올 함유할 수 있다. 또한， 상기 동물 사료 첨가용 조성물에는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 흔합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로， 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로， 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 섭취량 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물이 사용될 수 있는 동물은 예를 들어 식용우, 젖소， 송아지, 돼지， 돼지새끼， 양, 염소， 말， 토끼， 개, 고양이 등과 같은 가축， 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉 오리, 거위， 칠면조, 메추라기， 작은 새 등과 같은 가금류를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 탱자 씨앗 추출물을 포함하는 사료 첨가제를 포함하는 사료는 탱자 씨앗 추출물올 포함하는 사료 첨가제를 사료에 건조 중량 기준으로 사료 1 kg당 약 1 g 내지 100 g의 양으로-흔합함으로써 얻을 수 있다. 사료 흔합물은 완전히 흔합한 후, 성분들의 분쇄 정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질이 얻어진다. 이것을 매시로서 공급하거나， 또는 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성한다. 이 때， 저장 중에 분리되는 것을 방지하기 위해， 사료에 물을 첨가하고， 이어서 통상의 펠릿화， 팽창화， 또는 압출 공정을 거치는 것이 바람직하다. 과잉의 물은 건조 제거될 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면， 본 발명은 탱자 씨앗 추출물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A 형 H1N1 , H3N2 또는 H5N1 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스에 대한 소독용 조성물을 제공한다.

본 발명의 인플루엔자 바이러스 소독용 조성물은 제제에 따라 인폴루엔자 바이러스의 살상올 위해 첨가 가능한 공지의 첨가물을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 인플루엔자 바이러스 소독용 조성물은 액제， 정제， 과립제, 산제 등의 다양한 형태의 제제로 제조가 가능하다

본 발명의 소독용 조성물에 첨가 가능한 공지의 첨가제의 예를 들면 액상 배합의 경우 에탄올 또는 이소프로필 알콜이 있다. 특히 에탄올 또는 이소프로필 알콜은 자체적으로 소독력을 가지며 인체에 무해하며, 특히 상기 약리 작용을 가지는 천연 추출물의 균일한 분산을 목적으로 첨가될 수 있다. 이러한 알코을은 이에 제한되는 것은 아니나 1 .0 중량 % 내지 80 .0 중량 %, 바람직하게는 10.0 중량 % 내지 50.0 중량 %로 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물 중 액상 배합의 경우 항 인플루엔자 바이러스 소독제를 용해 및 분산시킬 목적으로 바람직하게는 정제수를 사용할 수 있다. 이 때 정제수의 함량은 첨가되는 성분의 함량이 정해지고 난 이후의 잔여량일 수 있다.

본 발명의 인플루엔자 바이러스 소독용 조성물은 소독제 또는 세정제로 제제화될 수 있다. 따라서 본 발명은 탱자 씨앗 추출물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A형 HlNl , H3N2 또는 H5N1 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스 소독용 조성물을 포함하는 세정제 및 소독제를 제공한다. 본 발명의 인플루엔자 바이러스 소독용 조성물은 예를 들어, ᅵ동물 관련ᅵ 시설 및 ᅭ동물에 직접 분사하기 위한 항 ᅵ호흡기 바이레스— 소독제로서 제품화될 수 있으며， 동물 관련 시설 또는 위생을 요하는 접객 업소 등에서 손 및 기구 등의 세척을 위한 항 인플루엔자 바이러스 소독제 및 세정제로서 제품화될 수 있다. 이러한 소독제 또는 세정제는 본 발명의 인폴루엔자 바이러스 소독용 조성물 외에도 소독제 또는 세정제에 요구되는 공지의 성분을 추가로 포함할 수 있다.

【발명의 효과】

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

( i ) 본 발명은 행자 씨앗 추출물을 유효성분으로 포함하는 인폴루엔자 A형 HlNl , H3N2 또는 H5N1 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스에 대한 항 인플루엔자 바이러스 조성물올 제공한다.

( i i ) 본 발명 조성물의 유효성분인 행자 씨앗 추출물은 인플루엔자 바이러스의 복제 및 감염을 억제함으로써 우수한 항바이러스 효능을 나타낸다.

