一种增加 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ 调节性 T细胞的抗原及其应用 技术领域 本发明属于免疫学领域， 具体涉及一种增加 CM ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ 调节性 T细胞 (Tregs)的血 吸虫来源的抗原分子一日本血吸虫热休克蛋白 60KDa { Schistosoma japonicum heat shock protein 60KDa, SjHSP60)及其应用。 背景技术 上个世纪九十年代前后， 西方发达国家提出来 "卫生假说"， 认为在卫生环境大大改善 的发达国家， 一些过敏性疾病和自身免疫病的发病率大为增 加， 这是与发达国家卫生条件改 善， 人群发生病原体感染的机会减少有关 (Wills-Karp, et al, Nat Rev Immunol, 2001, 1 :69-75)。 其后的若干年， 科学家们通过一些过敏性疾病和自身免疫病的 动物模型研究证明， 一些病原 体的慢性感染确实可以预防这些免疫性疾病的 发生或者减轻免疫病理损伤 (Dunne, Nat Rev Immunol, 2005, 5 :420-426)： 如曼氏血吸虫感染可以预防或减轻 I型糖尿病， 实验性脑炎， 甲 状腺炎； 绦虫感染会减少实验性结肠炎的发病； 链球菌感染可以抑制胶原诱导型关节炎的发 生发展， 等等。 从进化史的角度看， 慢性感染是病原体和宿主在长期共同进化彼此 选择后， 最终所形成的对双方都有利的一种平衡状态。 在这种状态下， 病原体不会被宿主完全清除， 可长期存在于宿主； 宿主既可维持对病原体有一定抵抗力， 也不会因为过强的免疫反应而产 生免疫病理损伤， 而且还预防了自身免疫病的发生。

随着免疫学的发展，在免疫系统中发现了一群 天然存在的 CD4 ⁺ CD25 ⁺ 调节性 T细胞（Tregs ) (Sakaguchi, α/. , J Immunol, 1995, 155: 1151-64), 这群细胞主要由胸腺产生， 参与维持外周自 身免疫耐受和免疫内环境稳定； 后来进一步发现， 一些病原体的感染（病毒， 细菌， 寄生虫） 也可以在外周从 CD4 ⁺ T细胞中诱导产生 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tregs(Bluestone and Abbas, Nat Rev Immunol, 2003, 3 :253-7)。如丙型肝炎病毒（HCV)感染人体后，可� ��诱导特异性的 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tregs(Bolacchi， et al Clin Exp Immunol, 2006, 144: 188-96)； 小鼠百日咳杆菌感染模型中研究发现， CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tregs发生增多 (McGuirk, et /., J Exp Med, 2002， 195 :221-31)； 寄生虫类感染中， 曼 氏血吸虫感染后 4周， 发现肠系膜淋巴结中 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tregs发生了扩增， 然后聚集到肝脏和 脾脏中发挥免疫抑制效应 （Wilson W a/,, unpublished observaton)„ 进一步探究导致慢性感染 的病原体是如何诱导调节性 T细胞， 从而抑制免疫攻击， 对于提高宿主抗感染力和治疗免疫 病意义都非常重大。 寄生虫中的蠕虫类， 是一类具有复杂生物学功能的多细胞真核生物 ， 能 够很好的逃避宿主免疫攻击， 长期存在于宿主机体中 (Maizels, et al, J Exp Med, 2009, 206:2059-66)。 蠕虫类中血吸虫感染是一种非常典型的慢性感 染， 在其感染模型中研究发现， 其虫卵抗原是剌激诱导 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tregs产生的关键因素 (； Baumgart, et al. , J Immunol, 2006, 176:5374-87)；此夕卜，本课题组也已发现， 日本血吸虫虫卵抗原也可以刺激诱导 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tregs 从而减轻哮喘所导致的气道炎症反应 (Yang, et al. , Immunology, 2006, 120:8-18)。

