Antimicrobianos frente a patógenos del género Streptococcus

La presente invención se refiere a una serie de compuestos para su uso antimicrobiano frente a patógenos del género Streptococcus.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Streptococcus pneumoniae, también conocido como neumococo, es una bacteria cocoide Gram-positiva, anaerobia facultativa, no esporulada e inmóvil cuyo hábitat principal son las vías respiratorias superiores de humanos (Brooks L, Mias G. (2018) Streptococcus pneumoniae’s virulence and host immunity: aging, diagnostics, and prevention. Front. Immunol. 9(1136): 1-29. https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.01366).

Neumococo es un importante patógeno humano responsable tanto de patologías invasivas como no invasivas, tales como la meningitis y la otitis media, siendo el principal agente causal de la neumonía adquirida en comunidad (Loughran AJ, Orihuela CJ, Tuomanen El. (2019). Streptococcus pneumoniae: Invasion and Inflammation. Microbiol Spectr. 7(2):GPP3-0004-2018. https://dx.doi.org/10.1128%2Fmicrobiolspec.GPP3- 0004-2018)). Además, se ha descrito recientemente como el mayor agente co-infectante con el virus SARS-CoV-2 (Zhu X, Ge Y, Wu T, Zhao K, Chen Y, Wu B, Zhu F, Zhu B, Cui L. (2020). Co-infection with respiratory pathogens among COVID-2019 cases. Virus Research 285: 198005. https://doi.Org/10.1016/j.virusres.2020.198005; y Garcia-Vidal C, Sanjuan G, Moreno-García E, Puerta-Alcalde P, Garcia-Pouton N, Chumbita M, Fernandez-Pittol M, Pitart e, Inciarte A, Bodro M, Morata L, Ambrosioni J, Grafía I, Meira F, Macaya I, Cardozo C, Casals C, Tellez A, Castro P, Marco F, García F, Mensa J, Martinez JA, Soriano A for the COVID-19 Researchers Group. (2021). Incidence of coinfections and superinfections in hospitalized patients with COVID-19: a retrospective cohort study. Clin. Microbiol. Infect 27(1):83-88. doi: 10.1016/j.cmi.2020.07.041), y en aquellos casos de co-infección se relaciona con un peor pronóstico (Pal C, Przydzial P, Chika-Nwosuh O, Shah O, Patel P, Madan N. (2020). Streptococcus pneumoniae coinfection in COVID-19: a series of three cases. Hindawi Case Reports in Pulmonology, article ID 8849068. https://doi.org/10.1155/2020/8849068; y Nieto-Moro M, Giuseppe Ecclesia F, Tomé-Masa I, De Lama Caro-Patón G, Leoz-Gordillo I, Cabrero-Hernández M, García-Salido A. (2020) SARS-CoV-2 and Streptococcus pneumoniae coinfection as a cause of severe pneumonia in an infant. Pediatric Pulmonology 2020; 1-3. http://doi.org/10.1002/ppul.24916).

La insuficiente cobertura procurada por las vacunas actuales, así como la falta de antimicrobianos eficaces para el tratamiento de ciertas cepas, lo ha convertido en un patógeno prioritario para la investigación de nuevas estrategias terapéuticas (World Health Organization. (2017). List of bacteria for which new antibiotics are urgently needed. Available from: htps://www.who.int/news/item/27-02-2017-who-publishes-list- of-bacteria-for-which-new-antibiotics-are-urgentiy-needed; y Centers for Disease Control and Prevention (CDC). (2019). Antibiotic resistance threats in the United States. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services, CDC. Available from: https://www.cdc.gov/drugresistance/biggest-threats.html).

