【발명의 명칭】

CD154에 특이적으로 결합하는 항체 【기술분야】

본 발명은 CD154 단백질에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것으로서， 보다 상세하게는 CD154 단백질에 특이적으로 결합하고 Fc 영역 내에 아미노산 변이를 가 지는 변이 항체에 관한 것이다. 【배경기술】

자가면역반응이란 우리 몸의 세포들을 외부 물질로 인식하여 각종 면역반웅 을 통해 세포조직을 파괴하는 현상이다. 대표적인 자가면역질환으로는 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 낭창 (루푸스) , 건선， 염증성 장 질환， 다발성 경화증 등이 있 으며， 이러한 자가면역질환들은 그 원인이 명확하지 않아 치료가 어렵다. 또한， 자 가면역반웅은 이식된 장기가 면역 반응을 유발하여 발생할 수도 있다. 따라서， 이 러한 자가면역질환이나 자가면역반응을 억제하기 위하여 다양한 면역억제제들의 개 발이 요구된다.

일반적으로 사용되고 있는 면역억제제로는 칼시뉴린 억제제인 타크로리무스 (tacrol imus ) , 유전자 합성 억제제인 마이코페노레이트 모페틸 (mycopheno late mofet i l ) , 항염증 스테로이드인 프레드니손 (predni sone) 등이 있다. 그러나， 이러 한 면역억제제는 장기간 투여되기 때문에 심각한 부작용을 유발할 수 있다 (Wor ld L Trans lant 2012, 294, 51-58； Trans lantation .2012, 709-719； Toxins 2014, 869— 891).

이에， 종래 면역억제제를 대체하거나 약물의 지속 기간을 늘리기 위해 다양 한 생물 의약품들이 개발되고 있는데， 이 중 하나가 공동자극 (costimulation) 억제 제이다. 대표적인 공동자극 면역반응으로는 CD28— CD80/CD86, CTLA4-CD80/CD86 , CD40-CD40L(CD154) 및 PD—1/PD-L1 등이 있으며， 이의 억제를 위하여 CTLA-Fc, PD- 1， 항 -CD40 및 항 -CD154 항체 등이 생물 의약품으로 연구되고 있다 (Transplantation 2013, 95(4), 527-535； Am J Transplant 2012, 12(10), 2575- 2587； World J Transplant 2013, 3(4), 68-77) . 한편， CD40은 B 세포, 대식세포， 수상세포， 흉선 상피세포와 같은 항원제시 세포뿐만 아니라 상피세포 및 섬유아세포 등의 일반세포에서도 발현된다. CD40L이 라고도 알려진， CD154는 활성화된 T 세포와 자연 살해 (natural killer) 세포에서 주로 발현이 된다. CD40— CD154 신호전달을 통하여 B 세포와 대식세포가 활성화되고 간접적으로 T 세포도 활성화시켜， 면역반응을 촉진시킨다 (Iran J Allergy Asthma Immunol 2012， 11(1)， 1-13).

따라서， CD154의 작용을 조절하여 면역 반응을 억제하기 위하여， 항 -CD154 항체가 개발되었고， 상기 항체는 원숭이를 비롯한 동물실험에서 좋은 효과를 보였 다. 그러나 사람을 대상으로 하는 임상실험 결과， 항 -CD154 항체는 혈전 생성이라 는 심각한 부작용을 나타내어， 현재 CD154에 대한 항체 의약품 개발이 전면적으로 중단된 상태이다 (Arthritis & Rheumatism 2002, 46(12), 3251-3258； Arthritis & Rheumatism 2003, 48(3), 719-727； Curr Opin Organ Trans lant 2012, 17， 368- 375).

