Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper gegen Epitope desmosomaler Cadherine, die auf der Oberfläche von Zellen außerhalb von Desmosomen exponiert sind, insbesondere auch auf nicht durch Desmosomen verbundenen Carcinom-Zellen, Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper und ihre Ver¬ wendung.

Zellen von Epithelgeweben und Carcinomen sind durch bestimmte Haftstrukturen miteinander verbunden, die als Desmosomen bezeichnet werden. Solche Desmo¬ somen enthalten transmembrane Glykoproteine, die als desmosomale Cadherine bezeichnet werden. Beispiele solcher desmosomaler Cadherine sind Desmoglein 2 (Dsg2) und Desmocollin 2 (Dsc2) .

Der Nachweis von metastasierenden Carcinomen ist schwierig. Oft enthalten Biopsieproben wie Punktate aus Knochenmark oder anderen Metastasen-ver¬ dächtigen Geweben oder Körperflüssigkeiten nur wenige Carcinom-Zellen, die unter einer Überzahl nicht-maligner Zellen übersehen werden. Damit ist eine quantitative und qualitative Beurteilung und Absicherung eines Befundes durch Untersuchung hinreichender Zahlen verdächtiger Zellen und mit verschiedenen Reagentien nicht möglich. Auch sind viele der zu untersuchenden Merkmale intrazellulär, was sie erst nach Aufbruch der Zellen für eine Nachweisreaktion zugänglich macht. Dies erfordert einen erheblichen Zeit- und Kostenaufwand, bzw. den Zeil-Aufbruch, d.h. irreversiblen Verlust der Zellen für weitere biologi¬ sche Untersuchungen.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit

dem metastasierende Carcinome schnell und zuverlässig nachgewiesen werden können.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände der Patentansprüche erreicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit Antikörper gegen Teile von desmosomalen Cadherinen, wobei diese Teile (Epitope) auch an der Zellober¬ fläche von nicht durch Desmosomen verbundenen Zellen exponiert sind.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis der Anmelderin, daß an der Oberfläche von nicht durch Desmosomen verbundenen Zellen, insbesondere einzelnen Epithel- und Carcinom-Zellen sowie Mikrometastasen, Teile von des¬ mosomalen Cadherinen exponiert sind, die bei durch Desmosomen verbundenen Zellen wie sie in normalen Geweben und in Carcinomen vorliegen, nicht oder in nur sehr geringem Ausmaß zugänglich sind. Gegen diese extrazellulär orientier¬ ten Teile, nachstehend als "Cad-ex"-Teile bezeichnet, hat die Anmelderin Anti¬ körper hergestellt.

Die erfindungsgemäßen Antikörper sind gegen extrazelluläre Epitope desmoso¬ maler Cadherine gerichtet, die im Verlauf des invasiven Karzinomwachstums in Form stabiler Molekülfragmente freigesetzt werden. Der Nachweis entsprechen¬ der Fragmente in Körperflüssigkeiten dient als Indiz für invasives und metastasie- rendes Karzinomwachstum. Benachbarte Zellen von normalen Epithelgeweben und davon abgeleiteten malignen Tumoren (Karzinomen) werden durch Haft¬ strukturen miteinander verbunden, die als Desmosomen bezeichnet werden. Die Zell-Zell-Haftung wird durch desmosomale Transmembran-Proteine vom Cadhe- rin-Typ vermittelt. Man unterscheidet Desmogleine (Dsg) und Desmocolline (Dsc), die mit jeweils 3 genotypisch verschiedenen Isoformen in den verschiede¬ nen Epithelgeweben gebildet werden.

Invasiv-destruktives Karzinomwachstum wird von ausgedehnten Proteolysen der extrazellulären Matrix an der Invasionsfront begleitet. Größtenteils durch Plasmin

aktivierte Matrixmetalloproteinasen besorgen den Abbau der extrazellulären Matrix. Karzinomzellen verlassen den Primärtumor, um nach Wanderung über Lymph- und Blutgefäße organferne Metastasen zu bilden. Aktivierte Proteasen spalten definierte, stabile Molekülfragmente der Desmogleine und Desmocolline von der Zelloberfläche ab, so daß diese anschließend in den Körperflüssigkeiten nachweisbar werden. Dieser Prozeß läuft bereits ab, bevor Primärtumor und gegebenenfalls vorhandene Metastasen klinisch-diagnostizierbare Symptome verursachen. Der laborchemische Nachweis solcher Molekülfragmente in Körper¬ flüssigkeiten ermöglicht die Einleitung weiterer diagnostischer Maßnahmen zur Früherkennung eines Tumors.

