【발명의 명칭】

항 NINJ-1 항체 및 이의 용도 【기술분야】

본 발명은 항 NINJ-l(Ninjurin-l) 항체 및 이의 용도에 관한 것으로， 보다 상세하게는 인간 NINJ-1에 결합하는 항체 또는 그 단편, 이의 생산 방법 및 이를 포함하는 다발성 경화증, 암 예방또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

【배경기술】

본 출원은 2016년 8월 26일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2016-0109557 호를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.

NINJ-l(Ninjurin-l)은 1996년 Toshiyuki Araki 등이 처음으로 보고 하였다 (Araki , T. & Mi lbrandt , J . , Neuron 17， 353-361, 1996) . 좌골 신경 (sciat ic nerve)의 원위부를 절단 (transect ion)하거나 압착 (crush)하여 손상을 일으킨 후 신 경 섬유초 세포 (Schwann cel l )에서 발현이 증가하는 유전자 (gene)를 찾는 과정에서 발견되었다.

GenBank에 알려져 있는 단백질 정보를 이용하여 Ninjurin과 상동성 (homology)을 가지는 단백질을 찾아 계통수 (phylogenet ic tree)가 보고되었다. 척 추동물 (Verterbrate)에서는 Ninjurin-l(NINJ-l)과 Ninjurin-2(NINJ-2)라는 두 가지 의 Ninjurin 단백질이 알려져 있다. 상기 NINJ-1과 NINJ-2는 인간， 마우스 및 랫트 등의 척추 동물에서 발견된 바 있다. 그리고 무척추동물 ( invertebrate)의 경우 A, B, C의 세 종류로 나눌 수 있고 초파리 및 모기 등에서 발견되었다. 인간 NINJ-1과 마우스 NINJ-1 단백질은 90¾>가 일치하고, 인간 NINJ-1과 인간 NI J— 2 사이에는 55% 의 동일성을 지닌다.

인간 NINJ-1은 염색체 (chromosome) 9q22에 위치하고 있으며 152개의 아미노 산으로 구성되어 있다. 마우스 NINJ-1의 경우는 염색체 13에 위치하고 있으며 152 개의 아미노산으로 구성되어 있다. NINJ-1의 아미노산 서열 (sequence) 에서 두 곳 의 막 통과 영역 (transmembrane domain)을 예측할 수 있다. 그리고 실험을 통하여 NINJ-1이 세포막에 위치한 단백질임이 알려져 있다 (Araki , T. & Mi lbrandt , J . , Neuron 17, 353-361, 1996) . 이러한 사실을 통해 NINJ-1의 N-말단 (terminal ) 영역 이 길게 세포 밖으로 뻗어 나와 있을 것으로 추측할 수 있다. NINJ-1은 실험을 통 하여 동종 단백질간의 결합함이 알려져 있으며， 염증 환경 또는 다발성 경화증의 동물모델에서 그 발현율이 증가하며， 암세포 및 면역세포의 이동성 (motility) 과 내피세포 내 이동 (transendothelial migration)에 주요하게 관여함이 알려져 있다. 특히， NINJ-1의 세포외 부분의 P26에서 N37가 동종 결합에 결정적인 도메인으로 알 려져 있으며， 해당 위치에 대한 중화항체 또는 단편 결합 펩타이드 투여 시에 질병 완화가 보고된 바 있다 (Ifergan I et al . , Ann Neurol . 70(5) :751-763, 2011； Ahn BJ et al. , J Biol Chem. 289(6) :3328-3338， 2014； Odoardi F. et al. , Nature. 488(7413) :675-679, 2012).

NINJ-1은 다양한 조직에서 발현되고 있다. 예를 들어， RNA 단계에서는 심장 (heart), 뇌 (brain), 태반 (placenta)， 폐 (lung), 간 (liver), 골격근 (sk. Muscle)， 콩팔 (kidney ), ^' 이자 (pancreas), 비장 (spleen), 흉선 (thymus), 전립선 (prostate) , 고환 (test is), 난소 (ovary), 소장 (sm.intj, 대장 (colon), 혈액 (blood), 부신 (adrenal gland) 및 후근절 (Dorsal Root Ganglia, DRG)에서 발현되고, 단백질 단계 에서는 간， 콩팔, 흉선, 자궁 (uterus), 부신， 망막 (retina) 및 후근절에서 발현되 는 것이 보고된 바 있다.

또한， 지금까지 알려진 NINJ-1의 기능으로는 세포 결합 (cell adhesion), 신 경 증식 (neurite ' outgrowth), 세포 ,노화 (eel hilar senescence) 및 암과 관련성 (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110(23), pp.9362-9367 (2013.06.04. ) 참조)이 있다.

하지만 인간 NINJ-1에 대한 바이오 마커로서의 중요성에도 불구하고, 인간 인간 NINJ-1를 높은 민감도와 정확도로 검출할 수 있는 기술이 부재한 실정이다. 특히 인간 NINJ-1 단백질은 마우스 NINJ-1과 단백질 구조상 유사한 점이 많아， 기 존에 알려진 통상적인 방법으로서 동물들로부터의 면역반응으로 얻어지는 항체는 마우스 NINJ-1에도 결합하는 교차 반응을 보이는 문제가 생기는 등, 인간 NINJ-1에 대한 고감도의 항체가 생성되지 않는 경우가 많다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

이에 본 발명자들은 인간 NINJ-1 단백질 또는 본 단백질의 동종 결합 부위 에만 특이적으로 결합하는 항체를 개발하고자 연구하던 중， 본 발명에서 개시하는 특유의 CDR 서열 구성을 가지는 항체 와 이의 단편이 다른 생물 유래 NINJ-1 단백 질 (특히 마우스 NINJ-1 단백질)과는 교차반웅성을 보이지 않고 인간 NINJ-1 단백질 에만특이적으로 결합하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 따라서 본 발명의 목적은， 인간 유래 NINJ-l(Ninjurin-l) 단백질에 특이적으 로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은， 상기 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오 티드를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은， 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터를 제공 하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은， 상기 백터를 포함하는 세포를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은， 상기 세포를 이용하여 인간 NINJ-1 단백질에 특 이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은， 상기 본 발명의 인간 유래 NINJ-1 단백질에 특이 적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계; 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 인간 NINJ-1 특이적 검출 방법을 제공하는 것 이다. 본 발명의 또 다른 목적은， 상기 본 발명의 인간 유래 NINJ-1 단백질에 특이 적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 다발성 경화증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은, 상기 본 발명의 인간 유래 NINJ-1 단백질에 특이 적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 전이 (cancer metastasis) 저해용， 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여， 인간 유래 NINJ-l(Ninjurin-l) 단백질 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티 드를 포함하는 백터를 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 백터를 포함하 는 세포를 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 세포를 폴리뉴 클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴 리펩타이드를 생산하는 단계; 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상 기 폴리펩타이드를 회수하는 답계를 포함하는， 인간 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명의 인간 유래 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키 는 단계; 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 인간 NINJ-1 특 이적 검출 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은상기 본 발명의 인간 유래 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포 함하는 다발성 경화증 예방또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 본 발명의 인간 유래 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포 함하는 암 전이 (cancer metastasis) 저해용, 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 인간 유래 NINJ-l(Ninjurin-l) 단백질에 특이.적으로 결합하는 항 체 또는 그 단편을 제공한다. 본 발명에서 항체 (ant ibody)는 면역 글로불린 ( i麵 unoglobul in, Ig)이라고도 불리며， 항원에 선택적으로 작용하여 생체 면역에 관여하는 단백질의 총칭이다. 자 연에서 발견되는 전체 항체 (whole ant ibody)는 일반적으로 여러 도메인으로 이루어 진 폴리펩티드인 경쇄 ( l ight chain, LC) 및 중쇄 (heavy chain, HC)의 2개 쌍으로 이루어지거나, 이들 HC/LC의 2개의 쌍으로 된 구조를 기본 단위로 한다. 포유류의 항체를 구성하는 중쇄의 종류는 그리스 문자 α , δ , ε ， γ 및 μ로 표시되는 5가 지 유형이 있으며, 중쇄의 종류에 따라 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 등 다른 종류의 항체를 구성하게 된다. S유류의 항체를 구성하는 경쇄의 종류는 λ 및 κ로 표시되는 2가지 종류가존재한다.