항체는 세포의 표면상에 발현된 FcyR(Fc gamma receptor)에 결합함으로써 면역 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. FcyR은 FcyRIa, FcyRIb, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa 및 FcyRIIIb로 이루어져 있다. 이중 항체와 FCYRI 및 FcyRIII와의 결합이 항체의 효과에 중요한 역할을 하는 반면 , 항 -CD154 항체와 혈 소판의 FcyRII와의 결합은 혈전을 유발한다. 따라서， 항 -CD154 항체의 효과는 유 지하면서도 이로 인한 혈전 생성을 방지하기 위해서는， FCYRI 및 FcyRIII와의 결 합력은 유지하면서도 FCYRII와 결합하지 않는 새로운 항 -CD154 항체의 개발이 요 구된다 (Journal of Biological Chemistry, 276, 6591-6604) .

【발명의 상세한 설명]

【기술적 과제】

따라서， 본 발명의 목적은 FCYRI 및 FCYRIII와의 결합력은 유지하면서 FcyRII와의 결합은 차단되어 혈전을 유발하지 않는， CD154에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치 료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 【기술적 해결방법】

상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변 영역 (V _H ) 및 서열번호 2로 표시되는 경쇄 가변 영역 (V _L )을 포함하는 항체로서， 상기 항체가 서열번호 15로 표시되는 중쇄의 Fc 영역 내에 D271E 및 S299A 변이를 갖는 CD154에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

또한， 본 발명은 상기 항체 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 자 가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한， 본 발명은 상기 항체 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 약 학적 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는， 자가면역질환의 예방 또는 치료방 법을 제공한다.

또한， 본 발명은 자가면역질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용 하기 위한 상기 항체 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 약학적 조성물 의 용도를 제공한다.

【발명의 효과】

본 발명에 따른 항체는 FC Y RI 및 FC Y RI I I과의 결합은 유지하되， Fc y RI I와 의 결합은 차단함으로써， 혈전 생성의 부작용 없이 항 -CD154 항체로서의 우수한 면 역억제효과를 나타낸다. 따라서， 상기 항체를 포함하는 조성물은 자가면역질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 본 발명에 따른 경쇄용 발현백터의 모식도이다.

도 2는 본 발명에 따른 중쇄용 발현백터의 모식도이다. 도 3은 본 발명에 따른 경쇄 및 중쇄용 발현백터의 모식도이다. 도 4는 본 발명에 따른 항체 (ClOm)와 FCY 수용체 I, Ila, lib, Ilia 및 Illb와의 농도별 결합력을 나타낸 그래프이다.

도 5는 모 항체 (C10)와 Fey 수용체 I， Ila, lib, Ilia 및 Illb와의 농도별 결합력을 나타낸 그래프이다.

도 6은 대조군으로서 리특산과 Fey 수용체 I, Ila, lib, Ilia 및 Illb와의 농도별 결합력을 나타낸 그래프이다.

도 7은 1 μΜ 농도의 리특산， ClOm 및 C10과 Fey 수용체 I， Ila, lib, Ilia 및 Illb와의 결합력을 비교한 그래프이다.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

이하， 본 발명에 사용된 용어의 정의를 설명한다.

본원에 사용된 용어 "항체' '는 가장 광범위한 의미로 사용되고， 구체적으로는 모노클로날 항체， 폴리클로날 항체， 이량체， 다량체, 다증-특이적 항체 (예: 이중- 특이적 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편이 포함된다. 상기 항체는 쥐과 (murine), 인간 또는 기타 종으로부터 유래된 것일 수 있으며, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 또한， 상기 항체는 특이적으로 항원을 인식하고 이와 결합함 ^로써 면역반응을 나타낸다.

본원에서 사용된 용어 c 영역"은 항체의 Fab 영역을 제외한 꼬리 (tail) 영 역으로서， 항체의 중쇄 불변 영역 중 C¾ 및 CH ₃ 을 포함하는 2개의 동일한 단백질 단편으로 구성된다. 상기 Fc 영역은 Fc 수용체 및 보체계의 일부 단백질과 상호작 용하며 면역계를 활성화시킨다.

