Caaspo da Invenção:

[001] A presente invenção se insere no campo de aplicação da nanoteenològia, mais especificamente na área de preparações medicinais contendo antigenos virais, uma vez que se refere a uma vacina .anti-zika vírus (ZIKV) combinada de vesícula de membrana externa de Neisseria meningitidis (OMV) e nanopartícuias de adjuvante vacinai.

Esta.do da técnica:

[002] São cada vez mais prevalentes as doenças infecciosas emergentes, enfermidades com potencial de causar graves epidemias ou pandemias. A probabilidade de ocorrência natural dessas doenças vem sendo reforçada pelas mudanças sociais e demográficas que são características da sociedade atual, tais como a livre circulação de pessoas em viagens e migrações internacionais e o aumento da importação e exportação de produtos alimentares. Estas doenças podem durar de semanas a meses, alterando o curso cotidiano da sociedade e causando impactos de curto, médio e de longo prazo sobre as populações e economias ao redor do globo.

[003] Portanto, iniciativas que visem mitigar os impactos destas doenças sobre as populações devem ser prioritárias entre as diferentes nações no mundo.

[004} O vírus Zika (ZIKV) foi isolado pela primeira vez em 1947 a partir do sangue de um macaco Rhesus na floresta Zika, Uganda, sendo que apenas um ano depois sua presença também foi confirmada em mosquitos Aecíes africanus na mesma floresta .

[005] Do ponto de vista clínico, a maioria dos sintomas associados à infecção pelo vírus são considerados relativamente leves como febre, dor de cabeça, dores no corpo e erupções cutâneas. Contudo, a grande preocupação que tem cercado os casos de infecção pelo vírus diz respeito ao aumento da incidência de microcefalia entre os recém- nascidos cujas mães foram infectadas por ZIKV durante a gestação.

[006] Outra comorbidade que parece suceder as infecções por ZIKV é a síndrome de Guillain-Barré , neuropatia periférica aguda que se caracteriza clinicamente por dor, dormência, parestesia, ou fraqueza nos membros.

[007] Desse modo, a situação epidemiológica do ZIKV no Brasil, sua relação com complicações neurológicas, como as microcefalias e a síndrome de GuíIlain-Sarré e a presença do vetor Aedes egyptí em todo território brasileiro, torna prioritário o desenvolvimento de metodologias profiláticas como vacinas e medidas imunológicas para o diagnóstico virai.

[008] Dentre as medidas profiláticas se encontra o desenvolvimento de vacinas contra o ZIKV. Taís vacinas podem ter diferentes abordagens, englobando as vacinas de primeira e segunda geração (celulares e acelulares respectivamente) , assim como àquelas baseadas na tecnologia de DNA recombínante como as vacinas de DNA.

[009] A presente invenção propõe uma vacina que utiliza a nanotecnologia como foco principal para combater o vírus do Zika. A mesma compreende vesículas de membrana externa (OMV) de N. menígitídis com nanopartícuias de adjuvante vacinai, tais como sílica mesoporosa e grafeno. Assim, a referida vacina apresenta alta inovação já que se busca uma vacina para tal patógeno que não envolva o uso de técnica de DNA recombínante, que facilitaria a sua implantação em escala industrial e transferências de tecnologia.

[010] Portanto, nenhum documento do estado da técnica descreve uma vacina anti-zíka virus fZIKV) , tal como proposto pela presente invenção.

Breve âascxlção da. Invenção:

[Gil] A presente invenção refere-se a. uma vacina anti-zika virus (ZIKV) combinada entre IxlO ⁴ e IxlO ⁶ unidades formadoras de placa virais (ufp ótímo IxlO ⁵ ) de Zika virus inativada e acelular por 1 a 50μς de vesícula, de membrana externa de Neissería menxngitídis {OMV) e 100 a 250μς de nanopartlcuias de adjuvante vacinai nanoencapsulado .

Breve descrição das figuzas:

[012] Para obter uma total e completa visualização do objeto desta invenção,, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue.