항체의 중쇄와 경쇄는 구조적으로 아미노산 서열의 가변성에 따라 가변영역 과 불변영역으로 구분된다. 중쇄의 불변영역은 항체의 종류에 따라 CHI , CH2 및 CH3( IgA, IgD 및 IgG 항체) 및 CH4(IgE 및 IgM 항체) 등 3 또는 4개의 중쇄불변영 역으로 구성되어 있으며, 경쇄는 1개의 불변영역인 CL으로 구성되어 있다. 중쇄와 경쇄의 가변영역은 각각 중쇄가변영역 (VH) 또는 경쇄가변영역 (VL)의 하나의 도메인 으로 이루어져 있다. 경쇄와 중쇄는 각각의 가변영역과 불변영 이 나란히 정렬되 어 1개의 공유 이황결합 (disul f ide bond)에 의해. 연결되고， 경쇄와 결합한 두 분자 의 중쇄는 2개의 공유 이황결합을 통해 연결되어 전체 항체의 형태를 형성한다. 전 체 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 통해 항원에 특이적으로 결합하며, 전체 항 체는 2개의 중쇄 및 경쇄의 쌍 (HC/LC)으로 구성되어 있으므로， 한 분자의 전체 항 체는 두 개의 가변영역을 통해 동일한 두 개의 항원에 결합하는 2가의 단일특이성 을 갖게 된다. 항체가 항원에 결합하는 부위를 포함하는 가변영역은 서열 가변성이 적은 골 격 부위 (framework region, FR)와 서열 가변성이 높은 과가변성 부위 (hypervariable region)?] 상보성 결정부위 (complementary determining region, CDR)로 세분된다. CDR-Ll은 경쇄 가변 영역에서 대략 잔기 24-34에， CDR-L2는 대략 잔기 50-56에， CDR-L3은 대략 잔기 89-97에 위치하며; CDR— HI은 중쇄 가변 영역에 서 대략 잔기 31-35에， CDR-H2는 대략 잔기 50-65에, CDR-H3은 대략 잔기 95-102에 위치한다. VH와 VL은 각각 3개의 CDR 및 4개의 FR이 N-말단부터 C-말단의 방향으 로 FR1-CDR1— FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 배열되어 있다. 항체의 가변영역 안 에서도 서열 가변성이 가장 높은 CDR이 항원과 직접 결합하는 부위로， 항체의 항원 특이성에 가장중요하다. 상기 '닌주린 l(Ninjurin-l, NINJ-1)' 은 세포막 단백질의 일종으로, 본 발 명에서 인간 NINJ-1은 천연형 또는 재조합 인간 NINJ-1을 모두 포함하는 의미하며， 당업계에 NCBI (genbank) Reference Sequence: NP_004139.2(서열번호 25) 등으로 그 천연형 단백질 서열이 공지되어있다. 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이 드 서열로서 NCBI (genbank) Reference Sequence ： NM_004148.3(서열번호 26) 등이 알려져있으며, 당업자는 이를 바탕으로 재조합 단백질을 수득가능하다. 본 발명자들은 상기 서열번호 25로 표시되는 인간 유래 NINJ-1 단백질 서열 중에서 26번째 아미노산 내지 37번째 아미노산 영역에 특이적으로 결합하는 항체 _^ 및 이의 단편들을 개발하였고， 이들 항체들이 가지는 특유의 가변부위 CDR 서열 구 성을 통하여 다른 생물 유래 NINJ-1 단백질 (특히 마우스 NINJ-1 단백질)과는 교차 반웅성을 보이지 않고 인간 NINJ-1 단백질에만 특이적으로 결합하는 효과가 현저함 을 확인하였다. 구체적으로 본 발명의 상기 항체 또는 그 단편은 다음과 같은 특유의 CDR서 열을 포함하는 경쇄가변영역 (VL) 및 중쇄가변영역 (VH)를 포함하는 것을 특징으로 한다:

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L1 , 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L2 및 서 열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L3를 포함 하는 항체 경쇄가변영역 (VU ; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) HI, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열올 포함하는 상보 성 결정부위 (CDR) H2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보 성 결정부위 (CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역 (VH)을 포함하는 항체일 수 있 고，

서열번호 7로 표시되는 아미노산서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L1 , 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L2 및 서 열번호 9으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L3를 포함 하는 항체 경쇄가변영역 (VL) ; 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함 하는 상보성 결정부위 (CDR) HI , 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) H2 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상 보성 결정부위 (CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역 (VH)을 포함하는 항체일 수 있고,

서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L1, 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L2 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역 (VL) ; 및 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) HI , 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함 하는 상보성 결정부위 (CDR) H2 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하 는 상보성 결정부위 (CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역 (VH)을 포함하는 항체일 수 있으며 ,

서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L1, 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L2 및 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역 (VL) ; 및 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포 함하는 상보성 결정부위 (CDR) HI, 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함 하는 상보성 결정부위 (CDR) H2 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 포함하 는 상보성 결정부위 (CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역 (VH)을 포함하는 항체일 수 있다. 본 발명에 따른 인간 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 상기한 CDR의 조합의 구성을 갖는 것이라면, 그 종류에 제한이 없다. 구체적으로는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 _. 있으며, 특히 IgG 항체 인 것이 바람직하다.

또한 1개의 B 세포에서 유래하는 단일클론 (monoclonal , 모노클로날) 항체일 수도 있고, 복수의 B 세포에서 유래하는 다클론 (polyclonal , 폴리클로날) 항체일 수도 있지만， 항체의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열이 실질적으로 동일한 항체의 집 단인 단일클론 항체인 것이 바람직하다. 본 발명에서 '모노클로날'이라는 말은 항 체가 실질적인 상동성 집단으로부터 수득되는 것과 같이 항체의 특성을 나타내는 말이며, 반드시 항체를 특정 방법에 의해 생산해야 한다는 것은 아니다. 예를 들 어， 본 발명의 모노클로날 항체는 문헌 [참조: Kohler et al . (1975) Nature 256： 495]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나， 또는 재조합 DNA 방법 (참조: 미국 특허 계 4,816,567호)에 의해 제조할 수 있다. 또한， 예를 들어， 문헌 [참조: Clackson et al . (1991) Nature 352： 624-628 및 Marks et al . (1991) J . Mol . Biol . 222： 581-597 및 Presta(2005) J . Al lergy Cl in. Immunol . 116:731]에 기술된 기술을사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 본 발명의 항체는 전술한 특유의 CDR구성을 포함하는 한 키메라 항체， 인간 화된 항체， 인간항체 등의 형태를 모두 포함할 수 있으며， 바람직하게는 인간항체 일 수 있다. 또한 본 발명에서 항체의 단편은 전체 항체의 항원 특이적 결합력을 유지하 고 있는 항체의 단편을 의미하며， 구체적으로는 디아바디, Fab, Fab ^' , F(ab)2, F(ab ^' )2, Fv 및 scFv등의 형태일 수 있다.

Fab( fragment ant igen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로， 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab' )2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로， 두 개의 Fab가 중쇄 경첩 (hinge)에서 이황결합 (disul f ide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab' )는 F(ab' )2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 증쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편 이다. FV variable fragment )는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv( single chain variable fragment )는 중쇄가변영역 (VH)과 경쇄가변 영역 (VL)이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디 (diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고， 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태 의 단편을 의미한다. 본 발명의 항체 또는 그 단편은 당업계에 알려져 있는 방법, 예를 들어， 파 지 디스플레이 방법 또는 효모 세포 표면 발현 시스템을 사용하여 생성될 수 있다. scFv를 제조하는 방법으로는 미국특허 제 4, 946， 778호 및 제 5 ,258,498호에 기재된 방법이 사용될 수 있으며, Fab, Fab' 및 F(ab' )2 단편을 재조합적으로 생성하기 위 한 방법으로는 W0 92/22324등에 기재된 방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 효소, 형광 물질， 방사선 물질 및 단백질 등과 접합된 것 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 항체에 상기 물질을 접합하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