본 발명에 사용된 아미노산 치환과 관련된 약어， 예를 들면 'D271E'는 본원 에 규정된 아미노산 서열에서 Kabat 등 (Kabat et al, SEQUENCE OF PROTEINS OF WMUNOLOGICAL INTEREST, 5 ^th ED. Public Health Service, NIH, MD(1991))에 의한 넘 버링 규칙에 따라 2기번째 위치의 아미노산인 아스파르트산 (D)이 글루탐산 (E)으로 치환된 것을 의미한다. 또한， 'S299A'는 본원에 규정된 아미노산 서열에서 Kabat 등에 의한 넘버링 규칙에 따라 299번째 위치의 아미노산인 세린 (S)이 알라닌 (A)으 로 치환된 것을 의미한다. 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변 영역 (V _H ) 및 서열번호 2로 표시 되는 경쇄 가변 영역 (V _L )을 포함하는 항체로서， 상기 항체가 서열번호 15로 표시되 는 중쇄의 Fc 영역 내에 D271E 및 S299A 변이를 갖는 CD154에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

본 발명에 따른 항체는 항 -CD154 항체로서 , CD154 CD40L)에 특이적으로 결합 하여 CD154 CD40L)가 CD40에 결합하는 것을 억제함으로써 면역억제제로서 기능한 다. 상기 CD154는 CD4 ⁺ T 세포의 표면 상에서 발현되는 II형 막관통 단백질로서, CD40 리간드 (CD40L: CD40 ligand), CD40 대응 수용체 (CD40CR: CD40 counter receptor), gp39, T-BAM, T 세포 활성화 분자， TRAF, TNF 관련 활성화 단백질 (TRAP: TNF-Related Activation Protein) 및 종양 괴사 인자 리간드 수퍼패밀리 멤 버 5(TNFSF5: Tumor Necrosis Factor Ligand Super f ami ly Member 5)와 같은 여러 명칭으로 알려져 있다.

하나의 구현예에서 , 본 발명의 항체는 서열번호 3으로 표시되는 중쇄 불변 영역 (C _H )을 가질 수 있다. 또한， 다른 구현예에서， 본 발명의 항체는 서열번호 4로 표시되는 경쇄 불변 영역 (C _L )을 가질 수 있다. 또한， 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 및 서열번호 7로 표시되는 경쇄를 가질 수 있다.

본 발명의 항체는 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변 영역 (V _H ) 및 서열번호 2 로 표시되는 경쇄 가변 영역 (V _L )을 포함하는 항 -CD154 항체로부터 제조될 수 있다. 본 발명의 항체를 제조하기 위한 모 (parent) 항체의 예로는 C10 항체 (GENEXINE사， 한국)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 C10 항체는 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변 영역 (V _H ) 및 서열번호 2 로 표시되는 경쇄 가변 영역 (V _L )을 포함하며， 서열번호 5로 표시되는 중쇄 불변 영 역 (C _H ) 및 서열번호 4로 표시되는 경쇄 불변 영역 (C _L )을 갖는다. 또한， 상기 C10 항 체는 서열번호 15로 표시되는 중쇄를 갖는다. 나아가， 상기 C10 항체는 서열번호 7 로 표시되는 경쇄를 갖는다. 상기 C10 항체는 FcyRI, FcyRII 및 FcyRIII과 모두 결합하며， 그 중 FcyRII와의 결합을 통해 혈전 형성 (thrombosis)의 부작용을 나타 낸다.