Von den Anmeldern wurde herausgefunden, daß desmosomale Oberflächen- Antigene unter bestimmten Bedingungen, zum Beispiel auch unter der in vitro- Kultivierung von Epithelzellen, von der Zelloberfläche abgespalten und an den extrazellulären Raum abgegeben werden. Gegen diese Molekülfragmente sind die erfindungsgemäßen Antikörper gerichtet.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein, wobei monoklonale Antikörper bevorzugt sind. Die Antikörper können aus Tieren oder dem Menschen erhalten sein, wobei für polyklonale Antikörper Meer¬ schweinchen und Kaninchen und für monoklonale Antikörper Mäuse bevorzugt sind.

Ferner können die Antikörper synthetisch sein, wobei ihnen ggfs. Teile, die für die Erkennung von Cad-ex-Teilen desmosomaler Cadherine nicht notwendig sind, ganz oder teilweise fehlen, bzw. diese Teile durch andere ersetzt sind, die den Antikörpern weitere günstige Eigenschaften verleihen.

Bevorzugt werden Antikörper gegen die Desmogleine Dsg1 , Dsg2 und Dsg3 sowie Desmocolline Dsc1 , Dsc2 und Dsc3 eingesetzt. Die Epitope der Antikörper liegen in den extrazellulären Moleküldomänen, die bevorzugt den nachfolgend genannten Aminosäuresequenzbereichen entsprechen:

Dsg1 : beginnend mit dem Dekapeptid EWIKFAAACR endend mit dem Dekapeptid AKDLLSDNVH Dsg2: beginnend mit dem Dekapeptid AWITAPVALR endend mit dem Dekapeptid REAQHDSYVG Dsg3: beginnend mit dem Dekapeptid EWVKFAKPCR endend mit dem Dekapeptid TRYGRPHSGR Dsc1 : beginnend mit dem Dekapeptid RWAPIPASLM endend mit dem Dekapeptid DKSTRDVRPN Dsc2: beginnend mit dem Dekapeptid RWAPIPCSML endend mit dem Dekapeptid IGGGGVQLGK Dsc3: beginnend mit dem Dekapeptid RWAPIPCSMQ endend mit dem Dekapeptid PTQCRATSRS

In bevorzugter Ausführungsform sind die Antikörper gegen Cad-ex-Teile von Dsg2 gerichtet. Besonders bevorzugt sind Antikörper, deren Epitope innerhalb des Abschnitts von Dsg2 liegt, der durch die folgende Aminosäuresequenz I bestimmt ist.

AWITAPVALR EGEDLSKKNP IAKIHSDLAE ERGLKITYKY TGKGITEPPF GI FVFNKDTG ELNVTS ILDR EETPFFLLTG YALDARGNNV EKPLELRIKV LDINDNEPVF TQDVFVGSVE ELSAAHTLVM KINATDADEP NTLNSKISYR IVSLEPAYPP VFYLNKDTGE IYTTSVTLDR EEHSSYTLTV EARDGNGEVT DKPVKQAQVQ IRILDVNDNI PWENKVLEG MVEENQVNVE VTRIKVFDAD EIGSDNWLAN FTFASGNEGG YFHIETDAQT NEGIVTLIKE VDYEEMKNLD FSVIVANKAA FHDS IRSKYK PTPI PIKVKV KNVKEGIHFK SSVIS IYVSE SMDRSSKGQI IGNFQAFDED TGLPAHARYV KLEDRDNWIS VDSVTSEI KL AKLPDFESRY VQNGTYTVKI VAI SEDYPRK TITGTVLINV EDINDNCPTL IEPVQTI CHD AEYVNVTAED LDGHPNSGPF SFSVIDKPPG MAEKWKIARQ ESTSVLLQQS EKKLGRSE I Q FLI SDNQGFS CPEKQVLTLT VCEVLHGSGC REAQHDSYVG