¾ 발명은 또한상기한 바와 같은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호 화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명에서 용어 '폴리뉴클레오티드' 는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산으로 기재될 수도 있으며， DNA분자들 (예를 들어， cDNA 또는 유전체 (genomic DNA) , RNA 분자들 (예를 들어， mRNA) , 뉴클레오티드 유사체들을 사용하여 생성 ¾ 상기 DNA 또 는 RNA의 유사체들 (예를 들어， 펩티드 핵산들 및 비 -자연적으로 발생하는 뉴클레오 티드 유사체들) 및 이들의 하이브리드들이 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단 일 -가닥 (single-stranded) 또는 이중 -가닥 (double—stranded)이 될 수 있다. 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드는 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 것이라면， 그 서열이 특별히 제한되지 아니한다. 전술한 본 발명의 항 체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법에 의 하여 얻어질 수 있다. 예를 들어， 전술한 본 발명의 항체 전장서열， 또는 중쇄 및 경쇄의 일부분 (특히 중쇄가변부위 및 경쇄가변부위를 포함하는 영역)에 해당하는 아미노산 서열에 근거하여 코돈을 분석하고， 이들 코돈분석을 통해 mRNA 또는 cDNA 구성할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 당업계에 알려진 을리고 뉴클레오타 이드 합성기법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응 (PCR)법 등올 사용하여 합성할 수 있 다. 또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터를 제공한다. 상기 백터는 재조합 발현 백터로서, 본 발명에서 '재조합 (recombinant ) '은 ' 유전자 조작 (genet i c manipulat ion) '과 호환하여 사용될 수 있으며 , 유전자에 변형 을 가하고 자르고 연결하는 등 분자적 클로닝 (molecular cloning) 실험 기법을 이 용하여 자연의 상태에는 존재하지 않는 형태의 유전자를 제조하는 것을 의미한다. 본 발명에서 발현 (expression) '은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것 을 의미한다. 본 발명에서 '재조합 발현 백터 '란 적합한 숙주세포 (host cel l )에서 목적하 는 단백질 또는 핵산 (RNA)을 발현할 수 있는 백터로서, 폴리뉴클레오티드 (유전자) 삽입물이 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. '작동가능하게 연결된 (operably l inked) '이란 일반적 기 능을 수행하도톡 핵산 발현조절서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결 (funct ional l inkage)되어 있는 것으로, 발현조절서열에 의 해 유전자가 발현될 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 상기 '발현조절서열 (expression control sequence) '이란 특정한 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 폴 라뉴클레오타드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터， 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열， 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열， 개시 코돈， 종결 코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다. 따라 서 본 발명에 따른 재조합 발현 백터는, 전술한 바와 같이 인간 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 특유의 CDR 구성을 갖는 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 적절한 숙주세포에서 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 유전자 작제물을 의미한다. 본 발명의 재조합 발현 백터는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 백터라 면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며， 그 예로는 플라스미드 백터, 코즈미드 백 터, 박테리오파아지 백터 및 바이러스 백터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드 (pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)) , 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드 (pUBllO 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드 (ΥΕρ13, ΥΕρ24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러 스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스， 배클로 바이러 스와 같은 곤층 바이러스 등이 사용될 수 있으며， pcDNA등을사용할 수 있다. 백터의 일종인 플라스미드 (plasmid)는 외부의 폴리뉴클레오티드 단편들이 결 합될 수 있는 선형 또는 원형의 이중 나선의 DNA 분자를 의미한다. 백터의 다른 형 태는 바이러스성 백터 (viral vector ; 예를 들어， 복제 -결핍 레트로바이러스 (repl icat ion defect ive retroviruses) , 아데노바이러스들 및 아데노 -연관 바이러 스들 (adenoassociated viruses) )이며, 여기에서 부가의 DNA 단편들은 상기 바이러 스성 게놈 (viral genome) 내로 도입될 수 있다. 특정의 백터들은 그 안으로 이들이 도입되는 숙주세포 (예를 들어， 박테리아 유래 (bacterial origin) 및 에피좀의 포유 류 백터 (epis이 nal mammal ian vectors)를 포함하는 박테리아성 백터들 (bacterial vectors)) 내에서의 자가복제 (autonomous repl icat ion)를 할 수 있다. 다른 백터들 (예를 들어， 비-에피좀의 포유동물 백터들 (non-episomal mammal ian vectors))이 숙 주세포 내로의 도입에 의한 숙주세포의 게놈 내로 통합 ( integrated)되고 그리고 그 에 의하여 상기 숙주 게놈과 함께 복제된다. 본 발명에 따른 항체의 중쇄와 경쇄， 또는 이들의 단편 (특히 중쇄가변부위 및 경쇄가변부위를 포함하는 단편)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 각각 별개의 재조합 발현 백터에 포함되어 있올 수도 있고， 하나의 재조합 발현 백터에 포함되 아있을 수도 있다. 한편， 본 발명은 본 발명의 백터를 포함하는 세포를 제공한다. 즉， 본 발명 은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명의 세포 (숙주세포)는 본 발명의 재조합 발현 백터에 포함된 항체 또 는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포라면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명에 따른 재조합 발현 백터로 형질전 환된 세포 (숙주세포)는 원핵생물 (예를 들어, 대장균)， 진핵생물 (예를 들어， 효모 또는 다른 균류)， 식물 세포 (예를 들어， 담배 또는 토마토 식물 세포)， 동물 세포 ( 예를 들어, 인간 세포， 원숭이 세포， 햄스터 (hamster) 세포， 랫 세포 (rat cel l ) , 마우스 세포 (mouse cel l ) , 곤층 세포 또는 이들에서 유래한 하이브리도마일 수도 있다. 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 세포일 수 있다. 본 목적에 적합한 원핵생물은 이에 제한되지 않으나, 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아새 (Enterobacteriaceae) , 예를 들어 에스케 리치아 (Escherichia) , 예를 들어 E.col i , 엔테로박터 (Enterobacter)， 에르위니아 (Erwinia) , 클렙시엘라 (Klebsiel la)， 프로테우스 (Proteus) , 살모넬라 (Salmonel la)， 예를 들어， 살모넬라 티피무륨 (Salmonel la typhimurium) , 세라티아 (Serrat ia) , 예 를 들어, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실리 (Bacilli)ᅳ 예를 들어, 비. 섭틸리스 (B. subtil is) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis), 슈도모나스 (Pseudomonas)， 예를 들어 피. 애루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트랩토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 본 발명의 세포는 본 발명의 백터를 발현가능 한 것이면, 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 이. 콜라이， 이에 한정되지 아니하나 예를 들어， 이 . 콜라이 coli) ER2537, 이 . 콜 라이 B, 이. 콜라이 X1776(ATCC 31,537), 이. 콜라이 W3110(ATCC 27,325) 또는 LacZ가 발현 가능한 이. 콜라이일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 이. 콜라이 ER2537일 수 있다. 본 목적에 적합한 진핵생물은 이에 제한되지 않으나， 예를 들어 사카로마이 세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 숙주， 예를 들어 케이. 락티스 ( .lactis), 케이. 프라길리스 (K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K, bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 위커라미 (K. wickerami i )(ATCC 24,178), 케이. 왈티 (K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophi 1 arum) (ATCC 36,906), 케이. 테르모를레란스 ((Κ· thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스 (K. mar xi anus); 야로위아 (yarrowiaKEP 402,226)； 피키아 파스토리스 (Pichia pastor is)(EP 183,070)； 칸디다 (Candida)； 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia(EP 244,234))； 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 쉬바니오마이세스 ( Schwann iomyces), 예를 들어 .쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidental is)； 및 필라멘트성 진균， 예를 들어 뉴로스포라， 페니실리움 (Penicillium), 를리포클라디 움 (Tolypocladium) 및 아스퍼질러스 (Aspergil lus) 숙주， 예를 들어 에이. 니둘란스 (nidulans) 및 에이. 니거 (niger)가사용 가능하다. 한편 본 발명의 세포는 동물세포 특히 척추동물 (포유동물) 세포일 수 있다. 배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 중식은 일상적인 방법이 되었고 기술들이 폭 넓게 이용가능하다. 이에 제한되지 아니하나， 유용한 포유동물 숙주 세포의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 라이 (현탁 배양으로부터 서브클로닝된 293 또는 293 세포 [Graham 등, 1977, J Gen Virol. 36： 59]), 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL10) , 차이니즈 햄스터 난소 세포 /— DHFR"(CH0, Urlaub 등， 1980， Proc. Natl. Acad. Sci . USA 77： 4216； 예를 들어, DG44), 마우스 세르를리 세포 (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251)， 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세 포 (VERO-76, ATCC CRL-1587), 인간 경부 암세포 (HELA, ATCC CCL 2)， 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34)， 버팔로 랫트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442)， 인간 폐세포 (W138.ATCC CCL 75)， 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065) , 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51), TRI 세포 (Mather 등， 1982， Annals NY. Acad. Sci . 383： 44- 68 ), MRC 5 세포， FS4 세포, 인간 간암 세포주 (Hep G2), HEK 293 cell (human

