CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se engloba dentro del campo de la salud humana, más específicamente dentro del campo de la salud buco-dental.

ANTECEDENTES

La cavidad oral humana esta habitada por cientos de especies bacterianas, la mayoría de las cuales son comensales y necesarias para mantener el equilibrio en el ecosistema oral. Sin embargo, algunas de ellas juegan un papel clave en el desarrollo de las enfermedades orales, principalmente caries dental y enfermedad periodontal (1 ). Las enfermedades orales empiezan con el crecimiento de la placa dental, un biofilm formado por la acumulación de bacterias conjuntamente con glicoproteinas de la saliva humana y los polisacáridos secretados por los microbios (2). La placa subgingival, localizada en el bolsillo subgingival neutro o alcalino, está típicamente habitado por anaerobios Gram negativos y es responsable del desarrollo de la gingivitis y periodontitis. La placa dental supragingival se forma en la superficie del diente e incluye bacterias acidogénicas y acidófilas, que al fermentar los azúcares ingestados en la dieta producen ácido y bajan el pH. Cuando el pH se acidifica demasiado (generalmente por debajo de un valor de 5.5) el esmalte del diente se desmineraliza y destruye, y por tanto estas bacterias son responsables de la caries dental, considerada la enfermedad infecciosa más extendida en el mundo, afectando a más del 80% de la población humana (3). Una mala salud oral puede estar asociada a otras patologías como por ejemplo, la úlcera de estómago, el cáncer gástrico o enfermedades cardiovasculares, entre otras.

Una de las principales razones por las que, a fecha de hoy, aún no se han conseguido erradicar a los patógenos orales, es la dificultad para estudiar las comunidades microbianas que habitan la cavidad oral, ya que por un lado, la complejidad del ecosistema (varios cientos de especies han sido detectadas con múltiples niveles de interacción) hace difícil detectar a la/s potencial/es especie/s patógena/s (4); además, no hay un único agente etiológico que pueda ser identificado como en las enfermedades clásicas, siguiendo los postulados de Koch. Este hecho ha sido claramente demostrado en la enfermedad periodontal, donde existen al menos 3 especies bacterianas pertenecientes a grupos taxonómicos muy diferentes (el llamado "complejo rojo" de patógenos periodontales) y que han sido relacionadas con el desarrollo y progresión de la enfermedad periodontal (5). Por otro lado, existe una gran proporción de bacterias orales que no pueden ser cultivadas (6) y por lo tanto, los métodos microbiológicos tradicionales dan una imagen incompleta de las comunidades naturales que habitan la placa dental. Sin embargo, el desarrollo actual de las técnicas metagenómicas y de 5 las tecnologías de secuenciación de última generación (Next Generation Sequencing) permiten el estudio de la comunidad bacteriana en su totalidad, analizando el conjunto del ADN total de muestras microbianas complejas (Metagenoma) sin necesidad de cultivar las bacterias en sí.

En este sentido, estudios pioneros en metagenómica se han centrado en el ecosistema intestinal, principalmente mediante una aproximación tipo "shot-gun", en la cual el í o ADN es clonado en plásmidos de pequeño tamaño seguido de secuenciación tradicional tipo Sanger (7,8). Aproximaciones más recientes incluyen la secuenciación de extremos de fósmidos de gran tamaño (9) y el uso de la tecnología de secuenciación "Hlumina" con una alta cobertura de secuencias cortas (10). Estudios de la microbiota de la cavidad oral, así como otros hábitats del cuerpo humano como la piel, la vagina o el tracto respiratorio se han

15 focalizado en la secuenciación de amplicones del ARN ribosomal (11 ,12). Estos estudios han proporcionado una mejora sustancial de nuestro conocimiento de estas comunidades bacterianas comparado con la anterior investigación basada en el cultivo, pero las estimaciones de diversidad microbiana están dificultadas por los sesgos en la amplificación por PCR (es decir, la PCR detecta solamente las bacterias más similares a las ya conocidas y en

20 base a la cual se usan los cebadores de amplificación, dando una imagen incompleta de la diversidad presente), por el sesgo de clonación (hay una gran cantidad de genes que no se clonan porque resultan tóxicos para la bacteria hospedadora y por tanto este método no permite estudiar la totalidad del reservorio genético de la muestra) y por una baja longitud de secuencia (las secuencias de la tecnología Hlumina tienen tan sólo entre 35-70 nucleótidos,

25 haciendo en la mayoría de los casos imposible una asignación taxonómica o funcional fiable), que unido al hecho de que como se ha comentado previamente, existe una gran proporción de bacterias orales que no pueden ser cultivadas.

Para solventar los problemas arriba mencionados, la presente invención describe la 30 obtención del metagenoma de placa dental mediante la secuenciación directa del ADN metagenómico por pirosecuenciación 454, eliminando así los posibles sesgos impuestos por las técnicas de clonación y de PCR y proporcionando además acceso a todo el repertorio genético de la comunidad bacteriana oral en diferentes estados de salud, así como la posibilidad de analizar qué especies bacterianas de las encontradas en el metagenoma obtenido pueden estar asociadas a una buena salud oral, al presentar una flora bacteriana diferente, aquellos individuos que nunca habían padecido caries respecto a los individuos que sí la habían padecido o la padecen. Mediante el metagenoma oral obtenido en la presente invención es posible dirigir el aislamiento, cultivo e identificación de las cepas con actividad anti-cariogénica, a partir del conglomerado de bacterias que comprende una muestra de la cavidad bucal, en concreto de la placa supragingival de individuos que nunca han padecido caries, es decir aquellas cepas capaces de inhibir el crecimiento de bacterias cariogénicas.

Otra de las estrategias descritas en la presente invención es la obtención de una librería metagenómica de fósmidos (insertos de ADN de longitud larga, aproximadamente 35- 45 Kb) de la placa dental de individuos que nunca han padecido caries. Mediante la obtención de dicha librería de fósmidos es posible el aislamiento e identificación de los péptidos bioactivos anticariogénicos sintetizados por las bacterias presentes en la cavidad oral de individuos que nunca han padecido caries. En este sentido, dado que en el estado de la técnica Streptococcus mutans ha mostrado ser el principal agente causal de la caries (13) no es sorprendente que la mayoría de las estrategias frente a esta enfermedad hayan ido enfocadas frente a dicho microorganismo. Estas estrategias han incluido el desarrollo de vacunas usando antígenos conocidos de superficie, estrategias de inmunización pasiva que puedan neutralizar la bacteria, la co-agregación de S. mutans con cepas probióticas o el uso de proteínas inhibidoras específicas de S. mutans, entre otras (14).

Otras estrategias diferentes han sido las descritas en diferentes documentos de patente que proponen el uso de diferentes cepas bacterianas, preferentemente S. mutans, que producen menor concentración de ácido (15), o el uso de los mismos recursos, por ejemplo los nutrientes, por parte de las cepas patógenas frente a las cepas no patógenas, suministrando altas concentraciones de bacterias no patógenas de forma continuada, lo que motiva el desplazamiento de las bacterias patógenas, siempre que compartan el mismo recurso (16), o incluso una menor adhesión de las cepas bacterianas cariogénicas al diente (17). En cambio, las cepas y péptidos bioactivos descritos en la presente invención, poseen por si mismos actividad antibiótica, preferentemente anticariogénica, frente a los microorganismos productores de caries. Por otro lado, en la patente WO20040072093 (18) se describen una serie de agentes antimicrobianos activos principalmente frente a microorganismos Gram- negativos, pero los principales agentes causantes de la caries, S. mutans y S. sobrinus, son microorganismos Gram-positivos. Además, los aislados de S. mitis y S. oralis productores de dichos péptidos antimicrobianos descritos en WO20040072093 (18) han sido aislados de la garganta de pacientes con fibrosis quística, no de la boca de personas sin caries, como es el caso de los péptidos y/o cepas de la invención. Asimismo, el uso terapéutico de dichos péptidos está dirigido al tratamiento de enfermedades de las vías respiratorias y no de la caries, como es el caso de los péptidos bioactivos descritos en la presente invención.

En este sentido, las cepas bacterianas aisladas y descritas en la presente invención, tienen como características técnicas principales que les diferencian del resto de cepas descritas en el estado de la técnica que pueden cultivarse mediante técnicas microbiológicas convencionales; que presentan actividad inhibitoria frente a organismos productores de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente caries, sin necesidad de estar modificadas genéticamente y que han sido aisladas de individuos que nunca han padecido caries. Por consiguiente, tanto las propias bacterias anticariogénicas, como, asimismo, los compuestos bioactivos anticariogénicos, preferentemente péptidos, descritos en la presente invención pueden usarse como composiciones probióticas y/o prebióticas propiamente dichas, o formando parte de diferentes composiciones farmaceúticas utilizadas para el tratamiento de infecciones de la cavidad bucal, como por ejemplo, caries, periodontitis, etc, o incluso como alimentos funcionales. Además, en la presente invención también se describe un método de prevención y/o tratamiento de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente caries, que comprende la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz de, al menos, u n a de las ce pas y/o al men os uno de los compuestos antimicrobianos, preferentemente péptidos, descritos anteriormente, o de la composición probiótica o farmacéutica o de los alimentos funcionales que comprendan al menos una de las cepas y/o al menos uno de los compuestos, preferentemente péptidos, de la invención. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Breve descripción de la invención

5 Los problemas existentes en el estado de la técnica a la hora de identificar cepas bacterianas que, directamente, inhiban el crecimiento de gérmenes patógenos relacionados con la aparición de enfermedades en la cavidad bucal, se basan, pues, en la enorme cantidad de especies bacterianas en dicha cavidad, por lo que el problema de aislar de entre todas ellas cepas que inhiban directamente el crecimiento de especies patógenas, siendo muchas de ellas o especies no cultivables, ha hecho hasta la fecha este problema de difícil solución.

La presente invención resuelve el mismo mediante la realización del metagenoma de la cavidad bucal de individuos que nunca han padecido caries. Con la realización de dicho metagenoma, empleando una secuenciación masiva, preferentemente mediante pirosecuenciación, del ADN presente en las muestras tomadas de la cavidad bucal de dichos5 individuos que nunca han padecido caries, permite identificar los géneros y especies de bacterias más frecuentes en la población bacteriana presente en la cavidad bucal de dichos individuos. Esta cuantificación de la frecuencia de cada bacteria en la muestra no había sido posible, hasta ahora, por técnicas de cultivo, clonación o PCR, dado que estas técnicas identifican sólo parte de las bacterias y las proporciones de las que sí identifica están sesgadas o por la propia metodología (principalmente por el cultivo, clonación o amplificación preferente de ciertas especies, respectivamente).

En principio, la invención se ha basado en seres humanos, pero podría aplicarse a cualquier mamífero superior, especialmente animales de compañía o cabañas ganaderas, o incluso a fauna salvaje. Bastaría con determinar el metagenoma característico de cada5 especie, en individuos que nunca hayan padecido caries, como enfermedad representativa de las enfermedades típicas de la cavidad bucal. A partir de los datos obtenidos del metagenoma, una vez identificadas las cepas bacterianas más frecuentes en la cavidad bucal de los individuos sanos, el siguiente paso de la presente invención es cultivar las muestras obtenidas de la cavidad bucal de estos individuos, en los medios de cultivo y en las condiciones o favorables, para que se desarrollen los géneros y las especies más frecuentes identificadas en el metagenoma de la especie de mamífero investigada. Una segunda alternativa para resolver el problema arriba mencionado es intentar aislar compuestos, especialmente péptidos activos, secretados, entre otros, por las cepas bacterianas presentes en la cavidad bucal de individuos que nunca han padecido caries y que presenten actividad inhibitoria directa del crecimiento de las especies cariogénicas. Con capacidad inhibitoria directa, en la presente invención se define, aquella capacidad que inhibe completamente el crecimiento, al crear halos de inhibición en cultivos césped de dichas especies patógenas, debido a su acción antibiótica, sin descartar que, adicionalmente a dicha inhibición debida a su efecto antibiótico, las cepas y los compuestos puedan ejercer su efecto antimicrobiano, preferentemente anticariogénico, dificultando la acción cariogénica por otras vías, tales como modificar el pH óptimo de crecimiento de dichas cepas cariogénicas, dificultar su adhesión a los dientes, etc....

Para ello, la invención ha partido, de nuevo, de muestras de la cavidad bucal tomadas de individuos sanos, pero en esta alternativa, no se ha centrado solo en compuestos de origen bacteriano que puedan ser secretados, entre otras, por las cepas aisladas mencionadas anteriormente. Además, pueden existir, compuestos secretados por otras cepas bacterianas, que no sean cultivables y que, por consiguiente, no podamos aislar con la estrategia propuesta anteriormente. Por último, en la cavidad bucal, además de compuestos de origen bacteriano procedentes de la población de cepas bacterianas que habitan dicha cavidad, se encuentran también compuestos secretados por las propias células del mamífero, particularmente el ser humano en el que, preferentemente, se basa la presente invención. Alguno de estos compuestos puede tener actividad inhibitoria directa del crecimiento de microorganismos cariogénicos. Para ello se ha procedido a lisar las muestras obtenidas de la cavidad bucal de individuos sanos, extraer el ADN de las mismas, construir fósmidos con dichos fragmentos y clonarlos en una célula huésped que se pueda cultivar y ensayar en cultivos de especies cariogénicas, para observar si se producen halos de inhibición de crecimiento de las especies cariogénicas patógenas.

Hay que hacer notar que, aunque las cepas y los compuestos inhibidores aislados se han obtenido a partir de muestras de la cavidad bucal y se muestran activos contra especies bacterianas patógenas productoras de caries (cariogénicas), debido a su capacidad inhibidora del crecimiento de bacterias patógenas que pueblan preferentemente la cavidad bucal, en principio, las cepas bacterianas y los compuestos aislados podrían encontrarse en otras partes del organismo y producir o asociarse a otras enfermedades. Por ello, es objeto de la presente invención, el uso de las cepas y los compuestos aislados como medicamentos , particularmente, como agentes anti-microbianos y, más específicamente, como antibacterianos.