Ganz besonders bevorzugt sind Antikörper, deren Epitope innerhalb des durch die folgenden Aminosäuresequenz II von Dsg2 bestimmten Abschnitts liegt:

INDNEPVFTQDVFVGSVEELS AAHTLVMKIN ATDADEPNTL NSKISYRIVS LEPAYPPVFY LNKDTGEIYT TSVTLDREEH SSYTLTVEAR DGNGEVTDKP VKQAQVQIRI LDVNDNIPW ENKVLEGMVE ENQVNVEVTR IKVFDADEIG SDNWLANFTF ASGNEGGYFH IETDAQTNEG IVTLIKEVDY EEMKNLDFSV IVANKAAFHK SIRSKYKPTP IPIKVKVKNV KEGIHFKSSV ISIYVSESMD RSSKGQIIGN FQ

Solche Antikörper wurden bei der DSM als Antikörper

Dsg2-G 1 1 unter DSM ACC 2226,

Dsg2-G91 unter DSM ACC 2227,

Dsg2-G96 unter DSM ACC 2228,

Dsg2-G 1 29 unter DSM ACC 2229 am 9. August 1 995 hinterlegt.

Der Antikörper Dsg2-G6 wurde unter DSM ACC 2236 am 20. September 1 995 hinterlegt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Antikörper gegen Cad- ex-Teile von Dsc2 gerichtet. Besonders bevorzugt sind Antikörper, deren Epitope in dem Aminosäuresequenz-Bereich von Dsc2 liegt, der mit dem Dekapeptid RWAPIPCSML beginnt und dem Dekapeptid DCTHRVDPRI endet.

Erfindungsgemäße Antikörper können nach üblichen Verfahren hergestellt werden. Sollen polyklonale bzw. monoklonale Antikörper hergestellt werden, ist es günstig, Tiere, insbesondere Meerschweinchen und Kaninchen für erstere und Mäuse für letztere Antikörper mit einem desmosomalen Cadherin und/oder Fragmenten davon zu immunisieren. Der Ausdruck "Fragmenten davon" umfaßt auch synthetische Peptide, die Teilsequenzen von desmosomalen Cadherinen aufweisen. Vorteilhaft kann es auch sein, die Tiere mit einem Gemisch aus desmosomalen Cadherinen und/oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weite¬ re "Booster" der Tiere können mit dem oder den gleichen desmosomalen Cadhe¬ rinen und/oder Fragmenten davon erfolgen. Auch können andere desmosomale Cadherine und/oder Fragmente davon oder eine Kombination aus diesen und dem oder den vorhergehenden desmosomalen Cadherinen und/oder Fragmenten

davon für "Booster" verwendet werden. Polyklonale Antikörper können dann aus dem Serum der Tiere erhalten werden. Für monoklonale Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert. Erhaltene Antikörper werden schließlich mit nicht durch Desmosomen verbundenen Zellen, insbesondere einzelnen Epithel- und Carcinom-Zellen sowie Mikrometastasen inkubiert, wo¬ durch diejenigen Antikörper identifiziert werden, die Cad-ex-Teile von desmoso¬ malen Cadherinen erkennen.

Beispielhaft wird die Herstellung von Antikörpern gegen Cad-ex-Teile von Dsg2 beschrieben. Hierzu werden aus Gewebe isoliertes oder rekombinant, z.B. in E.coli, tierischen Zellen oder Hefe, hergestelltes Dsg2 und/oder Fragmente davon zur Immunisierung von Tieren und für weitere "Booster" benutzt, z.B. ein Poly¬ peptid von Dsg2, das zumindest teilweise innerhalb der Domänen El, EM, EMI, EIV und EA von Dsg2 liegt, etwa die vorstehende Aminosäuresequenz I, ganz besonders die vorstehende Aminosäuresequenz II umfaßt. Dabei werden entwe¬ der glykosylierte oder nicht-glykosylierte Formen eingesetzt. Milzzellen werden den Mäusen entnommen und mit Myelomzellen fusioniert. Erhaltene monoklonale Antikörper werden mit einzelnen Epithel- und Carcinomzellen sowie Mikrometa¬ stasen inkubiert. Es werden so z.B. die folgenden, Cad-ex-Teile von Dsg2 erken¬ nenden monoklonalen Antikörper der IgG 1 -Klasse, Dsg2-G6, Dsg2-G 1 1 , Dsg2- G91 , Dsg2-G96 und Dsg2- 129 erhalten.

