EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en la identificación de glutatión S transferasa (GSTs) en tumores cancerígenos y un novedoso tratamiento para mamíferos, que inhibe la expresión proteica de las proteínas GSTs. El tratamiento se lleva a cabo mediante la utilización de oligonucleótidos antisentido dirigidos a los ácidos ribonucleicos mensajeros (ARNm) de la GSTM3 y GSTP 1 , conduciendo a una proliferación reducida de células cancerosas y una disminución de la progresión

tumoral. Además, esa reducción en la proliferación se extiende a cánceres resistentes a las terapias convencionales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS) el cáncer es un término genérico que designa un amplio grupo de enfermedades que pueden afectar cualquier parte del organismo; también se le denominan tumores malignos o neoplasias malignas. Una característica que define al cáncer es una alterada división celular que se extienden más allá de sus límites habituales, pudiendo invadir partes adyacentes del cuerpo o propagarse a otros órganos, un proceso que se denomina metástasis. Las metástasis son la principal causa de muerte por cáncer.

La OMS considera que los cánceres más comunes son los de pulmón, mama, colorrectal, próstata, de estómago, hepático, de esófago, cérvico uterino, de tiroides, de vejiga, Linfoma no Hodgkin, de páncreas, leucemia, de riñón, de cuerpo uterino, orofaringe, cerebral y del sistema nervioso central, de ovario, de melanoma, de vesícula biliar, de laringe, de mieloma múltiple, de nasofaríngeo, de laringofaringe, linfoma Hodgkign, de testículos, glándulas salivales, de vulva, sarcoma de Kaposi, de pene, mesotelioma, y vaginal.

Por lo anterior, existe una necesidad de fármacos y tratamientos para mamíferos que incluso han sido diagnosticados con cáncer.

A manera de ejemplo, uno de los tratamientos más comunes para el cáncer cérvico uterino incluye una terapia de quimiorradiación basada en cisplatino. Además, este tratamiento es regularmente la única opción para tratar el cáncer cérvico uterino en estadios avanzados, y en la mayoría de los casos no se logra erradicar la enfermedad (ver Green, J. A., Kirwan, J. M., Tiemey, J. F., Symonds, P., Fresco, L., Collingwood, M., & Williams, C. J. (2001). Survival and recurrence after concomitant chemotherapy and radiotherapy for cáncer of the uterine cervix: a systematic review and meta- analysis. Lancet, 358(9284), 781-786.

Existe una vasta literatura y documentos de solicitudes de patente relacionados con el tratamiento de cánceres, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense 15/270,774 de ZHI-MING ZHENG et al., se refiere a marcadores de polinucleótido que pueden ser detecta dos y pueden ser usados para el diagnóstico de pre-cánceres asociados al Virus del Papiloma Humano y cánceres asociados al Virus del Papiloma Humano, tal como cáncer cérvico uterino y neoplasias intraepiteliales cervical así como métodos de tratamiento de tales cánceres. Sin embargo, dicho documento al igual otros, no señala el tratamiento de cánceres en mamíferos ya diagnosticados con los mismos.

La solicitud de patente Mexicana No. MX/a/2014/004285 se refiere a un método para el diagnóstico de cáncer cérvico uterino que comprende realizar un corrimiento electroforético en gel de poliacrilamida de una muestra de suero de un sujeto sospechoso de tener cáncer cérvico uterino, así como determinar la presencia de al menos una proteína de peso molecular seleccionada entre el grupo de 60 kDa y 50 kDa. Este documento está dirigido a diagnosticar en forma temprana cáncer cérvico uterino , pero no a dar tratamiento a mamíferos que ya fueron diagnosticados con cáncer cérvico uterino.

La patente europea No. EP 1531843 se refiere al estudio hematológico en oncogineclogía, el cual puede ser usado en pacientes con reaparición de cáncer cervical para evaluar la efectividad del tratamiento anti-tumoral y predecir el curso del proceso del tumor. El método hace posible llevar a cabo la selección del más importante método racional de impacto antitumoral y minimizar el desarrollo de un número de efectos colaterales. Dicho documento no describe el seleccionar candidatos a dicho tratamiento para mejor la efectividad del mismo.