( i i i ) 본 발명 조성물의 유효성분인 행자 씨앗 추출물은 인플루엔자

A 형 HlNl , H3N2 또는 H5N1 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스의 감염을 치료할 뿐만 아니라 예방하는 효과를 나타내며， 타미플루와는 달리 고농도에서도 세포 독성을 나타내지 않으며 더 낮은 농도에서 효과를 보인다.

( iv) 본 발명의 조성물은 인플루엔자 바이러스에 의한 질환의 치료 또는 예방 용도의 약제학적 조성물로 사용될 수 있을 뿐만 아니라， 인플루엔자 바이러스에 의한 질환의 개선 또는 예방 용도의 기능성 식품 조성물， 동물 사료 첨가용 조성물 또는 소독제용 조성물로 개발이 가능하다.

【도면의 간단한 설명】

도 la는 탱자 씨앗 추출물의 인플루엔자 A형 H1N1 바이러스의 MDCK 세포 결합 (at tachment )에 대한 억제 효과를 나타내는 그래프이다. 도 lb는 MDCK 세포에탱자 씨앗 추출물 또는 타미플루를 표시된 농도대로 처리한 후, 인플루엔자 A형 H1N1 바이러스를 감염시킨 경우, 각 농도에 따른 MDCK 세포의 생존율을 나타내는 그래프이다. 첨부된 사진은 상기 실험에서 표시된 농도의 탱자 씨앗 추출물 및 타미폴투를 처리한_ _경ᅵ우의 세포사진이다.

도 2a 내지 d ^ 인폴루엔자 A 형 HlNl(a) , H5Nl(b) , H3N2(c) 또는 인플루엔자 B 형 바이러스 (d)를 각각 감염시킨 MDCK 세포에 탱자 씨앗 추출물 또는 타미풀루를 표시된 농도대로 처리한 경우, 각 농도에 따른 MDCK 세포의 생존율을 나타내는 그래프이다. 첨부된 사진은 상기 실험에서 인플루엔자 A 형 H1N1 바이러스를 감염시킨 후, 표시된 농도의 탱자 씨앗 추출물 및 타미플루를 처리한 경우의 세포사진이다.

【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】

이하， 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예

실험재료 및 실험방법 탱자씨앗추출물 준비

분쇄한 100 g의 건조된 탱자 씨앗의 종자를 2일 동안 1 L의 에탄을에서 추출한 다음 여과하였고 회수된 에탄올 탱자 씨앗 추출물을 약 2-3일간 감압 증발 후 동결건조하여 추출물을 수득하였다. 세포배양

실험에 사용된 MDCK 세포주는 37 ^° C 5% C0 ₂ 의 조건에서 배양하였다. 10% 소 태아 혈청 (FBS, Hyclone Thermo Scientific) 및 1% 페니실린- 스트랩토마이신 용액 (Gibco)이 포함된 EMEM(Eagle' s minimum essential medium, Gibco)배지에서 유지하였다. 인플루엔자 바이러스의세포결합조사방법

96-웰 플레이트에 분주한 MDCK 세포를 4 'C에서 1시간동안 배양하였다. 인플루엔자 H1N1 바이러스 100 TCID ₅₀ 와 각각 다른 농도의 탱자 씨앗 추출물 또는 타미플루를 흔합하여 세포주에 감염시킨 다음 4 ^° C에서 3 시—간동안 배양한 후， PBS로 2번 세척하고 다시 37 ^° C에서 배양하였다. 48 시간 후， 세포 생존율을 측정하였다. 세포 생존율은 직접 현미경 하에서 관찰하였으며 MTT 분석 키트 (Dae ill lab servers co. Seoul . Korea)를 이용하여 세포 생존율을 다시 정량 수치화 하였다. EC ₅₀ 값은 세포 생존율이 50%인 구간의 항바이러스제 농도를 구한 값이다. 탱자씨앗추출물의 인플루엔자 바이러스 감염 예방효과조사방법