Una de estas estrategias es el reposicionamiento de drogas, basada en emplear fármacos ya autorizados por las agencias reguladoras en el tratamiento de nuevas patologías, o al menos identificar moléculas bioactivas que permitan su investigación y desarrollo. Al ser fármacos ya autorizados por las agencias reguladoras, se conocen sus propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas, así como su toxicidad, seguridad y vía de administración más adecuada, por lo que el número de ensayos clínicos realizados para determinar estos parámetros sería menor. Esto permite reducir costes y tiempo en la investigación, dando como resultado la introducción de moléculas ya conocidas para el tratamiento de una nueva enfermedad de manera relativamente rápida (Oprea TI, Mestres, J. (2012). Drug repurposing: far beyond new targets for old drugs. The AAPS Journal 14: 759-763. http://doi.Org/10.1208/s 12248-012-9390- 1^Xue H, Li J, Xie H, Wang Y. (2018). Review of drug repositioning approaches and resources. Int. J. Biol. Sci. 14: 1232-1244. https://doi.org/10.7150/ijbs.24612; y Corsello SM, Bittker JA, Liu Z, Gould J, McCarren P, Hirschman JE, Johnston SE, Vrcic A, Wong B, Khan M, Asiedu J, Narayan R, Mader CC, Subramanian A, Golub TR. (2017). The drug repurposing hub: a next generation drug library and information resource. Nat. Med. 23: 405-408. https://doi.org/10.1038/nm.4306).

Por tanto, debido a los niveles preocupantes de resistencia a antimicrobianos y a la insuficiente cobertura de las vacunas actuales, sería deseable disponer de nuevos antimicrobianos frente a Streptococcus. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto seleccionado de:

GBR 12909 (Vanoxerina)

1-(2-[bis(4-fluorofenil)metoxi)etil)-4- (3-fenilpropil)piperazina

Clomifeno (Z, E) (E,Z)-2-(4-(2-cloro-1 ,2- difeniletenil)fenoxi) -N, N- dietiletanoamina

Mianserina

(±)-2-metil-1 ,2,3,4, 10, 14 b- hexahidrodibenzofc, f]pirazino[ 1 , 2- a]azepína

Clofiiium

4-(4-clorofenil)butil-dietil- heptilazanio

Amiodarona

(2-butil- 1 -benzofuran-3-il)-[4-[2- (dietilamino)etoxi]-3,5- diyodofenil]metanone

Perhexilina

2-(2,2-diciclohexiletil)pipendina

Terfenadina

1 -(4-tert-butilfenil)-4-[4- [hidroxi(difen¡l)met¡l]piperidin- 1 - il]butan-1-ol o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso antimicrobiano frente a patógenos del género Streptococcus, preferiblemente para su uso en el tratamiento de enfermedades microbianas causadas por Streptococcus, más preferiblemente para su uso en el tratamiento de enfermedades causadas por Streptococcus pneumoniae (neumococo), Streptococcus oralis, Streptococcus mitis, Streptococcus, pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus viridans o Streptococcus mutans, aún más preferiblemente para su uso en el tratamiento de enfermedades causadas por Streptococcus pneumoniae (neumococo), todavía más preferiblemente su uso en el tratamiento de neumonía, meningitis, bacteriemia, sinusitis u otitis, y todavía aún más preferiblemente para el tratamiento de neumonía adquirida en comunidad, meningitis bacteriana u otitis media.

En otra realización la invención se refiere al compuesto o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso definido anteriormente, seleccionado de:

Clofilium Amiodarona

(2-butil- 1 -benzofuran-3-il)-[4-[2-

(dietilamino)etoxi]-3,5- diyodofenil]metanone

En otra realización la invención se refiere al compuesto o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso definido anteriormente, seleccionado de:

GBR 12909 (Vanoxerina)

1-(2-[bis(4-fluorofenil)metoxi)etil)-4-

(3-fenilpropil)piperazina

Clomifeno (Z, E)

(E,Z)-2-(4-(2-cloro-1 ,2- difeniletenil)fenoxi) -N, N- dietiletanoamina En otra realización la invención se refiere al compuesto:

GBR 12909 (Vanoxerina)

1-(2-[bis(4-fluorofenil)metoxi)etil)-4-

(3-fenilpropil)piperazina para el uso definido anteriormente. Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto seleccionado de:

GBR 12909 (Vanoxerina)