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En la presente invención se describe pues el aislamiento de cepas bacterianas cultivables y de compuestos, principalmente, péptidos bioactivos, con capacidad inhibitoria del crecimiento de microorganismos patógenos implicados en la aparición de enfermedades de la cavidad bucal. A lo largo de la presente invención, se ha tomado como enfermedad0 representativa de las enfermedades típicas de la cavidad bucal, la aparición de caries, pero la invención se aplica a cualquier enfermedad infecciosa atribuible a microorganismos patógenos de la cavidad bucal. Por ello, la presente invención se centra, preferentemente, en el aislamiento de cepas bacterianas y de compuestos, principalmente, péptidos bioactivos, con capacidad inhibitoria del crecimiento de microorganismos patógenos implicados, 5 particularmente en la aparición de caries.

El procedimiento de aislamiento de cepas bacterianas cultivables con capacidad anticariogénica se basa en la obtención del metagenoma oral de individuos que nunca han padecido caries, para averiguar qué tipo de bacterias presentan dichos individuos, de forma o más frecuente en su cavidad bucal y, analizar cuáles de ellas están asociadas a una buena salud oral, al inhibir el crecimiento de bacterias cariogénicas. Mediante dicho procedimiento se ha conseguido aislar, caracterizar, cultivar y depositar en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) diferentes cepas con actividad anticariogénica: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773, CECT 7774 y CECT 7775. Cuatro de las cepas que presentan actividad anticariogénica 5 y que se depositaron en la CECT, específicamente las cepas CECT 7746, 7747, 7773 y 7775, mediante análisis de homología de secuencias, se concluyó que pertenecían al mismo género bacteriano: Streptococcus, compartiendo, por tanto, dichas cepas además de su funcionalidad (actividad anticariogénica) y su procedimiento de obtención, similitud estructural y taxonómica, al pertenecer, como hemos mencionado previamente, al mismo género bacteriano, o Streptococcus. Por otro lado, el procedimiento de aislamiento y caracterización de péptidos bioactivos anticariogénicos, se basa en la obtención de una librería metagenómica de fósmidos de individuos que nunca han padecido caries. Mediante dicho método se consigue caracterizar los péptidos con capacidad anticariogénica producidos por las bacterias que se encuentran en individuos que nunca han padecido caries, incluidas las bacterias no cultivables, así como por compuestos antimicrobianos, tipo defensinas, por ejemplo, sintetizados por los propios individuos. Dichos péptidos se ensayan para determinar su actividad inhibitoria sobre el crecimiento de bacterias cariogénicas, como por ejemplo, S. mutans o de S. sobrinus. Otro aspecto de la presente invención describe diferentes cepas bacterianas cultivables específicas, CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773, CECT 7774 y CECT 7775, aisladas de individuos con excelente salud oral y que nunca han sufrido caries, caracterizadas por presentar actividad inhibitoria frente a organismos productores de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente frente a microorganismos productores de caries. A partir del metagenoma de las bacterias existentes en la placa dental de individuos que nunca habían padecido caries, se identificaron, por homología con las librerías de ADN bacterianos existentes, los géneros y especies de bacterias que aparecían con más frecuencia en individuos sanos que nunca habían padecido caries. Las bacterias que aparecieron con más frecuencia en individuos sin caries y que aparecían ausentes o en muy baja frecuencia en individuos con caries pertenecían a alguno de los siguientes géneros: Rothia, Globicatella, Johnsonella, Kingella, Cardiobacterium, Phocoenobacter, Mannheimia, Haemophilus, Neissería, Streptococcus y Aggregatibacter; siendo el género Streptococcus de los más abundantes. En este sentido, las cepas bacterianas preferidas de la invención son las cepas CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 y CECT 7775, todas ellas pertenecientes al género Streptococcus.

En otro de los aspectos descritos en la presente invención se describen compuestos bioactivos, preferentemente péptidos, inhibidores del crecimiento de organismos productores de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente frente a microorganismos productores de caries. En concreto se describen péptidos codificados por secuencias de ADN comprendidas en algunos de los siguientes insertos de fósmidos con actividad inhibitoria frente a organismos productores de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente frente a microorganismos productores de caries: SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14.

Más específicamente, los péptidos codificados por las secuencias de ADN 5 comprendidas en los insertos de los fósmidos con actividad inhibitoria frente a organismos productores de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5, se caracterizan porque son de origen bacteriano y con características similares a las bacteriocinas. De igual manera, los péptidos codificados por las secuencias de ADN comprendidas en los insertos de los fósmidos con actividad inhibitoria í o frente a organismos productores de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal: SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO: 14, se caracterizan porque son de origen humano y con características similares a las defensinas

Más específicamente, la invención describe 2 péptidos concretos: SEQ ID NO:8 , un 15 péptido antimicrobiano de origen humano con características similares a las defensinas; SEQ ID NO:9, un péptido de origen bacteriano con características similares a las bacteriocinas.

La invención describe, asimismo, composiciones de aseo bucal, sólidas, pulverulentas (para su ingesta directa o disueltas) o pastosas, tipo dentífricos, chicles, caramelos, tabletas,

20 etc .. o soluciones líquidas de enjuague bucal, tales como colutorios, jarabes, bebidas, etc .. o composiciones probióticas y/o prebióticas de alimentos que comprendan en su composición bien las cepas y/o bien los compuestos, preferentemente péptidos, de la invención, con actividad inhibitoria frente a organismos productores de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente frente a microorganismos productores de caries. En una

25 realización preferida de la invención, las cepas y/o los péptidos de la invención se añaden a composiciones que presentan actividad antimicrobiana para la flora de la cavidad bucal y que pueden encontrarse comercialmente, tipo colutorios como el Listerine®, mostrando dichos colutorios un efecto mejorado en su actividad inhibitoria frente a organismos productores de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente frente a microorganismos

30 productores de caries, al añadirse en su composición las cepas y/o los péptidos de la invención. Una realización preferida de la invención lo constituyen probióticos/prebióticos o los alimentos funcionales, que comprenden en su composición las cepas y/o los compuestos, preferentemente péptidos, de la invención, con actividad inhibitoria frente a organismos productores de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente frente a microorganismos productores de caries. Dentro del concepto de probiótico o de alimento funcional, se pueden citar, de forma no limitativa: productos lácteos, tales como yogures, por ejemplo, zumos, alimentos sólidos, tipo dulces, por ejemplo, así como infusiones, productos de herboristería y para-farmacia, tales como complejos vitamínicos, con suplementos nutricionales, etc....

A efectos de la presente invención se hacen constar los siguientes términos:

Enfermedad infecciosa de la cavidad bucal: a efectos de la presente invención las enfermedades infecciosas de la cavidad bucal son preferentemente caries, periodontitis, gingivitis y halitosis.

Probióticos: a efectos de la presente invención el término probiótico se refiere a la utilización de microorganismos vivos que se adicionan a alimentos (leche, yogures, etc), suplementos dietéticos (en forma de cápsulas, tabletas, pastillas, polvo, etc) u otros, permaneciendo activos y ejerciendo sus efectos fisiológicos en el sujeto que ingiere el alimento o similar que contiene dicho probiótico. Ingeridos en cantidades suficientes tienen efectos beneficiosos, en este caso, sobre la salud bucal.

Prebióticos: a efectos de la presente invención el término prebiótico se refiere a la utilización de sustancias que se adicionan a alimentos, chicles, o suplementos dietéticos u otros, que ejercen un efecto en la composición de la microbiota oral favoreciendo el establecimiento de bacterias beneficiosas para la salud oral y/o desfavoreciendo el establecimiento de bacterias patógenas.

Meta enoma: representa los genomas de todas las bacterias que se encuentran presentes en una muestra, en un individuo o en un ecosistema, etc.

Microbioma: es el conjunto de microbios o bacterias que conviven con el ser humano.

Compuestos bioactivos antimicrobianos: son compuestos tales como péptidos, proteínas, antibióticos, pigmentos, etc... biológicamente activos que se encuentran en vertebrados e invertebrados y funcionan como antibióticos naturales, formando parte de la respuesta inmune innata. Algunos de estos compuestos, por ejemplo péptidos, son producidos por el ser humano, como por ejemplo las defensinas y las catelicidinas, entre otros. Son activos contra bacterias, hongos y virus enclaustrados.

Bacteriocinas: son péptidos biológicamente activos secretados por bacterias que tienen propiedades bactericidas contra otras especies estrechamente relacionadas con la cepa productora, o contra cepas distanciadas filogenéticamente de la cepa productora.

Fósmidos: fragmentos de ADN circulares que pueden ser introducidos fácilmente en las células hospedadoras, generalmente bacterianas y transportar fragmentos de ADN bacteriano o humano.

Alimentos funcionales: se definen como aquellos alimentos que son elaborados no sólo por sus características nutricionales sino también para cumplir una función específica como puede ser el mejorar la salud y reducir el riesgo de contraer enfermedades. Para ello se les agregan componentes biológicamente activos, como minerales, vitaminas, ácidos grasos, bacterias con efecto beneficioso, fibra alimenticia o antioxidantes, etc.

Cepas bacterianas cultivables: se consideran cepas bacterianas cultivables aquellas que crecen en cultivo puro y se mantienen en crecimiento de forma estable, en un medio de cultivo artificial de laboratorio bajo condiciones estándar de aerobiosis o anaerobiosis.

Descripción de las figuras

Figura 1. A. Fotografía de una placa de cultivo petri donde se muestra el cribado inicial de los clones de E.coli que contienen los fósmidos procedentes de ADN de placa dental de individuos sin caries y que producen halos de inhibición sobre un cultivo en césped de S. mutans. B. Fotografía de una placa de cultivo petri dónde se muestra el cribado de confirmación de los clones de E.coli que contienen los fósmidos procedentes de ADN de placa dental de individuos sin caries y que habían producido halos de inhibición en un cultivo en césped de S. mutans. Figura 2. Curvas de crecimiento de la bacteria cariogénica S. mutans (control positivo, sin adición del inhibidor de cariogénesis, ejemplificado en la gráfica como una línea continua) en medio HBI (infusión cerebro-corazón), y en medio HBI enriquecido con 100 ul (línea punteada), 150 ul (línea con trazos cortos), 200 ul (línea con trazo cortos y punto), 300 ul (línea con trazos largos) o 400 ul (línea con trazos largos y dos puntos) de la fracción de 3-10 kD del sobrenadante concentrado producido por cultivos de 1.5, 2.25, 3.0, 4.5 y 6 mi respectivamente, de células portadoras del fósmido S12E que contienen el péptido antimicrobiano de origen bacteriano tipo bacteriocina de la invención. Los datos, tomados cada media hora durante 19 horas, muestran la media de 3 experimentos. En el eje X de la gráfica se muestra el tiempo expresado en horas y en el eje Y la densidad óptica (DO) de los cultivos bacterianos.

5 Figura 3. Curvas de crecimiento de la bacteria cariogénica S. mutans en medio HBI (línea continua, control positivo sin adición de inhibidor de cariogénesis) y en medio HBI con 50 ul (línea con trazos) y 100 ul (línea punteada) de la fracción de 0-3 kD del sobrenadante concentrado producido por cultivos de 2 y 4 mi respectivamente de células portadoras del fósmido T5A que contiene el péptido antimicrobiano de origen humano tipo defensina de la í o invención. Los datos, tomados cada media hora durante 12 h, muestran la media de 3 experimentos. En el eje X de la gráfica se muestra el tiempo expresado en horas y en el eje Y la densidad óptica (DO) de los cultivos bacterianos.

Figura 4. Curvas de crecimiento de la bacteria cariogénica S. mutans en presencia de Listerine® y del inhibidor S12E de origen bacteriano. Los datos se tomaron durante 19 horas a

15 una temperatura de 37°C en medio de cultivo HBI y representan la media de 3 experimentos.

La línea continua representa el control negativo sin bacterias. La línea con trazos cortos representa el control positivo, crecimiento de S. mutans en ausencia de Listerine® y del inhibidor S12E. La línea de trazos largos representa el crecimiento de S. mutans en presencia de 100 ul de Listerine®. La línea punteada representa el crecimiento de S. mutans en

20 presencia de 100 ul del inhibidor S12E. La línea de trazos cortos y puntos representa el crecimiento de S. mutans en presencia de 100 ul de Listerine® + 100 ul del inhibidor S12E. En el eje X de la gráfica se muestra el tiempo expresado en horas y en el eje Y (DO) la densidad óptica de los cultivos bacterianos.

Figura 5. Curvas de crecimiento de la bacteria cariogénica S. mutans en presencia del 25 inhibidor S12E (péptido antimicrobiano de origen bacteriano tipo bacteriocina de la invención) sintetizado químicamente en el laboratorio y resuspendido en TCA al 0.1%. Los datos muestran el crecimiento de S. mutans, medido como la absorbancia a 600 nm, durante 30 minutos, a lo largo de 30 horas a una temperatura de 37 °C en 100 ul de medio de cultivo HBI, de tres experimentos independientes. La línea continua representa el control negativo, sin 30 bacterias. La línea con cuadros negros representa el crecimiento de S. mutans en medio de cultivo HBI. La línea punteada representa el control positivo, crecimiento de S. mutans en medio de cultivo HBI en presencia de 10 ul de TCA al 0.1%. La línea de trazos cortos y puntos representa el crecimiento de S. mutans en medio de cultivo HBI en presencia de de 0.3 mg de péptido S12E resuspendido en 10 ul de TCA al 0.1%. La línea de trazos cortos representa el crecimiento de S. mutans en medio de cultivo HBI en presencia de de 0.03 mg de péptido S12E resuspendido en 10 ul de TCA al 0.1%. En el eje X de la gráfica se muestra el tiempo 5 expresado en horas y en el eje Y la densidad óptica (DO) de los cultivos bacterianos.

