Antikörper, Verfahren zu ihrer Herstellung, Oligosaccharid-Haptene und Klone zur Erzeugung der Antikörper sowie Verwendung der Antikörper zur Diagnose und Therapie von Tumoren

Er ^β atzbfatt

Die Erfindung betrifft neue Antikörper, die gegen den Oligosaccharidteil von Glycoproteinen gerichtet sind, Verfahren zu Ihrer Herstellung sowie Oligosaccharid- Haptene und Klone zur Erzeugung .dieser Antikörper. Die neuartigen Antikörper sind zur Diagnose und -Therapie von Tumoren geeignet, da sie die organspezifischen Struktur¬ eigenheiten von tumorrelevanten Glycoproteinen erkennen und signalisieren können und in die Glycoproteinchemie der Zellmembranoberflächen von malignen Tumorgeweben bindend eingreifen.

Bisher wurden Antikörper durch Immunisierung gegen ganze Zellen, gegen Membranfragmente oder gegen isolierte Membranglycoproteine bzw. -lipide erzeugt, wobei im letzten Fall das Gesamtmolekül des Proteins als antigene Determinante diente. Demgegenüber wurde noch nicht ver¬ sucht, Antikörper getrennt gegen (den Protein- und) den abgetrennten Kohlenhydratanteil von Glycoproteinen zu erzeugen und in Seren zu testen. Da in den Glycoproteinen der Proteinanteil gegenüber dem Kohlenhydratanteil als antigene Determinante überwiegt, sind bisher die gewonne¬ nen Antikörper weitgehend gegen die Proteinstruktur gerichtet. Dadurch wird verhindert, daß sich gegen zell¬ typische Oligosaccharidstrukturen von Glycoproteinen überhaupt in nennenswertem Maße Antikörper bilden können. Infoldedessen war es bisher auch nicht möglich, struk¬ turelle Feinheiten und Abweichungen im Glykananteil zu verfolgen und nachzuweisen.

In der Tumordiagnostik werden seit längerer Zeit bestimm¬ te Serurnglycoproteine, in erster Linie Foetoprotein und

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carcinoembryonales Antigen, gemessen, vgl. G. ühlenbruck und F. Dati (1986). Zur Labordiagnostik von Tumorerkran¬ kungen: Diagnose & Labor 3_6.» 41-55. Sie werden beim Vorliegen eines relativ weit fortgeschrittenen Tumors vermehrt im Serum nachweisbar, sie sind jedoch relativ unspezifisch. Größere Spezifität wird mit der Messung von menschlichem Choriongonadotropin (hCG) erzielt, das bei bestimmten, relativ selten vorkommenden Tumoren der Gonaden und des Uterus positiv ist, vgl. Henry S. Kaplan, L. Olsson und A. Ranbitschek ( 1982 )"Monoclonal Human Antibodies: a recent development with wide-ranging clini- cal potential, Monoclonal Antibodies in Clinical Medicins (ed. by A.7. Mc Michael und J.W. Fabre) Academic Press, London, New York p. 16-35.

Es wurde auch bereits die Brauchbarkeit der Messung der Aktivität von Fucosyltransferasen für die Tumordiagnostik im Serum geprüft, vgl. C.H. Bauer, W.G. Reutter, K.P. Erhart, E. Köttgen und W. Gerok ( 1978 )*Decrease of Human Serum Fucosyltransferase as an Indicator of Successful Tumor Therapy, Science 201, 1232-1233. In ihrer Aussage¬ fähigkeit lassen sie sich mit den bisherigen Tumormarkern durchaus vergleichen. Zudem erbrachten sie beim Schild- drüsencarcinom positive Werte, was mit den oben genannten Markern bisher nicht gelungen ist. Trotzdem wurde auch mit diesen Enzymen keine wesentliche Verbesserung der Tumordiagnostik erzielt. Das Problem einer organspezifi¬ schen Diagnostik bedarf vermutlich einer grundsätzlich anderen Lösung. In jüngster Zeit hat sich die Anwendung monoclonaler Antikörper bei der Ly phomdiagnostik und - typisierung als sehr nützlich erwiesen, vgl. E . ' Stein und D.Y. Mason ( 1985 )" Immunological analysis of tissue sections in diagnosis of lymphoma. Recent Advantages in Haematology, Hrsg. A.V. Hoffbrand et al. _; Livingstone.