그러나， 본 발명의 항— CD154 항체는 C10 항체와는 달리 서열번호 15로 표시 되는 중쇄의 Fc 영역 내에 2기번째 위치의 아스파르트산 (D)이 글루탐산 (E)으로， 299번째 위치의 세린 (S)이 알라닌 (A)으로 치환됨으로써， FCYRII와의 결합력을 나 타내지 않는다. 또한， 서열번호 5로 표시되는 중쇄의 불변 영역 내에 153번째 위치 의 아스파르트산 (D)이 글루탐산 (E)으로, 181번째 위치의 세린 (S)이 알라닌 (A)으로 치환됨으로써， FC Y RI I와의 결합력을 나타내지 않는다. 따라서， 본 발명에 따른 항 체는 Fc y RI 및 Fc y RI I I과의 결합을 유지하여 항 -CD154 항체로서의 우수한 면역억 제효과를 나타낸다. 뿐만 아니라， 상기 항체는 Fc y RI I와는 결합하지 않아 혈전 생 성의 부작용을 낮출 수 있다. 본원에서， 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변 영역 (V _H ) , 서열번호 2로 표시되는 경쇄 가변 영역 (V _L ) , 서열번호 3으로 표시되는 중쇄 불변 영역 (C _H ) 및 서열번호 4로 표시되는 경쇄 불변 영역 (C _L )을 갖는 항체는 C10 항 체의 변이 항체라는 의미로 ' ClOm '이라 지칭된다ᅳ

본 발명에 따른 항체에서， 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변 영역 (V _H )은 서 열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되며， 서열번호 2로 표시되는 경쇄 가변 영역 (V _L )은 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩될 수 있다.

또한， 본 발명에 따른 항체에서， 서열번호 3으로 표시되는 중쇄 불변 영역 (C _H )은 서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되며， 서열번호 4 로 표시되는 경쇄 불변 영역 (C _L )은 서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩될 수 있다.

나아가， 본 발명에 따른 항체에서， 서열번호 6으로 표시되는 중쇄는 서열번 호 12로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되며， 서열번호 7로 표시되는 경 쇄는 서열번호 13으로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩될 수 있다. 또한， 본 발명에 따른 항— CD154 항체는 항체 접합체를 형성하는데 사용될 수 있다. 이때 항체 접합체란 항 -CD154 항체에 생물학적 활성을 갖는 물질이 결합된 형태의 항체를 의미한다.

상기 항 -CD154 항체는 항체 접합체를 형성함으로써 단백질의 면역원성 및 항 원성을 현저히 감소시킬 수 있고， 이의 물리적 및 화학적 안정성을 증진시킬 수 있 다. 상기 생물학적 활성을 갖는 물질과 항 -CD154 항체의 결합은 공유결합 또는 비 공유결합에 의해 이루어질 수 있으며， 가역적이거나 조절 가능한 것일 수 있다. 본 발명의 항 -CD154 항체 접합체를 형성하는데 사용될 수 있는 물질의 예로 는 항신생물제， 약물, 독소， 효소, 다른 항체， 항체 유도체 또는 항체 단편， 합성 (예를 들어, PEG) 또는 자연 발생 중합체， DNA , RNA , 압타머, 방사성 핵종， 특히 방사성 요오드화물， 방사성 동위원소, 킬레이트화된 금속， 및 醒 R 또는 ESR 분광분 석법과 같은 기법에 의해 영상화하여 검출할 수 있는 화합물을 포함하나, 이에 한 정되지 않는다. 또한, 본 발명은 상기 항체 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 자 가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

항— CD154 항체는 체액성 면역 반응 및 세포 매개 면역 반웅을 조절하는 것이 알려져 있으며， 이를 이용한 자가면역질환 치료제를 개발하기 위한 임상이 시도되 고 있다. 하지만， 상기 항 -CD154 항체는 혈전을 생성하는 부작용이 있어 치료제로 서 적용하는데 한계가 있다. 반면， 본 발명의 항 -CD154 항체는 FC Y RI I와 결합하지 않아 혈전 생성의 부작용이 없음을 확인하였다. 따라서， 본 발명의 항 -CD154 항체 는 부작용이 없으면서도 면역반응을 조절할 수 있어， 다양한 면역질환의 치료에 적 용될 수 있다 . 특히 , 면역질환 중에서도 자가면역질환에 속한 질환의 치료제로 이 용될 수 있다.