96-웰 플레이트에 각 well 당 1 X 10 ⁴ 개의 MDCK 세포를 분주하여 37 ^° C에서 16 시간동안 배양한 다음, PBS로 2회 세척한 후 각각 다른 농도의 탱자 씨앗 추출물 또는 타미플루를 MDCK 세포에 처리하였다ᅳ 다시 37 ^° C에서 6시간동안 배양한 후， PBS로 2회 세척하고 100 TCID ₅₀ HIN1 인플루엔자 바이러스를 세포에 감염시킨 다음 37 ^° C에서 배양하였다. 2시간 후, PBS로 3번 세척하여 감염되지 않은 바이러스를 제거한 뒤 , 바이러스 성장 배지 (EMEM,0. BSA, 1 P/S, 0.0005% trysin)를 넣어주고 37 ^° C에서 48시간 배양한 후， 세포의 병변효과 (cytopathic effect, CPE)를 관찰하였다. 탱자씨앗추출물의 항 바이러스 활성조사방법

96-웰 플레이트에 각 wel l 당 1 X 10 ⁴ 개의 MDCK 세포를 분주하여 37 ^° C에서 16 시간동안 배양한 다음， PBS로 2회 세척한 후 각각 A형 인플루엔자 H5N1 , H1N1 , H3N2 바이러스 또는 B형 인플루엔자 바이러스 100 TCID ₅₀ 로 37 ^° C에서 2시간동안 감염시킨 후， 다시 PBS로 2회 세척하였다. 인플루엔자 바이러스가 감염된 세포에 각각 다른 농도의 탱자 씨앗 추출물 또는 타미플루를 처리한 후 37 ^° C에서 48시간동안 배양하였다. 탱자 씨앗 추출물의 항바이러스 효능은 바이러스 감염에 의한 CPE(cytopathi c effect ) 저해 유효농도 50% 값 (EC ₅₀ )으로 나타내었다. 탱자 씨앗 추출물의 세포독성 농도의 50% 값 (CC ₅₀ )은 세포의 형태학적 변형올 기초로 결정하였다. 탱자 씨앗 추출물의 항 인플루엔자 바이러스의 능력은 CC ₅₀ 값을 EC ₅₀ 값으로 나눈 선택도 인텍스 (SI : select ivi ty index)로 나타내었다. 실험결과

탱자씨앗추출물의 바이러스의세포결합 억제효과

상기 실험 방법에 따라 인플루엔자 H1N1 바이러스와 각각 다른 농도의 탱자 씨앗 추출물 또는 타미플루를 흔합하여 세포주에 감염시킨 후 배양한 결과， 타미폴루의 경우 모든 세포가 바이러스에 감염되어 항바이러스 효과를 보이지 않은 반면ᅳ 탱자 씨앗 추출물은 0.25 의 EC ₅₀ 값을 나타냄으로써 바이러스가 세포에 결합하는 과정을 억제하는 효과를 나타내었다 (도 la) . 탱자씨앗추출물의 바이러스 예방효과

상기 실험방법에 따라 배양한 MDCK 세포에 각각 다른 농도의 탱자 씨앗 추출물 또는 타미플루를 MDCK 세포에 처리를 한 후 HIN1 인폴루엔자 바이러스를 세포에 감염시킨 다음 37 ^° C에서 48시간 배양하여 세포의 CPE를 관찰하였다. 그 결과 타미플루를 처리한 세포는 모두 바이러스에 감염되어 죽은 반면， 탱자 씨앗 추출물을 처리한 경우에는 EC ₅₀ 값이 123.5 Λιι£을 나타내었다 (도 lb) . 또한 세포를 현미경으로 관찰한 결과， 타미플루를 처리한 경우 감염된 세포와 같은 상태를 보인 반면, 행자 씨앗 추출물 123.5 을 처리한 경우 정상세포 (Normal cel l )와 비슷하게 바이러스에 감염되지 않은 상태를 나타내었다 (도 lb) .