Zur Herstellung von synthetischen Antikörpern kann z.B. von vorstehenden monoklonalen Antikörpern ausgegangen werden. Hierzu bietet sich an, die Antigen-Bindungsregion der monoklonalen Antikörper zu analysieren und die für die spezifische Erkennung von Cad-ex-Teile eines desmosomalen Cadherins notwendigen und nicht-notwendigen Teile zu identifizieren. Die notwendigen Teile können dann modifiziert und die nicht-notwendigen Teile ganz oder teilwei¬ se eliminiert bzw. durch Teile ersetzt werden, die den Antikörpern weitere günstige Eigenschaften verleihen. Auch können Teile außerhalb der Bindungs¬ region der Antikörper modifiziert, eliminiert oder ersetzt werden. Der Fachmann weiß, daß sich für vorstehende Maßnahmen insbesondere die DNA-Rekom-

binationstechnologie eignet. Diese ist ihm bestens vertraut.

Erfindungsgemäße Antikörper zeichnen sich dadurch aus, daß sie Teile von desmosomalen Cadherinen erkennen, die an der freien Zelloberfläche von nicht oder nur teilweise durch Desmosomen verbundenen Zellen exponiert sind. Solche Zellen sind insbesondere einzelne Epithel- und Carcinomzellen sowie Mikrometastasen. Damit eignet sich die vorliegende Erfindung zum Nachweis dieser Zellen und Zellgruppen. Der Nachweis kann durch übliche Nachweisver¬ fahren, insbesondere einem "Western Blot", einem ELISA, einer Immunpräzipita- tion oder durch Immunfluoreszenzmikroskopie, erfolgen. Hierzu können erfin¬ dungsgemäße Antikörper, wenn es angebracht ist, markiert sein oder in Kom¬ bination mit markierten, gegen sie gerichteten Antikörpern eingesetzt werden. Ferner können erfindungsgemäße Antikörper in einem Biosensor-Verfahren einge¬ setzt werden. Die Reaktion der erfindungsgemäßen Antikörper kann auf leben¬ den oder fixierten Zellen stattfinden.

Erfindungsgemäß werden auch Kits bereitgestellt, die erfindungsgemäße Antikör¬ per zusammen mit Trägermaterialien und üblichen Hilfsstoffen wie Puffer enthal¬ ten.

Desweiteren eignen sich erfindungsgemäße Antikörper dazu, nicht durch Desmo¬ somen verbundene Zellen, insbesondere einzelne Epithel- und Carcinom-Zellen sowie Mikrometastasen, bestehend aus wenigen, teilweise durch Desmosomen gekoppelten Carcinom-Zellen, in üblichen Zeilsortierungsverfahren anzureichern, insbesondere durch FACS-Methoden oder durch übliche Immunadsorption an geeignete Träger wie beschichtete Kügelchen (Beads), wodurch diese weiteren diagnostischen Untersuchungen unterzogen bzw. für therapeutische Tests und Maßnahmen herangezogen werden können. Als Nachweisverfahren eignen sich z.B. Immunblot-Analysen oder ELISA.

Darüber hinaus eignen sich erfindungsgemäße Antikörper als Vermittler, weitere Antikörper und Liganden, z. B. toxische Substanzen, an vorstehende Zellen und

Zellgruppen heranzuführen. Die erfindungsgemäßen Antikörper können auch als Carrier für Toxine und toxisch wirksame Substanzen eingesetzt werden. Deswei¬ teren eignen sie sich zum Entfernen von Tumorzellen aus Zellsuspensionen.

Mit der vorliegenden Erfindung sind somit neue diagnostische und therapeuti¬ sche Maßnahmen bei Carcinomen, insbesondere metastasierenden Carcinomen, möglich.