[013] A Figura 1 é uma representação esquemática de

OMV (extraído de N. meningítidis estirpe C2135 em círculos pequenos amarelos e azuis) no processo de fusão de ZIKV (círculos vermelhos) replicados em células C6/36, em que a força de agitação promove a fusão de OMV com partículas de vírus que produzem as partículas de fusão QMV/ZIKV (círculos de laranja e azul) .

[014] A Figura 2 representa graficamente a análise de ELISA de camundongos imunizados com OMV/ZIKVfusíon (grupo II) e fusão OMV / ZIKV + SBal6 (grupo III) .

[015] A Figura 3 representa a expressão de quimiocinas inflamatórias de camundongos vacinados em esplenócitos ,

[016] A Figura 4 representa a soroneutralização virai expressa em ng/ g cie partículas de ZIKV detectadas em uma quantidade total de 1 ug de RNA.

[017] A Figura 5 representa. também a soroneutralização virai expressando o número de cópias de partículas de ZIKV detectadas em uma quantidade total de 1 ug de RNA.

O sezrIção det&lh&da da xnvsnção:

[018] A presente invenção refere-se a uma vacina anti-zika vírus (ZIKV) combinada de vesícula de membrana externa de Neisseria meníngitidis (OMV) e nanopartículas de adjuvante vacinai.

[019] A referida vacina anti-zika vírus (ZIKV) compreende :

- pelo menos IxlO ⁵ unidades formadoras de placa virais (UFP) de Zíka vírus inativada;

- de 1 a 50pg de vesícula de membrana externa de Neisseria meníngitidis (OMV) ; e

- de 100 a 250ug de nanopartículas de adjuvante vacinai nanoencapsulado .

[020] Preferencialmente, a referida QMV é produzida pela linhagem bacteriana cepa vacinai C2135 ou qualquer outra cepa vacinai pertencente a Neisseria meníngitidis, Haemophílus influenzae, Neisseria lactamica, Haemophílus aegyptius ,

[021] Ainda, a associação de IxlO ⁵ UFP com as 1- 50 ug de OMV formam OMV+ZIKV+C6/36 fusionada que se refere à formulação vacinai;

[022] Ainda, a referida nanovesícula obtida

(O V+ZIKV+C6/36) possui tamanho que varia de 209,40 a 251,10 nm _f pref rencialmente 230,25; índice de polidispersêo (IP) que varia de 0, 552 a 0,592, preferencialmente 0 _, , 572; potencial zeta que varia de -0,139 a -0,719, preferencialmente 0,429.

[023] O referido adjuvante vacinai é seiecionado do grupo que consiste em sílic mesoporosa, poloxâmeros, ou ainda qualquer outro tipo de adjuvante vacinai de interesse futuro .

[024] Desse modo, a vacina da presente invenção não utiliza a técnica de DNA recombinante nem na produção do protótipo nem no aumento de escala e produção industrial.

[025] Para a produção da referida vacina, foi realizado um processo, embora não reivindicado, considerado essencial para se atingir as características diferenciadas apresentadas pela vacina,

[026] 0 referido processo compreende as etapas de: a) Selecionar a linhagem celular e a amostra virai do

ZIKV;

b) Produzir os antígenos virais;

c) Produzir vesículas de membrana externa (OMV) de Neisseria menínglti.dis;

d) Conjugar nanopartícuias de ZIKV com as OMV obtidas; e

e) Realizar adjuvância vacinai.

[027] Na etapa ^, a", a referida linhagem celular é selecionada do grupo que consiste em C6/36 (ATCC® CRL-1660™) proveniente da espécie de mosquito Ãedes albopictus, adaptadas a temperatura de 27 °C, sem COs; Vero (African green monkey - ATCC CCL 81) , adaptadas a temperatura de 37 "C, com 5% de COs, mantidas com meio RPMI1640 (E) e 10% de soro fetal bovino (SFB) ; entre outras, tais como a linhagem U251-MG (ECACC 09063001) célula tumoral de glia, e M059J (glioblastoma ATCC CRL2366) .