TM

embryonic kidney cell) 및 Expi293F cell일 수 있으며， 바람직하게는 CHO cell,

TM

HEK 293 cell (human embryonic kidney cell) 또는 Expi293F cell일 수 있다. 본 발명에서 제공하는 상기 세포는 전술한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 백터로 형질전환되거나 또는 형질감염 (transfected)될 수 있는 배양 된 세포이고， 이는 계속해서 상기 숙주세포 내에서 발현될 수 있다. 재조합 세포는 발현되어야 할ᅳ폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나 또는 형질감염된 세포를 말한 다. 상기 세포를 배양하기 위한 배지 조성과 배양 조건， 배양 시간 등은 당업계 에서 통상 사용되는 방법에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대 햄 (Ham's) F10(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, M0), 최소 필수 배지 (MEM, Sigma-Aldrich Co.), RPMI -1640 (Sigma-Aldrich Co.), 및 둘베코 (Dulbecco's) 개질 이글 (Eagle's) 배지 (DMEM, Sigma-Aldrich Co.)가 세포 * 배양하기에 적합하 다. 상기 배지는 필요하다면 호르몬 및 /또는 다른 성장 인자, 염， 완층액， 뉴클테 오티드， 항생제, 미량 원소 및 글루코스 또는 동등 에너지원이 추가될 수 있다. 한편 본 발명은 상기 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양 하여 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는， 인간 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법을 제공한다. 본 발명 생산방법의 세포에 대하여는 상기 기술한 바와 같으며， 본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있다. 전술한 바와 같이 본 발명의 항체 또는 그 단편은 항원 인식과 결합에 중요한 부위 (CDR 및 이를 포함하는 가변부위)의 아미노산 서열이 특정되어 있으므로， 당업자라면 이를 바탕 으로 본 발명의 항체를 용이하게 반복적으로 대량생산할 수 있다. 본 발명 생산방법의 폴리펩타이드는 본 발명의 항체 또는 그 단편 그 자체일 수 있으며, 본 발명의 항체 또는 그 단편 의 다른 아미노산 서열이 추가로 결합된 것일 수 있다. 이 경우 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 본 발명의 항체 또는 그 단편으로부터 제거할 수 있다. 상기 배양은 상기 세포의 종류에 따라 배지조성 및 배양 조건이 달라질 수 있으며, 세포에 따른 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건은 본 기술분야의 통상의 기술자가 적절히 선택 및 조절할 수 있으며, 본 발명 세포의 배양 배지와 관련하여 전술한 예시를 참조로 할수 있다. 상기 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나， 세포로부터 분비되거나， 적절한 신호 서열에 의하여 페리플라즘 또는 세포외 배지 (supernatant )로 표적화 (targeted)될 수 있으며, 페리플라즘 또는 세포외 배지로 표적화되는 것이 바람직 하다. 또한, 생산된 항체 분자를 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법올 이용하여 리폴딩 (refolding)시키고 기능적 형태 (conformat ion)를 갖도톡 하 는 것이 바람직하다. 또한 IgG 형태의 항체를 생산하는 경우， 중쇄와 경쇄는 별개 의 세포에서 발현시키고 별도의 단계에서 증쇄와 경쇄를 접촉시켜 완전한 항체를 구성하도록 제조할 수도 있고， 중쇄와 경쇄를 동일한 세포에서 발현되도록 하여 세 포 내부에서 완전한 항체를 형성하도록 할 수도 있다. 상기 폴리펩타이드의 회수는 생산된 생산된 항체 또는 그 단편 폴리펩타이드 의 특성， 숙주세포의 특성， 발현 방식 또는 폴리펩티드의 표적화 여부 등을 고려하 여 통상의 기술자는 수득 방법을 적절히 선택 및 조절할 수 있다. 예를 들어， 배양 배지로 분비된 항체 또는 그 단편은 숙주세포를 배양한 배지를 수득하고, 필터 (한 외여과 등) 또는 원심분리하여 불순물을 제거하는 등의 방법으로 항체를 회수할 수 있다. 필요에 따라 세포 내 특정 소기관이나 세포질에 존재하는 항체를 세포 외부 로 방출하여 회수하기 위하여 항체 또는 그 단편의 기능적 구조에 영향을 미치지 않는 범위에서 세포를 용해시킬 수도 있다. 또한 수득한 항체는 크로마토그래피, 필터 등에 의한 여과, 투석 등의 방법을 통해 불순물을 더욱 제거하고 농축하는 과 정을 추가로 거칠 수 있다. 단백분해를 억제하기 위하여 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에 포함될 수 있고， 우발적인 오염물의 성장올 방지 하기 위하여 항생제가포함될 수 있다.

세포로부터 제조된 항체는 예를 들어 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동， 투석 및 친화도 크로마토그래피를사용하여 정제될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그 단편은 인간 NINJ-1과 특이적으로 결합하므로 예를 들어, 특정 세포， 조직， 또는 혈청 내 인간 NINJ-1 단백질의 존재 (또는 발현)을 검 출하고 정량하기 위한 진단 분석에 유용하다. 본 발명에서 용어 '분석' 은 바람직 하게 '측정' 을 의미하는 것일 수 있고， 정성분석은 목적하는 물질의 존재 여부를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있으며， 정량분석은 목적하는 물질의 존 재 수준 (발현 수준) 또는 양의 변화를 측정 및 확인하는 것올 의미하는 것일 수 있 다. 본 발명에서 분석 또는 측정은 정성적인 방법과 정량적인 방법을 모두 포함하 여 제한없이 수행될 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 본 발명의 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계; 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 인간 NINJ-1 특이적 검출 방법을 제공한다. 상기 항체 또는 그 단편올 '검출 '하기 위하여， 항체 또는 그 단편은 일반적 으로 검출가능 모이어티로 표지될 수 있다.

예를 들어， 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2， 1991 , Col i gen 등， Ed. Wi ley-Interscience, New York, N. Y. , Pubs]에 기술된 기 술을 이용하여， 방사성 동위원소 또는 형광표지로 표지될 수 있다. 방사능은, 예를 들어， 신틸레이션 계수 (scint i l lat ion count ing)에 의해 측정될 수 있으며, 형광은 형광계를 이용하여 정량될 수 있다.

또는 다양한 효소 -기질 표지가 이용가능하며 , 상기 효소적 표지의 예는 초파 리 루시러파제 및 세균 루시퍼라제 (미국 특허 제 4,737 , 456호)와 같은 루시퍼라제， 루시페린 ( luci fer in) , 2 ,3-다이하이드로프탈라진디오네스, 말레이트 디하이드로게 나제 유라제 ( _urase ) , 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP0)와 같은 퍼옥시다제， 알칼라인 포스파타제, β—갈락토시다제， 글루코아밀라제， 라이소자임, 사카라이드 옥시다제( 예를 들어 글루코스옥시다제， 갈락토스 옥시다제， 및 글루코스 -6-포스페이트 디하 이드로게나제)， 헤테로사이클릭 옥시다제 (예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제) , 락토퍼옥시다제， 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 항체에 효소를 접합시키는 기 술은 예를 들어, 문헌 [O' Sul l ivan 등, 1981 , Methods for the Preparat ion of Enzyme一항체 Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J . Langone & H. Van Vunakis , eds . ) , Academic press , N. Y.， 73: 147-166]에 기술되 어 있다. 표지는 다양한 공지된 기술을 이용하여 항체에 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어， 항체는 바이오틴에 접합될 수 있고 상기에 언급된 3종의 광범위한 카테 고리에 속하는 임의의 표지들이 아비딘과， 또는 그 반대로 접합될 수 있다. 바이오 틴은 아비딘에 선택적으로 결합하고, 따라서 이 표지는 이러한 간접적 방식으로 항 체에 접합될 수 있다. 또는， 항체에 표지의 간접적 접합을 달성하기 위하여， 항체 는 작은 합텐 (hapten) (예를 들어， 딕옥신 [digoxin] )과 접합될 수 있고 상기에 언 급된 서로 다른 유형의 표지들의 하나가 항 -합텐 항체에 접합될 수 있다 (예컨대， 항-딕옥신 항체) . 따라서， 항체에 대한표지의 간접적 접합이 달성될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그 단편은 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석， 및 면역침전 분석과 같은 임의의 공지된 분석 방법에 사용될 수 있다. 구체 적으로 본 발명에서 상기 항체 또는 그 단편의 검출 방법은， 당업계에 항체를 사용 하는 검출 방법이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나 예를 들어 웨스턴 블랏， ELISA(enzyme-l inked immunospeci f ic assay) , 방사선면역분석, 방사선 면역 확산 법, 오우크테로니 면역 확산법， 로케트 면역전기영동, 면역염색법 (면역조직화학염 색 및 면역형광염색 등 포함)， 면역침전 분석법， 보체 고정 분석법， FACSCFluorescence act ivated cel l sorter ) 또는 단백질 칩방법 중 어느 하나를 이 용하는 것일 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그 단편은 진단 키트 즉, 진단 분석올 수행하기 위한 진단 ¾트， 즉 사용설명서와 함께 미리 지정된 양으로 시약들의 포장된 조합에 사 용될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우에， 키트는 기질 및 발색단 또는 형광단 을 제공하는 기질 전구체로서 효소에 의해 요구되는 보조인자 (cof actor)를 포함할 수 있다. 또한, 안정화제， 완충액 (예를 들어， 차단 완층액 또는 용해 완층액) 둥과 같은 다른 첨가제들이 포함될 수 있다. 다양한 시약들의 상대적인 양은 분석의 민 감도를 층분히 최적화시키는 시약의 용액 내 농도를 제공하기 위해 폭넓게 변화될 수 있다. 시약은 용해 시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하게 될 부형제를 포함하는， 일반적으로 동결건조된， 건조 분말로서 제공될 수 있다. 기존에 NINJ-1은 다발성경화증 환자에서 그 수준이 상향 조절 (up- regulat ion)되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 NINJ-1 다발성 경화증의 진단， 병의 진행 상태 및 치료전후의 예후의 평가를 위한 진단 마커로서 사용될 수 있음 이 알려져 있었다. 즉， 다발성 경화증의 진단 및 예후 평가는 생물학적 시료 중에 서 NINJ-1 단백질을 검출함으로써 수행될 수 있다. 따라서 전술한 본 발명의 인간 NINJ-1 특이적 검출 방법은 잠재 환자로부터 채취돤 시료로부터 인간 NINJ-1의 발 현 수준을 측정하여 다발성 경화증의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법으로 이 용가능하다. 상기 생물학적 시료는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료， 생검 표본， 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구 체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직 (특히 신경조직)， 추출물, 세포 용해물， 전혈, 혈장， 혈청， 침， 안구액, 뇌척수액, 땀， 뇨， 젖， 복수액， 활액， 복 막액 등일 수 있다. 상기 시료는 동물， 바람직하게는 포유동물， 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있 다. 예를 들어， 여과， 증류, 추출， 농축, 방해 성분의 불활성화， 시약의 참가 등을 포함할 수 있다. 또한， 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다. 상기 검출에 관하여는 앞서 설명한 바와 같다. 한편， 면역세포와 중추신경계 내피세포의 결합 및 면역세포의 중추신경계 내 부로 이동은 다발성 경화증에 있어서 중요한 병리이며， 기존 다발성 경화증의 치료 에 있어서 상기 결합 및 이동을 막기 위한 치료전략이 사용되고 있는 실정이다 (일 례로, Tysabri®(natal izumab) 등) . 면역세포와 중추신경계 내피세포의 결합과 면역 세포의 중추신계 내부로 이동에 있어서 NINJ-1이 부착분자로 작용함이 당업계에 알 려졌다. 이에 NINJ-1의 활성을 저해하여 면역세포와 중추신경계 내피세포간의 결합 과 면역세포 이동을 억제하면 다발성 경화증의 예방 및 치료효과를 거둘 수 있다. 이에 본 발명자들은 전술한 본 발명의 항체가 면역세포주와 인간 대뇌내피세포간의 부착올 현저히 억제하는 것을 확인하여, 다발성 경화증의 예방 및 치료 효과를 확 인하였다. 따라서 본 발명은 상기 본 발명의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하 는 다발성 경화증 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 상기 항체 또는 그 단편으로 구성되는 다발성 경화증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 상기 항체 또는 그 단편으로 필수적으로 구성되는 다발성 경화증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 다발성 경화증의 예방 및 치료용 제제를 제조하기 위한 상기 본 발명의 항체 또는 그 단편의 용도를 제공한다. 또한 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증의 예방 및 치료방법을 제공한다.