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Der Erfindung liegt u.a. die Aufgabe zu Grunde, neue spezifische Antikörper bereitzustellen, mit deren Hilfe Glycoproteine und Glycoproteinmuster spezifischer als bisher nachgewiesen werden können, um Zellen und Zellver¬ änderungen, insbesondere bei Tumoren und Metastasen, organspezifisch diagnostizieren und behandeln zu können.

Glycoproteine sind essentielle Bausteine von Plasmamem¬ branen, weil sie

a) zu 60 % die Plasmamembran bilden (z.B. in der Leber), b) den Kontakt der Zelle zum äußeren Milieu und zu den Nachbarzellen vermitteln, c) Informationen von außerhalb der Zelle zu erkennen und in das Zellinnere zu transferieren vermögen.

Das Glycoproteinmuster der Plasmamembran ist bei maligner Transformation verändert, vgl. P. Vischer und W. Reutter (1978) Specific Alterations of Fucoprotein Biosynthesis m the Plasma Membrane of Morris Hepatoma 7777. Eur. J. Biochem. 84_, 363-368, T. Galleotti, A. Cittadini, G. Neri, S. Papa und L.A. Smets (^βS^CeH Membranes and Cancer, Elsevier, Amsterdam- . Vermutlich ist auch die Struktur einzelner Glycoproteine nach maligner Transfor¬ mation modifiziert, vgl. T. Galleotti, A. Cittadini, G. Neri, S. Papa und L.A. Smets (1985) ^* Cell Membranes and Cancer, Elsevier, Amsterdam: ) . Diese Veränderungen sind von einer gestörten Infor ationsVermittlung, einem unre¬ gulierten Wachstum und schließlich dem Ablösen einiger Zellen aus dem Gewebeverband (Metastasierung) begleitet.

Als Veränderungen der Glycoprotein-Zusammensetzung konn¬ ten festgestellt werden:

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a) das Verschwinden leberspezifischer Glycoproteine, b) das Auftreten neuer Glycoproteine, c) die Veränderung proteingleicher Glycoproteine in ihrem Kohlenhydratanteil.

Eine Veränderung des Glycoproteinmusters, wie es von einer normalen Zelle her bekannt ist, läßt somit auf eine maligne Entartung schließen.

Die Diagnostik von Tumoren im allgemeinen und von Hepato- carcinomen im besonderen ist derzeit noch unbefriedigend. Der Gegenstand der Erfindung ist der Nachweis definier¬ ter, tumorspezifischer Membranproteine bzw. Membranpro¬ teinmuster im Serum von Tumorpatienten, insbesondere solchen mit Hepatomen.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß der in der Zell- membranglycoproteinen enthaltene Kohlenhydrat-Anteil, wenn er von dem Proteinverband abgelöst wird, eine außer¬ ordentliche spezifische antigene Determinante für die Erzeugung von Antikörpern darstellt. Die Antikörper der Erfindung sind deshalb spezifisch gegen N-Glycanstruk- turen von Zellmembranoberflächen gerichtet. Sie zeigen im ELISA-Test eine positive Reaktion gegen antigene Oligo- saccharide mit Strukturelernenten aus Chitobiose-Mannose- trisacchariden. Nach ihrer chemischen Struktur sind die erfindungsgemäßen Antikörper Immunglobuline der Klassen G und H mit einem Molekulargewicht im Bereich von 100.000 bis 900.000. Ihr Wirkungsoptimum liegt im Temperaturbe¬ reich von 20 bis 40 °C.