关于特异性抗原在外周诱导免疫负调控的研究 ， 在自身免疫研究领域已有一些报道， 有 些自身抗原的自身反应性在逃避了胸腺中枢的 阴性选择后， 它们还可以在外周诱导自身反应 性调节性 T细胞， 从而参与免疫调控。这些自身抗原包括： 一些组织抗原（谷氨酸脱羧酶 GAD， 少突胶质细胞蛋白 M0G， 肌球蛋白等）； 免疫调控分子 （泛素， 白介素， 肌动蛋白等）； 应激 蛋白 （HSP40，HSP60，HSP70 ) (Merbl, W J Clin Invest, 2007, 117:712-8)。 实际上， 免疫系统 天然就存在这些抗原的抗体或反应性 T细胞， 或其特定的受体（配体）， 它们会时刻监视着机 体免疫系统， 维持免疫内环境稳定 (Cohen, Nat Rev Immunol, 2007, 7:569-74)。 早些年就有研 究发现， 人自身 HSP60或其多肽可预防或减轻 I型糖尿病 (Elias and Cohen, Diabetes, 1996, 45: 1168-72), 且于两年前已经开始应用于临床 ΠΙ期实验 (Eldor, et al.， Diabetes Metab Res Rev, 2009, 25:316-20)； 通过大鼠佐剂性关节炎模型研究发现， 鼠自身 HSP60也可减轻关节炎症病 理反应 (Durai, et al , J Autoimmun, 2009, 33 :208-13) _o 而且非常特别的是， HSP60属于进化上最 为保守的分子家族一热休克蛋白家族， 在所有真核和原核生物中高度同源。 因此， 病原体很 可能会利用这个分子去模拟宿主 HSP60的作用， 诱导免疫调控， 抑制宿主免疫攻击， 维持慢 性感染。 如果能够鉴定和验证出这些病原体来源的 "模拟分子"， 不仅可以找到打破慢性感 染的靶标， 还可应用于预防或治疗免疫性疾病。

对于过敏性疾病和自身免疫病的治疗， 临床上很长时间以来一直在用一些直接抑制免 疫 应答行为的化学药物， 如激素类， 或者联合应用硫唑嘌吟 （抗胸腺球蛋白类药物）， 环孢素 A 等 (Bougneres, W a/.， Diabetes, 1990, 39: 1264-72)。 但是其中有些药物不仅价格比较贵， 会让患 者产生难以忍受的副作用，而且一旦停止用药 ， 自身免疫反应会立即反弹，疾病会卷土重来。 而廉价的纯化蛋白分子， 不仅安全没有毒副作用， 更重要的是， 它是通过免疫学途径去启动 其自身的调控机制， 从根本上解决了问题； 相比较于同类的短肽疫苗， 氨基酸序列较长而不 易被降解， 且具有多个表位， 可以联合发挥作用， 更易被机体免疫系统所识别； 此外， 蛋白 分子的制备， 一般都是通过生物表达系统 （原核或真核表达系统）， 而不是生物合成， 这有 助于形成蛋白质的高级空间结构， 能更有效地形成免疫学表位。

已公开的曰本血吸虫热休克蛋白 60KDa ί Schis tosoma japonicum heat shock protein 60KDa, SjHSP60) 基因在 Genebank中序列号为 AY813151。

总之， 利用慢性感染中病原体来源的抗原， 寻找诱导调节性 T细胞的特异分子， 不仅有 利于鉴定出导致慢性感染主要因素， 从而可以针对性地提高宿主抗感染力， 而且在进一步研 究应用于治疗过敏性疾病或自身免疫病方面具 有更广阔的前景。 发明内容 本发明旨在提供一种增加 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ 调节性 T细胞的蛋白。 本发明所说的增加 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ 调节性 T 细胞的蛋白， 是日本血吸虫热休克蛋白 60KDa ( SJHSP60)， 其全长氨基酸序列 SEQ. ID. NO. 1所示， 由 572个氨基酸构成。

本发明所说的增加 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ 调节性 T 细胞的蛋白， 还包括缺失了一段多肽的 SjHSP60， 即 SjHSP60 (D ) , SjHSP60 (D ) 的序列如 SEQ. ID. NO. 3所示， 由 548个氨基酸组 成。 本发明 SEQ. ID. NO. 1所示的蛋白与 Genebank中 SjHSP60基因 （序列号为： AY813151 ) 的蛋白质序列并不完全相同（一致性为 87 % )。但是 SEQ. ID. NO. 1分别与其它种属同源蛋白 中曼氏血吸虫 HSP60 ( SmHSP60， Genebank号： AF310263 )和人类 HSP60 (HomoHSP60， Genebank 号： BC003030 )的一致性更高， 分别为 92 %和 72 %， 而 AY813151的蛋白质序列与 SmHSP60 和 HomoHSP60的一致性分别为 81 %和 65 %。 这是单克隆测序与大规模测序的差异所在， 本 发明是经过 "Primer walking"测序拼接后翻译出来的序列， 所以更精确。 本发明所说的蛋白 SjHSP60， 主要通过以下两个途径增加 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs， 从而 增强机体免疫抑制力：