또한 상기 항체 또는 그 단편으로 구성되는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증의 예방 및 치료방법을 제 공한다.

또한 상기 항체 또는 그 단편으로 필수적으로 구성되는 조성물의 유효량을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증의 예방 및 치 료방법을 제공한다. 상기 다발성 경화증 (MS)은 중추신경계의 탈수초성 질환 (demyel inat ing disease) 중 한 종류로， 주로 젊 ： 연령층에서 발생하는 만성 염증성 질환이다. 다 발성 경화증의 원인은 신경세포의 축삭 (axon)을 둘러싸고 있는 수초 (myel in sheath)가 소실되어, 신경전달의 기능을 수행할 수 없고， 이로 인하여 신경학적 증 상이 발생한다. 수초가 소실된 곳은 흉터가 형성되거나 경화증이 나타게 된다. 또 한， 자가면역， 유전적 요인， 바이러스 감염， 환경적 요소 등으로 인해 수초에 이상 이 생기는 것으로 알려져 있지만 다발성 경화증의 정확한 원인은 아직 밝혀지지 않 았다. 본 발명에서 다발성 경화증은 재발 완화형 다발성 경화증 (Relapsing Remitt ing MS: RRMS) , 2차 진행형 다발성 경화증 (Secondary-Progressive MS: SPMS) , 원발성 진행형 다발성 경화증 (Primary Progressive MS: PPMS) 및 진행성 재 발형 다발성 경화증 (Progressive-Relapsing MS: PRMS) 등을 포함한다. 또한 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 암의 전이를 저해함으로써 암을 예방 또는 치료하는 효과가 있다. 따라서 본 발명은 상기 본 발명의 항체 또는 그 단편 을 유효성분으로 포함하는 암 전이 저해 (억제)용， 암 예방 및 치료용 약학적 조성 물을 제공한다.

또한 상기 항체 또는 그 단편으로 구성되는 암 전이 저해용， 암 예방 및 치 료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 상기 항체 또는 그 단편으로 필수적으로 구성되는 암 전이 저해용， 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 암 전이 저해용， 암 예방 및 치료용 제제를 제조하기 위한 상기 본 발명의 항체 또는 그 단편의 용도를 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로하는 개체에 투여하 는 것을 특징으로 하는 암 전이 저해， 암 예방 및 치료방법올 제공한다.

또한 상기 항체 또는 그 단편으로 구성되는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 전이 저해, 암 예방 및 치료방법을 제공한다.

또한 상기 항체 또는 그 단편으로 필수적으로 구성되는 조성물의 유효량을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 전이 저해, 암 예방 및 치료방법을 제공한다. 본 발명의 상기 항체 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 종양 세포의 전이 를 억제하므로 다양한 암에 대하여 적용할 수 있으며， 이에 제한되지 않으나， 예를 들어 상기 암은 대장암， 폐암， 간암, 위암， 식도암， 췌장암， 담낭암， 신장암， 방 광암， 전립선암, 고환암, 자궁경부암， 자궁내막암， 융모암, 난소암， 유방암， 갑상 선암， 뇌암， 두경부암, 악성혹색종, 림프종， 재생불량성 빈혈로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 그 단편을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 에서 "약학적으로 유효한 양" 이란 음성 대조군에 비해 그 이상 의 반응을 나타내 는 양을 말하며 바람직하게는 암을 치료하기에 층분한 양을 말한다 . 상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투 여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애， 현기증과 같 은 알레르기 반웅 또는 이와 유사한 반웅을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한 다. 본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서， 상기 항체 또는 그 단편은 임상 투 여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에 는 보통 사용하는 층전제, 증량제， 결합제, 습윤제，、붕해제， 계면 활성제 등의 희 석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 일례로 비경구 투영를 위한 제형으로서 주사제로 제형화 될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오 염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적힙 "한 담체의 예로는 이에 한정되지 는 않으나， 물, 에탄올， 폴리올 (예를 들어， 글리세를, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴 리 에틸렌 글리콜 등)， 이들의 흔합물 및 /또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 보다 바람직하게는， 적합한 담체로는 행크스 용액， 링거 용액, 트 리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buf fered sal ine) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올， 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄 올， 페놀， 소르빈산， 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포 함할 수 있다. 또한， 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다. 이들 제형과 그밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌 (Remington ' s

. th

Pharmaceut i cal Sc i ence , 15 Edi t i on , 1975， Mack Publ i shing Company , East on , Pennsylvani a)에 기술된 것을 참조로 할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그 단편의 총 유효량은 단일 투여량 (single does)으로 개체에게 투여될 수 있으며， 다중 투여량 (mult iple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법 ( fract ionated treatment protocol )에 의해 투여될 수 있다. 또한 투여 목적에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수도 있다. 상기 유효 용량은 대상 질환의 유형 및 중증도， 투여 경로 및 투여 횟수뿐 만 아니라 투여가 필요한 개체의 연령， 체중, 건강 상태， 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려 하여 각 개체에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로， 해당 분야의 통상적인 지 식을 가진 자라면 투여 목적에 따라 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 또한 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 투여한 후 면역 세포의 활성을 결정해주 는 검정 방법 (assay) 또는 널리 알려진 생체내 검정을 사용하여 요법의 효능을 모 니터링함으로써 결정할 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형， 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명의 상기 '유효량' 이란 개체에게 투여하였올 때， 전술한 질환들의 개 선, 치료, 예방 효과를 나타내는 양을 말하며， 상기 '개체' 란 동물， 바람직하게는 포유동물， 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며， 동물에서 유래한 세포， 조직, 기관등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자 (pat ient ) 일 수 있다. 본 발명의 상기 '조성물' 또는 '제제' 는 식품 조성물， 화장료 조성물， 약 학적 조성물 등의 형태일 수 있고， 본 발명에서는 바람직하게 약학적 조성물을 의 미하는 것일 수 있으며 이는 전술한 바와 같다. 본 발명의 조성물은 발명의 항체 0.0이중량 % 내지 99.999중량 % 및 적합한 담체 99.999중량 % 내지 0.0이중량 %를 포함 할수 있으며， 상기 담체에는 적합한 첨가물이 포함될 수 있다. 본발명의 용어 '〜을 포함하는 (compr i sing) ' 이란 '함유하는' 또는 '특징 으로 하는' 과 동일하게 사용되며， 조성물 또는 방법에 있어서, 언급되지 않은 추 가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 ' 로 구성되는 (consi st ing of ) ' 이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소， 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 '필수적으로 구성되는 (essent ial ly consi st ing of ) ' 이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서， 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 등을 포함하는 것을 의미한다. [발명의 효과】

따라서 , 본 발명은 인간 NINJ-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공한다. 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 인간 NINJ-1에 대한 결합친화력과 결합특이성이 매우 높고 단백질간 유사성이 높은 다른 생물 유래 NINJ-1 단백질 (특 히 마우스 NINJ-1 단백질)과는 교차반응성을 보이지 않는 것이 특징이다. 따라서 NINJ-1 단백질과 관련된 질환의 진단 뿐만아니라 NINJ-1 단백질이 관여하는 병리상 태의 억제에 있어서 정확성， 고감도 등에 상당한 이점을 제공한다. 특히 본 발명에 서 제공하는 항체는 면역세포와 인간 대뇌 내피세포 간의 부착을 억제하는 효과가 현저하여 다발성 경화증의 치료효과가 있다.

【도면의 간단한설명】

도 1은 인간 NINJ-l(Ninjurin-l) 단백질 서열 각 도메인 및 동종 결합능에 중요한 도메인올 표시하며， 동종 결합 도메인에 해당하는 항원을 이용한 바이오패 닝 과정 중 각 회차별로 콜로니 수를 표시한 결과를 나타낸다. 도 2는 3 회차 바이오패닝 과정을 거쳐 선별된 파지 후보들에 대하여， HBAgl(P26-N37 영역) 에 대한 친화성올 ELISA를 통하여 확인 및 선별한 결과를 나 타낸다. 도 3a는 pGEX-4T-l 발현 백터에 도입한 인간 NINJ-1 세포외 도메인 핵산 서 열과마우스 NINJ-1 세포외 도메인 핵산서열을 나타낸다.