1-(2-[bis(4-fluorofenil)metoxi)etil)-4- (3-fenilpropil)piperazina

Ciomifeno (Z, E) (E,Z)-2-(4-(2-cloro-1 ,2- difeniletenil)fenoxi) -N, N- dietiietanoamma

Mianserina

(±)-2-metil-1 ,2,3,4, 10, 14b- hexahidrodibenzo[c, f]pirazino[ 1 , 2- ajazepina

Clofilium

4-(4-clorofenil)butil-dietil- heptilazanio

Amiodarona

(2-butil- 1 -benzofuran-3-il)-[4-[2- (dietilamino)etoxi]-3,5- diyodofenil]metanone

Perhexilina

2-(2,2-diciclohexiletil)piperidina

Terfenadina 1-(4-tert-butilfenil)-4-[4- [hidroxi(difenil)metil]piperidin- 1 - il]butan-1 -ol o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para el tratamiento de enfermedades microbianas causadas por Streptococcus, preferiblemente para el tratamiento de enfermedades causadas por Streptococcus pneumoniae (neumococo), Streptococcus oralis, Streptococcus mitis, Streptococcus, pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus viridans o Streptococcus mutans, aún más preferiblemente para el tratamiento de enfermedades causadas por Streptococcus pneumoniae (neumococo), todavía más preferiblemente para el tratamiento de neumonía, meningitis, bacteriemia, sinusitis u otitis, y aún más preferiblemente para el tratamiento de neumonía adquirida en comunidad, meningitis bacteriana u otitis media, en un sujeto que lo necesite, especialmente en humanos, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de un compuesto seleccionado de:

GBR 12909 (Vanoxerina) 1-(2-[bis(4-fluorofenil)metoxi)etil)-4- (3-fenilpropil)piperazina

Clomifeno (Z, E)

( E,Z) -2- (4- (2-cloro -1,2- difeniletenil)fenox¡) -N, N- dietiletanoamina

Mianserina

(±)-2-metil- 1 ,2,3,4, 10, 14b- hexahidrodibenzo[c,f]pirazino[1,2- ajazepina

Clofilium

4-(4-dorofenil)butil-díetíl- heptilazanio Amiodarona

(2-butil- 1 -benzofuran-3-il)-[4-[2- (dieti!amino)etoxi]-3,5- diyodofeniljmetanone

Perhexilina

2-(2,2-diciclohexiletil)pipendina

Terfenadina

1 -(4- tert-butilfenil) - 4-[4 - [hidroxi(difenil)metil]piperidin- 1 - il]butan-1-ol o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto seleccionado de:

GBR 12909 (Vanoxerina)

1-(2-[bis(4-fluorofenil)metox¡)et¡l)-4-

(3-femlpropil)piperazina

Clomifeno (Z, E) (E,Z)-2-(4-(2-cloro-1 ,2- difeni1eteni1)fenoxi) -N, N- dietiletanoamina

Mianserina

(±)-2-metil-1,2,3,4, 10, 14b- hexahidrodibenzo[c, f]pirazino[ 1 ,2- a]azepina

Clofílium

4-(4-clorofenil)butil-dietil- heptilazanio Amiodarona

(2-butil- 1 -benzofuran-3-il)-[4-[2- (dietiiamino)etoxi]-3,5- diyodofeniljmetanone

Perhexilina

2-(2,2-diciclohexiletil)piperidina

Terfenadina

1 -(4- tert-butilfenil) - 4-[4 - [hidroxi(difenil)metil]piperidin- 1 - il]butan-1-ol o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo como antimicrobiano frente a patógenos del género Streptococcus, preferiblemente para el tratamiento de enfermedades microbianas causadas por Streptococcus, más preferiblemente para el tratamiento de enfermedades causadas por Streptococcus pneumoniae (neumococo), Streptococcus oralis, Streptococcus mitis, Streptococcus, pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus viridans o Streptococcus mutans, aún más preferiblemente para el tratamiento de enfermedades causadas por Streptococcus pneumoniae (neumococo), todavía más preferiblemente para el tratamiento de una enfermedad seleccionada de neumonía, meningitis, bacteriemia, sinusitis y otitis, y todavía aún más preferiblemente para el tratamiento de una enfermedad seleccionada de neumonía adquirida en comunidad, meningitis bacteriana y otitis media.