El documento de patente No. JP2005189228 proporciona un método y kit para diagnosticar cánceres incluyendo cáncer de pulmón no microcítico, cáncer esofágico, cáncer laríngeo, cáncer faríngeo, cáncer lingual, cáncer del estómago, cáncer renal, cáncer del intestino grueso, cáncer cervical, tumor cerebral, cáncer del páncreas y cáncer de la vejiga, los cuales son provistos con una técnica inmunológica que utiliza anticuerpos monoclonales antiAKRIBlO. En dicho documento se reclama una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: l en una muestra biológica, o una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la cual uno o más aminoácidos son suprimidos, sustituidos o adicionados en la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: l y tiene una actividad de aldoceto lactasa. La proteína es aquella que tiene la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: l, la cual es detectada por un método inmunológico. El documento se refiere a diagnosticar los tipos de cáncer allí mencionados, pero no a tratar un mamífero que ya ha sido diagnosticado con cáncer.

Las GST son una familia de enzimas que exhiben diversas funciones, que incluyen la detoxificación de compuestos xenobióticos, la evasión del sistema inmune y la inhibición de la apoptosis. En diversos tipos de cáncer, se ha informado que los miembros de la familia de la glutatión S- transferasa (GST) se encuentran sobre expresados y en la mayoría de los casos están relacionados con un mal pronóstico y con una resistencia a la quimioterapia (ver Cabelguenne et al., 2001; Huang, Tan, Thiyagarajan, & Bay, 2003; Meding et al., 2012; Pectasides, Kamposioras, Papaxoinis, & Pectasides, 2008). En particular, se ha informado que la GSTP1 y la GSTM3 se encuentran desregulados en las células del cáncer, como: cáncer de mama triple negativo, cáncer de próstata, cáncer de pulmón y cáncer colorectal (ver Loktionov, a, Watson, M. a, Gunter, M., Stebbings, W. S., Speakman, C. T., & Bingham, S. a. (2001). Glutathione-S-transferase gene polymorphisms in colorectal cáncer patients: interaction between GSTM1 and GSTM3 alíele variants as a risk- modulating factor. Carcinogenesis, 22(7), 1053-1060.

Además, se sabe que la proteína GSTP1 desempeña un papel regulador a través de la interacción con la proteína TRAF2 y la disminución de la transducción de señal de los receptores en las vías de TNF-a y JNK, que son responsables de la activación de la apoptosis (ver Adler, V., Yin, Z., Fuchs, S. Y., Benezra, M., Rosario, L., Tew, K. D., Ronai, Z. (1999). Regulation of JNK signaling by GSTp. The EMBO joumal, 18(5), 1321-1334). Por otro lado, se ha observado que, la sobre expresión de la GSTM3 en el cáncer de colon, se considera un marcador de metástasis ganglionares regionales (ver Meding, S., Balluff, B., Elsner, M., Schóne, C., Rauser, S., Nitsche, U., ... Walch, A. (2012). Tissue- based proteomics reveáis FXYD3, SI 00 Al 1 and GSTM3 as novel markers for regional lymph node metástasis in colon cáncer. Journal of Pathology, 228(4), 459-470), y la subexpresión de GSTM3 en el cáncer de vejiga urinaria se asocia con una mayor supervivencia (ver Mitra, A. P., Pagliarulo, V., Yang, D., Waldman, F. M., Datar, R. H., Skinner, D. G., ... Cote, R. J. (2009). Generation of a concise gene panel for outcome prediction in urinary bladder cáncer. Journal of Clinical Oncology, 27(24), 3929-3937).

Recientemente se han usado moléculas antisentido capaces de inhibir la expresión génica con una gran especificidad y, debido a esto, se están realizando muchos esfuerzos de investigación relacionados con la modulación de la expresión génica mediante los oligonucleótidos antisentido (OAS). Algunos de estos OAS se centran en la inhibición de genes específicos como los oncogenes o genes virales. Los oligonucleótidos antisentido se dirigen contra el ARN (cadena sentido) o contra el ADN, donde forman estructuras triples que inhiben la transcripción por la ARN polimerasa P. Para lograr un efecto deseado en la regulación negativa del gen específico, los oligonucleótidos deben promover la descomposición del ARNm dirigido o bloquear la traducción de ese ARNm, evitando así la síntesis de novo de la proteína diana no deseada (ver US 20120029060 Al)