상기 자가면역질환의 예로는 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis), 전 신성 경피증 (progressive systemic sclerosis , scleroderma) , 전신 홍반성 낭창 (lupus), 아토피 피부염, 원형탈모증 (alopecia areata), 건선 (psoriasis)， 천포창， 천식, 아프타구내염， 만성 갑상선염， 후천성 재생불량성 빈혈, 일차성 간경변， 궤 양성 대장염， 베체트병 (Behcet's disease), 크론병， 규소 폐증, 석면 폐증， IgA 신 장질환， 연쇄상구균감염후 사구체신염 (PSGN), 쇼그렌 증후군 (Sjogren Syndrome), 길리안 -바레 증후군 (Guilian— Barre syndrome) , 피부근염 (dermatomyosit is)， 다발성 근염 (polymyositis), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 자가면역성 용혈성 빈혈 (autoimmune hemolytic anemia) , 자가면역성 뇌척수염， 중증 근무력증 (myasthenia gravis), 그레이브병 (Grave ' s disease), 결절성 다발성 동맥염 (polyarterit is nodosa) , 강직성 척주염 (ankylosing spondylitis), 섬유조직염 (fibromyalgia syndrome) 및 측두 동맥염 (temporal arteritis)이 있으나， 이에 제한되지 않는다. 상기 첨가제는 담체， 부형제 또는 기타 첨가제일 수 있다. 본 발명의 조성물 은 통상적인 방법에 따라 약학 제형으로 제조될 수 있디ᅳ. 제형을 제조할 때， 상기 항체를 담체와 함께 흔합 또는 회석하거나， 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것 이 바람직하다. 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 항체에 대한 담체， 부형제 또 는 매질 (medium)로 작용하는 고형， 반고형 또는 액상의 물질일 수 있다.

따라서， 제형은 정게， 환제， 분제， 엘릭시르， 현탁제， 유제, 용액제， 시럽 거 1， 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제， 멸균 주사제， 멸균 분제 등의 형태 일 수 있다. 적합한 담체， 부형제 및 희석제의 예로는， 락토즈， 텍스트로즈， 수크 로즈， 솔비를， 만니를, 칼슘 실리케이트， 셀를로즈， 메틸 셀를로즈， 미정질 셀를로 즈， 폴리비닐피를리돈， 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시밴조에이 트， 탈크， 마그네슴 스테아레이트 및 광물유가 있다. 제형은 충진제， 항응집제， 윤 활제, 습윤제， 향료， 유화제， 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성 물은 포유동물에 투여된 후 항체의 신속， 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도 록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다 .

본 발명의 항체 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대 상， 예를 들어 인간을 포함하는 포유동물에게 투여함으로써 자가면역질환을 치료할 수 있다. 이띠 1， 상기 항체의 투여량은 처리되는 대상， 질병 또는 상태의 심각도， 투여의 속도 및 처방 의사의 판단에 따른다. 유효성분으로서 상기 항체는 포유동물 에 대해 하루 0.001 내지 10 mg/kg (체중)， 바람직하게는 0.005 내지 1 mg/kg (체중) 의 양으로 1일 1회 또는 분할하여 비경구적 경로를 통해 투여될 수 있으나， 이에 제한되지 않는다. 또한， 본 발명은 상기 항체 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 약 학적 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는， 자가면역질환의 예방 또는 치료방 법을 제공한다. 본 발명에 따른 항체 및 약학적으로 허용가능한 첨가제는 상기 서 술한 바와 같다. 상기 개체는 포유동물, 구체적으로는 인간일 수 있다. 또한， 본 발명은 자가면역질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용 하기 위한 상기 항체 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 약학적 조성물 의 용도를 제공한다. 상기 항체 및 약학적으로 허용가능한 첨가제는 상기 서술한 바와 같다. 【발명의 실시를 위한 형태】

이하， 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐， 이로 인해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니 다. 실시예 1 : 변이 항체 (ClOm)의 제조

<1-1>모 항체의 입수 및 서열 분석

변이 항체를 만들기 위한 모 항체로서， C10 항체를 GENEXINE사 (한국)로부터 입수하였다. 상기 C10 항체의 중쇄 및 경쇄 서열을 코스모진텍사 (한국)에 의뢰하여 확인하였다.