Los compuestos de la invención tienen propiedades bactericidas que, por tante, también los hacen útiles para usos no terapéuticos tales como antimicrobianos para la desinfección de, por ejemplo, superficies. Ejemplos de aplicación de los compuestos de la invención incluyen, entre otros la limpieza o recubrimiento de material médico, veterinario, dental y quirúrgico, implantes en general tales como dentales, cardiacos o cocleares, asi como catéteres, tubos de ventilación, ventiladores, tubos endotraqueales y en general cualquier otra superficie en la que pueda crecer una biopelícula del patógeno.

Así, otro aspecto de la invención se refiere al uso no terapéutico como antimicrobiano frente a patógenos del género Streptococcus, preferiblemente frente aStreptococcus pneumoniae (neumococo), Streptococcus oralis, Streptococcus mitis, Streptococcus, pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus viridans o Streptococcus mutans, más preferiblemente frente a Streptococcus pneumoniae (neumococo), y aún más preferiblemente para su uso no terapéutico como antimicrobiano para la desinfección de la superficie de un material, de un compuesto seleccionado de:

GBR 12909 (Vanoxerina) 1-(2-[bis(4-fluorofenil)metoxi)etil)-4- (3-fenilpropil)piperaz¡na

Clomifeno (Z, E) (E,Z)-2-(4-(2-cloro-1 ,2- difeniletenil)fenoxi) -N, N- dietiletanoamina

Mianserina

(±)-2-metil-1 ,2,3,4, 10, 14b- hexahidrodibenzo[c, f]pirazino[ 1,2- ajazepina

Clofilium

4-(4-clorofenil)butil-dietil- heptilazanio

Amiodarona

(2-butil- 1 -benzofuran-3-il)-[4-[2-

(dietilamino)etox¡]-3,5- diyodofenil]metanone

Los compuestos de la invención han sido seleccionados por cribado de compuestos aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (Food and Drug Administration’, FDA) de Estados Unidos y por la Agencia Europea del Medicamento (European Medicines Agency; EMA) incluidos en la librería química comercial Prestwick®. Estos compuestos han demostrado efecto bactericida in vitro frente a S. pneumoniae a concentraciones terapéuticas, con concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) entre 26 y 50 pg mL ^-1 en cepa capsuiada (infectiva), ocasionando una disminución de viabilidad bacteriana de entre un 80 y un 99,9 %. En todos los casos la adición de estos compuestos induce una perturbación de la membrana bacteriana que da lugar a un incremento de su permeabilidad, por lo que es probable que actúen mediante mecanismos similares.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención (o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo) y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Los excipientes deben ser “aceptables” en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la composición y de no ser perjudiciales para quién tome dicha composición.

Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados en forma de cualquier formulación farmacéutica, la naturaleza de la cual, como es bien sabido, dependerá de la naturaleza del principio activo y de su via de administración. En principio se puede utilizar cualquier vía de administración, por ejemplo, oral, parenteral, nasal, ocular, rectal, y tópica.

Las composiciones sólidas para la administración oral incluyen comprimidos, granulados y cápsulas. En cualquier caso el método de fabricación está basado en una mezcla simple, granulación seca o granulación húmeda del principio activo con excipientes. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes tales como lactosa, celulosa microcristalina, manitol o hidrogenofosfato calcico; agentes aglutinantes como por ejemplo almidón, gelatina o polivinilpirrolidona; disgregantes como carboximetilalmidón sódico o croscarmelosa sódica; y agentes lubricantes como por ejemplo estearato magnésico, ácido esteárico o talco. Los comprimidos pueden ser además recubiertos con excipientes adecuados y mediante técnicas conocidas con el objeto de retrasar su disgregación y absorción en el tracto gastrointestinal y así conseguir una acción sostenida durante un mayor período de tiempo, o simplemente para mejorar sus propiedades organolépticas o su estabilidad. El principio activo puede también ser incorporado por recubrimiento sobre pellets inertes mediante el uso de polímeros filmógenos naturales o sintéticos. También es posible la realización de cápsulas de gelatina blanda, en las que el principio activo se mezcla con agua o con medio oleoso, por ejemplo aceite de coco, parafina líquida o aceite de oliva.