La publicación internacional No. WO2017091885 que describe el uso de oligonucleótidos antisentido, proporciona compuestos , composiciones y métodos para modular la expresión del transportador de monocarboxilato 4 (MCT4). En particular, esta invención se refiere a oligonucleótidos antisentido (OAS) capaces de modular la expresión del ARNm de MCT4 humano, y sus usos y métodos para el tratamiento de diversas i ndicaciones, incluidos varios cánceres. En particular, la invención se refiere a terapias y métodos de tratamiento para cánceres tales como el cáncer de próstata, incluyendo el cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC). La sobre expresión proteica de las proteínas GSTM3 y GSTP1 durante la progresión tumoral (de aquí en adelante identificada como PT) desempeñan un papel regulador a través de la interacción con las proteínas, por ejemplo las proteínas TRAF2/6 y, por lo tanto, una evasión de la transducción de señales de la activación de la apoptosis, favoreciendo la supervivencia celular y la PT (Wu Y, Fan Y, Xue B, Luo L, Shen J, Zhang S, Jiang Y, Yin Z. Human glutathione S-transferase Pl-1 interacts with TRAF2 and regulates TRAF2-ASK1 signáis. Oncogene. 2006; 25: 5787-800. doi:

10.1038/sj.onc.1209576, Aunque GSTM3 interactua con TRAF6). Además, la expresión de GST’s está involucrada en la modulación de los procesos de detoxificación en las células cancerosas y, por lo tanto, participa en la respuesta de la quimiorresistencia de las terapias convencionales en los pacientes con cáncer.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la identificación de las proteínas GSTM3 y/o GSTP1 en cánceres, para proporcionar un tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigido a dichas proteínas (GSMT3 y GSTP1) a mamíferos identificados como candidatos para dicho tratamiento. Por lo menos uno o más de dichos oligonucleótidos combinados bloquean una proteína específicamente o ambas proteínas.

De acuerdo con un primer aspecto, la invención está dirigida a las proteínas GSTM3 y GSTP1 para ser usadas como blancos terapéuticos y/o factores de pronóstico para mamíferos con cáncer.

En la presente invención se utilizaron líneas celulares de cáncer xenoinjertadas en ratones inmunodeprimidos, para analizar a través de su proteómica, las diferencias de expresión de las proteínas durante la progresión tumoral. En este análisis se encontró que, las glutatión S transferasa P1 y M3 (de aquí en adelante nombradas como GSTP1 y GSTM3, respectivamente) fueron algunas de las proteínas que aumentaron consistentemente sus niveles durante el crecimiento del tumor. Además, se encontró, que a través de la“inhibición de los genes” (knock-down) de dichas proteínas, éstas juegan un papel crítico para la sobrevivencia celular y progresión tumoral. También, se correlacionó la abundancia de los niveles de estas proteínas en biopsias de cáncer, con la supervivencia de los pacientes. Por lo que se demostró que las proteínas GSTP1 y GSTM3 son útiles además para propósitos de pronósticos y que son candidatos excelentes para terapias basadas en genes blanco para cáncer. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona el uso de oligonucleótidos antisentido de las glutatión S transferasas, preferentemente GSTM3 y GSTP1, sin estar limitadas a ellas, para el tratamiento de cánceres, en sujetos candidatos que previamente han sido diagnosticados con cáncer, en donde los oligonucleótidos antisentido son de entre 15-50 nucleótidos de longitud. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de tratamiento para el cáncer que comprende: a) la extracción de la proteína del tejido tumoral, b) llevar a cabo un análisis mediante técnicas de inmunodetección tal como, por ejemplo, manchado de bandas por western (Western blot), inmunohistoquímica, ELISA, etc., para identificar si el tumor tiene las proteínas GSTM3 y/o GSTP1 y c) administrar los oligonucleótidos antisentido para dichas proteínas.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un kit para identificar a un sujeto candidato a ser tratado con los oligonucleótidos de la presente invención que comprende por lo menos un oligonucleótido antisentido de las glutatión S transferasas, preferentemente GSTM3 y GSTP1, sin estar limitadas a ellas, una solución de extracción de proteínas, por lo menos dos anticuerpos para la identificación de Las proteínas GSTM3 y GSTP1 y opcionalmente un anticuerpo secundario, y una solución de revelado colorimétrico para manchado western (western blot) o inmunohistoquímica (IHQ). Aspectos y ventajas adicionales de la presente invención serán mejor comprendidas por personas diestras en la técnica a la luz de la descripción detallada y con referencia a las siguientes figuras.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

La figura 1 A es una representación esquemática del diseño experimental para analizar la dinámica del proteoma de los tumores en un modelo murino de líneas celulares HeLa y SiHa.