1 . 上述所说蛋白诱导 CD4 ⁺ CD25— T细胞转化为 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs; 2. 上述所说蛋白直接使 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tre _g s发生扩增；

本发明公开了 SjHSP60和 SjHSP60 (D) 作为增强 CD4 ⁺ CD25+ Foxp3 ⁺ 调节性 T细胞抑 制效应的免疫抑制剂的应用。

本发明公开了 SjHSP60和 SjHSP60 (D)在制备治疗免疫反应引起的炎症性疾病药物 中的 应用。 特别是在制备防治关节炎所致的炎性症状和免 疫病理药物中的应用。

本发明所说的 SjHSP60和 SjHSP60 (D) 蛋白使扩增后的 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tregs的免疫抑制力 增强。

本发明所说的蛋白应用于实验性炎症动物模型 中有抑制炎性症状和免疫病理反应的作 用， 在治疗免疫性疾病方面具有比较广阔的应用前 景。 附图说明 图 1 SjHSP60序列同源性比对分析， 天然表达分析。

A SjHSP60的全长氨基酸序列， 与宿主 （人， 小鼠） 的 HSP60进行序列比对；

B SjHSP60在虫体中的天然表达情况； 表 1 SjHSP60与宿主 （人， 小鼠） 自身 HSP60的交叉性 T细胞表位分析。 图 2 SjHSP60增加 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs。

A用 SjHSP60体内免疫小鼠， 小鼠脾和淋巴结中 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例显著增加；

B用 SjHSP60体内免疫小鼠， 检测小鼠脾和淋巴结中 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例的流式细胞 术检测图；

C用 SjHSP60体外处理小鼠脾和淋巴结细胞， CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例均发生增加；

D用 SjHSP60体外处理小鼠脾和淋巴结细胞， 检测 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例的流式细胞术 检测图； 图 3 SjHSP60减轻 CIA (胶原性关节炎） 小鼠炎性症状和病理损伤。

A S jHSP60体内免疫可减轻 CIA小鼠关节炎性症状；

B S jHSP60体内免疫可减轻 CIA小鼠踝关节肿胀度；

C SjHSP60体内免疫可减轻 CIA小鼠关节周围软组织肿胀和骨关节损害；

D SjHSP60体内免疫可减轻 CIA小鼠关节及其周围软组织的炎症病理反应； 图 4 SjHSP60增加 CIA小鼠 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例， 抑制炎症抗原 （Col lagen II， C II) 的特异性体液和细胞免疫应答。

A SjHSP60体内免疫 CIA小鼠， 小鼠脾和淋巴结中 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例显著增加；

B SjHSP60体内免疫 CIA小鼠， 检测小鼠脾和淋巴结中 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例的流式细胞 术检测图；

C SjHSP60体内免疫后， CIA小鼠体内针对炎症抗原 C II的特异性体液免疫应答水平明显降低； D SjHSP60体内免疫后， CIA小鼠体内针对炎症抗原 C II的特异性细胞免疫应答水平明显降低； 图 5 HSP60±曾加 CD4+CD25+Foxp3+ Tregs可通过诱导 CD4+CD25— T转化为 CD4 ⁺ CD25+Foxp3+ Tregs。 A 用 S jHSP60处理小鼠 CD4 ⁺ T， CD4+CD25 T细胞， S jHSP60诱导 CD4 ⁺ CD25― T转化为 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs ;

B 用 S jHSP60处理小鼠 CD4 ⁺ T， CD4 ⁺ CD25 _ T细胞， SjHSP60诱导 CD4 ⁺ CD25 T转化为 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs的流式细胞术检测图； 图 6 SjHSP60增加 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs可通过直接扩增 CD4 ⁺ CD25+ Tregs , 且扩增后的

CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tregs免疫抑制力更强。

A SjHSP60直接扩增 CD4+CD25+ Tregs；

B扩增后的 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tregs具有更强的免疫抑制力； 图 7: SjHSP60 (D)仍可显著增加 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例。