Se pueden obtener polvos y granulados para la preparación de suspensiones orales mediante la adición de agua, mezclando el principio activo con agentes dispersantes o humectantes; suspensantes y conservantes. También pueden añadirse otros excipientes, por ejemplo edulcorantes, aromatizantes y colorantes.

Como formas líquidas para la administración oral se pueden incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires que contienen diluyentes inertes comúnmente utilizados, tales como agua destilada, etanol, sorbitol, glicerol, polietilenglicoles (macrogoles) y propilénglicol. Dichas composiciones pueden también contener coadyuvantes como agentes humectantes, suspensantes, edulcorantes, aromatizantes, conservantes y reguladores de pH.

Preparaciones inyectables, de acuerdo con la presente invención, para la administración parenteral, comprenden soluciones, suspensiones o emulsiones estériles, en un solvente acuoso o no acuoso como propilénglicol, polietilénglicol o aceites vegetales. Estas composiciones pueden también contener coadyuvantes, como humectantes, emulsionantes, dispersantes y conservantes. Podrían ser esterilizadas por cualquiera de los métodos conocidos o preparadas como composiciones sólidas estériles que serán disueltas en agua o cualquier otro medio inyectable estéril inmediatamente antes de uso. También es posible partir de materias primas estériles y mantenerlas en estas condiciones durante todo el proceso de fabricación.

Para la administración rectal, el principio activo puede ser formulado preferentemente como supositorio en una base oleosa, como por ejemplo aceites vegetales o glicéridos semisintéticos sólidos, o en una base hidrófila como polietilénglicoles (macrogol).

Los compuestos de la invención pueden también ser formulados para su aplicación tópica para el tratamiento de patologías en zonas o órganos accesibles por esta vía, como ojos, piel y tracto intestinal. Formulaciones incluyen cremas, lociones, geles, polvos, soluciones y parches en las que el compuesto se encuentra dispersado o disuelto en excipientes adecuados.

Para la administración nasal o por inhalación, el compuesto puede presentarse formulado en forma de aerosol de dónde es convenientemente liberado con el empleo de propelentes adecuados.

La dosificación y ia frecuencia de las dosis variarán en función de la naturaleza y gravedad de la enfermedad a tratar, la edad, la condición general y el peso del paciente, así como también del compuesto particular administrado y la vía de administración, entre otros factores.

Asimismo, los compuestos de la invención se pueden administrar solos o en combinación. También se ha de prever, para su administración, la utilización de soportes transportadores de tales compuestos en una o en múltiples copias, por ejemplo mediante el uso de nanopartículas, puesto que se ha demostrado que la dosis antimicrobiana de un determinado compuesto puede reducirse en varios órdenes de magnitud tras su disposición múltiple en la superficie de tales partículas, como por ejemplo se ha demostrado con partículas dendriméricas conteniendo varias copias de colina frente a Streptococcus pneumoniae (Hernández- Rocamora V, Maestro B, Waal B, Morales M, García P, Meijer EW, Merkx M, Sanz JM. (2009). Multivalent choline dendrimers as potent inhibitors of pneumococcal cell-wall hydrolysis. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 48(5): 948-951. https://doi.org/10.1002/anie.200803664: y de Gracia Retamosa M, Diez-Martinez R, Maestro B, García-Fernández E, de Waal B, Meijer EW, Sanz JM. (2015). Aromatic esters of bicyclic amines as antimicrobials against Streptococcus pneumoniae. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 54(46): 13673-13677. https://doi.org/10.1002/anie.201505700).