La figura IB muestran la cinética del crecimiento tumoral de las líneas celulares HeLa (amarillo) y SiHa (azul). Se utilizaron los puntos finales de la cinética (30, 45 y 50 días), para realizar el análisis proteómico.

La figura 1C muestra que GSTM3 se identificó en tumores de HeLa y la GSTP1 en tumores de SiHa en electroforesis en 2-D. Los niveles de expresión de ambas proteínas se confirmaron mediante análisis de inmunotransferencia. Las figuras 1D-1F muestran una imagen representativa de cada proteína en los días 30, 45 y 5 0. (ID) 14 proteínas con expresión constante en tumores HeLa y SiHa; (1E) 3 proteínas con una subexpresión a lo largo del tiempo en HeLa y SiHa; (1F) 17 proteínas con diferente expresión entre los tumores de HeLa y SiHa. Las figuras 2A-2C muestran un análisis realizado a través del sitio web GeneCodis del enriquecimiento de la ontologia génica de las proteínas identificadas en el tumor délas células HeLa y SiHa. (2A) Procesos biológicos enriquecidos en las proteínas compartidas sobre-reguladas; (2B) procesos biológicos enriquecidos en las proteínas compartidas constantes; (2C) procesos biológicos enriquecidos en las proteínas sub-reguladas compartidas.

Las figuras 3A-3F muestran que GSTM3 interactúa con TRAF6 en tumores de cáncer cérvico uterino HeLa y SiHa , en condiciones fisiológicas. (3A) Red de interacción en Cytoscape que representa las interacciones-presa de GSTM3; (3B) análisis de coinmunoprecipitación de la GSTM3 y TRAF6; (3C) manchado Western para TRFA6, ERK, pERK, NF-k, PNF- KB; IKBa, p38, pp38, JNK, pJNK y TLR4 en los extractos de proteínas de los tumores de HeLa y SiHa; (3D) diagrama de Venn proporcional de las proteínas secretadas en las lineas celulares de cáncer cérvico uterino con 264 proteínas comunes; (3E) identificación de dos proteínas secretadas in vitro que pueden activar la vía señal de TLR4; HSP60 y HSP70; (3F) manchado western de los activadores de TRL4; HSP70 y HSP60 en los tumores de cáncer cérvico uterino, HSP60 secretada en SiHa y tumores HeLa en el día 50, y la proteína HSP70 secretada en tumores SiHa a los 45 días y tumores HeLa a los 30 y 50 días.

Las figuras 3G-3H muestran los flujos de trabajo para obtener proteínas secretadas in vivo o ex vivo. Las figuras 4A-4F muestran que GSTM3 interactúa con E7 de HPV18 en donde las GST y E7 proporcionan ventajas de supervivencia a las células expuestas a condiciones de estrés. (4A) La superposición de las proteínas de GSTP1 y GSTM3 muestran altas similitudes estructurales (verde- naranja), estructuras no conservadas (gris) y la estructura de la proteína E7 de HPV18 (azul) usando como molde la E7 de HPV16; (4B) interacción de la proteína recombinante humana ScGSTM3 N-6x his-tag con la E7 de la proteína HPV18; (4C) las células HeLa se transfectarón con un plásmido que expresa HE718C-6x his-tag; (4D) muestra ensayos PAEP; (4E) ensayo de supervivencia con 6.0 mM de cisplatino; (4F) ensayos de PAEP utilizando la línea celular MDA con 6.0 mM de cisplatino. Las figuras 4G-4H muestran que MDA-MB-231 es una línea celular negativa para HPV18 y las proteínas GSTs (GSTM3 y GSTP1) (4G), (4H) muestra la expresión de las proteínas GSTM3 y GSTP1 en cortes de tumores de mama (de MDA) y cáncer de colon (COLO 237) generados en ratonas de la cepa Nu/Nu. Las figuras 4I-4L muestran la construcción de plásmidos de levadura, transformación y expresión de proteína recombinante. (41) Proteína recombinante humana de GSTM3 con una etiqueta de histidina (His) que se expresara en la levadura Saccharomyces cerevisiae; (4J) después de capturar el GSTM3 recombinante, éste se incubó con un extracto de proteína de células HeLa (positivo para HPV18); (4K) proteína recombinante de E7 de HPV18 con una expresión de His en la línea celular HeLa; (4L) después de capturar la E7 del HPV18 recombinante 6x his-tag con perlas de níquel, está se incubó.