A SjHSP60的蛋白质空间结构和表面功能残基 （蛋白质一蛋白质作用位点） 的预测和分析； B通过两次 PCR得到了接头部分重叠且缺失了 SJMHE1的两个 PCR产物；

C通过第三次 PCR得到了缺失 SJMHE1的 SjHSP60 (D)；

D用 S jHSP60 (D)体内免疫小鼠， 小鼠脾和淋巴结中 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例显著增加； E用 S jHSP60 (D)体内免疫小鼠， 检测小鼠脾和淋巴结中 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例的流式细 胞术检测图；

F用 SjHSP60 (D)体外处理小鼠脾和淋巴结细胞， CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例显著增加；

G用 SjHSP60 (D)体外处理小鼠脾和淋巴结细胞， 检测 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例的流式细胞 术检测图； 图 8 : 去除 SjHSP60全长序列中一段多肽 （第 435到第 458个氨基酸， SJMHE1 ) 的引物设计法 和三步 PCR示意图。

具体实施方式：

在本发明中所使用的术语， 除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人 员通常理解的 含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例， 并参照数据进一步详细地描述本发明。应理 解为： 这些实施例只是为了举例说明本发明， 而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中， 未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知 的常规方法。 所用试 剂的来源、 商品名以及有必要列出其组成成分者， 均在首次出现时标明， 其后所用相同试剂 如无特殊说明， 均与首次标明的内容相同。

本发明实施例中所提及的表达载体 pGEX-6p-l可从 GE Healthcare公司购买 （货号：

28-9546-48)。

日本血吸虫总 cDNA的获取： 日本血吸虫感染性钉螺（阳性钉螺）购自江苏 省血吸虫病 防治研究所。 感染性钉螺可以释放出具有感染性的尾蚴 （日本血吸虫发育阶段之一， 此阶 段具有感染性）从而用来攻击感染实验性小鼠 。 然后尾蚴在小鼠体内可以继续发育为童虫， 最终发育为日本血吸虫成虫， 寄居在小鼠的门静脉系统。 剖杀小鼠后， 可以通过灌注小鼠 门静脉系统取出成虫， 从而可以用来抽提日本血吸虫总 R A，最后再逆转录成日本血吸虫总 cDNA。 实施例一： SjHSP60同源性的序列比对分析， 交叉性表位分析， 及其天然表达的检测。 1、 根据 Genebank中 SjHSP60基因 （序列号为： AY813151 ) 全长 cDNA序列， 先行设计引 物： 上游弓 I物为 5， ― cgcggatcccaaccggtgacaatgttacgag― 3 ' (含 〃 /酶切位点及 起始密码字 ATG)，下游引物为 5, -ccgctcgagattaagagcaggcagtgtttac— 3 ' (含 ¾。 /酶 切位点及终止密码子 TAA)， 由上海英潍捷基贸易有限公司 （Invitrogen)合成； 通过 PCR方 法从日本血吸虫总 cDNA中扩增 SjHSP60 0RF全长序列， 送生物技术公司 （上海英潍捷基贸易 有限公司， Invitrogen)测序， 并回收 PCR产物； 测序结果如 SEQ. ID. NO. 2所示， 再通过在 线生物学工具 Biology WorkBench (http : //workbench, sdsc. edu/ ) 将其翻译成氨基酸序 列；并与人和小鼠的 HSP60 (Genebank中基因序列号分别为：人 HSP60— BC003030,小鼠 HSP60 -NM010477)进行序列比对。

SJHSP60开放阅读框 0RF的全长序列， 如 SEQ. ID. NO. 2所示， 共 1719bp。

SjHSP60开放阅读框 0RF的全长序列翻译后的氨基酸序列为如 SEQ. ID. NO. 1所示， 共

572个氨基酸。

2、 综合应用在线表位预测软件： IEDB (h tt ： / 1 tools, immuneepitope. org/main/ index, html ), w. syfpeithi. de/home. htm) 分析 SjHSP60分别与人 HSP60， 小鼠 HSP60的交叉性 T细胞表位。