[028] Preferencialmente, a linhagem celular utilizada é a C6/36. Para tal., a referida linhagem é mantida com meio Leibovitz L-15 especial, com adição de 50 a 200 ug/mL de aminoácidos essenciais, piruvato, penicilina, estreptomicina, anfotericina (Vitrocell©) e 5% de soro fetal bovino (SFB) .

[029] Na etapa "b", é realizado a produção de antígénos virais. Para tal, de 50 a 1000 L, preferencialmente 500 uL da solução de amostras virais do 21KV é incubada em garrafas de 25 cm ² contendo cerca de 1.10 ^s células por mL em monocamada confluente da linhagem celular C6/36 ou Vero, preparadas com 24 horas de antecedência. Primeiramente, previamente à inoculação, todo o conteúdo do meio de cultura com 5% a 10% de SFB da linhagem celular é removido e, posteriormente ocorre a inoculação de 500 μΐ. da solução virai. Assim, a garrafa é mantida em estufa por 45 minutos a. Ih30mi na. temperatura de 28-39°C (ótimo 37 °C) sendo levemente movimentada de 5 a 15 em 15-30 minutos para que a amostra virai entre em contato co toda a monocamada. Após o período de adsorção, são adicionados 5 a lOmL do mesmo meio de manutenção celular, sem soro. Assim, observações diárias são realizadas até que o efeito citopático do vírus se espalhe por cerca de 80% da monocamada celular. O sobrenadante é coletado após centrifugação a 2000-4000 rpm durante 5-15 minutos, para então serem preparadas aliquotas para o estoque virai.

[030] Na etapa ^w c", a produção de OMVs de Neisseria m&níngitídis é realizada por ultrafiltraçao em membranas de retenção conforme descrito por Alves et al 2013 (Alves, Danilo Antonini ; Mattos, Ives B ; Hollanda, Luciana M ; LANCELLOTTI, Marcelo. Use of mesoporous silica SSa-15 and SBa-16 in assocíation of outer membrane vesicles - OMV fro Neisseria meníngitídis . Journal of Vaccines & Vaccination, v. 4, p. 6, 2013} .

[031] A linhagem bacteriana utilizada é preferencialmente a cepa vacinai C2135 ou qualquer outra cepa vacinai pertencente a Neisseria meníngitídis , Eaemophilus influenzae, Neisseria lactamica. , Haemophíius aegyptíus .

[032] Uma etapa sobressalente de retirada de lipooligossacarideo bacteriano (LOS) por uma lavagem com. solução aquosa de desoxicolato de sódio a 0,01% (m/v) é realizada para diminuir a toxicidade desta preparação vacinai .

[033] Posteriormente, na etapa ", as OMVs são liofílizadas ou já adicionadas às culturas celulares de ZIKV, afim de promover a extração das partículas virais no momento do "budding" virai.

[034] Nesse sentido, ainda na etapa "d", os filtros contendo OMVs obtidos na etapa anterior foram colocados em solução salina a 0,9% e armazenados em uma estufa na temperatura de 25-39 °C durante 20 minutos para libertar as membranas das vesículas do filtro. .Assim., as amostras foram armazenadas a -80 °C. preparação da vacina foi realizada seguindo os mesmos passos de adição do vírus era células C6/36, tal co o etapa ^, b". Posteriormente, foram adicionadas em diferentes concentrações de OMV de N. meninçitidis em diferentes momentos (3 horas, 10 horas e 24 horas) , para obter a melhor preparação da vacina.

[035] 0 sobrenadante foi .recolhido contendo a fusão de antígeno ZIKV em OMV. A possível presença de vírus foi inatívada (56 ° C durante 1 hora) e depois foi liofilizada. Os mecanismos de obtenção de antígenos por fusão de OMV com vesículas de ZIKV são demonstrados na Figura 1.

[036] A quantificação das OMVs é realizada por espectrometria de UV pela técnica de varredura , onde massas definidas fornecerão uma curva de quantificação de OMV pelo comprimento de onda definido na análise de varredura. Quantidades ótimas de OMVs deverão ser definidas para a captura das partículas ou proteínas virais do ZIKV para análises e caracterizações posteriores.