Figura 6. Curvas de crecimiento de la bacteria cariogénica S. mutans (A) y S. sobrinus (B) en presencia del Inhibidor S12E (péptido antimicrobiano de origen bacteriano tipo bacteriocina de la invención) sintetizado químicamente en el laboratorio y resuspendido en agua ultrapura. Los datos muestran el crecimiento de S. mutans, medido como la absorbancia a 600 nm, durante í o 30 minutos, a lo largo de 48 horas a una temperatura de 37 °C en 200 ul de medio de cultivo HBI, siendo la media de tres experimentos independientes. Tanto el la gráfica A como en la B, las líneas continuas representan el control negativo, sin bacterias; las líneas punteadas representan el crecimiento de S. mutans (A) o S. sobrinus (B) en medio de cultivo HBI. La línea de trazos cortos representa el control positivo, crecimiento de S. mutans (A) o S. sobrinus

15 (B) en medio de cultivo HBI en presencia de agua. La línea de cuadros negros representa el crecimiento de S. mutans (A) o S. sobrinus (B) en medio de cultivo HBI en presencia de de 0.23 mg de péptido S12E de la invención, resuspendido en agua ultrapura. La línea de rombos negros representa el crecimiento de S. mutans (A) o S. sobrinus (B) en medio de cultivo HBI en presencia de de 0.047 mg de péptido S12E de la invención, resuspendido en agua

20 ultrapura. La línea de triángulos negros representa el crecimiento de S. mutans (A) o S. sobrinus (B) en medio de cultivo HBI en presencia de de 0.094 mg de péptido S12E de la invención, resuspendido en agua ultrapura. En el eje X de la gráfica se muestra el tiempo expresado en horas y en el eje Y la densidad óptica (DO) de los cultivos bacterianos.

Figura 7. Curvas de crecimiento de la bacteria cariogénica S. mutans en presencia de 4 ug, 40

25 ug y 80 ug del inhibidor T5A de la invención, sintetizado químicamente en laboratorio y resuspendido en agua ultrapura. Los datos muestran el crecimiento de S. mutans, medido como la absorbancia a 600 nm, durante 30 minutos, a lo largo de 44 horas a una temperatura de 37 °C en 200 ul de medio de cultivo HBI, siendo la media de tres experimentos independientes. La línea continua representa el control negativo, sin células. La línea de trazos

30 cortos representa el crecimiento de S. mutans en medio de cultivo HBI (control positivo) con agua ultrapura. La línea de cuadros negros representa el crecimiento de S. mutans en medio de cultivo HBI en presencia de 1 ul del péptido T5A de la invención (péptido antimicrobiano de origen humano tipo defensina). La línea de rombos negros representa el crecimiento de S. mutans en medio de cultivo HBI en presencia de de 10 ul del péptido T5A de la invención. La línea de triángulos negros representa el crecimiento de S. mutans en medio de cultivo HBI en presencia de de 20 ul de péptido T5A de la invención. En el eje X de la gráfica se muestra el 5 tiempo expresado en horas y en el eje Y la densidad óptica (DO) de los cultivos bacterianos.

Figura 8. Curvas de crecimiento de la bacteria cariogénica S. mutans en medio de cultivo líquido en presencia de los sobrenadantes concentrados 10 veces y aislados en función de su peso molecular producido por cultivos de células bacterianas E. coli portadoras del fósmido W4D que comprende la secuencia polinucleotídica SEQ ID NO: 13 que codifica para un í o péptido antimicrobiano de origen humano, tipo defensina, de la invención. Los datos, tomados cada media hora durante 24 h, muestran la media de 3 experimentos. Como control se muestra la curva de crecimiento de S. mutans en presencia del sobrenadante concentrado de un cultivo de bacterias E. coli ep¡300 sin transformar. En el eje X de la gráfica se muestra el tiempo expresado en horas y en el eje Y la densidad óptica (DO) de los cultivos bacterianos.

15 Figura 9. Curvas de crecimiento de la bacteria cariogénica S. mutans en medio de cultivo líquido en presencia de los sobrenadantes concentrados 10 veces y aislados en función de su peso molecular y producidos por cultivos de células bacterianas E. coli portadoras del fósmido T5H que comprende la secuencia polinucleotídica SEQ ID NO: 14 que codifica para el péptido antimicrobiano de origen humano tipo defensina de la invención. Los datos, tomados cada

20 media hora durante 24 h, muestran la media de 3 experimentos. Como control se muestra la curva de crecimiento de S. mutans en presencia del sobrenadante concentrado de un cultivo de bacterias E. coli ep¡300 sin transformar. En el eje X de la gráfica se muestra el tiempo expresado en horas y en el eje Y la densidad óptica (DO) de los cultivos bacterianos.

Figura 10. Curvas de crecimiento de la bacteria cariogénica S. mutans en medio de cultivo

25 líquido en presencia de los sobrenadantes concentrados 10 veces y aislados en función de su peso molecular y producidos por cultivos de células bacterianas E. coli portadoras del fósmido A5D1 1 que comprende la secuencia polinucleotídica SEQ ID NO: 6 que codifica para el péptido antimicrobiano de origen humano tipo defensina de la invención. Los datos, tomados cada media hora durante 24 h, muestran la media de 3 experimentos. Como control se

30 muestra la curva de crecimiento de S. mutans en presencia del sobrenadante concentrado de un cultivo de bacterias E. coli ep¡300 sin transformar. En el eje X de la gráfica se muestra el tiempo expresado en horas y en el eje Y la densidad óptica (DO) de los cultivos bacterianos. Figura 11. Curvas de crecimiento de la bacteria cariogénica S. mutans en medio de cultivo líquido en presencia de los sobrenadantes concentrados 10 vecesy aislados en función de su peso molecular y producidos por cultivos de células bacterianas E. coli portadoras del fósmido A4H11 que comprende la secuencia polinucleotídica SEQ ID NO: 7 que codifica para el 5 péptido antimicrobiano de origen humano tipo defensina de la invención. Los datos, tomados cada media hora durante 24 h, muestran la media de 3 experimentos. Como control se muestra la curva de crecimiento de S. mutans en presencia del sobrenadante concentrado de un cultivo de bacterias E. coli ep¡300 sin transformar. En el eje X de la gráfica se muestra el tiempo expresado en horas y en el eje Y la densidad óptica (DO) de los cultivos bacterianos. í o Figura 12. Fotografías de placas petri que demuestran la inhibición del crecimiento de cultivos en césped de S. mutans en presencia de los aislados de las cepas CECT 7746 (A), CECT 7747 (B), CECT 7773 (C), CECT 7774 (D) y CECT 7775 (E) descritas en la invención.

Figura 13. Fotografías de placas petri que demuestran la inhibición del crecimiento de cultivos en césped de S. sobrínus en presencia de los aislados de las cepas CECT 7746 (A), CECT

15 7747 (B) y CECT 7775 (C) descritas en la invención.

Figura 14. Curvas de crecimiento de la bacteria cariogénica S. mutans en medio de cultivo HBI en presencia de los sobrenadantes concentrados 10 veces y aislados en función de su peso molecular obtenidos de cultivos de las cepas CECT 7746 (A) y CECT 7747 (B) en fase estacionaria. Los datos, tomados cada 15 minutos durante 20 h, muestran la media de 4

20 experimentos. La línea marcada como antb representa el tratamiento con el antibiótico cloranfenicol (control positivo). En el eje X de la gráfica se muestra el tiempo expresado en horas y en el eje Y la densidad óptica (DO) de los cultivos bacterianos.

Figura 15. Curvas de crecimiento de la bacteria cariogénica S. mutans en medio de cultivo HBI en presencia de los sobrenadantes concentrados 10 veces y aislados en función de su peso

25 molecular obtenidos de cultivos de la cepa CECT 7746 en fase estacionaria (est) y exponencial (EXP). Los datos, tomados cada 15 minutos durante 24 h, muestran la media de 4 experimentos. La línea marcada como clorf representa el tratamiento con el antibiótico cloranfenicol (control positivo). En el eje X de la gráfica se muestra el tiempo expresado en horas y en el eje Y la densidad óptica (DO) de los cultivos bacterianos.

30 Figura 16. Curvas de crecimiento de la bacteria cariogénica S. mutans en medio de cultivo HBI en presencia del sobrenadante concentrado 10 veces y menor de 3 KDa obtenido de cultivos de la cepa CECT 7746 (A) y CECT 7747 (B) y sometido a un tratamiento a 100°C durante 10 minutos. Los datos, tomados cada 15 minutos durante 24 h , muestran la media de 4 experimentos. En el eje X de la gráfica se muestra el tiempo expresado en horas y en el eje Y la densidad óptica (DO) de los cultivos bacterianos.

Figura 17. Fotografías de placas petri que demuestran la inhibición del crecimiento de cultivos 5 en césped de S. mutans en presencia de los sobrenadantes de cultivos de las cepas CECT

7746 (mostrado como 46 en la fotografía) y CECT 7747 (mostrado como 47 en la fotografía) en condiciones de aerobiosis y anaerobiosis.

Figura 18. Concentración de ácido láctico expresada en mM producida por el biofilm procedente del cultivo de saliva humana en un modelo de diente artificial en condiciones de í o aerobiosis y anaerobiosis, al que se ha añadido las cepas bacterianas CECT 7746 y CECT

7747 o sus respectivos sobrenadantes. Para mayor detalle ver Ejemplo 15. Como control negativo se utilizó la cepa C7.1 , que es un aislado perteneciente a las especies del grupo Streptococcus mitis/oralis/infantis, obtenido de un individuo sin caries pero que no produce inhibición del crecimiento de especies cariogénicas.

15

Descripción detallada de la invención

Un objeto de la presente invención lo constituye una cepa bacteriana antimicrobiana cultivable seleccionada entre cualquiera de las siguientes: CECT 7746, CECT 7747, CECT

20 7773, CECT 7774 y CECT 7775. En una realización preferida, las cepas bacterianas de la invención se caracterizan por pertenecer al género Streptococcus, seleccionadas entre: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 o CECT 7775. En otra realización preferida, las cepas bacterianas antimicrobianas descritas en la invención, presentan actividad inhibitoria del crecimiento de los organismos productores de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, 25 preferentemente, de los organismos productores de caries. En una realización preferida, las cepas de la invención se caracterizan por que además de crecer de forma competitiva para ocupar el diente, son capaces de producir sustancias inhibidoras del crecimiento de las bacterias cariogénicas.

3 o Otro objeto de la presente invención se refiere a las cepas bacterianas antimicrobianas cultivables seleccionadas entre cualquiera de las siguientes: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773, CECT 7774 y CECT 7775, o una combinación de las mismas, para ser usadas como medicamento. En una realización preferida, las cepas bacterianas antimicrobianas descritas en la invención, se caracterizan por pertenecer al género Streptococcus y se seleccionan de entre: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 o CECT 7775.

5 Otro objeto de la presente invención se refiere al uso de al menos una de las cepas bacterianas antimicrobianas cultivables seleccionadas entre cualquiera de las siguientes: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773, CECT 7774 y CECT 7775, o una combinación de las mismas, en la fabricación de un medicamento. En una realización preferida, dicho uso se caracteriza por que la cepa bacterianas pertenece al género Streptococcus, seleccionada de o entre: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 o CECT 7775.

Otro objeto de la presente invención hace referencia a una cepa bacteriana antimicrobiana cultivable seleccionada entre cualquiera de las siguientes: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773, CECT 7774 y CECT 7775, o una combinación de las mismas, para ser5 usada como agente anti-microbiano, preferentemente como agente anti-bacteriano. En una realización preferida, la cepa bacteriana antimicrobiana se caracterizada por pertenecer al género Streptococcus y seleccionarse de entre: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 o CECT 7775. o Otro objeto de la presente invención se refiere al uso de al menos una de las cepas bacterianas antimicrobianas cultivables seleccionadas entre cualquiera de las siguientes: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773, CECT 7774 y CECT 7775, o una combinación de las mismas, en la fabricación de una composición anti-microbiana, preferentemente de una composición anti-bacteriana. En una realización preferida, dicho uso se caracteriza por que la5 cepa bacteriana pertenece al género Streptococcus y se selecciona de entre: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 o CECT 7775.

Otro objeto de la presente invención hace referencia a una cepa bacteriana antimicrobiana cultivable seleccionada entre cualquiera de las siguientes: CECT 7746, CECT0 7747, CECT 7773, CECT 7774 y CECT 7775, o una combinación de las mismas, para ser usada en el tratamiento de las enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente en el tratamiento de la caries. En una realización preferida, la cepa bacteriana de la invención se caracteriza por pertenecer al género Streptococcus y seleccionarse de entre: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 o CECT 7775.

Otro objeto de la presente invención se refiere al uso de al menos una de las cepas 5 bacterianas antimicrobianas cultivables seleccionadas entre cualquiera de las siguientes:

CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773, CECT 7774 y CECT 7775, o una combinación de las mismas, para la elaboración de una composición destinada al tratamiento de las enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente para el tratamiento de la caries. En una realización preferida, el uso de las cepas de la invención se caracteriza por que la cepa i o bacteriana cultivable pertenece al género Streptococcus y se selecciona de entre: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 o CECT 7775.

Otro de los objetos de la presente invención se refiere a las cepas bacterianas antimicrobianas cultivables seleccionadas entre cualquiera de las siguientes: CECT 7746, 15 CECT 7747, CECT 7773, CECT 7774 y CECT 7775, o una combinación de las mismas, para ser usadas como probiótico o alimento funcional destinado a mejorar la salud bucal , preferentemente a prevenir la caries. En una realización preferida, las cepas de la invención se caracterizan por pertenecer al género Streptococcus, seleccionada entre: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 o CECT 7775.

