Die Erfindung betrifft Anti-Sinn-Oligonukleotide, die sich zur Inhibierung der Ex¬ pression von Aromatase eignen, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Ver¬ wendung.

Aromatase gehört zur Cytochrom P 450 Enzym-Familie. Aromatase ist das Schlüs¬ selenzym in der Ostrogen-Biosynthese. Es wandelt die männlichen Sexualhormone (Androgene) in die weiblichen (Östrogene) um. Letztere sind Wachstumsfaktoren für eine Vielzahl von Tumoren, insbesondere solche der Ovarien, des Endometri- ums und der Brust.

Zur Behandlung vorstehender Tumoren wird versucht, die Ostrogen-Biosynthese zu inhibieren. Hierzu werden vielfach Aromatase-Inhibitor.en eingesetzt. Diese zeigen jedoch bisher keine befriedigenden Ergebnisse, insbesondere mangelt es ihnen an Spezifität.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu¬ stellen, mit dem Aromatase spezifisch inhibiert werden kann.

Erfindungsgemäß wird dies durch Bereitstellung eines Anti-Sinn-Oligonukleotidser- reicht, das durch Bindung an Aromatase-DNA und/oder -mRNA die Expression von Aromatase verhindert. Der Ausdruck "Anti-Sinn" (anti-sense) ist allgemein bekannt und weist auf eine Komplementarität der Oligonukleotid-Sequenz zu einem Bereich der Aromatase-DNA und/oder -mRNA hin.

Ein erfindungsgemäßes Anti-Sinn-OIigonukleotid kann in üblicher Weise hergestellt werden. Als günstig erweist sich ein Verfahren, das folgende Verfahrensschritte umfaßt: a) Konstruktion von Anti-Sinn-Oligonukleotiden über die Gesamtlänge codie¬ render und regulatorischer Bereiche einer Aromatase-DNA und/oder Trans- kripten davon, wobei sich die Anti-Sinn-Oligonukleotide überlappen, b) Inkubation einer Aromatase exprimierenden Zelle mit einem oder mehreren der Anti-Sinn-Oligonukleotide von (a), und

c) Nachweis der Inhibierung der Aromatase-Expression in üblicher Weise, sowie Identifizierung des oder der hierfür verantwortlichen Anti-Sinn-Oligo¬ nukleotide.

Ein erfindungsgemäßes Anti-Sinn-Oligonukleotid kann in verschiedenen Längen vorliegen. Längen von 20 bis 30 Nukleotiden sind bevorzugt. Ferner kann das Anti- Sinn-Oligonukleotid Variationen in jeweils seiner Zucker- und Phosphatkomponente aufweisen. Als Zuckerkomponente ist z.B. Desoxyribose, Ribose oder eine chemi¬ sche Variante davon denkbar. Die Phosphatkomponente kann z.B. ortho-Phosphor- säurediester oder eine chemische Variante davon sein. Ein bevorzugtes Anti-Sinn-

Oligonukleotid enthält Desoxyribose als Zuckerkomponente und ortho-Phosphor- säurediester als Phosphatkomponente.

Im vorstehenden Verfahrensschritt (a) werden Anti-Sinn-Oligonukleotide über die Gesamtlänge codierender und regulatorischer Bereiche einer Aromatase-DNA und/oder Transkripten davon konstruiert. Eine Aromatase-DNA und Transkripte davon sind z.B. aus Mahendroo, M.S., et al., Journal of Biol. Chem. (1993), Seiten 19463-19470 bekannt. Eine solche DNA umfaßt 9 codierende Exons (Exons ll-X). Ferner existieren mehrere Exons I (Exons 1.1-1.4), die nicht-codierend sind, gewebe- spezifisch transkribiert werden und somit regulatorische Funktionen haben. Die verschiedenen Aromatase-Transkripte (mRNA) sind im translatierten Bereich (Exons ll-X) gleich, jedoch im 5'-nicht-translatierten Bereich (Exon I) gewebespezifisch unterschiedlich.

Die Konstruktion von Anti-Sinn-Oligonukleotiden erfolgt in üblicher Weise. Günstig ist es, sie überlappend zu konstruieren. Damit ist die Eingrenzung von Sequenzen, die eine Aromatase-Expression inhibieren, erleichtert. Auch sind solche Sequenzen besonders im Exon II (5'-translatierter Bereich der mRNA) und Exon 1.1-1.4 (5'- nicht-translatierter Bereich der mRNA) einer Aromatase-DNA sowie im 3'-nicht- translatierten Bereich einer Aromatase-mRNA zu suchen.