3、 用 BamH I (NEB, #R3136V)禾 D Xhol I (NEB， #R0146V)将质粒 pGEX- 6P-1 和此上 ( 1 ) 中回收的 PCR产物进行双酶切； 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳进行分离鉴定后， 再分别 割胶回收质粒和 PCR片断的双酶切产物； 通过 T4 DNA连接酶 （NEB， #M0202S)进行载体和 PCR产物的连接， 构建重组表达载体 pGEX— SjHSP60; 转化 E. coli BL21感受态细胞， 37°C 培养过夜后， 挑取单克隆菌落， 接种于含 Amp的 LB培养液中， 37°C振摇培养过夜后， 抽提 质粒后行双酶切鉴定，进一步送测序公司鉴定 。鉴定成功后， 将菌液进行 1 : 100扩大培养， 至 0D值达 0. 6-0. 8时，加入 IPTG使其终浓度为 0. 05 mmol/L, 37Ό诱导表达 5h; 收集菌液， 4°C高速离心 20min， 用 1 X PBS重悬细菌沉淀； 通过超声破碎仪和反复冻融法裂菌； 再次 4 °0高速离心 20min， 分别取上清和沉淀， 以及未裂解的总蛋白进行 SDS— PAGE电泳分析蛋白 的表达量及分布情况；鉴定为可溶性表达后， 通过融合蛋白 GST亲和层析法，用 Glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare, 17-0751-01 ) 进行融合蛋白 GST_SjHSP60 的纯化； 并用 蛋白酶 PreScission™ Protease (GE Healthcare, 270843)对融合蛋白进行酶切， 最后得 到纯化的 SjHSP60; 经过 SDS-PAGE电泳分析纯化结果，纯度 >95%。 纯化的 SjHSP60交由上 海中科院英沐生物科技有限公司制备抗 SjHSP60的单克隆抗体 （anti-SjHSP60 mAb)。 制备 可溶性的成虫（SWA)和虫卵抗原（SEA)，通过 Weatern Blot实验检测 anti_SjHSP60 mAb的特 异性和抗体效价； 验证成功后， 再用 anti-SjHSP60 mAb, 通过免疫组织化学方法， 检测日 本血吸虫成虫 （雌虫和雄虫） 和虫卵中 SjHSP60的天然表达和分布情况。 结果如图 1和表 1所示， SjHSP60与人、 小鼠 HSP60序列上具有高度的同源性， 序列的一 致性分别达到 72 %和 70 % ;通过 T细胞表位预测后，发现 SjHSP60，与人 HSP60,与小鼠 HSP60， 均具有一系列相同或高度相似的 MHCI和 MHCI I类交叉性 T细胞表位。 表 1

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&2DPTKW TAL 实施例二： SjHSP60体内免疫小鼠或体外刺激小鼠淋巴细胞� �观察 SjHSP60对 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs的影响。

1. 将实施例一 (3)中纯化的 SjHSP60， 滤菌并通过 Polymyxin B— Agarose (Sigma, P14H) 去除其中的类毒素及其相关分子， 然后再通过 Limulus amebocyte lysate (LAL)检测试 剂盒 E— TOXATEKits (Sigma, ET0200) ， 验证纯化蛋白的内毒素去除效果， <0.001 FU/ml (0. I pg/ml) , 最后用 DC Protein Assay (BIA-RAD, 500-OHl)进行蛋白定量。 将 SJHSP60与不完全弗氏佐剂 IFA(Sigma，F550l)等体积混合，使 SjHSP60浓度为 250ug/ml， 反复涡悬振荡混匀。 对 BALB/c小鼠 （SPF级， 6— 8周龄， 雌性， 购自上海斯莱克实验动 物有限责任公司）进行腹股沟皮下免疫， 剂量为 25ug/l00ul/只， 首次免疫后， 隔两周再 同样免疫一次， 设 PBS免疫组为对照组。 整个过程小鼠饲养于 SPF级动物房 （南京医科 大学实验动物中心） 。 末次免疫结束后一周， 剖杀小鼠， 分离各组小鼠的脾和淋巴结， 研磨过滤后， 制备成单细胞悬液； 再经红细胞裂解液去除红细胞， 制备成单淋巴细胞悬 液; 进行细胞计数后， 对各组每只小鼠取 1X10 ⁶ 个细胞， 按 Mouse Regulatory T Cell Staining Kit (eBioscience, 88-8111-40) 操作说明书进行淋巴细胞的染色标记， 再经 流式细胞仪 FACSCalibur检测 CD4+CD25+Foxp3 ⁺ Tregs比例。