[037] Por fim, na etapa ^e", são adicionadas às formulações de OMVs extraídas e adsorvidas por ZIKV obtidas na etapa anterior, de 100 a 200ug/dose de adjuvantes vacinais selecíonados do grupo que consiste em sílica mesoporosa, poloxâmeros, ou ainda qualquer outro tipo de adjuvante vacinai de interesse futuro.

[033] Tais nanovesícuias em contato com os antígenos vacinais são caracterizadas pelas técnicas que se seguem e definidas em quantidades ótimas que permitam aumento da resposta imune sem comprometimento da toxicidade da vacina .

[039] Para avaliar o potencial das nanovesícuias da presente invenção, a seguir são apresentados os resultados dos testes realizados.

-Caracterização das nanoestruturas :

[040] Este procedimento analítico determina o comprimento médio das OMVs e o índice de polidispersão (IP) , que é uma medida adimensional da amplitude da distribuição do tamanho de particular. O procedimento analítico é realizado em um Zeta-sizer Nano series Zs da marca Malvem (USA) . Os resultados são expressos na forma de média ± desvio padrão de pelo menos três lotes diferentes de cada preparação de OMV. O potencial zeta é determinado por laser Doppler Anemometria (LDA) de OMV seguida de diluição em NaCl a uma condutibilidade de aproximadamente 120± 20 S/cm ² .

[041] A técnica de NTA (nanoparticle tracking analysis) permite definir em porcentagem populacional da formulação o tamanho e a carga das formulações vacinais. Muito semelhante à citornetria de fluxo o NTA nos permite caracterizar o tamanho destas nanoestruturas e mudanças no tamanho e na carga residual , caso houver, após diversas etapas do processo de produção vacinai, adsorção virai ou adjuvãncia .

[Q42] Nesse sentido, os resultados da caracterização das nanoestruturas foram resumidos na Tabela 1.

[043] 0 OMV (OMV) isolado teve um valor menor que o vírus diretamente associado a OMV (OMV + ZIKV) e apresentou tamanho menor quando comparado ao OMV associado ao vírus e às células C6/36 (OMV + ZIK + C6/3-6) .

[044.] Quanto menor o IP, melhor o aspecto da amostra, uma vez que isso resulta em garantir que não há agregação das nanopartículas. Esse resultado também mostra, que não existe presença de interferentes na amostra, já que os dados se aproximaram de zero.

[045] Além disso, é possível observar o valor de carga dessas nanopartículas. A carga OMV (OMV) se aproxima de -12,0 mV, enquanto a carga OMV + ZIKV e OMV + ZI V + C6/36 se aproxima de zero: (± 0,371 -0,179 mV) e {- 0,429 ± 0,29 mV) , respectivamente. Este resultado mostra que a estrutura foi rauito mais positiva e, portanto, houve mais estabilidade em conexão entre OMV e ZIKV, além da conexão com o mosquito.

Tabela 1 - Caracterização das amostras de nanoparticulas de OMV, OMV+ZIKV, e OMV+ZIKV+C6/36 por Zeta- sizer.

[046] A caracterização por teste MTA foi realizada para obter a validação da. caracterização das nanovesiculas . Os resultados foram resumidos na Tabela 2. Como o dispositivo Zetasizer, a KTA também representa o tamanho da nanopartícula, mas é um método mais preciso. A velocidade do movimento está diretamente relacionada ao tamanho da partícula, quanto maior a partícula, mais lenta é a mesma. Assim, a velocidade das partículas varia muito conforme o tamanho das partículas .

[047] Após a triagem do tamanho das nanoparticulas isoladas, pode~se ver que a média da população desses (D90) é 268,9 ± 23,5 nm. OMV mostrou um valor menor (192,6 ± 6,1 nm) do que OMV + ZIKV (293,1 ± 11,9 nm) . Além do tamanho, o NTA fornece como parâmetros de dados: partículas por quadro (PPF) e partículas por mL (PPmL) que foram apresentadas na Tabela 2.

Tabela 2 - Caracterização das amostras de nanopartículas de OMV, OMV+ZIKV, e OMV-+ZIKV-+C6/36 por NTA.