20

Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere al uso de al menos una de las cepas bacterianas antimicrobianas cultivables seleccionadas entre cualquiera de las siguientes: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773, CECT 7774 y CECT 7775, o una combinación de las mismas, para la elaboración de un probiótico, o de un alimento funcional 25 destinado a mejorar la salud bucal, preferentemente a prevenir la caries. En una realización preferida, el uso de al menos una de las cepas bacterianas mencionadas anteriormente, se caracteriza dichas cepas pertenecen al género Streptococcus y se seleccionan de entre: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 o CECT 7775.

30 Otro objeto descrito en la presente invención hace referencia a una composición probiótica/prebiótica o alimento funcional que comprende al menos una cepa antimicrobiana cultivable según se ha mencionado a lo largo de la presente invención, así como las sustancias, compuestos o moléculas anti-cariogénicas secretadas por dichas cepas.

Otro objeto descrito en la presente invención hace referencia a una composición 5 médico-farmacéutica o composición para la salud bucal que comprende al menos una cepa antimicrobiana cultivable según se ha descrito a lo largo de la presente invención o las sustancias, compuestos o moléculas anti-cariogénicas secretadas por dichas cepas.

Otro de los objetos descritos en la presente invención hace referencia a un compuesto í o antimicrobiano que comprende la SEQ ID NO: 9 o a un compuesto antimicrobiano codificado por una secuencia de ADN que comprende cualquiera de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 14.

Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere a un compuesto 15 antimicrobiano que consiste en la SEQ ID NO: 9 o a un compuesto antimicrobiano codificado por una secuencia de ADN que consiste en cualquiera de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 14. En una realización preferida de la invención, los compuestos antimicrobianos descritos anteriormente presentan actividad inhibitoria del crecimiento de los organismos productores de enfermedades 2 o infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente, de los organismos productores de caries. En otra realización preferida, dichos compuestos antimicrobianos son péptidos.

Otro de los objetos de la presente invención se refiere a los compuestos antimicrobianos mencionados en los párrafos previos, o a una combinación de los mismos, 25 para ser usados como medicamento.

Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere al uso de al menos un compuesto antimicrobiano según se ha descrito previamente, o una combinación de los mismos, en la fabricación de un medicamento.

30

Otro de los objetos de la presente invención se refiere a los compuestos antimicrobianos descritos previamente, o a una combinación de los mismos, para ser usados en la fabricación de una composición anti-microbiana, preferentemente de una composición anti-bacteriana.

Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere al uso de al menos un compuesto antimicrobiano según se ha descrito previamente, o una combinación de los mismos, en la fabricación de una composición anti-microbiana, preferentemente de una composición anti-bacteriana.

Otro de los objetos de la presente invención se refiere a los compuestos antimicrobianos descritos previamente, o a una combinación de los mismos, para ser usado en el tratamiento de las enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente en el tratamiento de la caries.

Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere al uso de al menos un compuesto antimicrobiano según se ha descrito previamente, o una combinación de los mismos, para la elaboración de una composición destinada al tratamiento de las enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente de una composición anti-caries.

Otro de los o bjetos de la presente i nvención se refiere a los compuestos antimicrobianos mencionados previamente, en la presente invención, para ser usados como prebiótico o alimento funcional destinado a mejorar la salud bucal, preferentemente a prevenir la caries.

Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere al uso de al menos un compuesto antimicrobiano según se ha descrito previamente, o una combinación de los mismos, en la elaboración de un prebiótico o de un alimento funcional destinado a mejorar la salud bucal, preferentemente a prevenir la caries,

Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere a una composición probiótica/prebiótica o alimento funcional que comprende al menos un compuesto antimicrobiano según se ha descrito a lo largo de la presente invención. Otro de los objetos descritos en la presente invención hace referencia a una composición médico-farmacéutica o composición para la salud bucal que comprende al menos un compuesto antimicrobiano según se ha descrito a lo largo de la presente invención.

5 Otro de los objetos descritos en la presente invención, hace referencia a un compuesto antimicrobiano que comprende la secuencia SEQ ID NO: 8 o compuesto antimicrobiano codificado por una secuencia de ADN que comprende cualquiera de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5. i o Otro objeto descrito en la presente invención se refiere a un compuesto antimicrobiano que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 8 o a un compuesto antimicrobiano codificado por una secuencia de ADN que consiste en cualquiera de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5. En una realización preferida, dichos compuestos antimicrobianos presentan actividad inhibitoria del crecimiento de los organismos

15 productores de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente, de los organismos productores de caries. En otra realización preferida, los compuestos antimicrobianos descritos previamente se caracterizan por ser péptidos. En otra realización preferida, los compuestos antimicrobianos descritos previamente se caracterizan por que inhiben la producción de ácido, preferentemente de ácido láctico, en la cavidad bucal.

20

Otro objeto descrito en la presente invención hace referencia a un compuesto antimicrobiano según se describe anteriormente, o a una combinación de los mismos, para ser usado como medicamento.

25 Otro objeto de la presente invención se refiere al uso de al menos un compuesto antimicrobiano según se describe en la presente invención, o a una combinación de los mismos, en la fabricación de un medicamento.

Otro objeto de la presente invención se refiere a un compuesto antimicrobiano según 30 se ha mencionado anteriormente, o una combinación de los mismos, para ser usado en la fabricación de una composición anti-microbiana, preferentemente de una composición antibacteriana. Otro objeto de la presente invención hace referencia al uso de al menos un compuesto antimicrobiano según se describe previamente, o a una combinación de los mismos, en la fabricación de una composición anti-microbiana, preferentemente de una composición antibacteriana.

Otro objeto descrito en la presente invención se refiere a un compuesto antimicrobiano, según se ha descrito previamente, o a una combinación de los mismos, para ser usado en el tratamiento de las enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente en el tratamiento de la caries.

Otro objeto descrito en la presente invención se refiere al uso al menos un compuesto antimicrobiano según se describe previamente, o a una combinación de los mismos, para la elaboración de una composición destinada al tratamiento de las enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente de una composición anti-caries.

Otro de los objetos de la presente invención se refiere a los compuestos antimicrobianos según se describe previamente, o a una combinación de los mismos, para ser usados como prebióticos o alimentos funcionales destinados a mejorar la salud bucal , preferentemente a prevenir la caries.

Otro objeto descrito en la presente invención se refiere al uso al menos un compuesto antimicrobiano según se describe previamente, o a una combinación de los mismos, en la elaboración de un prebiótico o de un alimento funcional destinado a mejorar la salud bucal, preferentemente a prevenir la caries.

Otro objeto descrito en la presente invención hace referencia a una composición probiótica/prebiótica o alimento funcional que comprende al menos un compuesto antimicrobiano según se describe en la presente invención. Otro de los objetos descritos en la presente invención hace referencia a una composición médico-farmacéutica o composición para la salud bucal que comprende al menos un compuesto antimicrobiano según se describe en la presente invención. Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere a un procedimiento de aislamiento de cepas bacterianas antimicrobianas cultivables, preferentemente con actividad inhibitoria del crecimiento de los organismos productores de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal y más preferentemente, de los organismos productores de la caries, caracterizado por comprender:

a) Obtener muestras de la placa dental supragingival de individuos que nunca han padecido caries.

b) Sembrar las muestras en medios y condiciones adecuadas para crecer y aislar solo las bacterias que son más frecuentes en individuos que nunca hayan padecido caries, estimando éstas mediante la pirosecuenciación del metagenoma.

c) Cultivar las cepas aisladas en un medio de crecimiento para bacterias cariogénicas y seleccionar, al cabo de un periodo de tiempo de cultivo apropiado, aquellas cepas que presenten halos de inhibición de dicho crecimiento.

En una realización preferida, el procedimiento descrito anteriormente se caracteriza por que en la etapa b) las bacterias más frecuentes en individuos que nunca han padecido caries se estiman mediante procedimientos de pirosecuenciación del metagenoma, técnica que permite estimar las proporciones de cada especie bacteriana. En otra realización preferida, el procedimiento descrito anteriormente se caracteriza por que en la etapa c) se seleccionan preferentemente bacterias pertenecientes a los géneros: Streptococcus, Rothia, Neisseria, Globicatella, Johnsonella, Haemophilus, Kingella, Cardiobacterium, Mannheimia, Phocoenobacter y Aggregatibacter. Específicamente se seleccionan las cepas: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773, CECT 7774 y CECT 7775. Más específicamente se seleccionan bacterias pertenecientes al género Streptococcus, preferentemente pertenecientes a las especies: S. sanguis, S. oralis, S. mitis, S. infantis o especies nuevas no descritas pero pertenecientes al subgrupo de Streptococcus donde se engloban estas cuatro especies. Más específicamente se selecciona al menos una cepa bacteriana antimicrobiana de entre: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 o CECT 7775. Otro objeto descrito en la presente invención hace referencia a un método de prevención y/o tratamiento de enfermedades infecciosas, preferentemente de la cavidad bucal y más preferentemente de la caries, que comprende la administración de una cantidad eficaz para inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos, preferentemente microorganismos cariogénicos, presentes habitualmente en dicha cavidad, de al menos una de las cepas antimicrobianas cultivables descritas en la presente invención; o de la composición probiótica/prebiótica o de los alimentos funcionales descritos en la presente invención que comprendan dichas cepas; o de la composición médico-farmacéutica o de la composición para la salud bucal descrita en la presente invención que comprendan dichas cepas.

Otro objeto de la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de compuestos antimicrobianos, preferentemente con actividad inhibitoria del crecimiento de los organismos productores de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal y, más preferentemente, de los organismos productores de la caries, caracterizado por comprender:

a) Obtener muestras de la placa dental supragingival de individuos que nunca han padecido caries.

b) Lisar dichas muestras y extraer de las mismas ADN genómico íntegro.

c) Elaborar a partir del ADN extraído restante una librería metagenómica de vectores, preferentemente plásmidos o fósmidos, capaces de ser insertados y expresar el ADN extraído que portan, en una célula hospedadora.

d) Insertar los vectores en una célula hospedadora.

e) Sembrar los clones de células hospedadoras que contienen los vectores, en un cultivo con microorganismos productores de caries y seleccionar, al cabo de un periodo de cultivo apropiado, aquellos clones que presenten halos de inhibición de crecimiento.

f) Secuenciar el ADN de los vectores de los clones que muestren actividad inhibitoria, sintetizando y/o purificando el compuesto codificado por dicho ADN.

En una realización preferida, el procedimiento descrito previamente se caracteriza por que la concentración de ADN extraído es al menos de 300 g/ml. En otra realización preferida, dicho procedimiento se caracteriza por que tras el proceso de extracción de ADN se construyen fósmidos que contienen ADN con un rango de tamaño comprendido preferentemente entre 35 y 45 kb. En otra realización preferida, dichos fósmidos contienen ADN con un tamaño inferior a 1 kb. En otra realización preferida, dicho procedimiento se caracteriza por que la célula hospedadora donde se insertan los fósmidos es E. coli.

En otra realización preferida, dicho procedimiento se caracteriza por que el cultivo del 5 microorganismo sobre el que se siembran los clones con los insertos de ADN contenidos en los fósmidos, es de una bacteria cariogénica, preferentemente S. mutans o S. sobrinus. En otra realización preferida, dicho procedimiento se caracteriza por que la secuencia de ADN de los fósmidos se selecciona entre secuencias que comprenden: SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID i o NO: 14, o combinaciones de las mismas. En otra realización preferida, dicho procedimiento se caracteriza por que la secuencia de ADN de los fósmidos se selecciona entre secuencias que consisten en: SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, o combinaciones de las mismas.

En otra realización preferida, dicho procedimiento se caracteriza por que se obtiene al

15 menos un péptido antimicrobiano que comprende una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:9, o un compuesto antimicrobiano codificado por una secuencia de ADN que comprende cualquiera de las siguientes: SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14. En otra realización preferida, dicho procedimiento se caracteriza por que se obtiene al menos un

2 o péptido antimicrobiano que consiste en una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:9, o un compuesto antimicrobiano codificado por una secuencia de ADN que consiste en cualquiera de las siguientes: SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14.

En otra realización preferida, las secuencias de ADN de los fósmidos SEQ ID NO: 1 ,

25 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 y el péptido antimicrobiano con SEQ ID NO: 8 son de origen bacteriano, preferentemente bacteriocinas. En otra realización preferida, las secuencias de ADN de los fósmidos SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5 son de origen humano, preferentemente defensinas/catelicidinas.

30 Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere a un método de prevención y/o tratamiento de enfermedades infecciosas, preferentemente de la cavidad bucal y más preferentemente de la caries, que comprende la administración de una cantidad eficaz para inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos presentes habitualmente en dicha cavidad, de al menos un compuesto antimicrobiano según se describe a lo largo de la presente invención; o de la composición probiótica/prebiótica o de los alimentos funcionales que comprenden al menos uno de los compuestos antimicrobianos descritos en la presente invención, o de la composición médico-farmacéutica o de la composición para la salud bucal que comprende al menos uno de los compuestos antimicrobianos descritos en la presente invención.

Depósito de microorganismos según el tratado de Budapest

Los microorganismos utilizados en la presente invención fueron depositados en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) sita en el Edificio de Investigación de la Universidad de Valencia, Campus Burjassot, Burjassot 46100 (Valencia, España), con n° de depósito:

· CECT 7746: cepa bacteriana del género Streptococcus depositada el 7 de Junio de 2010.

• CECT 7747: cepa bacteriana del género Streptococcus depositada el 7 de Junio de 2010.

• CECT 7773: cepa bacteriana del género Streptococcus depositada el 22 de Julio de 2010.