Las figuras 5A-5E muestran que la“inhibición de los genes” (knock-down) de GSTM3 y GSTP1 afecta la viabilidad de las líneas celulares de cáncer cervical en cultivo. (5A) Experimentos genéticos de“inhibición de los genes” (knock-down) de GSTM3 y GSTP1 en células de HeLa (líneas amarillas) y HaCaT (líneas azules); (5B) ensayo de viabilidad con OAS-control o OAS-GST (a 640 ng/mL) determinado por tinción con cristal violeta; (5C) ensayos de células vivas/muertas determinados por tinción de SYTO 9 (células vivas, color verde y células muertas, rojas) en células tratadas con OAS-control y OAS-GST (640 ng/mL); (5D-E) inhibición de GST con tratamiento oligonucleótido antisentido en líneas celulares de cáncer cérvico uterino.

Las figuras 6A-6E muestran como la“inhibición de los genes” (knock-down) de GSTM3 y GSTP1 afecta la progresión tumoral (TP) en tumores de cáncer cérvico uterino.

La figura 6F muestra la cinética de crecimiento de las líneas celulares con y sin SFB indicando que no hay diferencias significativas cuando las células llegan a confluencia del 70% al sexto día. Las figuras 7A-7B ilustran que los tumores HeLa tratados con OAS-GSTM3 muestran inactivación de las proteínas ERK y p65 NF- B.

Las figuras 7C-7D muestran que en los tumores de CaLo solo pERK se inactivó después del tratamiento con cualquiera de los oligonucleotidos antisentido para GST.

Las figuras 7E-7F muestran que para los tumores de SiHa solo se inactivó NF-kB por cualquiera de los tratamientos.

Las figuras 7G-7H muestran que en los tumores de CaSki ambas proteínas se inactivaron después de cualquier tratamiento.

Las figuras 8A-8D muestra la correlación entre la expresión de proteínas GST y la supervivencia de pacientes con cáncer cérvico uterino. (8A) Especímenes representativos de cáncer cérvico uterino invasivo con diferentes nivele s de expresión de GSTM3 y GSTP1 (débil, moderado y alto); (8B) ROI de GSTM3 y GSTP1 en 13 pacientes con cáncer cérvico uterino evaluados; (8C) el porcentaje de ROI de GSTP1 se clasificó como débil (<10%), moderado (20-50%) y alto (51-100%); (8D) gráfica de supervivencia de Kaplan-Meier, para el estadio avanzado del cáncer cérvico uterino según los niveles de expresión protéica de GSTM3 y GSTP1 (prueba de log-rank, p<0.05).

Las figuras 8E-8F muestra la expresión de GSTM3 y GSTP1 en cáncer cervical en etapa terminal.

La figura 9 muestra que durante la progresión del cáncer cérvico uterino varios procesos como la supervivencia celular, la proliferación y la evasión de la apoptosis a través de las vías de las MAPK cinasas y NF-kB son estimuladas por la presencia de GSTM3 y/o GSTP1. La“inhibición de los genes” (knock-down) de GSTM3 y GSTP1 afecta la activación de la apoptosis activada a través de la activación de JNK y p38 o la inhibición fosforilada de NF-kB y ERK.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN.