이러한 결과는 타미플루와는 달리 탱자 씨앗 추출물이 바이러스가 세포에 감염되는 과정을 억제한다는 것을 보여주는 것으로서 탱자 씨앗 추출물이 인플루엔자에 대한 높은 예방효과를 가지고 있을 가능성을 제시해준다. 탱자씨앗추출물의 항 바이러스 활성

상기 실험방법에 따라 인플루엔자 A형 바이러스 H1N1 , H3N2 또는 H5N1 , 또는 B형 인플루엔자 바이러스를 MDCK 세포에 감염시킨 후， 각각 다른 농도의 탱자 씨앗 추출물 또는 타미플루를 처리하여 항바이러스 활성을 분석하였다 (post-t reatment assay) . 탱자 씨앗 추출물의 항바이러스 효능은 바이러스 감염에 의한 CPE 저해 유효농도 50% 값 (EC ₅₀ )으로 나타내었으며， 탱자 씨앗 추출물의 세포독성 농도의 50% 값 (CC ₅₀ )은 세포의 형태학적 변형을 기초로 결정하였다. EC ₅₀ 값과 ^' CC ₅₀ 값은 Reed와 Muench 방법으로 산출하였다. 탱자 추출물 _와 _항 인플루엔자 바이러스의 능력은 CC ₅₀ 값을 EC ₅₀ 값으로 나눈 선택도 인텍스 (SI : se l ect ivi ty i ndex)로 나타내었다. 표 1은 MDCK 세포에서 타미폴루와 탱자 씨앗 추출물의 인플루엔자 A형 H1N1ᅳ H3N2 또는 H5N1 , 또는 인폴루엔자 B형 바이러스에 대한 항 인플루엔자 바이러스 활성을 비교한 결과를 보여준다.

【표 11

인플루엔자 B 타미플루 1111.1 13.7 81

표 1에서 볼 수 있는 바와 같이， 양성 대조군으로 사용한 타미플루의 경우, CC ₅₀ 값은 1111.1 EC ₅₀ 값은 H1N1, H3N2에서 3.5 /g/m , H5N1에서 1.5 ug/mi, B형 바이러스에서 13.7 /g/ 을 각각 나타내었다. 탱자 씨앗 추출물의 경우， 세포 독성이 3333.3 /g/in에서 나타나지 않았으며， EC ₅₀ 값은 H1N1에서 0.07 g wi, H3N2에서 1.5 /zg/m.?,, H5N1에서 0.5 g/mi, B형 바이러스에서 13.7 //g/in£을 각각 나타내었다.

H1N1 감염주에 대한 결과를 보면， 타미플루의 경우 50% 이상의 항바이러스 효과를 보이는 EC50는 3.5 g/ 에서 관찰되었고， 탱자 씨앗 추출물의 경우 0.2 ug/mi 이상에서 50% 항바이러스 효과 (EC50)를 나타내었다. 또한， 세포를 현미경으로 관찰한 결과, 타미플루의 경우 감염되어 죽은 세포들이 많은 반면， 탱자 씨앗 추출물의 경우 0.07 /g/ 을 처리한 경우에도 항바이러스 효과를 나타내었다 (도 2a). H5N1 감염주에 대한 결과를 보면， 타미폴루의 경우 EC50는 1.5 /ml에서 관찰되었고， 탱자 씨앗 추출물의 경우 0.5 g/m 에서 50 % 항바어러스 효과 (EC50)를 ― 나타내었다 (도 2b). H3N2 감염주에 대한 결과를 보면， 타미플루의 경우 EC50는 3.5 /g/ 에서 관찰되었고, 탱자 씨앗 추출물의 경우 1.5 //g/ 에서 50 % 항바이러스 효과 (EC50)를 나타내었다 (도 2c). 인플루엔자 B형 감염주에 대한 결과를 보면, 타미플루와 탱자 씨앗 추출물 모두 13.7 / 에서 50 % 항바이러스 효과를 나타내었다 (도 2d).

종합해보면， 이상의 결과들은 탱자 씨앗 추출물이 A형 인플루엔자 바이러스 H1N1, H3N2 및 H5N1, 또한 B형 인플루엔자 바이러스에 대해 타미플루만큼의 높은 수준의 항바이러스 활성을 가지고 있음을 보여준다. 이러한 결과는 탱자 씨앗 추출물이 인플루엔자 바이러스에 대해 비교적 높은 수준의 치료 효과를 가지고 있을 가능성을 제시해준다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한

구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의

등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.