• CECT 7774: cepa bacteriana del género Rothia depositada el 22 de Julio de 2010

• CECT 7775: cepa bacteriana del género Streptococcus depositada el 22 de Julio de 2010.

Los ejemplos que se detallan a continuación tienen como objetivo ilustrar la invención sin limitar el alcance de la misma.

Ejemplo 1. Obtención del metagenoma de placa dental supragingival.

En primer lugar se procedió a la toma de muestras de placa dental supragingival de voluntarios que nunca han padecido caries, así como, a efectos comparativos, también de las mismas muestras de voluntarios que habían padecido caries anteriormente y de voluntarios que padecen caries y que además presentan lesiones en dichas caries, después de firmar el consentimiento informado. El procedimiento de muestreo fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Clínica de la Dirección General de la Salud Pública de la Generalitat Valenciana (GSP-CSISP). El estado de salud bucal de cada voluntario fue evaluado por un dentista siguiendo las recomendaciones y la nomenclatura de los Estudios de Salud Bucal de 5 la Organización Mundial de la Salud (OMS), y las muestras fueron tomadas con sondas estériles. Se pidió a los voluntarios que no se cepillaran los dientes 24 horas antes de la toma de muestras.

Para estudiar la diversidad microbiana en la placa dental y obtener su metagenoma, el material recogido de la placa de las superficies de todos los dientes de cada individuo fue o mezclado para posteriormente proceder a su lisis y obtener el ADN total de cada placa dental.

El ADN se extrajo utilizando el MasterPure™ Complete ADN y ARN Purification Kit (Epicentre Biotechnologies), siguiendo las instrucciones del fabricante y añadiendo un tratamiento con lisozima (1 mg/ml a 37 °C durante 30 minutos) durante la etapa de lisis. La concentración de ADN se midió con NanoDrop (Thermo Scientific) y las muestras elegidas deberán tener5 preferentemente una concentración de ADN por encima de los 300 ug/ml y una cantidad total de al menos 5 ug (debido al umbral de sensibilidad de los aparatos y procedimientos involucrados en la pirosecuenciación). Además las muestras de ADN fueron corridas en un gel de agarosa con el fin de comprobar la integridad del ADN genómico extraído de las placas dentales de los voluntarios. Posteriormente se procedió a la pirosecuenciación de dicho ADN o extraído mediante el secuenciador GS FLX-Titanium Chemistry (Roche). La pirosecuenciación consiste en la fragmentación del ADN en fragmentos de unos 500-800 nucleótidos mediante nitrógeno a presión, añadiendo a los extremos unos adaptadores que permiten anclar el ADN a unas esferas de tamaño inferior a un micrómetro de diámetro. Las esferas se introducen en un aceite que funciona a modo de microreactor para realizar una PCR en emulsión (emPCR) 5 donde se amplifica el ADN integrado en cada esfera.

Tras un enriquecimiento de las esferas que han amplificado el ADN, se pone la solución en unas placas de titanio en el secuenciador GS FLX (Roche), donde tiene lugar la reacción de pirosecuenciación. Ésta consiste en la transformación de cada molécula de pirofosfato que la polimerasa libera al añadir un nucleótido en un haz de luz, mediante un juego0 de enzimas como la luciferasa. Este haz de luz es proporcional al número de nucleótidos añadidos y de esta forma una cámara de alta sensibilidad traduce los pulsos de luz en la secuencia de ADN correspondiente (19). La longitud promedio de dicho ADN fue de 425 pb. Las secuencias replicadas artefactualmente mediante la técnica de pirosecuenciación 454 que aparecían de forma sistemática fueron eliminadas del conjunto de datos final a través del "454 Replicar Filter" (20), para que el número de lecturas de una secuencia determinada estuviera relacionada únicamente con su frecuencia en la muestra.

La cantidad de ADN humano en los metagenomas varió entre 0.5-40% en las muestras de placa dental supragingival (Tabla 1) y fueron identificadas haciendo uso de la base de datos del genoma humano mediante Megablast (21) y eliminadas del conjunto de datos final.

10

Tabla 1. Características de las muestras orales pirosecuenciadas y su metagenoma.

¹ "P" indica muestras de placa dental suprangingival. Las muestras con código numérico indican el diente del cual se han extraído muestras de la cavidad de la caries.

15 ² Número de piezas dentales con caries (C), ausentes (A) y obstruidas (O). El número entre paréntesis indica el número de caries expuestas del paciente.

³ Número de secuencias del rARN 16S detectadas en el metagenoma y asignadas mediante el clasificador RDP

⁴ índices de diversidad de Simpson, Shannon, y Chaol , realizados a nivel de género.

20 A continuación una media de 425 pbs permitió la asignación funcional en una fracción significativa del metagenoma (Tabla 2). Además, el ensamblaje de dichas lecturas produjo 1103 ensamblados ["contigs"] mayores de 5 Kpb y 354 mayores de 10 Kpb. Obtuvimos una media de 129.5 Mpb de secuencias filtradas de alta calidad (mayores de 100 pb y donde más 5 del 90% de los nucleótidos tenían una exactitud del 99.99%: La probabilidad de que el nucleótido leído por el pirosecuenciador sea correcto; es decir, un 99.99% de exactitud implica que sólo el 0.01% de los nucleótidos son incorrectos (errores de secuenciación) para cada una de las 6 muestras orales. En las dos muestras de lesiones de caries, entorno al 70% de las secuencias correspondían a ADN humano, obteniendo en este caso un promedio de 32.5 Mpb í o de lecturas filtradas de alta calidad.

Tabla 2. Asignación funcional de las muestras presentes en el metagenoma oral según diferentes sistemas de clasificación.

15

¹ s: individuos sanos sin caries; c: individuos con caries en el pasado; ca: individuos con caries activas; cav: muestras de lesiones de caries,

(n): recuento absoluto

20 (%): porcentaje total de lecturas en la muestra que fueron asignadas una función

acdd : asignación a dominios conservados analizados en la base de datos del NCBI Conserved Domains

bcog: asignación a conjuntos de grupos ortólogos

cTfam: asignación a Tigr Fams

25 ^d seed : asignación a los subsistemas Seed / MG-RAST Ejemplo 2. Construcción de la librería metagenómica de fósmidos de placa dental supragingival.

Con las muestras del ADN intacto extraído de la placa dental supragingival de los 5 voluntarios sanos incluidos en el estudio, y que no había sido utilizado para el proceso de pirosecuenciación, se procedió a la realización de la librería metagenómica de fósmidos (insertos que tienen una longitud preferentemente de 35-45 kb) de la placa dental de dichos voluntarios, utilizando para ello el kit EpiFOS™ Fosmid Library Production Kit (Epicentre Biotechnologies) y de acuerdo a l as instrucciones proporcionadas por el fabricante. o Brevemente, los fósmidos, en una alternativa preferida del procedimiento de construcción de la librería metagenómica de la invención, se insertan en un hospedador, preferentemente Escherichia coli. La elaboración de la librería se realiza, como se ha comentado previamente, con el kit EpiFOS™ Fosmid Library Production Kit (Epicentre) siguiendo las indicaciones del fabricante con algunas modificaciones, como son el aumento del tiempo de ligación (12 horas5 en un baño a 20°C), el uso de ADN total para su inserción y no el ADN extraído del gel de campo pulsante, modificar ligeramente el procedimiento de extracción del ADN para que éste se rompa lo menos posible (uso de puntas de pipeta cortadas, evitar el vórtex, uso de membranas Centricom (Millipore) para concentrar el ADN).

La inserción del ADN en el hospedador E. coli se realiza mediante el empaquetado de o los fósmidos en partículas del fago lambda y su posterior infección en cepas Epi300T1 R de E. coli. En el empaquetado se pone en contacto el producto de la ligación y los virus durante 3 horas a 30°C en 1 mi de tampón para fagos. La infección se realiza a 37 °C durante 30 minutos, poniendo en contacto las partículas del virus con la cepa de E. coli. Se realiza una titulación previa para seleccionar la concentración óptima de colonias en una placa (que estén5 lo suficientemente separadas entre sí como para poder sembrar con ayuda de un palillo estéril una única colonia), plaqueando diferentes diluciones de la mezcla en medio LB-agar con cloranfenicol.

Posteriormente, se procede a inocular cada una de las colonias en una placa Elisa de 96 pocilios en medio LB líquido con cloranfenicol donde se dejarán crecer de nuevo antes de0 su almacenaje. Los clones se encuentran almacenados en placas tipo Elisa de 96 pocilios (Nunc) a una temperatura de -80°C en glicerol al 19% para evitar la formación de cristales de hielo y mantener la integridad de las células. Los fósmidos se congelan sin inducir a copia múltiple para evitar procesos de recombinación entre los mismos.

Los diferentes clones de E. coli con los diferentes insertos de fósmidos, se siembran puntualmente en cultivos de bacterias cariogénicas, tales como Streptococcus mutans o 5 Streptococcus sobrinus. Se seleccionan aquellos clones que en dichos cultivos presenten un halo de inhibición alrededor del punto de siembra (Figura 1 ) . Los clones obtenidos se identifican mediante homología de secuencias del ADN contenido en cada fósmido, frente a diferentes bases de datos públicas de secuencias disponibles. Para obtener la secuencia de ADN de cada fósmido se extrae el ADN total de los mismos separándolo del ADN del vector í o mediante kits midipreps de QIAGEN, procediendo a su pirosecuenciación directa. Así se obtienen los respectivos ORFs y, posteriormente, los péptidos codificados por los mismos.

Ejemplo 3. Análisis de la diversidad del Metagenoma oral humano.

15 Una vez obtenido el metagenoma de la placa dental supragingival de individuos con caries y de individuos sanos según el procedimiento descrito en la presente invención, se procedió a analizar la diversidad de dicho metagenoma oral utilizando tres técnicas diferentes:

Asignación taxonómica mediante el análisis del rARN 16S: las secuencias del ARNr 20 16S fueron extraídas de las lecturas (reads) obtenidas de cada metagenoma mediante búsquedas de similitud con BLASTN (26) contra la base de datos RDP (Ribosomal Datábase Project). Las secuencias que presentaban un tamaño menor a 200 pb fueron eliminadas. La asignación filogenética de las secuencias se realizó utilizando el Clasificador RDP (27) con un umbral de confianza del 80%.

25 Asignación taxonómica qénica: la asignación taxonómica de todos los ORFs se llevó a cabo sobre la base del algoritmo del último ancestro común (lowest common ancestor, LCA) mediante las características descritas en el software MEGAN (28). Para obtener el LCA de cada secuencia se llevó a cabo búsquedas de homología utilizando la base de datos BLASTx contra otra base de datos personalizada que incluye secuencias no eucariotas de la base de 30 datos NCBI no redundante (NR). Para cada secuencia leída, sólo aquellos resultados que mostraron una coincidencia de al menos un 90% fueron considerados para la obtención del LCA. Asi nación taxonómica de las lecturas (reads) (PhvMM): dicha asignación taxonómica se realiza mediante el uso de PhymmBL (29) que combina la asignación de secuencias tanto por homología como por la composición de nucleótidos utilizando para ello los modelos ocultos de Markov. Todos los genomas completos disponibles se obtuvieron de la base de datos 5 Microbioma Oral Humano (HOMD) (30) así como del NCBI (RefSeq) que contienen todos los genomas de bacterias y arqueas (marzo, 2010), y se utilizaron para construir una base de datos local para realizar construcciones taxonómicas modelo y búsquedas de homología mediante PhymmBL. En este análisis sólo hicimos uso de secuencias de más de 200 pb para predecir la identificación taxonómica. Mediante dicha longitud de lectura, la exactitud de la í o búsqueda mediante PhymmBL, a nivel de clase, ha sido estimado en más del 75%. Todos los resultados taxonómicos y funcionales fueron analizados en una base de datos MySQL para su posterior análisis.

Los resultados obtenidos mediante la utilización de estos tres métodos muestran que 15 un pequeño número de genes 16S en metagenomas secuenciados directamente son suficientes para describir los principales grupos taxonómicos presentes en el metagenoma oral, sin los sesgos asociados a las técnicas de clonación o de PCR.

De las muestras examinadas se pueden observar diferencias interesantes entre individuos sanos y enfermos. Los tres métodos mostraron una tendencia a que los grupos 20 taxonómicos Bacilli y Gamma-proteobacteria fueran más comunes en individuos sanos, mientras que los taxones típicamente anaeróbicos como Clostridiales y Bacteroidetes son más frecuentes en muestras de enfermos. Las lecturas asignadas a Beta-proteobacterias (principalmente Neisseriales) y al phylum TM7 (todavía sin un nombre determinado y sin ningún miembro cultivado hasta la fecha) estaban en muy baja proporción en muestras de 25 enfermos y pueden por tanto estar asociadas a condiciones de salud.

Análisis de correspondencia entre los metagenomas basados en la asignación taxonómica de las lecturas del rARN 16S mostraron que las muestras con mala salud oral tendían a agruparse, mientras que diferentes consorcios bacterianos pueden ser encontrados 30 en individuos sanos. Mediante el presente estudio metagenómico, la invención demuestra que los géneros Streptococcus y Rothia, son géneros prevalentes en sujetos sin caries y más preferentemente el género Streptococcus. Por ello, a la hora de seleccionar en las muestras tomadas de la placa supragingival de individuos que nunca habían padecido caries, aquéllas que pudieran tener actividad anti-cariogénica, la selección se dirigió en la búsqueda (medios de cultivo, parámetros de cultivo, morfología al microscopio de las bacterias, morfología de las colonias, etc ..) de especies pertenecientes a dichos géneros Streptococcus y Rothia, más 5 preferentemente al género Streptococcus.