2. 分离正常 BALB/c小鼠的脾和淋巴结， 按此上（1) 中方法， 制备成单淋巴细胞悬液； 细胞 计数后， 分别转移至 96孔圆底培养板， 5X10 ⁵ 个细胞 /孔； 再分三组进行刺激， 分别是 SjHSP60组 (0. lug/ml) /PBS组 /无刺激 (Medium)组， 每组设 4孔； 在 37°C， 5% C0 ₂ 细胞 孵箱培养 3天后， 收集各组细胞并进行计数， 每组取 IX 10 ⁶ 个细胞， 同此上（1)中方法检 测 CD4+CD25 ⁺ Foxp3+ Tregs比例。 结果如图 2所示， 体内外实验均证明， SjHSP60可以增加 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例。 实施例三： 探究 SjHSP60能否在炎症模型中发挥抑制炎症及免疫� �理反应的作用。

1. 按实施例二（1)中方法， 分两组： SjHSP60组 /PBS组， 体内免疫 DBA1小鼠 （南京大学国家 遗传工程小鼠资源库， 6— 8周龄， 雌性）。 建立胶原诱导型关节炎 （CIA) 小鼠模型： 混 合牛源 I I型胶原 （C II) Bovine Col lagen Type II ( BD , 354257 ) 和 Mycobacterium tuberculosis H37 A (Difco, 3114)，用 1 X PBS稀释，使两者浓度分别为 2mg/ml， 3mg/ml _; 在混合体系中再加入等体积的不完全弗氏佐剂 CFA，涡悬振荡仪上混匀 2min，反复 6— 8次， 每隔 30min—次； 于首次免疫 SjHSP60/PBS后一周， 在两组小鼠尾部皮下免疫混合抗原诱 导 CIA， lOOul/只。 诱导后一周， 对两组小鼠再分别免疫 SjHSP60/PBS—次。 诱导后 4周， 开始动态观察两组小鼠关节炎症表现， 隔天一次； 按如下标准进行炎性症状严重程度评 分：

0分： 正常， 无症状；

1分： 红斑， 只有踝关节轻微肿胀；

2分： 红斑， 从踝关节到跖骨、 掌指关节轻微肿胀；

3分： 红斑， 从踝关节到掌指关节中度肿胀；

4分： 红斑， 从踝关节到指尖严重肿胀；

每侧肢体最高分为 4分， 最低分为 0分； 每只小鼠总得分最高为 16分， 最低为 0分。

2. 与此上 （1 ) 中观察时间点同步， 使用电子数显游标卡尺 （购自温州三和量具仪器有限公 司）测量各组小鼠左后肢踝关节直径。

3. 诱导后 7周剖杀各组小鼠， 取各组小鼠前爪固定于含 10 %福尔马林的 1 X PBS中， 送标本至 上海瑞金医院伤骨科研究所进行 X光检测。

4. X光检测后， 将标本继续固定于含 10 %福尔马林的 1 X PBS中， 交由江苏省人民医院病理科 进行标本脱钙、 石蜡包埋、 切片及病理 HE染色； 显微镜下观察 HE病理结果。 结果如图 3所示， SjHSP60免疫组的 CIA小鼠， 其关节的炎性症状， 关节肿胀度， 关节损 害程度以及病理炎症反应都显著减轻。 实验例四： 观察 SjHSP60能否增加 CIA小鼠 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs, 从而发挥免疫抑制作用。

1. 分离 CIA诱导后 3W和 7W各组（HSP60组 /PBS组）小鼠脾和淋巴结， 按实施例二（1 )中方法， 检测各组小鼠 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例。

2. 在剖杀此上 （1 ) 中各组小鼠前， 对各组小鼠采血， 并分离出血清； 再经 ELISA检测各组 血清中 CII特异性抗体（IgG， IgG2a, IgGl ), 具体操作是： 用高亲和力酶标板预包被 CII， 5ug/ml， 4°C包被过夜； 弃去包被液， PBS-T洗板 2— 3遍； 5 %脱脂牛奶进行封闭， 200ul/ 孔， 37 °C孵育 2小时； 弃去封闭液， PBS-T洗板 2— 3遍； 1 : 20稀释各组血清后， 加入酶标 板， lOOul/孔， 4°C孵育过夜； 弃去血清， PBS-T洗板 3— 4遍； 加入稀释后的二抗： HRP anti-mouse IgG (Boster, BA1050 ) 1： 10000稀释， HRP anti-mouse IgG2a (BD, 553391 ) 和 HRP anti-mouse IgGl (BD, 559626 ) 均 1 : 1000稀释， lOOul/孔， 37°C孵育 1小时； 弃 去二抗， PBS-T洗板 4-5遍； 加入 TMB显色液 （ eBioscience, 00-4201-56)， 室温避光放置 10-15min后， 加入 2N ¾S0 ₄ 终止反应， lOOul/孔； 最后在酶标仪上进行读值。