도 3b는 인간 NINJ-1 세포외 도메인 핵산 서열 또는 마우스 NINJ-1 세포외 도메인 핵산 서열 도입을 위한 백터 (vector)의 절단 부위 및 최종 제조된 발현백터 를 나타내는 모식도이다. 도 4는 형질 전환 시킨 대장균 (E.col i )에서 GST/huNINJ-1 및 GST/musNINJ-1 단백질의 발현을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과를 나타낸다 (도 4A: expression, 도 4B: Son i cat ion, 도 4C: Puri f icat ion) . 도 5는 HBAgl에 친화도를 보이는 후보군 중에 GST/HuNINJ-1 및 GST/musNINJ- 1에 친화도가 높은 4가지 (D9, D12, E4 및 G11)를 최종 선정한 결과 데이터로서， 각 각의 항체가 나타내는 GST (대조군)， GST/huNINJ-1, GST/musNINJ-1에 대한 친화도를 비교적으로 나타낸다 (각 후보군이 나타내는 430nm 흡광도 값은 B1 (비결합 활성 대 조군)의 값으로 표준화 하였다) . 도 6은 scFV의 항체 중쇄가변영역 (VH) 또는 항체 경쇄가변영역 (VL)을 포함하 는 IgG발현백터의 제조과정올 나타낸 모식도이다. 도 7은 각 실험군 항체들의 HBAgl(P26-N37 영역) 에 대한 친화력을 비교적 으로 나타내는 것으로， 본 발명의 D12 Ig 항체 (도 7a)가 타、사에서 판매중인 항- NINJ-1 항체들 (도 7a, 도 7b)보다 HBAgl(P26-N37 영역) 에 대한 친화력이 현저히 높다. 도 8a는 여러 가지 후보군들 중 본 발명의 D9, D12, E4 및 Gil Ig 항체가， 정상세포에서 발현되는 천연형 인간 NINJ-1 단백질에 결합하는 특이성이 매우 높음 을 비교적으로 보여준다.

도 8b는 본 발명의 D12 Ig 항체가 타사에서 판매중인 항 -NINJ-1 항체 (R&D systems , Cat No. MAB51051 R** 으로 표시)와 항원인지부위를 공유하지 않는 다는 것을 확인한 결과이다. 도 9a는 독시사이클린 유도성 인간 NINJ-1 과발현 교아종 세포주 제작을 위 한 재조합백터 수득 과정을 나타내는 모식도이다.

도 9b는 상기 U87MG pLVX NINJ-1 교아종세포주에서 독시사이클린 처리 농도 에 따른 인간 NINJ-1 발현정도를 웨스턴블롯으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 10은 본 발명의 D9, D12, E4 및 Gil Ig 항체와 2종의 타사 항 -NINJ-1 항 체 (BD bioscience Cat No. BD610776 (B** 표시)， SantaCruz Cat No. sc-136295 (S** 표시) )에 대하여, 상기 U87MG pLVX NINJ-1 교아종세포주에서 발현하는 인간 NINJ-1 단백질에 대한 친화성을 비교 평가한 결과를 나타낸다. 도 11은 본 발명의 D9, D12, E4 및 Gil Ig항체가 다발성 경과증의 치료제로 서의 효용성을 가지는지 확인하기 위하여， 면역세포와 인간 대뇌 내피세포 간의 부 착을 억제하는지 확인한 결과를 나타낸다. 【발명의 실시를 위한 형태】

이하본 발명을 상세히 설명한다.

단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

인간 NINJ-1 단백질의 P26-N37 영역을 이용한 항체 동정 <1-1> 바이오 패닝

인간 NINJ-l(Ninjurin-l, 서열번호 25)의 P26-N37 영역에 특이적인 항체를 발굴하기 위하여 , 인간 scFv 라이브러리를 기반으로 파지 디스플레이 기술을 이용 하여 다음과 같은 실험을 실시하였다. 상기 P26-N37 영역에 대한 단편 펩타이드를 이하에서 HBAgl로 칭한다.

HBAgl의 말단에 바이오틴이 결합된 펩타이드를 합성하고， 이를 Dynabeads M- 270 streptavidin(GE Healthcare Li fe Science)에 결합시킨 후, 상기 라이브러리의 scFv파지를 1시간 30분 동안 37 ^° C에서 반웅시켰다.

이후 특이적인 결합을 하는 scFv 파지를 수득하고 0D600에서 0.5~0.7이 되도 록 배양한 ER2537 대장균 (NEB)에 감염시킨 뒤 ( input ) , 보조 파지를 넣고 고체 배지 에서 12시간 내지 16시간 동안 37 ^° C에서 배양하였다. 일부는 액체 배지에서 12시간 내지 16시간 동안 37 ^° C에서 160rpm으로 진탕 배양을 실시하였다. 이후에 고체 배지 상의 콜리니 수를 측정하여， output을 확인하였다. 상기 배양액에 PEG(Poly ethylene glycol , Sigma aldrich)를 넣어 phage를 침전시킨 뒤 동일한 실험을 추가 로 2회 더 진행하여 최종 3회차 패닝을 수행하였다.

1회차에 비하여 2회차에서 파지의 colony 수가 감소하였으나 3회차에서 증 가하는 것을 확인하였으며， 이를 도 1에서 보여준다.

<1-2> 인간 NINJ-1 scFv후보 선별

상기 <1-1>의 3차 바이오 패닝에서 회수된 파지들을 숙주세포 (ER2537, NEB) 에 감염 시킨 후 LB 고체 배지 상에서 콜로니 95개를 선별한 다음， 액체 배지에 상 온 700rpm에서 배양하였다. 그 후에 각 웰에 최종 농도가 ImM이 되도록 IPTGdsopropyl -D— 1-thiogalactopyranoside)를 처리 후 30 ^° C 12-16시간 동안 200rpm에서 배양하였다. 배양액을 3, 000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 제 거한 후, TES 버퍼를 통한 삼투압 세포 용해법을 통하여 세포 내 파지입자를 얻었 다. 사전에 스트렙타아비딘 (streptavidin)이 도포된 96 웰 플레이트 (Thermo scient i f ic , Cat No. 436014)에 lOug/ml의 농도로 HBAgl 또는 PBS(Phosphate buffered sal ine, 대조군)로 코팅한 플레이트에 회수한 파지 입자를 50ul씩 넣고 상온에서 1시간 반응 시켰다. 그 다음 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase)가 결합된 항 HA(hemagglut inin) 이차 항체 (Santa cruz biotechnology) 를 넣고 다시 상온에서 1시간 동안 ^' 반웅시킨 후 TMB용액을 이용한 발색반웅을 5분 간 유도 후에 IN H2S04 용액으로 반웅을 정지 시킨 후 430nm에서 흡광도를 측정하 였다. 대조군의 결과와 HBAgl이 코팅된 플레이트에서 나타난 결과를 비교하였올 때 ， 도 2에서 보는 바와 같이 HBAgl에서만 반웅이 나타난 웰들올 대상으로 콜로니의 DNA 서열분석을 수행하였다. 이를 통해 인간 NINJ-1 , 특히 HBAgl에 특이적으로 결 합할 수 있는 다수의 scFv후보 (도 2의 초톡색으로 표시 )들을 얻을 수 있었다.

<실시예 2>

NINJ— 1의 재조합 단백질의 발현 및 정제

<2-1> NINJ-1의 세포외 도메인 단백질 생산용 발현 백터의 제조

상기 실시예 1에서 수득한 scFv 후보들이， 실제 인간 NINJ-1 단백질의 P26- N37 영역에 구조적 결합할 수 있는지 및 NINJ-1의 세포외 도메인 부분에 대한 결 합이 가능한지. 확인하기 위하여， 인간 NINJ-l(h injurin-l, NM_004148.3, 72. .284, 서열번호 26) 또는 마우스 NINJ-l(MusNINJ-l , NM_013610.2, 17. .229, 서 열번호 27) 유전자 중 세포외 도메인 부분에 전사 종결 코돈 2개를 포함하는 염기 서열을 pGEX-4T-l 발현 백터 (GST-tag를 포함하고 있는 백터, GE healthcare Li fe Sciences) 내 다클로닝 부위 BamHI과 Xhol 사이에 넣어 각각의 재조합 단백질 발현 백터를 제작하였다. 구체적 염기서열은 도 3a에 나타내었으며， 구체적인 클로닝 영 역은 도 3b에 도시하였고， 각각의 발현 백터를 pGST/hu INJl과 pGST/musNINJl으로 명명하였다. 상기 발현백터를 대장균 DH5a(enzynomics)에 형질 도입하여 배양하였 다. 미디프랩 후 DNA 염기서열 확인을 통하여 GST/huNINJ-1 및 GST/musNINJ-1와 삽 입 유무를 최종적으로 확인하였다. <2-2> NINJ-1 세포외 도메인 단백질의 발현 및 정제

상기 실시예 <2-1>에서 제작된 발현 백터 pGST/huNINJ-1또는 pGST/musNINJ- 1가 형질전환된 대장균 DH5a를 미디프랩하여 층분한 플라스미드 DNA를 회수한 후， 대장균 (E. col i ) 상에서 재조합 단백질의 발현 및 정제를 위하여 다음과 같이 실험 을 실시하였다. pGST/huNINJ-1 또는 pGST/musNINJl 플라스미드 DNA를 이용하여 대 장균 BL21DE3를 각각 형질전환시키고 LB배지에서 배양한 뒤， 단일 콜로니를 암피실 린 (ampici l l in)이 포함된 5ml LB 액상 배지에서 0D 600값이 0.6 에서 0.8이 되도록 배양하였다. 이후 OmM, 0.5mM, ImM의 IPTG를 처리하고 37 ^° C에서 3시간 동안 배양한 후, 10분 동안 8,000 rpm에서 원심분리하여 세포만을 회수하였다. 세포액으로 SDS- PAGE를 실시하고 쿠마시 용액 (coomassie stain; Sigma Aldrich)을 처리하여 발현을 확인하였다 (도 4A) .