Die Erfindung wird nun weiter mit Bezug auf die Abbildungen beschrieben:

In der Abbildung 1 sind beispielhaft menschliche Carcinom-Zellen in der Immun¬ fluoreszenzmikroskopie dargestellt, nachdem sie als intakte Zellen fixiert worden sind und mit Antikörpern gegen Cad-ex-Teile von Dsg2 reagiert haben, so in der linken Hälfte eine einzelne Zelle eines Plattenepithel-Carcinoms der Vulva (Linie A-431 der American Type Culture Collection, Katalog-Nr. ATCC CRL 1 555) und in der rechten Hälfte ein Zellpaar der Linie PLC eines primären Leberzell-Carci- noms (American Type Culture Collection, Katalog-Nr. ATCC CRL 8024) . Die in der Fluoreszenz hell aufleuchtenden Punkte sind die Reaktionsstellen der von außen zugänglichen Cad-ex-Teile des Dsg2 Glykoproteins.

In der Abbildung 2 ist eine solche Reaktionsstelle auf einer intakten Zelle in der Immunelektronenmikroskopie dargestellt, wobei hier eine menschliche Epidermis- Zelle der Linie HaCaT als Beispiel benutzt wurde und die an der Oberfläche gebundenen Antikörper gegen Cad-ex-Teile von Dsg2 mit einem spezifisch gegen die Art dieser Antikörper gerichteten zweiten Antikörper nachgewiesen wurden, der an kolloidale Goldpartikel mit einem Durchmesser von durchschnittlich etwa 1 0 Nanometer gekoppelt war. Die Gruppe der sechs kontrastreichen Goldpartikel markiert so eine Dsg2-haltige Oberflächenstruktur, die nicht in einem Desmosom vorkommt.

In Abbildung 3 wird beispielhaft das Ergebnis der Immunblot-Analyse der Zell¬ kulturflüssigkeit von menschlichen HaCaT-Zellkulturen dargestellt. Die Proteine

der Zellkulturflüssigkeit wurden elektrophoretisch größenfraktioniert und auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Die Färbung der Membran mit Ponceau- Reagenz zeigt unspezifisch die quantitativ am stärksten vertretenen Proteine der Probe (Abb. 3, a, Spur 2) sowie Größenmarker-Proteine (Abb. 3, a, Spur 2). Die Membran wurde anschließend mit den monoklonalen Antikörpern Dsg2-G 1 1 (Abb. 3, b) beziehungsweise Dsc3-U1 14 (Abb. 3, c) untersucht. Die spezifi¬ schen Antikörper detektieren sowohl für Dsg2 als auch für Dsg2 als auch für Dsc3 ein spezifisches, etwa 90kDa großes Molekülfragment der extrazellulären Moleküldomäne.

Die Gewinnung solcher der vorliegenden Erfindung zugrunde liegenden Antikör¬ per wird durch das nachstehende Beispiel erläutert.

Beispiel 1 : Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Cad-ex-Teile von Dsg2

Zur Immunisierung wurden Mäuse des Stammes Balb/c verwendet. Als Antigen wurde ein Dsg2-Polypeptid verwendet, das die vorstehende Aminosäuresequenz II enthielt. Einer Maus wurden dann etwa 100μg Polypeptid, emulgiert in voll¬ ständigem Freund's Adjuvans, verabreicht. Es folgten drei "Booster"-Injektionen mit jeweils 1 00 μg Polypeptid, wobei das Polypeptid in nicht-vollständigem Freund's Adjuvans emulgiert war. Vier Tage vor Entnahme der Milzzellen wurden der Maus 1 00μg Polypeptid intraperitoneal verabreicht. Die dann entnommenen Milzzellen wurden mit Maus-Myelomzellen des bekannten Stammes X63-Ag8 653 fusioniert. Es wurden monoklonale Antikörper erhalten. Diese wurden mit einzelnen Epithel- und Carcinom-Zellen inkubiert, wodurch jene Antikörper identifiziert wurden, die Cad-ex-Teile von Dsg2 erkennen. Von diesen Antikör¬ pern wurden die mit Dsg2-G 1 1 , Dsg2-G91 , Dsg2-G96 und Dsg2-G 1 29 bezeich¬ neten Antikörper bei der DSM unter DSM ACC 2226, DSM ACC 2227, DSM ACC 2228 bzw. DSM ACC 2229 am 9. August 1 995 hinterlegt. Der Antikörper

Dsg2-G6 wurde bei der DSM unter ACC 2236 am 20. September 1995 hinter¬ legt.