3. 取此上（1 )中分离后得到的各组每只小鼠的淋巴细胞，� �别转移至 96孔圆底细胞培养板， 4 10 ⁵ 个/孔， 每只小鼠设 9个孔， 再各分为三组处理： Medium组 （不刺激） /ConA刺激组

( 2ug/ml ) /C II刺激组（5ug/ml)， 3孔 /组; 按实施例四 ( 5 ) 中方法， 通过 ¾摻入法捡测 各组淋巴细 fi增殖情况： 培养至 56小时， 加入氚胸腺嘧啶（ ³ H -thymidine , ¾-TDR) , 0. 5 Ci/?L ; 继续培养 16小时 （总计培养 3天） 后， 经 Beckman液体闪烁计数仪检测细胞的 3H-TDR掺入情况， 从而反映出 C II特异性的细胞免疫应答水平。 结果如图 4所示, SjHSP60使 CIA模型小鼠体内 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例显著增加； 进一步的 实验也证明， 针对 C II特异性的体液和细胞免疫应答都有明显的抑� ��。 实施例五： SjHSP60体外分别剌激小鼠 CD4 ⁺ T细胞， CD4 ⁺ CD25— T细胞， 进一步观察 SjHSP60如 何增加 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs。 分离正常 BALB/c 小鼠脾和淋巴结， 制备成单淋巴细胞悬液； 用试剂盒 CD4 ⁺ T cel l Isolation Kit (MACS, 130-090-860) 分选出 CD4+T细胞； 剩余的 CD4—淋巴细胞经 50ug/ml 丝裂霉素， 37Ό， 5 % (¾处理 30min后， 作为抗原递呈细胞 （APC) 使用。 再取部分 CD4 ⁺ T 细胞， 进一步再用 CD4+CD25+ Regulatory T Cel l Isolation Kit (MACS, 130-091-041 ) 去 除 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tregs, 从而分离出 CD4 ⁺ CD25— T细胞。 具体分选步骤均参照产品说明书。 通过 流式细胞术检测 CD4 ⁺ T细胞和 CD4 ⁺ CD25— T细胞纯度， 纯度分别>90 %和>95 %。 将两种细 胞分别转移 96孔圆底培养板， 2 X 10 ⁵ 个细胞 /孔， 再加入 APC：， 2 X 10 ⁵ 个 /孔； CD4 ⁺ T细胞和 CD4+CD25— T细胞再各自分两组处理， 刺激组 (SjHSP60, 0. lug/ml ) /不处理组 (Medium) 在 37°C， 5 % C0 ₂ 细胞孵箱培养 3天后， 收集各组细胞并计数； 每组取 I X 10 ⁶ 个细胞， 流式 细胞术检测 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例。 此实例中相关具体方法可参考实施例二 （1 )。 结果如图 5所示， SjHSP60增加 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs可通过诱导 CD4 ⁺ CD25— T细胞转化 而来。 实施例六： 观察 SjHSP60增加 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs是否可通过直接扩增 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tregs, 扩 增后的 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tregs免疫抑制力如何。

1. 按实施例二 （2 ) 中方法分离正常 BALB/c小鼠的脾和淋巴结， 制备成单淋巴细胞悬液； 用 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Regulatory T Cell Isolation Kit按照说明书步骤分选出 CD4+CD25+ Tregs。 参 照实施例五中方法， 流式细胞术检测 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tregs的细胞纯度， 纯度 > 95 %。 转移 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tregs至 96孔圆底细胞培养板， 2 X 10 ⁵ 个细胞 /孔； 再分三组处理： anti-CD3 (BD, 553057)刺激组（lug/ml) /SjHSP60刺激组（0· 5ug/ml ) / SjHSP60 (0. 5ug/ml ) + anti-CD3 (lu _g /ml)刺激组， 均为 5孔 /组。 按实施例四 （3 ) 中方法， 通过 摻入法检测 各组 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tregs的增殖情况。