이 후 0.5mM, l .OmM IPTG로 발현을 유도하였던 세포액을 모아 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 1ml PBS로 세포를 균질화 시킨 후 초음파분쇄기 (BRANSON)를 사 용하여 세포를 용해하였다. 그 다음 용해된 세포를 원심분리하여 수용성 단백질과 inclusion bodies를 분리하고, 분리한 샘플을 SDS-PAGE와 쿠尸 "시 용액 처리를 이용 하여 재조합 단백질의 수용성 여부를 확인하였다 (도 4B) . 그 다음， Glutathione

TM

sepharose 4B resin(GE healthcare Li fe Sciences)에 수용성 단백질 부분을 1시간 동안 4 ^° C에서 반웅 Al킨 뒤， 원심분리하여 resin에 결합된 단백질만을 분리하였다. 그 다음 50mM Tris-HCl , 10mM reduced glutathione, H 8.0 버퍼를 이용하여 GST- tag된 재조합 단백질만을 회수하였다. 회수한 단백질로 SDS-PAGE를 실시하였고, 쿠 마시 용액 (coomassie stain)을 이용하여 동일한 방법으로 정제하여 회수한 단백질 의 크기를 확인하였다 (도 4C) .

<실시예 3>

GST/hu INJ-1 및 GST/musNINJ-1의 ELISA를 통한 친화도 측정 상기 실시예 2에서 수득한 재조합 단백질 GST/huNINJ-1 및 GST/musNINJ-1에 대하여 특이적인 결합이 가능한 scFv 후보군을 스크리닝 하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

상기 실시예 1에서 HBAgl에 특이적으로 결합하는 활성을 보였던 scFV후보군 들과， 특이적 결합이 나타나지 않은 B1을 대조군으로 이용하여， GST/huNINJ-Ι 및 GST/musNINJ-1에 대한 친화도가 있는지 확인하는 실험을 실시하였다. 96 웰 플레아 트 (corning 3690 f lat bottom, hal f-area plate)에 재조합 단백질 GST/huNINJ-1 , GST/musNINJ-1 또는 GST를 각각 10ug/ml의 농도로 코팅하였다. 실시예 1에서 선별 한 scFv 후보군에 대하여, 상기 실시예 1-2에서와 동일한 실험방법을 통하여 세포 내에 있는 scFv 파지입자를 분리하고， 상기 코팅된 플레이트들을 이용하여 ELISA를 실시하였다. 각 후보군이 나타내는 430nm 흡광도 값은 B1 (비결합 활성 대조군)의 값으로 표준화 하였으며， 최종적으로 HBAgl에 친화도를 보이는 후보군 중에 GST/HuNINJ-1 및 GST/musNINJ-Ι에 친화도가 높은 4가지 (D9 , D12 , E4 및 G11)를 선정하였다. 도 5 에 나타난 바와 같이， 4가지 후보군에 따라 인간 및 마우스 NINJ-1에 대한 친화도 의 차이를 확인할 수 있었으며， 이들 후보군들이 가지는 CDR 서열은 하기 표 1과 같다. .

【표 11

<실시예 4>

인간 항 NINJ-1 항체 생산용 발현백터의 제조 및 항체 생산 상기 선정된 4가지 scFv(D9 , D12 , E4 및 G11)의 VH 및 VL 염기서열을 포함하 고， 분자량이 160kDa인 면역글로불린 G( Immunoglobul in G, IgG) 항체를 발현하기 위하여 다음과 같이 클로닝을 수행하였다.하기 표 2의 프라이머를 이용하였으며， 도 6에서 보는 바와 같이 각 scFv의 VH, VL 염기 서열을 IgG 발현 백터 (변형된 pOpt iVEC ( IgG VL-LC 표기, 경쇄 불변부위 포함; Thermo Fi sher Scient i f ic , pOptiVEC-TOPO TA cloning kit, Cat No. 12744-017) , 변형된 pcDNA3.3 TOPOdgG VH-HC 표기， 중쇄 불변부위 포함; Thermo Fisher Scientific, pcDNA3.3-T0P0 TA cloning kit, Cat No. K830001) Clal 및 Nhel 영역에 삽입하여， 중쇄 발현 백터 (IgG VH-HC) 및 경쇄 발현 백터 (IgG VL-LCK)를 계작하였다 (도 6 참고). 그 다음 상기 백터들을 대장균에 형질전환시킨 후 액체 배지 상에서 배양하였고， 미디프렙 을 통하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 이후 추출된 플라스미드 DNA를 Freestyle 293 Expression system(Thermo Fisher Scient i f ic)에서 제공되는 실험방법에 따라 FreeStyle 293F 세포주에 공동-형질주입하여 면역글루블린 G 형태의 항체 발현을 유 도하였다. 세포 배양액을 원심분리하여 세포를 분리한 후에 MabSelect SuReTM Protein A(GE Healthcare Life Sciences)를 이용하여 친화성 크로마토그래피 방법 으로 항체를 분리 정제 하였다..

【표 2】

프라이머 정보

<실시예 5>

HBAgl에 대한 인간 항 -NINJ-1 IgG의 친화도 측정

상기 실시예 4에서 제작한 Ig 항체 중 대표로 D12를사용하였고， 대조군으 로서 타사에서 판매 중인 NINJ-1 항체 (MAB51051, BD610776, SC- 136295)를 사용하 여, P26-N37 영역에 대한 친화성을측정하였다.

구체적으로 HBAgl을 스트렙타아비딘 (streptavidin)이 도포된 96 웰 플레이트 (Thermo scientific, Cat No. 436014)에 lOug/ml의 농도로 4 ^° C에서 밤샘 코팅을 하 였다. 이 후 0.05%의 Tween20가 포함된 TBS 버퍼를 이용하여 3회 세척 후 다시 동 일한 버퍼에 3) 소혈정알부민 (bovine serum albumin, BSA)를 녹인 후 1시간 동안 상온에서 반웅 시켰다. 본 발명의 Ig 항체와 타 사 (社)에서 판매 중인 다양한 항 NINJ-1 항체를 5ug/ml 또는 25ug/ml의 농도에서 2배 씩 희석하여 각 웰에 1시간동 안 상온에서 반웅시킨 뒤 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 이차 항체를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 20분간 TMB와 반응 시킨 후 IN H2S04으로 반응을 정지시킨 뒤 430nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 도 7a 및 도 7b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 D12 Ig항체는 인 간 P26-N37 펩타이드에 대한 친화력이 타사에서 판매 중인 항 -NINJ-1항체에 비하여 현저히 높은 것을 확인 할수 있었다.

<실시예 6>

정상세포 기반의 항 NINJ-1 IgG스크리닝 상기 선정된 4 가지 후보군과， 실시예 1-2후보군에 속하였지만 추후 배제된 실험군들에 대하여， 실제 인간 세포주에서 발현하는 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는지를 확인하였다. 또한， 타 사에서 판매 중인 항 NINJ-1 항체와의 항원인 지부위가동일한지 유세포분석기를 이용하여 확인하였다.

인간 대뇌 혈관 내피세포주 (M EC/D3)에 10% 소태아혈청 (Fetal bovine serum; Hyclone)을 20분간 4 ^° C에서 처리한 후에, 마우스 유래의 항 NINJ-1 항체 (R&D systems , MAB51051) , Isotype control (R&D systems , MAB002) , 상기 선정된 인 간 항 -NINJ-1 항체 (D9, D12, E4, G11외 추가 8가지, 모두 Ig 형태로 실험됨)을 10,000 세포 당 lug의 농도로 90분간 4 ^° C 상에서 반응을 시켰다. 반응이 끝난 후에 PBS를 통하여 3회 세척 후， 항 마우스 IgG에 FITC가 결합된 2차 항체를 마우스 유 래의 항체에 반웅시키고， 인간 유래의 항체 (본 발명의 항체들)에는 항 인간 IgG에 FITC가 결합된 2차 항체를 1시간 동안 4 ^° C에서 반응 시켰다. 본 분석은 유세포 분 석기 (BD FACS Cal ibur™)를 이용하여 결합유무를 확인하였다.