Die Antikörper der Erfindung werden hergestellt, indem man die Oligosaccharid-Fraktion aus Glycoproteinen der

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Zellmembranoberflachen abspaltet und nach Koppeln der Haptene immunologisch als Antigene zur Erzeugung der Antikörper verwendet. Die Abspaltung des Oligosaccharid- A eils geschieht entweder chemisch, z.B. durch Hydra- zinolyse, oder enzymatisch unter Verwendung geeigneter Enzyme wie Amidase F (E.C. 3.2.2.18), Endoglycosidase F (E.C. 3.2.1.96) und H (E.C. 3.2.1.96). (Gleiche Nummern, da sie an den gleichen Stellen spalten. )

Die Oligosaccharid-Fraktion wird zunächst gereinigt und gegebenenfalls in die verschiedenen Oligosaccharidkörper aufgetrennt. Die isolierten Oligosaccharide werden dann als Haptene an einen geeigneten Träger, z.B. an Albumin oder Eidestin, chemisch gekoppelt und als Antigene zur Erzeugung der Antikörper verwendet.

Die Antikörpere zeugung kann polyklonal oder monoklonal erfolgen.

Als geeignete Träger zur Kopplung der Haptene eignen sich insbesondere Albumin und Eidestin.

Die polyklonale Erzeugung der Antikörper erfolgt vorzugs¬ weise durch Injizieren einer micellaren Antigensuspension in die Rückenhaut eines Versuchstieres und Gewinnen der Antikörper aus der Serumfraktion des Blutes. Als Ver¬ suchstiere dienen insbesondere Kaninchen oder Hühner.

Die monoklonale Erzeugung der Antikörper wird vorzugs¬ weise so ausgeführt, daß die zu einem Antigen gekoppelten Haptene einem Versuchstier injiziert werden, wobei insbe¬ sondere verschiedene Mäusestämme wie Balb/c, NSI, NSO oder Rattenstämme wie , _f YB2/0 in Betracht kommen. Dann werden die Milzzellen des immunisierten Tieres gewonnen

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und mit Myeloma- oder Plasmocytomzellen von Balb/c- Mäusen, z.B. X.63/Ag8653, fusioniert und die Antikörper aus dem Medium der reklonierten positiven Klone gewonnen.

Diese Klone sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Die Strukturvielfalt und der Verästelungsgrad der Oligo¬ saccharide in den Glycoproteinen ist wesentlich größer als die der linearen Proteine. Es war deshalb überra¬ schend, daß die Antikörper in hochdifferenzierter Form und sogar monospezifisch erhalten werden können, wodurch eine Gruppe von immunologischen Struktursensoren geschaf¬ fen wurde, die nicht nur die Struktur der normalen Glycoproteine differenziert erkennen können, sondern auch die in ihrem Kohlenhydratanteil abgewandelten Glycopro¬ teine, so wie sie von Tumorzellen gebildet werden, zu diagnostizieren vermögen.

Im Zuge der Erfindung wurden auch die Oligosaccharide der Glycoproteine von normalen und malignen Zellmembranen analysiert und aufgeklärt. Allen N-Glycan-Oligosacchari- den liegt ein Chitobiose-Mannosetrisaccharid zu Grunde, das in unterschiedlichen Mengen und Positionen durch L- Fucose, D-Mannose, N-Acetyl-D-glucosamin, Lactosylamin und N-Acetylneuraminsäure substituiert ist. Die Anzahl der Monosaccharideinheiten liegt bei 6 bis 24. Sehr charakeristisch ist der hohe Fucose- und Mannoseanteil, der im Falle von reifen Tumorzellen festzustellen ist.