Como se indicó anteriormente, la palabra cáncer es un término genérico que designa un amplio grupo de enfermedades que pueden afectar a cualquier parte del organismo, como ejemplo, el cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de estómago, cáncer hepático, cáncer de esófago, cáncer cérvico uterino, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, Linfoma no Hodgkin, cáncer de páncreas, leucemia, cáncer de riñón, cáncer de cuerpo uterino, cáncer de orofaringe, cáncer cerebral y del sistema nervioso central, cáncer de ovario, cáncer de melanoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer de laringe, cáncer de mieloma múltiple, cáncer de nasofaríngeo, cáncer de laringofaringe, linfoma Hodgkign, cáncer de testículos, cáncer de glándulas salivales, cáncer de vulva, sarcoma de Kaposi, cáncer de pene, mesotelioma, y cáncer vaginal, entre otros, por lo que deberá de entenderse que una persona diestra en la materia apreciará que la invención enseguida descrita es susceptible a variaciones y modificaciones diferentes a aquellas específicamente descritas y por consiguiente, la presente invención incluye todas esas variaciones y modificaciones así como todas las etapas, características, composiciones y compuestos referidos o indicados en la misma, ya sea en forma individual o colectiva y cualquiera de todas las combinaciones o cualquiera de dos o más de las etapas o características.

Además, debe también entenderse que la presente invención no está limitada en su alcance a las modalidades específicas descritas en la misma, las cuales son propuestas para solamente propósitos de ejemplificación. Productos, composiciones, combinaciones y métodos funcionalmente equivalentes asi como su aplicación en mamíferos están claramente dentro del alcance de la invención, tal y como se describe.

La progresión del tumor (de aquí en adelante señalada también como PT) involucra cambios en la desregulación de los procesos metabólicos y celulares. El estudio de la dinámica del proteoma tumoral representa los cambios proteicos de este mecanismo de desregulación durante la PT. Por lo tanto, el estudio de la dinámica del proteoma por ejemplo en el cáncer cérvico uterino (de aquí en adelante señalado también como CC) proporcionará información relevante para comprender la PT y de la enfermedad a tratar. La sobre expresión proteica de los genotipos de la glutatión S transferasa GSTM3 y GSTP1 durante la progresión tumoral (PT) desempeña un papel regulador a través de la interacción con las proteínas, por ejemplo TRAF2/6 y por lo tanto una evasión de la transducción de señales de la activación de la apoptosis, favoreciendo la supervivencia celular y la PT. Además, la expresión de GST está involucrada en la modulación de los procesos de detoxificación en las células cancerosas y, por lo tanto, participa en la respuesta de la supervivencia a la quimioterapia convencional en pacientes con CC y otros tipos de cáncer.

La presente invención se refiere a oligonucleótidos antisentido de las glutatión S transferasa (GSTs) como por ejemplo las GSTM3 y GSTP1, como novedosos candidatos para ser usados como blancos terapéuticos y/o factores de pronóstico para pacientes (mamíferos) que han sido diagnosticados con CC y otros tipos de cáncer.

La identificación de sujetos candidatos al tratamiento de cánceres y al tratamiento de los mismos se lleva a cabo al identificar la expresión proteica de las proteínas glutatión S transferasa (GSTs). El tratamiento incluye la utilización de oligonucleótidos antisentido dirigidos a los ácidos ribonucleicos mensajeros (ARNm) de la GSTM3 y GSTP1, las cuales les confieren a las células tumorales una mayor resistencia a las quimioterapias. El oligonucleótido antisentido (OAS) es preferentemente cualquier oligonucleótido antisentido, el cual reduce los niveles de expresión de las GSTMs y de esta manera incrementa la sensibilidad de la célula, tejido y/o órgano al agente quimioterapéutico in vitro, ex vivo, o in vivo.

En una primera modalidad, el oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido compuesto por subunidades llamada“nucleótidos”, donde cada nucleótido se compone de tres partes: un azúcar o un análogo funcional del mismo, una base nitrogenada y un grupo funcional que sirve como enlace intemucleotídico (usualmente un grupo fosfato) entre las subunidades que componen el oligonucleótido. Cada uno de estos componentes puede contener las siguientes modificaciones:

Modificaciones generales en los

oligonucleótidos naturales en donde

X significa un azúcar, ribosa en el caso de ARN o desoxirribosa en el caso de ADN o el análogo funcional de esté en el nucleótido.

B significa la base nitrogenada unida al azúcar o un análogo funcional del mismo, y R significa el grupo funcional en el carbono 2’ del azúcar cuando esté es ribosa.