Una de las potentes aplicaciones de las aproximaciones de LCA y phymmBL es que la mayor parte de las lecturas con coincidencias significativas pueden asignarse a un origen taxonómico y también a una posible función. Relacionando la taxonomía y la función se ha í o podido predecir el papel, ecológico o metabólico, que puede desempeñar cada grupo bacteriano. Haciendo uso del sistema de clasificación funcional de COGs (Cluster of Orthologous Groups), se observa que las categorías no están igualmente distribuidas, y que ciertos grupos bacterianos están especialmente dotados para llevar a cabo determinadas funciones. Por ejemplo, una gran proporción de genes involucrados en mecanismos de

15 defensa (p.ej. endonucleasas de restricción y bombas de expulsión de fármacos) están codificados por Bacilli, lo cual unido a la mayor presencia de Streptococci en personas sin caries, nos llevó a predecir que esas bacterias podían ser potenciales productores de inhibidores naturales de patógenos humanos en una posible estrategia de terapia de reemplazamiento para el tratamiento de las enfermedades infecciosas bucales.

20

Ejemplo 4. Análisis de la riqueza y abundancia microbiana presente en el metagenoma oral humano

Estudios iniciales basados en técnicas tradicionales de cultivo y trabajos moleculares 25 pioneros incluyendo amplificación y clonaje del gen 16S rARN predijeron una diversidad de alrededor de 500 especies diferentes en la cavidad oral (6). El uso de tecnologías de última generación (Next Generation Sequencing, NGS) dieron estimaciones de entre 4000 y 19000 unidades taxonómicas operativas (OTUs). Las OTUs son una estimación del número de especies en base a las secuencias de ADN, considerando que secuencias del gen 16S rARN 30 con una similitud menor de un umbral determinado pertenecen a especies distintas. El umbral usado es el estándar para el gen 16S rARN, un 97% de identidad de secuencia; así, si la similitud es superior al 97% se considera de la misma especie, pero si es inferior al 97% es probable que sea una especie diferente. Lecturas de pirosecuenciación más largas (250 pbs) en tres sujetos sanos estimaron en torno a 600 OTUs por persona, y un reciente proyecto intentó secuenciar 11447 amplicones de casi la longitud completa de amplicones de 16S rARN por secuenciación de tipo Sanger (22), reduciendo las estimaciones por debajo de 300 OTUs 5 en 10 individuos.

Aunque nuestras estimaciones de diversidad microbiana están más cerca de las obtenidas a partir de lecturas secuenciadas por Sanger (6,22), las lecturas de 16S rARN extraídas de nuestros datos metagenómicos identificaron 186 nuevos OTUs que no se habían o detectado previamente por amplificación por PCR. Las curvas de rarefacción (la saturación en el número de especies según se incrementa el esfuerzo de muestreo) y diferentes índices de diversidad como se describe en la Tabla 1 (en concreto los índices de Shannon, Simpson, y Chaol) basados en 4254 lecturas de rARN, indicaron una estimación de 73-120 géneros para las muestras de placa dental (Tabla 1 y 2). No se observaron claras diferencias en cuanto a la5 diversidad encontrada entre las muestras de los voluntarios con distinto estado de salud, aunque las dos muestras procedentes de las lesiones de caries tendían a tener menos diversidad.

Una herramienta eficaz para cuantificar la presencia de especies seleccionadas en 0 metagenomas es el reclutamiento de secuencias. Aquellas lecturas metagenómicas individuales que dan coincidencias por encima de un determinado umbral de identidad frente un genoma bacteriano de referencia, son "reclutadas" para trazar un gráfico que variará en densidad dependiendo de la abundancia de ese organismo en la muestra. Si la media de identidad nucleotídica mostrada está por encima de 94%, el reclutamiento probablemente haya 5 sido realizado frente a lecturas de la misma especie (23).

Comparando nuestros metagenomas frente a los 1 117 genomas disponibles hasta la fecha utilizando los algoritmos Nucmer y Promer v 3.06, hemos sido capaces de estimar la abundancia de estas especies en nuestras muestras. Curiosamente, las bacterias relacionadas o con Aggregatibacter y Streptococcus sanguis estaban entre las más abundantes en gente sin caries, lo que concuerda con la mayor frecuencia de amplificación por PCR de estas especies de la cavidad oral de individuos sanos. El género Neisseria también era frecuente en muestras de individuos sanos. Además, los gráficos de reclutamiento indican que unos pocos taxones son normalmente dominantes en cada metagenoma, sugiriendo que aunque la diversidad bacteriana es grande en la cavidad oral, unos pocos taxones comprenden la mayor parte de las células bacterianas.

Ejemplo 5. Diversidad funcional en el ecosistema oral

Para analizar la diversidad funcional de los organismos que forman parte del ecosistema oral de los individuos analizados en la presente invención, todas las lecturas obtenidas de las secuencias de los metagenomas fueron comparadas frente a diferentes bases de datos: base de datos de dominios conservados (CDD) (24), sistema de anotación por subsistemas (SEED) y perfiles TigrFams (25).

El análisis de correspondencia (CoA) de las muestras en base a la asignación funcional de las lecturas dieron unos patrones de agrupamiento similares para los tres sistemas de clasificación funcional (CDD, SEED y TigrFams). Las muestras de personas enfermas (con caries) tendieron a agruparse juntas, indicando que un grupo similar de funciones estaban codificadas en sus metagenomas, y las muestras de individuos que nunca habían padecido caries, junto con uno de los individuos que presentaba un bajo número de las mismas, están agrupados aparte. Cuando se compara la asignación funcional de los metagenomas orales frente al microbioma intestinal de personas adultas (8) las muestras orales se agrupan conjuntamente, indicando que el intestino y la boca son dos ecosistemas diferentes en términos de frecuencias relativas de funciones codificadas. En la presente invención se demuestra que existen bloques de funciones sobre-representadas en el microbioma intestinal, mientras otras aparecen sobre-representadas en las muestras orales.

En las muestras orales, los individuos se agrupan en base a su estado de salud. Desde un punto de vista aplicado, es interesante que muchas categorías funcionales estén sobre-representadas en muestras de individuos sin caries. Éstas incluyen genes de captura de ADN involucrados en competencia en las bacterias Gram-positivas, otros involucradas en el metabolismo de fosfolípidos, sistemas de fosfotransferasas inducibles por fructosa y mañosa, el reguión estreptocócico mga, proteínas involucradas en la fermentación de ácidos mixtos, genes de quorum-sensing y péptidos anti bacterianos tipo bacteriocinas. Dichos compuestos bioactivos, bacteriocinas, son potenciales agentes anticaries, y por tanto la presente invención demuestra que la placa dental de individuos que nunca han sufrido caries es un reservorio genético de nuevas sustancias antimicrobianas y potencialmente anti-cariogénicas.

5

Ejemplo 6. Ensayos de inhibición de los clones obtenidos en la librería de fósmidos de la invención sobre cultivos de Streptococcus cariogénicos.

Una vez obtenida la librería de fósmidos de placa dental supragingival de individuos i o que nunca habían padecido caries, se procedió a la siembra de diferentes clones de E. coli con los diferentes insertos de fósmidos, en cultivos de bacterias cariogénicas, tales como Streptococcus mutans o Streptococcus sobrinus. Sobre dichas placas se picó una réplica de las librerías metagenómicas de fósmidos de los voluntarios que nunca habían sufrido caries, mediante un 96-pin replicator de Nunc, de tal forma que cada placa petri pueda albergar el 15 crecimiento de los 96 clones de cada placa de la librería, inducidos previamente a copia múltiple mediante un inductor (Epicentre Technologies). Mediante este sencillo cribado ("screening"), se puede realizar un ensayo de actividad de alto rendimiento de miles de clones en un tiempo limitado, seleccionando aquellos clones que producen un halo de inhibición sobre las bacterias cariogénicas (Figura 1).

20

Las secuencias de ADN o insertos de estos fósmidos, según se ha explicado en el Ejemplo 2 de la presente invención , son los que potencialmente producen sustancias excretadas que difunden en el agar e impiden el crecimiento de las bacterias causantes de la caries dental. Se realizó entonces un segundo cribado o screening de actividad con los clones 25 positivos para eliminar falsos positivos (Figura 1 B). Los clones obtenidos se identifican mediante homología de secuencias del ADN contenido en cada fósmido, frente a diferentes bases de datos públicas de secuencias disponibles.

Para obtener la secuencia de ADN de cada fósmido se extrae el ADN total de los 30 mismos separándolo del ADN del vector mediante kits midipreps de QIAGEN, procediendo a su secuenciación directa. Se secuenciaron los extremos de veinte fósmidos haciendo uso de la tecnología clásica Sanger mediante el uso de los cebadores Reverse (SEQ ID NO: 10 y SEQ ID N0:11) y 17 (SEQ ID NO: 12) del vector comercial PCCI Fos. De los veinte fósmidos secuenciados, cuatro secuencias muestran homología con ADN bacteriano (30-98%) y otras cinco secuencias muestran un 99-100% de homología con ADN humano. Por tanto, tenemos las secuencias de los extremos de cuatro fósmidos distintos con capacidad inhibitoria de origen bacteriana y otros cinco de origen humano. En dos de los casos (uno bacteriano y otro humano), el inserto resultó ser de muy corta longitud, por lo que la secuencia de los dos extremos se solapaba, obteniendo por tanto la longitud completa del inserto. El inserto de origen humano completamente secuenciado por este procedimiento tiene 244 nucleótidos (SEQ ID NO:1) y el bacteriano 666 nucleótidos (SEQ ID NO:2).

La secuencia de los otros siete insertos se obtuvo por pirosecuenciación, haciendo grupos de 2-5 fósmidos, y combinando su ADN en 1/16 ó 1/8 de placa del pirosecuencidor Genome Sequencer FLX (Roche). Las secuencias obtenidas se ensamblaron mediante el programa Newbler (Roche) usando parámetros estándar, y los ensamblados obtenidos se relacionaron con los fósmidos correspondientes en base a las secuencias de los extremos de los insertos previamente obtenidas. Las características de los nueve insertos se indican en la Tabla 3.

Tabla 3. Características de los insertos de ADN de los fósmidos con capacidad inhibitoria de bacterias cariogénicas.

Longitud

Nombre Origen N° de secuencia

Inserto (pb)

T5A Humano 244 SEQ ID NO: 1

S12E Bacteriano 666 SEQ ID NO: 2

T1 F Bacteriano 42797 SEQ ID NO: 3

T4H Bacteriano 28023 SEQ ID NO: 4

T9B Bacteriano 33804 SEQ ID NO: 5

A5D11 Humano 45166 SEQ ID NO: 6

A4H11 Humano 32692 SEQ ID NO: 7

W4D Humano 34079 SEQ ID NO: 13

T5H Humano 27661 SEQ ID NO: 14 Ejemplo 7. Identificación de los péptidos antimicrobianos en los fósmidos cortos S12E y T5A.

Una vez obtenidas las secuencias de los siete fósmidos según se describe en el 5 Ejemplo 6, se procedió a analizar la secuencia de ADN de los dos insertos de ADN de corta longitud, obteniendo todos los ORFs codificados en sentido 3'-5' y 5'-3'. De entre estos ORFs se seleccionaron aquellos que contenían secuencias de unión al ribosoma (con secuencia complementaria al extremo 3' del 16S de E. coli) y que por tanto se podían traducir con eficiencia, y aquellos que podían ser excretados, bien por la presencia de un péptido señal o (identificado por el software SIGNAL-IP) o por la vía no clásica de secreción (identificado por el software SECRETOME-P). Mediante dichos métodos se obtuvo un ORF candidato en el fósmido de origen humano (T5A), de tan sólo 26 aminoácidos de longitud (SEQ ID NO:8) y otro ORF candidato en el fósmido de origen bacteriano (S12E) de 39 aminoácidos de longitud (SEQ ID NO:9). Estos genes además mostraron una composición de aminoácidos característica de5 los péptidos antimicrobianos, y además, en el caso del T5A, de origen humano, se observó la presencia de dos cisteínas que pueden formar un puente di-sulfuro. Esto, unido a su corta longitud y su carga neta positiva, sugiere que se trata de péptidos bioactivos antimicrobianos.

Posteriormente se procedió a la purificación de dichos péptidos. Para ello, se o separaron del resto de productos secretados en base a su peso molecular. Así, se cultivaron

15 mi de cada clon inducido a multicopia en medio Infusión Cerebro Corazón (HBI), centrifugando las células y recogiendo el sobrenadante, que se filtró a través de filtros Millipore de 0.2 mieras de poro para eliminar cualquier resto de bacterias. Este sobrenadante que contiene los productos secretados se volvió a filtrar a través de filtros Amicon de Millipore de 5 10 kD y el filtrado se volvió a pasar por filtros Amicon de Millipore de 3 kD, obteniendo así la fracción comprendida entre 3 y 10 kD hasta un volumen de 1 mi. La fracción de tamaño inferior de 3 kD (fracción de 0-3 kD) se concentró en frío en un speed-vac hasta un volumen de 1 mi.

A continuación, se añadieron volúmenes de 50, 100 y 150 ul de estas dos fracciones,0 3-10 kD y 0-3 kD respectivamente, a un cultivo líquido de S. mutans y otro de S. sobrinus, midiendo, en un luminómetro Fluostar de 48 pocilios, la densidad óptica cada media hora, con cada tratamiento por triplicado, durante 12-19 horas. Como se puede observar en las Figuras 2 y 3, las curvas de crecimiento de las bacterias cariogénicas demuestran que la fracción menor de 3 kD, en el caso del péptido antimicrobiano de origen humano, tipo defensina (Figura 3), tiene un efecto inhibidor dosis-dependiente sobre las bacterias cariogénicas, mientras que en el caso del péptido antimicrobiano de origen bacteriano, tipo bacteriocina es la fracción de 3-10 5 kD la que posee el efecto inhibitorio dosis-dependiente sobre dichas bacterias cariogénicas (Figura 2), concordante con los pesos moleculares estimados en base a la secuencia de aminoácidos para cada uno de los fósmidos.