Die Wechselbeziehung von Strukturantigenität und Anti¬ körperaktivität ist auf dem Gebiet der Oligosaccharide mit Strukturen der Formel I wesentlich differenzierbarer und deshalb sensibler als bei Proteinen. Hierdurch wird ein Weg zur organspezifischen Tumordiagnose eröffnet.

Ersatzblatt

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?.§§£ den e findungsgemäßen Antikörpern ist die Möglichkeit - i ben, die peripheren Bereiche einer Zelle, die mit dem .asgebenden Milieu und den Nachbarzellen kommunizieren, zu .ässre-iche ; sie brauchen nicht zum Proteinanteil vorzu- .•Sngen, der- viel tiefer in der Zelloberfläche (Lipiddop- ose&schicht) verankert ist.

^- ^~~~ - treue diagnostische Vorgehen bietet die folgenden "Anteiles

— ^ werden Antikörper erzeugt gegen Oberflächenstruktu- -ssfcv- die besser zugänglich sind als die in der Membran abgelager e Proteinträger;

—sg£ _e Zeil- bzw. Organspezifität wird vornehmlich durch .jiiar QXigαsaccharidstruktur und -Zusammensetzung der ^' jüEImembranen geprägt.

Antikörper werden identifiziert durch einen ELISA- " ^' "S-feb- ^' Cβnzyme linked immunosorbent assay) . Hierzu wird das sSS geπ (Zeil- bzw. Membranextrakte) auf eine Plastik- -.-äsrfläc e gebracht (z.B. in die Vertiefungen von 96- --•asEl— ikrαtiter-Platten) , antrocknen lassen (30 min.), rüsach mit Maus-IgG' s (= die zu prüfenden Antikörper) .üεubiert; dreimal mit Puffer gewaschen (PBS = Phosphat rsg αfferte Kochsalzlösung); dann wird mit Anti-Maus-IgG's r---m.-Schaf, die mit einem Enzym, z.B. Peroxidase, gekop- gl sind, inkubiert (2 h bei Raumtemperatur), mit PBS Nach Zugabe des Substrates Orthophenylendiamin

'^ ^' O .ul) und Stoppen der Reaktion durch 5 ,ul .1 M NaF MÜL -Reaktion wird etwa 2 h verfolgt) , erfolgt die A^e ung der Farbenentwicklung durch ein Spektrophono- -asέfer, die der Antikörpermenge proportional ist.

Die Membranen von Tumorzellen haben einen anderen Glyco- proteinbestand als die entsprechenden Normalzellen. Glycoproteine der Plasmamembranen werden an das Serum abgegeben

a) durch Sekretion solcher Glycoproteine, die vorüber¬ gehend Bestandteil von Plasmamembranen sind, b) durch Abschilferung ( "shedding" ) , und c) durch Zellalterung und Untergang.

Da es unwahrscheinlich ist, daß alle Hepatocarcinome ein gemeinsames spezifisches Glycoprotein exprimieren, das als Tumormarker benutzt werden könnte, wurde erfindungs¬ gemäß mit Hilfe einzelner monoclonaler Antikörper ein Gylcoprotein uster charakterisiert, das einer normalen Lebermembran entspricht. Dieses Muster wurde so gewählt, daß es durch eine maligne Transformation verändert wird. Im einzelnen wurden isolierte Membranglycoproteine aus Leber (acht) und aus Hepatom (acht) untersucht. Der Nachweis eines veränderten Glycoproteinmusters im Patientenserum signalisierte eine maligne Transformation bzw. die Entstehung eines Hepatocarcinoms.

Bei der Herstellung von Antikörpern gegen Membranglyco¬ proteine wurden bisher noch nie Antikörper getrennt gegen den Protein- bzw. Kohlenhydra an eil erzeugt und in Seren von Tumorpatienten getestet. Erfindungsgemäß wurden erstmals Antikörper sowohl gegen den Oligosaccharid- wie auch den Proteinanteil erzeugt und in Tumorseren geprüft. Mit der Einbeziehung des Kohlenhydratanteils von Membran- glycoproteinen als antigene Determinante erfährt die Tumordiagnostik eine bedeutsame molekulare Erweiterung.