A Io largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1 Muestra las curvas de crecimiento de S. pneumoniae R6CIB17 en presencia de 25 pM del compuesto a testar, excepto maieato de perhexilina (50 pM) y clorhidrato de mianserina (100 pM). Fig. 2 Muestra la variación de la permeabilidad de las células neumocócicas S. pneumoniae R6CIB17 incubadas con cada compuesto a una concentración de 25 pM. Control positivo: Tritón X100 al 1 %.

EJEMPLOS

A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del producto de la invención.

Procedimiento: Se ha cribado una quimioteca de 1280 compuestos autorizados tanto por la U.S Food and Drug Administration (FDA) como por la European Medicines Agency (EMA) y comercializada por la empresa Prestwick Chemical (http://www. prestwickchemical.com/libraries-screening-lib-pcl.html) denominada Prestwick® (Prestwick Chemical Library®).

Los compuestos se obtuvieron en una concentración de 10 mM en dimetil sulfóxido (DMSO).

Los ensayos se realizaron en primera instancia de forma ciega sobre la cepa no capsulada R6CIB17 de neumococo ((GenBank accession number: CP038808), variante no floculante de la cepa usual de laboratorio R6), y el cribado se realizó de manera secuencial (100, 50 y 25 pM) en cultivos planctónicos (medio de cultivo líquido (Roig- Molina E, Sánchez-Angulo M, Seele, J, García-Asencio F, Nau R, Sanz JM, Maestro B. (2020). Searching for antipneumococcal targets: choline-binding modules as phagocytosis enhancers. ACS Inf. Dis. 6(5): 954-974. https://dx.doi.org/10.1021/acsinfecdis.9b00344), añadiendo el compuesto a una D.O.550nm de 0,1 .

Ejemplo 1.- Efecto sobre la curva de crecimiento

Tras el cribado a 25 pM, se seleccionaron los compuestos más eficaces que afectaban a la curva de crecimiento con respecto al control, y que no han sido descritos para su uso frente a S. pneumoniae. En la Fig. 1 se muestran las curvas de crecimiento, mientras que en la Tabla 1 se muestra el descenso en densidad óptica en el crecimiento de los compuestos definitivamente seleccionados, en % con respecto al control sin compuesto.

En segundo lugar, los más efectivos se testaron de nuevo sobre curva de crecimiento a concentración de 0,1 , 1 y 5 pM, pero ninguno de ellos tuvo efecto sobre la misma.

Ejemplo 2.- Efecto sobre la viabilidad

La actividad bactericida (ensayos de viabilidad en placa) de los compuestos seleccionados se llevó a cabo a 25 pM, excepto clorhidrato de mianserina (100 pM) y maléate de perhexilina (50 pM). De este ensayo se seleccionaron aquellos que disminuyen la viabilidad en más de un 90 % (recuento de viables < 3,6 x 10 ⁷ unidades formadoras de colonia por mililitro), a excepción del clorhidrato de mianserina.

En la Tabla 1 se muestra la viabilidad celular de R6CIB17 tras 140 min en presencia del compuesto.

Ejemplo 3.- Efecto sobre la permeabilidad

Para investigar el posible mecanismo bactericida de estos compuestos, y dado que todos ellos tienen una estructura química general comúnmente implicada en mecanismos de perturbación de la membrana celular (aminas terciarias o cuaternarias unidas a una parte hidrofóbica, casi siempre con grupos aromáticos) (Alkhalifa S, Jennings MC, Granata D, Klein M, Wuest WM, Minbiole KPC, Carnevale V. (2020). Analysis of the destabilization of bacterial membranes by quaternary ammonium compounds: a combined experimental and computational study. Chem.Bio.Chem. 21(10):1510-1516. https://doi.org/10.1002/cbic.201900698), se realizaron ensayos de permeabilidad de la membrana bacteriana (Roig-Molina E, Domenech M, Retamosa MG, Nácher-Vázquez M, Rivas L, Maestro B, García P, García E, Sanz JM. (2019). Widening the antimicrobial spectrum of esters of bicyclic amines: In vitro effect on grampositive Streptococcus pneumoniae and gram-negative non-typeable Haemophilus influenzae biofilms. BBA-General Subjects 1863(1). 96-104. https://doi.Org/10.1016/j.bbagen.2O18.10.001).