Ejemplo 8. Ensayo comparativo de la actividad inhibitoria de los péptidos bioactivos de í o la invención frente a bacterias cariogénicas

Para comparar el efecto inhibidor de la bacteriocina frente a otros productos competitivos existentes en el mercado se realizaron los mismos experimentos de crecimiento de S. mutans en medio líquido ICC que los descritos en el ejemplo anterior, pero esta vez

15 añadiéndole: a) 100 ul de uno de los enjuagues bucales líder en el mercado (Listerine®, que es un agente anti-placa dental y antiséptico oral), b) 100 ul del sobrenadante concentrado (según se ha explicado en el ejemplo anterior) del clon S12E que contiene la bacteriocina (fracción 3- 10 kDa), y c) 100 ul de Listerine® + 100 ul del sobrenadante del clon S12E que contiene la bacteriocina. El efecto inhibitorio de la bacteriocina a esta concentración, 100 ul, sobre el

20 crecimiento de S. mutans, es superior al de producto comercializado para esta especie bacteriana (Figura 4) y además, se puede observar en dicha Figura 4, que la adición de la bacteriocina al producto comercializado, mejora sensiblemente la actividad inhibitoria, frente a S. mutans, de dicho producto.

25 Ejemplo 9. Análisis de la actividad cariogénica de los péptidos S12E y T5A sintetizados químicamente.

La síntesis química de los 2 péptidos inhibidores aislados (SEQ ID NO: 8 y 9) se hizo según el método de síntesis de fase sólida (32 y 33). La síntesis de los péptidos mediante

3 o SPPS (Síntesis de Péptidos en Fase Sólida) es el método más común para crear péptidos y proteínas en el laboratorio de forma sintética, y permite la síntesis de péptidos naturales que son difíciles de expresar en bacterias, la incorporación de aminoácidos no naturales o la modificación de los péptidos (por ejemplo la formación de puentes disulfuro).

En el caso del péptido de origen humano, se usó un grupo protector, el Fmoc-Cys(trt)- 5 OH, para proteger los grupos -SH, que son bastante reactivos y eran relativamente frecuentes en este péptido. Los péptidos se unen covalentemente a unas esferas, dejando libre el grupo amino N-terminal, de forma que se pueda unir a un único aminoácido N-protegido. Tras la unión, éste se desprotege y se lava. Tras repetidos ciclos de unión, lavado, desprotección y lavado se van construyendo las cadenas peptídicas. Cuando el péptido está completo, se í o libera mediante la adición de un reactivo (en este caso fluoruro de hidrógeno anhídrico). El control de calidad, para comprobar que el péptido sintetizado es el correcto y no contiene impurezas se hizo mediante espectrometría de masas y HPLC

Para corroborar que los péptidos identificados son los responsables de la actividad 15 inhibitoria de las bacterias cariogénicas, se procedió a la síntesis química de los péptidos S12E (bacteriocinas de origen bacteriano) y T5A (péptido de origen humano con estructura similar a las defensinas), obteniendo aproximadamente 4 mg de cada uno de dichos péptidos con una pureza superior al 80%. Se resuspendieron totalmente en tricloroacético (TCA) al 0.1% y se procedió a realizar los experimentos de inhibición de dichos compuestos sintetizados

2 o químicamente sobre cultivos líquidos de S. mutans.

En el caso del péptido S12E, de origen bacteriano, tipo bacteriocinas, se confirmó la actividad inhibitoria sobre cultivos de S. mutans, especialmente a concentraciones altas (Figura 5). Posteriormente se procedió a la síntesis química de más péptido S12E, esta vez a una 25 pureza superior al 95% y dicho péptido se resuspendió en agua ultrapura, para demostrar que los efectos inhibitorios obtenidos previamente no eran debidos al TCA y sí al propio péptido S12E sintetizado químicamente. De nuevo, se observó que el tratamiento de cultivos de S. mutans y S. sobrinus con el péptido S12E sintetizado químicamente a una alta pureza produjo un efecto inhibitorio y dosis-dependiente frente a ambas bacterias cariogénicas, S. mutans

3 o (Figura 6A) y S. sobrinus (Figura 6B). En el caso del péptido T5A (de origen humano, tipo defensina), no se encontró un efecto inhibitorio en un primer momento. Se da la circunstancia de que este péptido tiene varios aminoácidos reactivos, entre ellos dos cisteínas, cuya presencia es típica en péptidos antimicrobianos humanos, siendo en muchos casos un enlace de puente disulfuro entre estas 5 dos cisteínas necesario para que el péptido sea activo. Por ello, se volvió a sintetizar dicho péptido añadiéndole un puente disulfuro entre las cisteínas 3 y 12, y protegiendo los aminoácidos reactivos durante la síntesis. Tras estas modificaciones, se confirmó que este péptido es capaz de inhibir el crecimiento de las bacterias cariogénicas, S. mutans, a diferentes concentraciones, con una inhibición total del crecimiento al añadir la máxima o concentración de péptido, 80 g (Figura 7).

Ejemplo 10. Identificación de los genes inhibitorios en fósmidos largos

En cuanto al resto de potenciales compuestos antimicrobianos, se ha procedido al5 aislamiento de ADN de todos los fósmidos que han dado un halo de inhibición, así como la secuenciación de sus extremos y del inserto completo (Tabla 3). Con ello, se obtiene un catálogo de bacterias productoras de sustancias antimicrobianas (no solo péptidos anti bacterianos), así como de las zonas del genoma humano que codifican para las mismas. Se ha procedido a realizar los experimentos de inhibición en cultivos líquidos de S. mutans o añadiendo el sobrenadante concentrado (según se ha indicado en los ejemplos precedentes) producido por los clones correspondientes, en fracciones de 0-3 KDa, 3-10 KDa, 10-100 KDa y >100 KDa. Estos experimentos revelan que la fracción de tamaño que produce la inhibición es la de 0-3 KDa en los fósmidos bacterianos T9B,y T4H y en los fósmidos humanos W4D (Figura 8), T5H (Figura 9), A5D1 1 (Figura 10) y A4H1 1 (Figura 11), y la de 3-10 KDa en el fósmido5 bacteriano T1 F. Por tanto, los presentes resultados vuelven a poner de manifiesto que la inhibición está producida por péptidos de pequeño tamaño, es decir por péptidos de un tamaño comprendido entre 0-3 KDa o entre 3-10 KDa, consistente con que se trata de péptidos anti bacterianos tipo bacteriocinas o defensinas/catelicidinas humanas. 0 Asimismo, se ha realizado en las secuencias de dichos fósmidos una búsqueda de

ORFs que codifican péptidos de estos tamaños (es decir, de 0-3 KDa o de 3-10 KDa, según corresponda) seleccionando aquellos genes con secuencia de unión al ribosoma, con presencia de péptidos señal y con uso de amino ácidos similar al de los péptidos anti bacterianos y/o con secuencia similar a otros péptidos anti bacterianos conocidos, y/o con hidrofobicidad y/o con carga neta positiva, como posibles candidatos a ser los genes codificantes de los inhibidores.

5

Ejemplo 11. Identificación de bacterias anticaries

La existencia de una pequeña proporción de la población humana adulta que nunca ha padecido de caries ha llevado a sugerir la presencia de especies bacterianas con un potencial í o efecto antagonista frente a bacterias cariogénicas (23). El reemplazamiento bacteriano de las cepas patógenas por aislados inocuos obtenidos de individuos sanos se ha mostrado satisfactoriamente como preventivo en infecciones de faringe y es la base de los probióticos para prevenir enfermedades infecciosas en el intestino y otros ecosistemas humanos (31). Reclutamientos metagenómicos de bacterias cariogénicas frente al microbioma oral de sujetos

15 sanos muestra una total ausencia de S. mutans y S sobrinus. Curiosamente, la ausencia de detección de bacterias cariogénicas va acompañada por un intenso reclutamiento de otras especies de Streptococos (principalmente los similares a S. sanguis), Aggregatibacter y Neisserias, las cuales suponen los géneros más abundantes en estos individuos.

20 Dada la posibilidad de que aislados de estos géneros dominantes puedan estar involucrados en interacciones antagonistas con bacterias cariogénicas, muestras frescas de placa dental de 10 individuos sanos (incluyendo los 2 individuos sanos de los que se obtuvieron las secuencias metagenómicas) fueron tomadas y usadas para cultivar en condiciones óptimas para el crecimiento de especies de Neisseria, Rothia y Streptococcus (en

25 concreto en medios de cultivos de agar sangre, agar chocolate, brucella agar y TSA, en condiciones de aerobiosis y en jarras de anaerobiosis). Después de un examen microscópico, se seleccionaron diplococos y estreptococos (para maximizar la posibilidad de encontrar especies de Streptococcus, Rothia y Neisseria), obteniéndose una colección de 249 aislados.

30 Aquellos que podían crecer en el mismo medio que S. mutans y S. sobrinus fueron transferidos a cultivos en césped en presencia de dichas bacterias cariogénicas. Este simple cribado identificó 16 cepas que mostraron halos de inhibición (Figuras 12 y 13). Mediante técnicas de PCR y secuenciación del rARN 16S se identificó a la mayoría de dichas cepas como pertenecientes a las especies de Streptococcus, con 96-99% de identidad de secuencia a las especies S. oralis, S. mitis y S. sanguis o alguna especie relacionada y también a las especies de Rothia con un 100% de identidad de secuencia en el gen 16S con la especie R. 5 mucilaginosa. De las cepas que mostraron halos de inhibición frente a S. mutans y/o S. sobrinus se ha realizado el depósito de las mismas en la CECT, asignándoseles los números CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773, CECT 7774 y CECT 7775. Como se ha comentado previamente, las cepas CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 y CECT 7775, pertenecen al mismo género bacteriano Streptococcus, compartiendo, por tanto, además de su método de o obtención, similitud estructural y taxonómica, al pertenecer al mismo género bacteriano.

Específicamente, dichas cepas, dentro del género bacteriano Streptococcus se asemejan, en base a la secuencia del gen ribosomal 16S, a las especies S. mitis (CECT 7746 y CECT 7775) y S. oralis (CECT 7747 y CECT 7779). La secuenciación del genoma completo5 de las cepas CECT 7746 y 7747 revela que se trata de especies nuevas del género Streptococcus (ver Ejemplo 12), que son cepas hermanas a pesar de provenir de individuos diferentes y además, se encuentran dentro del cluster de especies S. mitis/oralis/infantis. La otra cepa bacteriana depositada en la CECT, con el número CECT 7774, pertenece al género Rothia y más específicamente a la especie R. mucilaginosa. Los halos de inhibición de dichas 0 cepas depositadas en la CECT sobre cultivos de especies cariogéniocas, S. mutans o S. sobrinus, se pueden observar en las Figuras 12 y 13, respectivamente.

Ejemplo 12. Caracterización de las cepas bacterianas CECT 7746 y CECT 7747 5 La caracterización de las cepas bacterianas CECT 7746 y CECT 7747 se llevó a cabo mediante diferentes técnicas. En primer lugar se procedió a la obtención del genoma completo de estas dos cepas mediante pirosecuenciación tipo "shot-gun" (7,8) y "pair-ends", esta última consistente en la rotura del ADN en fragmentos de unos 3000 nucleótidos y la secuenciación de aproximadamente 200 nucleótidos desde cada extremo, de tal manera que la distancia o conocida entre estos dos extremos ayuda en el ensamblaje de las secuencias. Para la obtención del genoma completo para cada una de las cepas CECT 7746 y CECT 7747, se partió de muestras recogidas de cada uno de los cultivos de dichas cepas, específicamente se utilizó un cuarto de placa de cultivo para los experimentos de pirosecuenciación mediante el pirosecuenciador GS-FLX de Roche (química Titanium) mediante el sistema "shot-gun" (7,8) y otro cuarto de placa de cultivo para los experimentos de pirosecuenciación mediante el sistema de "pair-ends". La cantidad de secuencia obtenida para cada una de las cepas mediante ambos sistemas fue:

Cepa 7746

Tipo Shot-gun: 441.549 lecturas, con un total de 165.105.921 nucleótidos

Tipo Pair-ends: 187.530 lecturas, con un total de 32.721.622 nucleótidos

Cepa 7747

Tipo Shot-gun: 28.021 lecturas, con un total de 5.711.998 nucleótidos

Tipo Pair-ends: 305.826 lecturas, con un total de 51.501.510 nucleótidos

El tamaño esperado de los genomas para cada una de las cepas era de unos 2.1 Mb. Para la cepa CECT 7746, el tamaño de los ensamblados mayores de 500 pb es de 2.122.087 pb. En el caso de la cepa CECT 7747, el tamaño de los contigs mayores de 500 pb es de 1.953.989 pb.

Las secuencias se filtraron y se ensamblaron mediante el software Newbler (Roche) adaptado por los inventores con parámetros standard, obteniendo un total de 109 ensamblados >500 pb para la cepa CECT 7746 y de 51 contigs para la cepa CECT 7747. A continuación se procedió a la anotación automática de dichos genomas obteniéndose la secuencia completa del genoma de dichas cepas CECT 7746 y CECT 7747.

Una vez obtenido el genoma completo de las cepas CECT 7746 y CECT 7747, se procedió a la asignación taxonómica de dichos aislados en base a los árboles filogenéticos obtenidos en base a la secuencia completa de los genes 16S y 23S rRNA, que son los más extendidos a la hora de hacer árboles filogenéticos bacterianos.