도 8a에 나타난 바와 같이， 세포에서 발현하는 인간 NINJ— 1에 본 발명의 4 가지 항체가 특이적으로 결합하는 것이 나타났으며， 선정된 4가지 항체 중 D9 , D12, G11에서 특히 높은 결합능을 확인할 수 있었다. 또한 상기 후보군 중 D12를 이용하여, 타사에서 판매중인 항 -NINJ— 1 항체 (R&D systems)와의 항원인지부위를 공유하는지 확인하였다. 불멸화 인간 대뇌 혈관 내피세포주 (HBMEC)에 10,000 세포 당 lug의 동일한 농도로 각각의 항체를 처리 후， 항 -인간 IgG에 FITC가 결합된 2차 항체를 1시간 동안 4 ^° C에서 반응 시켰다. 본 분 석은 유세포 분석기 (BD FACS Cal ibur™)를 이용하여 결합을 확인하였다. 도 8b에서 보는 바와 같이 본원 발명의 항체 D12는 타사에서 판매중인 항 -NINJ-1 항체 (R&D systems)와 항원인지부위를 공유하지 않는 다는 것을 확인하였다.

<실시예 7>

NINJ-1에 대하 진단 특이성 확인

독시사이클린 (doxycycl ine) 처리 시에 NINJ-1를 과발현하는 교아종세포주를 이용하여, 상기 실시예 3 및 실시예 4를 통하여 검증된 4가지 후보군 (D9, D12, E4, G11)의 인간 NINJ-1 단백질에. 대한 특이적 결합능을 검증하였다.

<7-1>독시사이클릭 유도성 인간 NINJ-1과발현 세포주 구축을 위한발현 백 터 제작 및 안정한 발현 세포 구축 인간 NINJ-1 과발현 세포주를 구축하기 위하여， A VJ-1의 cDNA (한국유전자은 행, U007113) 염기서열 중 클로닝 위치는 CDS 21 내지 476 부분 (ATGGACTC 부터 AGCAGTAG)까지를 선정하였으며， pLVX-Tet-On puro 백터의 MCS 부분 중 BamHI 및 EcoRI 을 이용하여 클로닝 프라이머를 제작하였다. 정방향 프라이머 5 '- TATGGATCCCTACTGCTGGGGTGCCATG-3' 및 역방향 프라이머 5' -

TATGMTTCATGGACTCGGGMCCGAGG-3' 으로 PCR (95 ^° C/5min, (95 ^° C/30sec , 60 ^° C /45sec , 72 ^° C/30sec) 30회， 72 ^° C/10min)을 진행 후에 0.7% 아가로스 젤상에 전기정 동하여 특정 부분만을 회수하여， 백터와 PCR산물을 BamHI 및 EcoRI으로 1시간동안 37 ^° C 상에서 반責시킨다. 반응이 완료된 샘플은 회수하여 정제 후 T4 l igase를 통 하여 유도성 발현백터를 완성 시켰다 (도 9a에 이러한 과정을 도시) . 교아종세포주 (U87MG)에 상기 유도성 발현백터를 형질주입한 후에 lug/ml의 농도에 프로마이신 (puromycin)을 3일간 반복적으로 처리하여 stable 세,포주를 확립하였다. Stable 세 포의 생육배지에 최종농도가 1， 5， 10, 50 ng/ml의 독시사이클린을 넣고 웨스턴블 롯을 통하여 NINJ-1의 발현율의 증가를 확인하였다 (도 9b 참조) . 이와 같은 증가는 독시사이클린의 농도가 증가함에 따라 발현율의 증가를 나타났다 (도 9b 참조) . 이 러한세포주를 이하에서 U87MG pLVX NINJ1로 칭한다. <7-2>독시사이클릭 유도성 인간 NINJ-l 과발현 세포주 기반의 결합능 측정 상기 실시예 4에서 최종 선정된 인간 항 NINJ-l IgG 후보군 (D9, D12, E4, G11) 및 타-사에서 개발 판매 중인 항 NINJ-1 항체 (BD bioscience, SantaCruz)와 결합능 비교를 위하여， 상기 <그1>에서 제작한 독시사이클린에 의하여 인간 NINJ-1 과발현이 유도되는 교아종세포주 (U87MG pLVX NINJ1)을 이용하여 다음과 같은 실험 을 실시하였다.

사전에 U87MG pLVX NINJ-1 교아종세포주에 50ng/ml의 최종농도로 독시사이클 린을 37 ^° C 24시간동안 처리한 세포주를 준비하여， 실시 예 3에서 제외되었던 F4(대 조군)를 기준으로 본 발명의 4종 후보군과 2종의 타사 항 -NINJ-1 항체 (BD bioscience, SantaCruz)에 대하여 분석하였으며， 실시예 6과 동일한 실험방법에 따 라유세포 분석기를 통하여 분석하였다. 그 결과 도 10에 나타난 바와 같이， 4종 후보군은 타 사에서 판매되는 항체 에 비하여 NINJ-1에 대한 높은 결합능을 확인할 수 있었다 (도 10A 및 도 10B) .

<실시예 8>

본 발명의 항 -NINJ-1 IgG처리 후 대뇌혈관내피세포 및 면역세포의 부착 억 제능 분석

면역세포와 증추신경계 내피세포의 결합 및 면역세포의 중추신경계 내부로 이동은 다발성 경화증에 있어서 중요한 병리이며， 기존 다발성 경화증의 치료에 있 어서 상기 결합 및 이동을 막기위한 치료전략이 사용되고 있는 실정이다 (일례로，

Tysabri®(natal izumab) 등) . 면역세포와 중추신경계 내피세포의 결합과 면역세포의 중추신계 내부로 이동에 있어서 NINJ-1이 부착분자로 작용함이 당업계에 알려졌다. 이에 NINJ-1의 활성을 저해하여 면역세포와 중추신경계 내피세포간의 결합과 면역 세포 이동을 억제하면 다발성 경화증의 예방 및 치료효과를 거둘 수 있다.

이에 본 발명에서 제작한 인간 NINJ-1 Ig항체 (D9, D12, E4, G11)가 면역세포 주와 인간 대뇌 내피세포 간의 부착을 억제할 수 있는 지 확인하기 위히여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

Col lagen I Rat tai l Protein을 50ug/ml 농도로 96 웰 플레이트를 코팅한 뒤 각 웰에 l .OxlO ⁴ 개의 hCMEC/D3 세포주를 72시간 동안 37 ^° C , 5% C0 ₂ 환경에서 배양 후 16시간 동안 200IU/ml TNF a와 IFN y 또는 lug/ml 농도의 PMA를 처리하였다. 그 다음 마그네슘과 칼슘이 포함되지 않은 DPBS로 2회 세척하여 세포에 잔존하는 염증 유도 물질을 제거 한 후에 lO y g/ml농도의 각 항체를 해 ^' 당 웰에 넣고 반웅시켰다. 이 과정이 끝나면 다시 한번 DPBS로 2회 세척하여 잔존하는 항체를 제거한 뒤, 면 역세포로서 Green f luorescent protein (GFP)를 발현하는 U937 세포주

( lymphoblast , 림프구)를 Ι .ΟχΚ) ⁴ 개를 넣고 90분간 37 ^° C， 5% C0 ₂ 환경에서 부착을 유도 후에 DPBS로 3회 세척하였다. 모든 과정은 실시간 세포 이미지 분석기

TM ―

( IncuCyte ZOOM)를 이용하여, 녹색으로 표지된 세포의 개수를 측정하였다. 그리고 각 웰에 최종적으로 남은 세포의 개수를 초기 세포수로 나눠준 뒤， PMA(Sigma Aldrich)처리한 것을 기준으로 표준화하였다. 그 결과 도 11에 나타난 바와 같이， 인간 NINJ-1 항체를 처리한 군 (l y g/ml PMA + D12, l u g/ml PMA + Gil)에서 면역세포주와 인간 대뇌 내피세포 간의 부착이 감소하는 것으로 나타났다. 이를 통해， 본 발명에서 제작한 항체들은 P26-N37 영역 에 특이적인 결합능을 통하여 면역세포와 인간 대뇌 내피세포 간의 부착을 억제하 는 것을 확인 할 수 있었다. 이를 통해 다발성 경화증에서 치료효과를 거둘 수 있 음은 자명하다.

【산업상 이용가능성】

이상 살펴본 바와 같이， 본 발명은 인간 NINJ-1 및 이 단백질의 동종 결합 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공한다. 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 인간 NINJ-1에 대한 결합친화력과 결합특이성이 매우 높고 단백질 간 유사성이 높은 다른 생물 유래 NINJ-1 단백질 (특히 마우스 NINJ-1 단백질)과는 교차반웅성을 보이지 않는 것이 특징이다. 따라서 NINJ-1 단백질과 관련된 질환의 진단 뿐 만 아니라 NINJ-1 단백질이 관여하는 병리상태의 억제에 있어서 정확성， 고감도 등에 상당한 이점을 제공한다. 특히 본 발명에서 제공하는 항체는 면역세포 와 인간 대뇌 내피세포 간의 부착을 억제하는 효과가 현저하여 다발성 경화증의 치 료효과가 있다. 따라서 본 발명은 표적화 (target ) 특성이 중요한 진단 산업 및 치 료산업분야에서 산업상 이용가능성이 높다.