확인 결과， C10 항체는 서열번호 8의 폴리뉴클레오타이드를 갖는 중쇄 가변 영역, 서열번호 9의 폴리뉴클레오타이드를 갖는 경쇄 가변 영역， 서열번호 14의 폴 리뉴클레오타이드를 갖는 중쇄 불변 영역 및 서열번호 11의 폴리뉴클레오타이드를 갖는 경쇄 불변 영역으로 구성되어 있었다. 상기 염기서열을 아미노산 서열로 번역 한 결과， C10 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역， 서열번 호 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역， 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역으로 구성되 어 있었다.

<1-2> 모 항체 서열에 기반한 변이 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자 의 합성

상기 모 항체인 C10의 염기서열 분석 결과를 바탕으로， 서열번호 15로 표시 되는 중쇄의 Fc 영역 내 2기번째 위치의 아스파르트산 (D)이 글루탐산 (E)으로， 299 번째 위치의 세린 (S)이 알라닌 (A)으로 치환된 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레 오타이드를 갖는 유전자를 설계하였다. 상기 중쇄 유전자는 서열번호 12의 폴리뉴 클레오타이드를 갖고 경쇄 유전자는 서열번호 13의 폴리뉴클레오타이드를 갖도록 설계하였다. 이때, 상기 중쇄 유전자의 상류에는 신호 펩타이드 (s ignal pept ide)를 코딩하는 서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드를 접합시켰고， 상기 경쇄 유전자의 상류에는 신호 펩타이드를 코딩하는 서열번호 18의 을리고뉴클레오타이드를 접합시 켰다. 상기 설계된 유전자를 유전자 합성 전문기관인 Topgene (Canada)에 의뢰하여 합성하였다.

합성한 서열을 확인한 결과, 서열번호 8의 폴리뉴클레오타이드는 중쇄 가변 영역을， 서열번호 9의 폴리뉴클레오타이드는 경쇄 가변 영역을， 서열번호 10의 폴 리뉴클레오타이드는 중쇄 불변 영역을， 그리고 서열번호 11의 폴리뉴클레오타이드 는 경쇄 불변 영역을 코딩하였다.

<1-3> 변이 항체의 제조 경쇄용 발현백터를 제조하기 위해， pAD15백터 (GENEXINE사, 한국)를 제한효소

Notl 및 ba/으로 처리한 후， Topgene사에 의해 합성된 경쇄를 코딩하는 유전자와 라이게이션 (ligation)하여 경쇄를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현백터를 제조하 였다. 상기 제조된 백터의 모식도를 도 1에 나타내었다.

또한， 중쇄용 발현백터를 제조하기 위해， pGEM 백터 (INVITROGEN사)를 제한효 소 및 Xbal으— — 처리한 후， Topgene사에 의해 합성된 증쇄를 코딩하는 유전 자와 라이게이션 (ligation)하여 중쇄를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현백터를 제 조하였다. 상기 제조된 백터의 모식도를 도 2에 나타내었다.

그리고 경쇄 및 중쇄를 동시에 발현시키기 위한 백터를 제조하기 위해， 경쇄 용 발현백터 (도 1)를 제한효소 A¾o/으로 처리한 후， 제한효소인 5a//으로 처리한 중쇄용 발현백터 (도 2)와 라이게이션하여 경쇄 및 중쇄용 발현백터를 제조하였다. 상기 제조된 백터의 모식도를 도 3에 나타내었다.