Ersatzbiatr

Im einzelnen ist die Isolierung von je 8 Membranglyco- prote£nen aus Leber und Morris Hepatomen gelungen. Gegen diese sGlycoproteine wurden mono-spezifische Antikörper e zeug . Mit Hilfe der Immunpräzipitation wurde gezeigt, daß tEändestens 2 der Glycoproteine (DPPIV, gp80) sowohl in LeFoer als auch, in Hepatomen vorkommen. Das gp80 wird von normalen Leberzellen an das Serum abgegeben, wobei sicfe seine GlycanStruktur im Serum von der des membran- ständ Lgen Proteins unterscheidet. Noch ist nicht gesi¬ chert „ ob und in welchen Konzentrationen das Hepatom gp80 ins S αrum abgibt.

Auch aas Vorkommen anderer Membranglycoproteine im Serum bzw. in Kulturüberständen primärer Hepatocyten konnte nachgewiesen werden. Weiterhin konnten mono-spezifische Antikörper hergestellt werden, die nur ein Glycoprotein der fepatommembran (M 175 k) erkennen. Dieses Glycopro¬ tein iLst besonders stark fucosyliert. Die Antikörper sind gegen: diese ungewöhnliche Zuckerstruktur gerichtet.

Es -srεπrde außerdem eine Reihe monoclonaler Antikörper zur VerfiEsrung gestellt, die gegen Glycoproteine der Plasma- memb3ra:n normaler Hepatocyten gerichtet sind.

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Monocl. Ak. Antigen Bemerkungen

9.1 110, 135 kD

9.2 110 kD Kommt nicht auf Hepa¬ tomen vor.. Ist an der gallekanalikulären Membran der Hepatocyten und zu¬ sätzlich im Dünndarm und Speicheldrüse lokalisiert,

11.1 170 kD Kommt nicht im Hepatom vor. 11,3 130 kD Kommt in hohen

Konzentrationen in Leber- und Hepatomzellen vor.

15.2 70 kD Gegen alkalische Phosphatase gerichtet, kommt auch im Hepatom vor.

Weitere Antikörper wurden bereits hergestellt; soweit die Antigene charakterisiert sind, fallen die enthaltenen Oligosaccharide alle unter die allgemeine Formel II.

Es wurde gefunden, daß in Hepatomen und Nierentumoren charakteristische Unterschiede der Oligosacchar-idstruktu- ren von Membranglycoproteinen gegenüber Normalgewebe bestehen.

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Auch gegen solche tumorspezifischen Oligosaccharide wurden poly- und monoklonale Antikörper hergestellt. Dazu werden Membranen von Tumoren isoliert, der Oligo- saccharidanteil abgetrennt (enzymatisch und notfalls chemisch) und Antikörper gegen ihn induziert. Wegen einer wahrscheinlichen Kreuzreaktivität zwischen Mensch und Ratte und der leichteren Zugänglichkeit wurden zunächst Oligosaccharide aus Plasmamembranen von chemisch indu¬ zierten Hepatomen bei der Ratte untersucht und auf ihre Brauchbarkeit als Tumormarker geprüft. Es ist anzunehmen, daß sich die Untersuchungen auf menschliches Material übertragen lassen.

Außer gegen Hepatomoligosaccharide sind auch entsprechen¬ de Untersuchungen mit Oligosacchariden aus anderen Tumo¬ ren, insbesondere Dickdarmtumoren, durchgeführt worden.