Ein bevorzugtes Anti-Sinn-Oligonukleotid ist jenes mit einer Teilsequenz von Exon

II einer Aromatase-DNA, besonders bevorzugt mit folgender Sequenz:

3'-TTCTACCAAAACCTTTACGA-5\

Ein weiteres bevorzugtes Anti-Sinn-Oligonukleotid ist jenes mit einer Teilsequenz von Exon 1.1 einer Aromatase-DNA, besonders bevorzugt mit folgender Sequenz:

3'-CCTCCCGACTTGTGCACCTC-5'.

Ein weiteres bevorzugtes Anti-Sinn-Oligonukleotid ist jenes mit einer Teilsequenz von Exon I.2 einer Aromatase-DNA, besonders bevorzugt mit folgender Sequenz:

3'-GTAGTCTCTCGGAGGGGAGG-5'.

Weitere bevorzugte Anti-Sinn-Oligonukleotide sind jene mit jeweils einer Teilse¬ quenz von Exon I.3 bzw. Exon I.4 einer Aromatase-DNA. Auch wird ein Anti-Sinn- Oligonukleotid bevorzugt, das eine Teilsequenz des 3'-nicht-translatierten Bereichs einer Aromatase-mRNA aufweist.

Ein erfindungsgemäßes Anti-Sinn-Oligonukleotid kann in seiner Sequenz eine vollständige Komplementarität zu der zu bindende.* Sequenz einer Aromatase-DNA und/ oder-mRNA besitzen. Andererseits kann das Anti-Sinn-Oligonukleotid auch ein oder mehrere Nucleotide enthalten, die zu den entsprechenden Nukleotiden der zu bindenden Sequenz nicht komplementär sind. Desweiteren kann das Anti-Sinn- Oligonukleotid eine für eine Funktionalität, wie RNase-Aktivität, codierende Se¬ quenz aufweisen (vgl. Ellis, J. und Rogers, J., Nucleic Acids Research, Band 21 , Nr. 22 (1993), Seiten 5171-5178). Ein solches Anti-Sinn-Oligonukleotid zeigt sich besonders vorteilhaft im Abbau der gebundenen Aromatase-mRNA. Es stellt ebenso einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar.

Im vorstehenden Verfahrensschritt (b) wird eine Aromatase-exprimierende Zelle mit einem oder mehreren der erfindungsgemäßen Anti-Sinn-Oligonukleotide inkubiert.

Die erhaltene Inhibierung der Aromatase-Expression wird dann nachgewiesen, und das oder die für die Inhibierung verantwortlichen Anti-Sinn-Oligonukleotide werden identifiziert (vorstehender Verfahrensschritt (c)).

Der Ausdruc " Aromatase-exprimierende Zelle" umfaßt jegliche zur Expression von Aromatase befähigten Zellen und Zellverbände. Dies sind z. B. Zellen humaner Placenta, ferner Zellen von Gonaden und Fettgewebe sowie die entsprechenden Organe bzw. Gewebe selbst. Bevorzugt werden Zellen der Corion-Carcinoma- Zellinie JEG-3. Diese Zellinie ist bei der American Type Culture Collection unter HTB 36 erhältlich.

Der Nachweis einer Aromatase-Expression erfolgt durch übliche. Verfahren. Dies sind z. B. Bestimmungen der Aromatase-Aktivität, wobei z.B. Testosteron oder Androstendion als Substrat verwendet wird und die Bildung von 17ß-Estradiol (E2) bestimmt wird (vgl. Beispiel 2, nachstehend), des Aromatase-Proteins über das Verfahren von Bradford, M.M., Anal. Biochem., 72 (1976), Seiten 248-254 und anschließendem Western-Blot, oder der Aromatase-mRNA in einen Northern Blot, wobei eine für Aromatase-mRNA spezifische DNA-Probe, z.B. cDNA, verwendet wird (vgl. Beispiel 2, nachstehend).