~ V&zifícâção da ativida.de antigêníca vacinai:

[048] São utilizados camundongos albinos Mus mu.sc lus - Swiss, fêmeas, não isogênicos e cora padrão sanitário adequado (SPF) com pesos entre 18 a 22 g (5-6 semanas de idade), mantidos em câmaras com temperatura controlada (22 a 25 °C) em ciclos claro-escuro de 12 horas, onde receberão ração e água ad libitum. 0 protocolo de imunizações foi aprovado pela CSUA-UNICAMP. Foram utilizadas fêmeas de Swiss, não isogênicos e com padrão sanitário adequado (SPF) . Os animais foram separados em 4 grupos, sendo eles: controle (somente PBS) ; vacinados com OMV, vacinados com OMV+ nanopartículas, e vacinados cora OMV + nanopartículas ÷ ZI V. As imunizações foram realizadas pela via subcutânea sendo o número de animais por grupo foi definido pelo número mínimo de animais que respondam de maneira estatisticamente significativa à produção de anticorpos vacinais.

[0 9] Camundongos normalmente não sucumbem ou demonstram sinais clínicos visíveis após infecção com o vírus Zika. Entretanto, é possível observar viremia entre os dias 3 a 6 após inoculação virai. Por isso, foi determinado o título virai no soro, fígado, baço e rins no terceiro dia após infecção com ZIKV em camundongos S 1S3 imunizados e controles. Ά infecção virai foi realizada pela injeção de 10 ⁵ PFU de ZIKV em 50 pL pela via subcutânea na pata, três semanas após a última dose vacinai. Todos os animais foram sacrificados no terceiro dia de infecção para coleta dos órgãos após perfusão com 20 mL de PBS. Os órgãos foram mantidos a -80 °C em 1 mL de meio MEM com 10% de soro fetal bovino até titulação virai.

[050] A titulação virai foi determinada por ensaio de formação de placa de lise, em células Vero em placas de 24 poços. Após cinco dias de infecção, as células foram fixadas por 10 minutos com. 10% de formaldeído era PBS e a revelação se deu pela observação da formação de placas de líse após coloração com Cristal de Violeta.

[051] Através deste método foi feita a análise do soro dos camundongos imunizados com OMV e ZIKV com e sem associação das nanopartículas para o reconhecimento de anticorpos produzidos com diluições de títulos de anticorpos frente ao coating de ZIKV com cerca de 1.10 ³ unidades formadoras de placa por poço. Foram ensaiados testes de ELISA índireto na detecção de IgM, IgGl e IgG2 e IgAs.

[052] A Figura 2 representa graficamente a análise de ELISA de camundongos imunizados com O V/ZIKVfusíon (grupo II) e fusão OMV / ZIKV + SBalô (grupo III), em que o anticorpo reconhecido foi comparado com o grupo de controle não imunizado (grupo I) e os valores significativos foram obtidos até os títulos 1: 160 em ambos os grupos (II e III).

[053] O ensaio ELISA mostrou um aumento importante da produção de anticorpos {Figura 2) em comparação com o grupo de ratos naive. Além disso, os títulos de anticorpos determinados para esses testes demonstraram o efeito semelhante quando comparados com as preparações adjuvadas (com sílica mesoporosa) e não vacinas adjuvadas. De fato, tais formulações mostraram efeito semelhante em. estímulos de anticorpos que indicaram o uso de vacina menos expansiva.

[054] Ainda, os animais vacinados tiveram seus soros analisados quando à produção de quimíocinas inflamatórias referentes à resposta TH1 e TH2 utilizando o kit de multiensaios do 3íoPlex200 [Biorad) com o apoio do LACTAD - UNICAMP . Também foram retirados os baços destes animais e as .respostas TH1 e TH2 também foram avaliadas por qP.T-PCR utilizando pzimers específicos para cada uma das quimíocinas analisadas. Quimíocinas avaliadas por ambas as metodologias: ILl, 112, IL4, IL6, IL8, IL10, IL12, 1113, TNFa, IISfFy.