Concatenando las secuencias de los genes 16S y 23S rRNA se obtuvo un sólo fragmento de más de 4.000 nucleótidos, que se alineó con el mismo fragmento de las especies de Streptococci secuenciadas hasta la fecha. Las secuencias se alinearon usando el software informático libre MAFFT, alineando por separado los genes del 16S y del 23S, y posteriormente se concatena el alineamiento. Después se depura el alineamiento usando el software informático libre GBIocks para seleccionar las posiciones informativas conservadas. El árbol se obtiene usando el programa RAxML, mediante el método de máxima verosimilitud, con 500 repeticiones. El árbol filogenético obtenido puso de manifiesto que ambas cepas son hermanas a pesar de provenir de individuos diferentes y además, se encuentran dentro del cluster de especies S. mitis/oralis/infantis, y la topología del árbol sugiere que se trata de cepas pertenecientes a una especie nueva no descrita. Para determinar si dichas cepas pertenecen a especies diferentes se utilizo la técnica

ANI (average nucleotide identity). Cuando se comparan los genomas de cepas secuenciadas, la similitud media a nivel de nucleótido entre los genes homólogos de la misma especie es superior al 95% (34, 35). De hecho, los taxónomos dan por bueno este valor de ANI del 95% como límite para separar aislados bacterianos pertenecientes a distintas especies y como alternativa al clásico umbral del 70% en el valor de hibridización DNA-DNA (36). Utilizando el software informático libre J-species para determinar los valores de ANI entre las dos cepas secuenciadas de la i nvención, CECT 7746 y CECT 7747, y el resto de Streptococci secuenciados, se comprobó que se trata de dos cepas pertenecientes a una especie nueva no descrita actualmente. En el caso de la cepa bacteriana de la invención CECT 7746 no existe ninguna cepa con una similitud por encima del umbral del 95% y en el caso de la cepa bacteriana de la invención CECT 7747, sólo otra cepa de las secuenciadas, el Streptococcus M143, supera dicho umbral. Dicha cepa M143 es una cepa que a pesar de tener un borrador de su genoma secuenciado no está descrita taxonómicamente como una especie. Los resultados para calcular el ANI se obtuvieron mediante dos metodologías diferentes: Mummer y Blast (36), mostrando ambas metodologías resultados casi idénticos.

Ejemplo 13. Ensayos de inhibición de bacterias cariogénicas, S. mutans, en presencia de los sobrenadantes obtenidos de los cultivos de las cepas CECT 7746 y CECT 7747 descritas en la invención.

Se crecieron las dos cepas de la invención CECT 7746 y 7747 en medio de cultivo ICC a una temperatura de 37°C. A continuación se recogieron los sobrenadantes de los cultivos en fase exponencial y en fase estacionaria, filtrándose por un filtro de 0.2 mieras para eliminar cualquier resto bacteriano. Posteriormente, dichos sobrenadantes se volvieron a filtrar mediante centrifugación con membranas de un tamaño de poro de 100, 10 y 3 KDa (Amicon, Millipore), según se describe en los ejemplos previos que se muestran en la presente invención.

La fracción de los sobrenadantes obtenidos de cada una de las cepas CECT 7746 y 7747, recogidos en la fase estacionaria de crecimiento de las mismas y que produjeron inhibición del crecimiento de cultivos bacterianos de S. mutans, se concentró en la fracción de tamaño inferior a 3 KDa para ambas cepas testadas CECT 7746 (Figura 14 A) y CECT 7747

(Figura 14 B). Dichos resultados ponen de manifiesto que la sustancia inhibidora sintetizada por dichas cepas y que presenta efecto bactericida específico contra especies cariogénicas, debe tener un pequeño tamaño, preferentemente <3 KDa como en el caso de las bacteriocinas.

Por el contrario, cuando se llevó a cabo el mismo experimento pero con las muestras de los sobrenadantes de los cultivos de las cepas de la invención CECT 7746 y 7747 recogidos durante la fase exponencial del crecimiento de los mismos, no se observó inhibición del crecimiento de los cultivos bacterianos de S. mutans (Figura 15), indicando que el agente inhibidor sólo se produce en fase estacionaria del crecimiento bacteriano de las cepas de la invención.

Cuando las muestras del sobrenadante concentrado obtenidas en fase estacionaria y menor de 3 KDa se sometió a una temperatura de 100°C durante 10 minutos, se comprobó que la actividad inhibidora de dicho sobrenadante sobre cultivos de S. mutans se mantuvo e incluso aumentó (Figura 16). Estos resultados son consistentes con que el agente inhibidor es una bacteriocina y no otro tipo de péptido, ya que las bacteriocinas de pequeño tamaño son extremadamente termoestables e incluso aumentan su efecto antimicrobiano al poderse eluir mejor en el medio tras disolverse sus agregados con el choque térmico. A continuación se realizaron ensayos de inhibición con los sobrenadantes obtenidos de los cultivos de las cepas bacterianas de la invención CECT 7746 y CECT 7747 frente a cultivos de S. mutans, pero alterando el orden de la siembra y la temperatura de crecimiento de los cultivos de dicha bacteria cariogénica, para comprobar si dichas modificaciones tenían algún efecto sobre la actividad inhibitoria de los sobrenadantes de las cepas de la invención.

En primer lugar se sembraron placas de cultivo con la bacteria cariogénica S. mutans y 5 transcurridas 24 h, en la misma placa de cultivo, se sembraron las cepas de la invención.

Transcurrido un tiempo no se observaron halos de inhibición. En cambio, cuando se sembraron placas de cultivo con ambas cepas a la vez, se observó inhibición en el crecimiento de S. mutans, tal como habíamos mostrado anteriormente. La mayor inhibición en el crecimiento de cultivos de S. mutans, se observó cuando se sembraron primero las cepas de la invención, í o CECT 7746 y 7747, y 24 h después se sembraron las cepas de S. mutans, indicando la existencia de una mayor concentración del agente o sustancia inhibidora antes del crecimiento de la bacteria cariogénica, y que además, la presencia de dicha bacteria no es necesaria para activar la producción del agente inhibidor por parte de las cepas de la invención.

15 A continuación se realizaron experimentos de inhibición del crecimiento de bacterias cariogénicas en medio sólido sembrando primero las cepas de la invención mediante una gota del cultivo en medio líquido en fase estacionaria, seguido de un cultivo en tapiz de S. mutans a diferentes temperaturas: 30°C, 33°C, y 36°C. No se observó inhibición del crecimiento de S. mutans a la temperatura de 30°C, pero sí a 33°C, siendo de hecho superior a la obtenida a

20 36°C.

Ejemplo 14. Ensayos de inhibición de bacterias cariogénicas, S. mutans, cultivadas en presencia de los sobrenadantes obtenidos de los cultivos de las cepas bacterianas de la invención CECT 7746 y CECT 7747, en condiciones de aerobiosis y anaerobiosis.

25

Para determinar si la acción inhibitoria del crecimiento de bacterias cariogénicas mediante las cepas de la invención se veía modificada por un ambiente aerobio o anaerobio, se realizaron experimentos de inhibición en medio sólido ICC sembrando primero las cepas de la invención mediante una gota del cultivo en medio líquido en fase estacionaria en una jarra 30 de anaerobiosis durante 12 h, seguido de un cultivo en tapiz de S. mutans a 37°C, o seguido de un sembrado con una gota de cultivo de S. mutans a 37°C. Los resultados de ambos experimentos pusieron de manifiesto que la inhibición del crecimiento de S. mutans, es mucho menor en condiciones anaerobias, especialmente para la cepa CECT 7746 (Figura 17). Por tanto, los resultados demuestran que para las cepas de la invención, la inhibición ejercida sobre las bacterias cariogénicas, es más efectiva durante la etapa aerobia de la formación de la placa dental, es decir, en el período de adhesión y formación inicial de la biopelícula o biofilm sobre el diente.

Ejemplo 15. Efecto anticariogénico de las cepas bacterianas CECT 7746 y CECT 7747 y sus sobrenadantes sobre biofilm en un modelo de diente artificial.

Para poner de manifiesto el efecto anticariogénico de las cepas bacterianas descritas en la presente invención, se realizaron ensayos de inhibición de producción de ácido con las cepas CECT 7746 y CECT 7747, sobre biofilm en un modelo de diente artificial. Dichos experimentos se realizaron en el Active Attachment biofilm model del Academic Center for Dentistry Amsterdam (ACTA, Amsterdam). Dicho modelo de biofilm fue descrito por Exterkate RA et al (37). Brevemente, discos de hidroxiapatita o vidrio se inoculan con saliva humana de un voluntario con un porcentaje elevado de S. mutans (superior al 4%), con o sin presencia de la cepa probiótica, o de su sobrenadante. Para los presentes ensayos se testaron las cepas CECT 7746 y 7747 descritas en la presente invención, así como la cepa C7.1 , que es un aislado perteneciente a las especies del grupo Streptococcus mitis/oralis/infantis, obtenido de un individuo sin caries pero que no produce inhibición del crecimiento de especies cariogénicas y que por tanto sirve como control negativo.

La saliva humana está almacenada a -80 °C. Las cepas probióticas CECT 7746 y 7747 y la cepa control C7.1 , se crecen 12 horas en medio de cultivo HBI con sacarosa, hasta obtener una densidad de cultivo de aproximadamente 4 x 10 ⁸ ufe (Unidades Formadoras de Colonias). A continuación, se mezcla la muestra de saliva al 50% con el inoculo de las cepas probióticas de la invención (CECT 7746 o 7747) o con el inoculo de la cepa control (C7.1) y se aplican sobre el disco de vidrio.

Los biofilms se forman durante 48 horas en medio de saliva artificial modificada (38) en aerobiosis y anaerobiosis, y una vez formados se incuban durante 3 horas a una temperatura de 37 °C en agua peptonada con cisteína (Sigma-Aldrich, St Louis, EEUU) que contiene glucosa al 0.2% para poder medir la producción de ácido. Durante este período de incubación, las cepas producirán ácido, que es medido mediante una reacción colorimétrica: Dicho biofilm se transfiere a un tubo eppendorf y se incuba a una temperatura de 80 °C durante 5 min para 5 parar el metabolismo bacteriano. La cantidad de ácido L-láctico se determina enzimáticamente usando un ensayo colorimétrico con el espectrofotómetro Spectra Max M2 (Molecular Devices, USA), siguiendo el protocolo descrito por Pham LC et al. (38).

Para analizar la inhibición en la producción de ácido de los sobrenadantes, tanto de las í o cepas de la invención (CECT 7746 y 7747) como de la cepa control (C7.1), en primer lugar, se procedió a la obtención de los sobrenadantes de los cultivos de dichas cepas bacterianas. Para ello se crecieron cultivos de dichas cepas en medio ICC durante 12 horas. A continuación se eliminaron las células bacterianas por centrifugado y posterior filtrado mediante poros de un tamaño de 0.2 mieras. El medio se filtra por membranas Amicon Ultra (Millipore) de 100, 10 y 3 15 kDa. La fracción menor de 3 kDa se concentra a la mitad de su volumen en un rotavapor y se mezcla al 50% con la muestra de saliva, procediendo, al igual que en el caso de los probióticos, a formar el biofilm durante 48 horas y a una incubación de 3 horas en medio de cultivo de agua de peptona tamponada (Buffered Peptone Water) (38) que contiene glucosa al 0.2%, para así poder medir la producción de ácido.

20

Cada tratamiento se repite por cuadruplicado en condiciones de aerobiosis y anaerobiosis. Los grupos experimentales analizados han sido:

1. Biofilms formado con inoculo de saliva.

2. Biofilms formado con inoculo de saliva + CECT 7746.

25 3. Biofilms formado con la cepa CECT 7746.

4. Biofilms formado con inoculo de saliva + CECT 7747.

5. Biofilms formado con la cepa CECT 7747.

6. Biofilms formado con inoculo de saliva + cepa de Streptococcus no inhibidora (cepa

C7.1).

30 7. Biofilms formado con inoculo de saliva + sobrenadante de la cepa CECT 7746 conteniendo la sustancia activa inhibidora. 8. Biofilms formado con inoculo de saliva + sobrenadante de la cepa CECT 7747 conteniendo la sustancia activa inhibidora.

9. Biofilms formado con inoculo de saliva + sobrenadante de la cepa no inhibidora (cepa C7.1).

10. Biofilms formado con la cepa Streptococcus no inhibidora (cepa C7.1).

Los resultados se muestran en la Figura 18, e indican que el biofilm monoespecífico formado únicamente por las cepas CECT 7746 (grupo experimental 3) ó CECT 7747 (grupo experimental 5) producen una cantidad de ácido significativamente inferior al de la saliva (grupo experimental 1 ). Tomando la saliva humana como valor de referencia (grupo experimental 1), los sobrenadantes de la cepa CECT 7747 (grupo experimental 8) redujeron significativamente la producción de ácido, tanto en aerobiosis como en anaerobiosis, mientras que el sobrenadante de la cepa CECT 7746 (grupo experimental 7) redujo la cantidad de ácido producido por el biofilm únicamente en condiciones de anaerobiosis. La adición de la cepa CECT 7747 al biofilm redujo la producción de ácido tanto en aerobiosis como en anaerobiosis, mientras que la adición de la cepa CECT 7746 al biofilm sólo produjo una reducción en aerobiosis.

La reducción de ácido, sobre todo en el caso de la cepa y los sobrenadantes de la cepa CECT 7747, es muy relevante para el tratamiento y prevención de la caries dental, ya que ésta se forma por la producción de ácido por parte de los microorganismos cuando éstos fermentan los azúcares ingeridos en la dieta. Es precisamente el pH ácido el que desmineraliza el esmalte y produce la caries, y por tanto cualquier especie acidogénica, no sólo los Streptococcus del grupo mutans, podrían ser potencialmente cariogénicos (2). La reducción en la producción de ácido es por tanto un indicador de que el efecto global del tratamiento con la cepa probiótica o su sobrenadante es la reducción de ácido y por tanto una menor probabilidad de desarrollo de caries. BIBLIOGRAFIA

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