El estudio de la permeabilización de la membrana celular se realizó sobre S. pneumoniae R6 con los compuestos mostrados en la Tabla 1 , y se llevó a cabo utilizando como sonda Sytox Green. Un aumento en la permeabilidad de la membrana conlleva un incremento en la emisión de fluorescencia, causado por la entrada del colorante a través de la membrana y su unión subsiguiente a los ácidos nucleicos (Roig-Molina E, Domenech M, Retamosa MG, Nácher-Vázquez M, Rivas L, Maestro B, García P, García E, Sanz JM. (2019). Widening the antimicrobial spectrum of esters of bicyclic amines: In vitro effect on gram-positive Streptococcus pneumoniae and gram-negative non- typeable Haemophilus influenzae biofilms. BBA-Generai Subjects 1863(1). 96-104. https://doi.Org/10.1016/j.bbagen.2018.10.001).

La Fí g. 2 muestra que todos los compuestos, en mayor o menor grado, permeabilizaron la membrana, lo que parece indicar que todos ejercen su actividad antimicrobiana mediante un mecanismo molecular similar. En la Tabla 1 se muestran los datos de la permeabilidad de la membrana a los 95 min, respecto al control del 100 % de permeabilidad en presencia de tritón X100 al 1 %. En cualquier caso, es necesario recalcar que muchos otros compuestos de la librería que poseen similares características químicas (aminas unidas a una región hidrofóbica), no presentan actividad antimicrobiana alguna, por lo que luego los compuestos objeto de esta patente presentan un alto grado de especificidad adicional.

Ejemplo 4.- Concentración mínima inhibitoria (CMI)

Finalmente, se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI) de los compuestos utilizando los criterios del Instituto de Estándares del Laboratorio Clínico (CLSI) (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). (2009). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 19th informational supplement. CLSI documents M100-S19. CLSI, Wayne, PA.) mediante el sistema de microdilución, siguiendo las indicaciones descritas en la Norma Internacional ISO 20776 y empleando las cepas de neumococo R6 (no capsulada) y D39 (cepa capsulada, y por tanto infectiva). La CMI se calculó como la concentración más baja del agente a la cual se inhibe el crecimiento de forma visible. En paralelo se realizaron controles de crecimiento para cada cepa ensayada, y un control positivo (cepa tipo ATC49619+ ampicilína) y negativo (de esterilidad: medio de cultivo + mismo volumen del fármaco añadido al experimento) (Tabla 1).

Tabla 1 : (a): Actividad bactericida de compuestos seleccionados frente a S. pneumoniae R6CIB17. Los cultivos se crecieron en medio C+Y hasta una O.D.ssonm de 0,1 , momento en el que se adicionó el compuesto a estudiar a la concentración de 25 pM excepto * (50 pM) y ** (100 pM), tomando la muestra para el estudio de viables a los 140 min tras la adición. Se muestra el control de recuento de unidades formadoras de colonia (UFC) de S. pneumoniae y del mismo en presencia de DMSO a la concentración final en la que se encuentran los compuestos en el ensayo (0,5 %).

(b): Incremento de la entrada intracelular del colorante SyTOX Green desde el exterior, tras 90 min de incubación. Los cultivos de R6CIB17 se crecieron en medio C+Y hasta una O.D.550nm de 0,5-0, 6, posteriormente se centrifugaron y resuspendieron en tampón fosfato sódico 5 mM, pH 7,0 conteniendo sorbitol 280 nM y SyTOX Green 1 pM y se determinó la línea base. A continuación, se añadió el compuesto, a una concentración de 25 pM, y se midió el incremento de fluorescencia a 520 nm tras excitación a 485 nm en función del tiempo.