Die Expression von Aromatase wird in vorstehenden Zellen bzw. Zellverbänden durch Induktion bewirkt bzw. bei JEG-3 Zellen verstärkt. Hierzu können übliche Adenylat-Cyclase-Stimulatoren, z.B. humanes Corion-Gonadotropin (hCG), oder Membran-permeierende Analoga von cyclischem AMP (cAMP), wie Dibutyryl cAMP (dbcAMP), verwendet werden. Die einzelnen Konzentrationen werden vom

Fachmann in Standardtests ermittelt oder sind der Literatur zu entnehmen (vgl. Nebert, D.W. und Gonzales F.J., Ann. Rev. Biochem. 56 (1987), Seiten 945-993).

Die Inkubation vorstehender Zellen bzw. Zellverbände mit einem oder mehreren der erfindungsgemäßen Anti-Sinn Oligonukleotide erfolgt in üblicher Weise. Die einzel¬ nen Konzentrationen werden vom Fachmann in Standardtests ermittelt. Ferner kann die Aromatase-Expressions-inhibierende Wirkung des oder der Anti-Sinn-

Oligonukleotide direkt bestimmt werden. Hierzu wird die Differenz aus der Aroma¬ tase-Expression von mit und ohne Anti-Sinn-Oligonukleotiden inkubierten Zellen bzw. Zellverbänden herangezogen. Die Bestimmung der Aromatase-Expression erfolgt, wir vorstehend angegeben.

Erfindungsgemäße Anti-Sinn-Oligonukleotide eignen sich bestens zur Inhibierung der Expression von Aromatase. Sie stellen damit Mittel dar, gezielt die Ostrogen- Biosynthese zu inhibieren. Dies eröffnet neue Möglichkeiten, verschiedene mit der Ostrogen-Biosynthese in Zusammenhang stehende Erkrankungen, insbesondere Tumorerkrankungen, gentherapeutisch behandeln zu können.

Erfindungsgemäße Anti-Sinn-Oligonukleotide können als solche, einzeln oder in Kombination einer Person verabreicht werden. Sie können aber auch mittels eines Expressionsvektors, der für sie codierende Sequenzen enthält, in der Person exprimiert werden.

Kurze Erläuterung der Zeichnung:

Fig. 1 zeigt die Wirkung eines erfindungsgemäßen Anti-Sinn-Oligonukleotids auf die Expression von Aromatase-mRNA, und

Fig. 2 zeigt die Wirkung eines erfindungsgemäßen Anti-Sinn-Oligonukleotids auf die Aromatase-Aktivität (A) bzw. das Aromatase-Protein (B).

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 : Konstruktion eines Anti-Sinn-Oligonukleotids

Eine den 5'- translatierten Bereich (Exon II) umfassende Aromatase-mRNA weist im Bereich der Nucleotide 36-55 folgende Sequenz auf:

36 46 55

I I I

5 ' -GTCAAGGAACACAAGATGGTTTTGGAAATGCTGAACCCGATACA-3 '

Bezüglich dieser Sequenz wurde ein Anti-Sinn-Oligonukleotid folgender Sequenz konstruiert. Es wurde ein allgemein erhältlicher Synthese-Apparat (Applied Biosy¬ stems) verwendet:

3 ' -TTCTACCAAAACCTTTACGA-5

Beispiel 2: Inhibierung der Expression von Aromatase

Halbkonfluente JEG-3 Zellen (vgl. vorstehend) wurden in 2 Ansätzen jeweils 14 Stunden in einem Standardmedium inkubiert. In dem einen Ansatz enthielt das

Medium kein dbcAMP (vgl. vorstehend). Die Zellen werden nachstehend mit "unbehandelte Zellen C" bezeichnet. In dem anderen Ansatz enthielt das Medium 1 mM dbcAMP. Diese Zellen werden nachstehend mit "stimulierte Zellen S" bezeichnet.