2. 按此上（1)中具体方法分选并剌激处理 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tregs, 培养 3天后， 收集并计数； 转移至 96孔圆底细胞培养板， 1 10 ⁵ 个/孔， 4孔 /组。 再按实施例五中方法分选正常 BALB/C小鼠 CD4—细胞 （作为 APC使用） 和 CD4+CD25— T细胞， 分别加入每孔 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tregs, 1 X 10 ⁵ 个 /孔。 共培养 3天后， 同样按实施例四 （3 ) 中方法， 通过¾惨入法检测各组 CD4 ⁺ CD25— T细 胞的增殖情况， 进而反映各组 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tregs的抑制力。 结果如图 6所示， SjHSP60还可通过直接扩增 CD4+CD25+ Tregs,增加 CD4+CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs; 且扩增后的 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tregs具有更强的免疫抑制力。 实施例七： 去除 SjHSP60全长序列中第 435到第 458氨基酸的多肽 （ SJMHE1 ) 后， 得到 SjHSP60 (D)， 观察 S jHSP60 (D)是否还能增加小鼠 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例。 1. 应 用 在 线 蛋 白 质 结 构 和 功 能 预 测 软 件 Phyre server (http://www. sbg. bio. ic. ac. uk/phyre/), 预测 SjHSP60蛋白分子的空间结构以及表面功能 残基 （蛋白一蛋白作用位点）。

2. 按附图中图 8所示设计引物：

P1 (5， 一 3， ) ： cgcggatcccaaccggtgacaatgttacgag

P2 (5' ― 3' ) ： cacacctgttcgctgtatgccttcctcaattgct

P3 (5' ― 3， ) ： attgaggaaggcatacagcgaacaggtgtgcg

P4 (5' ― 3' ) ： ccgctcgagattaagagcaggcagtgttta

以实施例一 （3) 中构建的重组表达载体 pGEX— SjHSP60为模板： 以 P1/P2为上下游引 物进行 PCR I; 以 P3/P4为上下游引物进行 PCR II； 两次 PCR后， 得到了缺失 SJMHE1且有 部分重叠的两个 PCR产物。

3. 等摩尔混合此上 （2) 中 PCR I和 PCR II产物 （质量比大约为 3.5: 1) ，以此为模板， 以 P1/P4为上下游引物， 进行 PCR III， 得到了缺失 SJMHE1的 SjHSP60(D)， 共 1816bp。 其全长 cDNA序列和经过翻译出来的氨基酸序列分别为 SEQ. ID. NO.4和 SEQ. ID. NO.3所 示。

4. 回收此上（3)中 PCR III产物；按实施例一（3)中方法，用回收的 PCRIII产物和 pGEX-6P-l 构建重组表达载体 pGEX-SjHSP60(D); 诱导表达和纯化 SjHSP60 (D)； 再进行内毒素的去 除和定量验证， 最后进行蛋白定量。 按实施例二（1)中具体方法， 用 SjHSP60(D)以及多 肽 SJMHE1 (由上海生工公司合成， 纯度 >99%， 序列如 SEQ. ID. NO.5所示） 体内免疫正 常 BALB/c小鼠， 设 PBS免疫组为对照组， 检测各组小鼠脾和淋巴结中 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Fox _P 3 ⁺ Tregs比例。

5. 按实施例二（2) 中方法， 用 SjHSP60(D)/多肽 SJMHE1/PBS体外剌激正常 BALB/c小鼠的脾 和淋巴结细胞， 检测各组小鼠脾和淋巴结中 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例。 结果如图 7所示， 经过软件预测发现， SjHSP60的三维空间结构表面， 除了 SJMHE1, 还 存在其它一些功能性残基 （蛋白 -蛋白作用位点）； 进一步体内外实验证明， 缺失 SJMHE1的 SjHSP60 (D)仍可增加小鼠脾和淋巴结中 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例。 结合图 2分析， 可以发 现： 与 SJMHE1相比较， SjHSP60和 SjHSP60(D)体内免疫小鼠 （ / w'ra)增力 []CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例的能力更强一些；而体外刺激淋巴细� ��（ in vitro), SJMHEl, SjHSP60和 SjHSP60 (D) 三者增加 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs比例的能力无明显差异。 本发明不限于这些公开的实例方案， 本发明将覆盖在专利书中所描述的范围， 以及权 利要求范围的各种变型和等效变化。