[055] A Figura 3 representa a expressão de quimíocinas inflamatórias de camundongos vacinados em esplenócitos . Nesta análise foram realizados o qRTPCR usando primers específicos para IL2 (marcador THl), IL4 (marcador Ϊ.Η2), IL10, IM FY e ΤΘΕβ (marcador de memória}. O (*} indica a significativa resposta imune e comparação com o grupo controle não vacinado.

[056] Apesar da resposta imunológica celular, a expressão de quimíocinas por esplenócitos foi determinada visando a diferenciação THl e TH2 em camundongos vacinais (Figura 3) . Essa ativação mostrou aumento de THl (IL2 e INFy) e uma forte ativação de TH2 (IL4, IL6, IL10) . Outros marcadores de quimiocinas também foram, observados como ΊΌ ^' Γβ, Ι1.1β e TNFa. Esse estudo é a análise qualitativa da resposta imune celular por ter demonstrado uma ativação da resposta imune TH1 e TH2.

- Ensaio de soroneutralização (FRNT) :

[057] Para caracterizar a presença de anticorpos neutralizantes no soro dos animais imunizados, foi realizado um ensaio de soroneutralização denominado de ensaio de redução da formação de placas de lise (PRK do inglês Plaque Reduction Neutralization Test) . Sm suma, foi coletado o soro dos animais após três semanas da imunização e incubado diluições seriadas (1:20, 1:40 e 1;80) desses soros com. 100 unidades formadoras de placa (PFU) de um estoque virai de ZIKV. Após uma hora de incubação, a mistura entre os soros e as amostras foram inoculadas em. células M059J e incubados por vinte e quatro horas a 37 °C com 5% de CO2. Essa monocamada foi lavada com PBS e o RNA virai extraído com o auxílio do reagente Trizol ® ou equivalente.

[05S] Assim, a análise da seroneutrali zação em células M059J e Vero utilizando soros de camundongos imunizados com duas preparações diferentes (Figuras 4 e 5) demonstrou a eficácia desta nova vacina. Ά infecção por vírus major de 1000 copias de vírus diminui mais de 1,5 log de detecção de número de cópias ZIKV. As Figuras 4 e 5 mostraram esta diminuição em número de cópia de carga virai, em que os valores encontrados por qRTPCR expressos foram considerados muito significativos com. P <0, 005.

~ Produção em escala laboratorial e piloto formulações vacinais com ZIKV atenuado: [059] As formulações vacinais obtidas a partir dos processos anteriormente descritos seguiram as etapas de aumento de escala de laboratorial (utilizando um biorreator de 1 litro de volume útil), para a escala piloto (biorreator de 10 litros de volume útil) . Para isso, foram utilizados os parâmetros de bioprocessos {como manutenção de nutrientes, temperatura, pH, demanda de oxigénio e tipos celulares) . Contudo, alguns parâmetros desse bioprocesso devem ser alterados mediante a mudança de escala como a agitação, a qual deve obedecer algumas constâncias de escalonamento (constâncias de cisalhamento, potência do impelidor e número de Reynolds) sendo usadas para nortear o processo de aumento de escala. Tal processo deve manter a mesma produção de partículas virais a serem atenuadas, ou ainda, a mesma quantidade proteica de antígeno (no caso de utilizar proteínas de origem virai obtidas de Escherichia coli) .

- Testes de controle de qualidade das preparações vacinais :

[060] Os testes de controle de qualidade das preparações vacinais realizados nos protótipos vacinais foram eficazes em fases do processo caracterizadas como pontos críticos de controle de qualidade. Taís testes se baseiam da RDC17/2010 da A ISA visando as boas práticas de produção de ímunobiológicos, dentre eles as vacinas.

[061] Ainda, foi realizado o teste de toxicidade, em. que o teste é conduzido segundo a Farmacopeia Brasileira (2010) . Cinco camundongos sadios são submetidos às doses semelhantes as prováveis doses clinicas das vacinas. Os camundongos são observados por 15 dias quanto aos sinais de errfermidade, peso, comportamento e morte dos animais. Os dados são comparados ao grupo controle de animais que não receberam a vacina .