Den unbehandelten Zellen (C) und den stimulierten Zellen (S) wurden dann jeweils 100 μg/ml des Anti-Sinn-Oligonukleotids von Beispiel 1 dreimal zugegeben. Die Zugaben erfolgten 14,16 und 18 Stunden nach dem Zeitpunkt, wo den stimulier¬ ten Zellen (S) dbcAMP zugegeben worden war. 24 Stunden nach dem vorstehen- den Zeitpunkt wurden sämtliche Zellen getrennt geerntet und hinsichtlich folgender Aspekte analysiert:

(I) Aromatase-mRNA

(II) Aromatase-Aktivität; Aromatase-Protein

(I) Aromatase-mRNA

Aus den geernteten Zellen wurde jeweils Gesamt-RNA in üblicher Weise isoliert. Diese RNA wurde zweifach analysiert (vgl. Fig. 1 ):

(A) Northern Blot (Fig. 1 (A)):

Die RNA (12 μg) wurde einem üblichen Northern Blot unterzogen. In diesem wurde sie gegen ein Aromatase-cDNA-Fragment hybridisiert, das Exon II teilweise, die Exons III und IV vollständig, sowie Exon V teilweise umfaßte (Fig. 1 (A)a). Ferner wurde die RNA gegen ein Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH)- cDNA-Fragment als Kontrolle hybridisiert (Fig. 1 (A)b). Die Angabe C bedeutet unbehandelte Zellen ohne Anti-Sinn-Oligonukleotid, C _AS unbehandelte Zellen mit Anti-Sinn-Oligonukleotid, S stimulierte Zellen ohne Anti-Sinn-Oligonukleotid und S _AS stimulierte Zellen mit Anti-Sinn-Oligonukleotid.

(B) Densitometrische Quantifizierung (Fig. 1 (B)):

Die Autoradiographie-Signale der Aromatase-mRNA in Fig. 1 (A) wurden in den Fällen, wo keine Anti-Sinn-Oligonukleotid-Behandlung (C, S offene Säulen) vorlag,

auf 100 % gesetzt und mit den Signalen verglichen, die bei Zellen mit einer Anti- Sinn-Oligonukleotid-Behandlung (C _AS , S _AS , gestrichelte Säulen) erhalten wurden.

Aus Fig. 1 (A) geht somit hervor, daß nach Zugabe des Anti-Sinn-Oligonukleotids die Menge von Aromatase-mRNA um ca. 60 % verringert wurde. Ferner wurde ein erhöhter Abbau der Aromatase-mRNA bewirkt.

(II) Aromatase- Aktivität; Aromatase-Protein

(A) Aromatase-Aktivität (Fig. 2 (A)):

Die geernteten Zellen wurden in einem Homogenisierungspuffer, pH 7,4 (10 mM Kaliumphosphat, 150 mM KCL und 10 mM EDTA) aufgenommen. Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen und nach Zentrifugation des Homogenats bei 10.000 g für 20 Minuten und Zentrifugation des erhaltenen

Überstands bei 300.000 g für 20 Minuten wurden Mikrosomen erhalten. Diese wurden in einem Reaktionspuffer, pH 7,4 (50 mM Kaliumphosphat, 2,5 mM Glucose-6-phosphat, 0,25 U/ml Glucose-6-phosphat-dehydrogenase und 10 μM Testosteron als Substrat) resuspendiert. Das Gemisch wurde 5 Minuten bei 37 °C inkubiert und die Reaktion wurde durch Zugabe von NADPH bis auf eine Endkon¬ zentration von 100 μWΛ gestartet. Nach 5 Stunden wurde die Reaktion durch 5- minütiges Erhitzen auf 95 °C gestoppt und die Bildung von 17 ß-Estradiol wurde durch einen kompetitiven E2-Enzym Immunoassay-Kit (Dianova) bestimmt. In Fig. 2 (A) bedeutet die Angabe S stimulierte Zellen ohne Anti-Sinn-Oligonukleotid und S _AS stimulierte Zellen mit Anti-Sinn-Oligonukleotid. Erstere wurden mit 100 % angesetzt.

(B) Aromatase-Protein (Fig. 2 (B)):

Aus den Mikrosomen wurden jeweils 70 μg Protein in eine SDS-Page eingebracht.

Anschließend wurde das Protein auf eine PVDF-Membran übertragen und das Aromatase-Protein wurde durch einen allgemein erhältlichen, monospezifischen po-

lyclonalen Aromatase-Antikörper identifiziert.

Aus Fig. 2 geht somit hervor, daß nach Zugabe des Anti-Sinn-Oligonukleotids die Aromatase-Aktivität um ca. 60 % verringert wurde. Ferner wurde ein Nicht-Identi- fizieren des Aromatase-Proteins in einem Western-Blot bewirkt.