이후， 상기에서 제조한 경쇄 및 중쇄용 발현백터 (도 3)를 전기천공기를 이용 하여 CHO DG44 세포주 (DHFR-)에 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 세포주 중 ELISA 정량 분석을 통해 항체의 발현양이 높은 세포를 선별했으며， 단계적으로 메토트렉 세이트 (methotrexate)의 양을 증가시키면서 "증폭 → 단일클론 선별 → 생산성 측 정'' 과정을 반복하여 원하는 발현 세포주를 수득하였다.

상기 수득된 발현 세포주를 상업적 배지인 Hycell™ media를 이용하여 3L 배 양기에서 배양하였다. 상기 수득한 배양액을 단백질 A 컬럼 및 양이온교환 크로마 토그래피 (DEAE column)를 통과시키고 연마 (pol ishing) 과정 후 초미세여과 공정을 거쳐 본 발명에 따른 변이 항체 (ClOm)를 수득하였다. 실시예 2: 변이 항체 (ClOm)의 서열 확인 상기 실시예 1에서 제조된 ClOm의 중쇄 및 경쇄 서열을 확인한 결과， ClOm 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 서열번호 2의 아미노 산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역， 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영 역 및 서열번호 4의 아미노산을 갖는 경쇄 불변 영역으로 구성되어 있었다.

상기 ClOm의 아미노산 서열을 C10과 비교한 결과， ClOm은 C10의 Fc 영역 내 2기번째 아미노산인 아스파르트산 (D)이 글루탐산 (E)으로， 299번째 아미노산인 세린 (S)이 알라닌 (A)으로 치환되었다. 시험예 1: Fey 수용체와의 결합력 확인 상기 실시예 1에서 제조된 ClOm 및 모항체인 C10의 Fey수용체 (Iᅳ Ha, lib, Ilia, 11 lb)에 대한 결합력을 다음과 같이 비교하였다.

구체적으로， GLC 칩 (Cat #. 176—5011, Bio-Rad사)의 5개 채널에 Fey 수용체 I, Ila, lib, Ilia 및 Illb를 코팅하였다. 여기에 ClOm, C10 및 리룩산 (양성대조 군, Roche사)을 각각 0.011， 0.03, 0.11, 0.3, 1 μΜ 농도로 분당 30 μ 1의 속도로 홀려주었다. 실험은 재생 버퍼인 25 niM NaOH를 이용하여 원점을 확인한 후, 상기 단계를 반복하여 진행하였다. 그 후， 단백질 결합 분석기기 (Proteon XPR36, BI0- RAD, USA)를 이용하여 결합곡선을 확인하였다. 상기 결과를 도 4 내지 6에 나타내 었다.

도 4 내지 6에서 보는 바와 같이， ClOm, C10 및 리룩산과 FCY 수용체 I Ilia 및 Illb와의 결합에 따른 RU 값은 농도에 비례해서 증가하였다. 이는 ClOm, C10 및 리툭산과 Fc _Y 수용체 I Ilia 및 Illb와의 결합이 유지되고 있다는 것을 보여준다. 한편, C10 및 리특산과 FCY 수용체 Ila 및 lib와의 결합에 따른 RU값은 농도에 비례하여 증가한 반면 ClOm와 Fey 수용체 Ila 및 lib와의 결합에 따른 RU 값은 농도가 높아져도 변화가 없었다. 상기 결과는 본 발명의 ClOm 항체가 C10 및 리툭산과 달리 FCY 수용체 Ila 및 lib와의 결합이 차단되었음을 보여준다. 시험예 2: 특정농도에서 FCY 수용체와의 결합력 확인 같은 농도의 리특산， ClOm 및 C10과 FCY 수용체와의 결합력을 한번에 비교 하기 위하여, 1 μΜ 농도의 각각의 항체와 Fey 수용체 I, Ila, lib, Ilia 및 Illb 와의 결합력을 비교하였다. 상기 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에서 보는 바와 같이， ClOm은 C10 및 리특산과 비교하여 Fey 수용체 Ila 및 lib와의 결합력이 없었다.