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Herstellung von Antikörpern

Isolierung von subzellulären Membranstrukturen aus Tumσr- und Metastasengewebe durch Homogenisation des Gewebes in einem Puffer A, bestehend aus 10 mM NaHCO^ und 0, 5 mM CaCl-, pH 7.0, und anschließenden Zentrifugationen. 1. Zentrifugation : 20 min bei 1.500 x g, Aufnahme des Sedimentes in Puffer A und anschließende Homogenisation im Ultraturrax oder mit dem Dounce-Homogenisator. 2. Zentrifugation wie oben. Das Sediment wird insgesamt 4 mal auf diese Weise gewaschen. Danach werden aus dem

Sediment die Oligosaccharidstrukturen gewonnen. Dies geschieht entweder chemisch durch Hydrazinolyse oder enzymatisch durch Amidase F. Bei der chemischen Spaltung durch Hydrazinolyse der getrockneten ( lyophilisierten) Sedimente (100°C für 10 h), indem zu 100 mg bis 1 g Membranfraktion 0,5 bis 5 ml frisch destilliertes, wasserfreies Hydrazin zugegeben und für 8-12 h bei 100 °C belassen werden (nach S. Takasaki, T. Mizouchi und A. Kobata in Methods in Enzymology (1982) Vol. 83, 263-277). Anschließend wird das Reaktionsgemisch erhitzt (1 h) und zum Trocknen im Vakuum eingeengt (über konz . H_SO. bei Raumtemperatur). Der Rückstand wird von Hydrazin durch wiederholte Evaporation mit Tuluol behandelt und dann in gesättigtem NaHCO^ gelöst. Bei der enzymatischen Abspaltung der Oligosaccharidseitenketten mit Hilfe von Amidase F (E.C. 3.2.2.18) werden zu 10 bis 100 mg lyophilisierter Membranfraktion eine l%ige Natriumdodecylsulfat (= SDS ) in Wasser und Mercaptopro- panol oder Mercaptoethanol (Endkonzentration 100 mM) zugesetzt und mit Ultraschall behandelt, für 1 min bei 100°C belassen, danach in 0,5 M Phosphatpuffer, pH 8.6 „ dem 1% Mega-10 (= Octanoyl-N-methyl-glucamid) aufgenommen und wieder mit Ultraschall behandelt. Durch Zusatz von Amidase F (12 mU/1 mg Protein, spaltet 1 nmol Oligo-

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saccharid pro min ab) erfolgt die Abspaltung der Oligo¬ saccharide (bei 41 ^β C, 24 h). Die Auftrennung der Oligo¬ saccharide wird an einer Säule, gefüllt mit BioGel P4, kleiner -400 mesh (1,6 cm x 300 cm), durch Gelpermeations- chromatographie vorgenommen und durch Anionenaustausch- hochdruckflüssigkeitschromatographie an einer Säule, gefüllt mit Partisil AX-10, 2 x 4,6 x 250 mm, mit einem absteigenden Gradienten von H_0/ .0,15 M KH-PO^, pH 4. Die GelpermeationsChromatographie erlaubt die Trennung nach der Anzahl n der Monosaccharide in einer Oligosaccharid- ^" fraktion (n = 1-22), die Anionen-HPLC erlaubt die Tren¬ nung einzelner Oligosaccharidfraktionen nach Ladungs¬ unterschieden, die durch N-Acylneuraminsäuren (= Sialin- säuren) oder Sulfat bedingt sind. Um aus diesen Hapten Antigene herzustellen, werden noch die Oligosaccharide an Rinderserumalbumin oder Edestin (Methode von Kunz und Waldmann, Angewandte Chemie (1985) 24_, 883-885) wie folgt gekoppelt: Das Oligosaccharid wird peracetyliert mittels Essigsäureanhydrid/Pyridin, in einer frischen kaltge¬ sättigten Lösung von Chlorwasserstoff in Acetylchlorid suspendiert und 48 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels wird der Rückstand aus Aceton/Ether umkristallisiert. Das so gewonnene Oligo¬ saccharidchlorid wird in wasserfreiem Formamid unter Zugabe von Natriumazid (pro 1 Mol Oligosaccharid 20 Mole Azid) gelöst und 2 h bei 80°C gerührt. Das Reaktions¬ gemisch wird auf 100 ml H_0 gegossen und die wäßrige Phase dreimal mit CHC1- extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über MgSO. getrocknet, ein¬ geengt und der Rückstand aus Essigester/Ether umkris¬ tallisiert. Aus diesem Oligosaccharidazid wird das Oligo- saccharidamin gewonnen durch Lösen dieses Azids in Etha- nol und Zugabe von Platinoxidhydrat (pro mol Azid 100 mg Planinoxidhydrat) .Nach 2 h bei Raumtemperatur wird der

Ansatz abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Zur Her¬ stellung der vollständig geschützten Oligosaccharid-

Asparagin-Albumin-Verbindung (peracetyliertes Oligo-

2 saccharid-N - (tert.-butyloxycarbonyl)-L-asparaginally- lester) wird das Oligosaccharidamin mit Boc-Asp-OAII (mol/mol) in Methylenchlorid gelöst und Ethyl-2-ethoxy-l, 2-dihydrochinolin-l-carboxylat (EEQD) im 1,5-fachen mola¬ ren Überschuß zugegeben. Nach 3 Tagen Rühren bei Raumtem¬ peratur kristallisiert der Allylester aus. Die Verunrei¬ nigungen werden chromatographisch mit Essigester/Petrol- ether (1 : 1) abgetrennt und das Produkt mit Essigester eluiert. Die Spaltung des Allylesters erfolgt in wasser- und sauerstofffreiem Tetrahydrofuran und Dimethylsulfoxid durch Zugabe von Tetrakis(triphenylphosphin) palladiu (o) unter Argon und Lichtabschluß. Danach wird Morpholin im 10-fachen molaren Überschuß zugetropft. Nach 4 h wird das Lösungsmittel im Hochvakuum abdestilliert und das Produkt chromatographisch gereinigt.

Gegen diejenigen Oligosaccharidfraktionen, die quantita¬ tiv in Tumoren nachweisbar sind, werden mono- und poly- klonale Antikörper hergestellt. Die Herstellung der monoklonalen Antikörper erfolgt nach der Methode von Köhler und Milstein (Nature (1975) Vol. 256, 495-497): Balb/c-Mäusen werden in Abständen von 10 Tagen 10-20 ug Antigen 3 bis 4 mal injiziert. Vier Tage nach der letzten (Booster)-Injektion werden den Mäusen die Milzen entnom¬ men, die Milzzellen gewonnen und mit Myeloma-Zellen (NS- 1) unter Zusatz von Polyethylenglykol (Endkonz. 38 %) fusioniert. Die positiven Zeilklone werden rekloniert und die monoklonalen Antikörper aus dem Medium gewohnen. Die Reinigung der Antikörper erfolgt an einer Affi-Gel Blue-, gefolgt von einer HPLC-Säulenchromatographie (TSK- 3000 SW-Säule) nach Josic; Schutt, van Renswoude und Reutter

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(J. Chromatogr. (1986) Vol. 353, 13-18) oder neuerdings an einer Protein A-Eupergit-Säule (Eupergit C30N der Fa. Röhm Pharma, Eupergit ist ein aktiviertes Polyacrylamid) .

Die polyklonalen Antikörper werden durch Vermischen des gereinigten Antigens mit Öl zu einer micellaren Suspen¬ sion und intracutane Injektion (10-20 Quaddeln) in die Rückenhaut eines Kaninchens erzeugt. Die erste Injektion enthielt Freund' schges Adjuvans, die folgenden 2-4 Injek¬ tionen enthielten kein Adjuvans. Die Injektionen erfolgen in Abständen von 3 bis 4 Wochen. Das Blut (aus Ohrvene oder -arterie oder aus dem Herzen) wird zentrifugiert und aus der Serumfraktion in der oben beschriebenen Weise die Antikörper gewonnen.

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