En una segunda modalidad, las modificaciones al azúcar de ribosa, sin ser limitattivas, son:

Modificaciones en la posición 2’ de la azúcar ribosa que incluyen la sustitución del grupo OH por diferentes grupos entre los que se encuentran (2’-0-metil (2OMe), 2’-0-metoxietilo (2’-OMOE), 2’- fluor (2’-F) y 2’-fluor quiral (2’-F))

en donde base la hace referencia a la base nitrogenada del nucleótido.

En una tercera modalidad, las modificaciones en la ríbosa incluyen la utilización de un análogo de ribosa bicíclico, donde en la estructura de la ribosa contiene un anillo adicional, por ejemplo, ribosa con anillos 2’-0,4’-C-metileno (LNA- ácido nucleico bloqueado), 2’-0,4’-C-oximetileno, 2’-0,4’- C-metileno-p-D-ribofuranosil, entre otros.

Adicionalmente, la sustitución del azúcar ribosa se puede llevar a cabo por grupos funcionales análogos con función similar, por ejemplo, la sustitución de la ribosa por otro azúcar como la arabinosa, morfolino, o por análogos de la ribosa con un anillo espeirocíclico en diferentes posiciones del anillo del azúcar, sin ser tales ejemplos limitativos.

Los siguientes son ejemplos de algunas de las diferentes modificaciones a la parte azucarada del oligonucleótido. Sustituyeme en la posición 2'

Anillo extra fusionado a la azúcar del nudeótido

Sustitución de la ribosa por otro grupo funcional

Espiro núcleos ¡dos con uñ anillo «piróciclico en diferentes posiciones del anilló de

En una cuarta modalidad, las modificaciones a las nucleobases o bases nitrogenadas incluyen, sin ser limitativas, adenina, citosina, guanina, timina, así como sus modificaciones 5-metilcitosina, 2- aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,-diammopurina, hipoxatina, 5-propinil uracilo, 2-tio timina, N3-tioetil timina, 3-deaza adenina, 8-azido adenina y 7-deaza guanina, o la utilización de bases universales tales como 3-nitropirrol, imidazo -carboxamida, 5-nitroindol. Los siguientes son ejemplos de algunas estructuras de diferentes tipos de nucleobases modificadas y análogos de nucleobases. 6ases de pirimimidia

5-propinil U 2-tio T N3-tioetil T

Bases de purina

3-deaza A 8-azido A 7-deaza G

BaYes uñivéiYalés

3-nitropirrol imidazol-4-carboxamida 5-nitroindol

En una quinta modalidad, las modificaciones en la columna o esqueleto de los grupos intemucleósidos, que los enlazan, pueden ser pero no se limitan a:

guanidino

fosforotioato (PS) metilfosfonato triazol MMI

guanidinopropjl boranofosfato S-metiltiourea

N3-fosforamidato (NP) fosforamidato

5’-N-carbamato, metileno-metilimina, amida, fosforoditioato, tioeter, tioformacetal y

mercaptoacetamida. La sustitución del grupo fosfodiéster o fosforotioato se puede llevar a cabo por grupos de fosforodiamidato con residuos de piperazina y morfolinos (PMOs).

Para una persona experimentada en el campo de la presente invención será obvio que, dentro del alcance, también se incluyen las quimeras resultantes de la mezcla de 2 o más modificaciones químicas antes mencionadas, por ejemplo sin ser limitativos, la sustitución de la ribosa por un anillo de morfolino y sustitución del grupo fosfodiéster por grupos de fosforodiamidato sin carga (PMOs), la sustitución de la ribosa y el enlace fosfodiéster es sustituido por pseudopéptido N-(2 aminoetil) glicina y la nucleobase es enlazada a la columna del oligonucleótido a través de un enlace etil- enecarbonilo (PNA), una quimera donde la ribosa contiene un sustituyente alquilo en la posición 2’ y el enlace fosfodiéster es sustituido por un enlace fosfotiester, una quimera donde la ribosa es sustituida por un análogo de ribosa con anillos 2’-0,4’-C-metileno (LNA) y el enlace fosfodiéster es sustituido por un enlace fosfotiester, entre otras. Ejemplos de quimeras resultantes de la combinación de los distintos componentes de un nucleótido son a manera de ejemplo:

DESCRIPCIÓN DE LA MODALIDAD PREFERIDA

Modelo de progresión tumoral

Con el fin de crear un modelo adecuado que permita estudiar la progresión tumoral (PT), se utilizaron líneas celulares de cáncer de cuello uterino (SiHa y HeLa), mama triple negativo (MDA- 231-MB) y colón (COLO 205) para generar tumores injertados en ratones. Las células cancerosas se cultivaron al 70% de la confluencia y se inocularon 10 ⁷ células en ratones hembra de la cepa Nu/Nu de 4 a 6 semanas. El volumen del tumor se midió de acuerdo con la ecuación del volumen de un elipsoide descrita como: Vtm = jt / 6 (L * W * H), donde L: largo, W: ancho y H: alto, y fueron tomadas en siete momentos diferentes de la PT, por ejemplo, se tomó una cinética de los tumores HeLa y SiHa a 5, 10, 15, 20, 30, 45 y 50 días después de la inoculación. Los primeros cuatro tiempos de medición mostraron una baja progresión del crecimiento tumoral. Sin embargo, en los puntos finales de la cinética, el volumen tumoral creció exponencialmente para los tumores de células HeLa. Desde el día 30 hasta el 45 se duplicó el volumen tumoral promedio y para el día 50 el volumen promedio fixe 3 veces más que la medición anterior. Para las células SiHa las tasas de crecimiento del tumor fueron más bajas que HeLa; de 30 a 45 días los tumores SiHa crecieron 1.6 veces más, mientras que, en los últimos cinco días los tumores crecieron en promedio 1.6 veces mayores (ver Figuras 1 A-B). Debido a estos resultados, la dinámica de la PT se evaluó más a nivel de proteoma entre los tiempos 30, 45 y 50 días después de la inoculación.

Análisis de los geles de 2D-PAGE e identificación de proteínas.

Los tumores de los dos tipos de células cancerosas (HeLa y SiHa) fueron colectados y se extrajeron las proteínas totales para analizarse por medio de geles de electroforesis de dos dimensiones (2D- PAGE). El análisis de las imágenes de 2D-PAGE de cada repetición para cada tiempo estudiado y para cada tipo de célula se llevó a cabo utilizando el software PDQuest. Se detectaron en promedio 866 entidades electroforéticas (puntos o“manchas”) para muestras de los tumores de HeLa en cada repetición. Para tumores SiHa, el promedio de puntos o“manchas” detectados en las imágenes de 2D-PAGE fue de 766. El coeficiente de correlación entre las repeticiones para cada tiempo de tumor y tipo de célula se determinó a partir de los mapas de 2D-PAGE.

La Tabla 1 siguiente muestra que el coeficiente de correlación en todos los tumores fue mayor de 0.7 en los dos tipos de células. El perfil proteómico se obtuvo de cada vez y luego se comparó para encontrar proteínas diferenciadas durante la PT. Tabla 1.

HeLa SiHa

Tiempo (días) Manchas/CCf* Manchas/CCf*

30 824/0.710 765/0.731

45 763/0.723 768/0.836

50 1012/ 0.724 766/0.756

* CCf = coeficiente de correlación.

Además, en los tumores de HeLa se detectaron 601 puntos en los tres tiempos del PT, mientras que en los tumores SiHa el número de puntos comunes fueron de 716 (ver Figura 1A). Para la identificación de proteínas, se seleccionaron un total de 90 puntos de gel de tumores que incluyen ambos tipos de células HeLa y SiHa, en base a sus patrones de abundancia entre las edades de los tumores. Todas las entidades electroforéticas o de gel 2D se procesaron como se describe en la sección experimental y se identificaron después del análisis de espectrometría de masas MALDI-

TOF.

La Tabla 2 siguiente muestra que de los tumores HeLa se identificaron 46 proteínas diferentes, incluyendo 34 con expresión constante a través del PT, 7 proteínas mostraron una regulación negativa a lo largo del PT, 3 proteínas aumentaron su abundancia durante el crecimiento del tumor, y 2 se encontraron con un patrón oscilante.

Tabla 2.Total de proteínas expresadas en tumores de HeLa (días 30, 45 y 50)

Tabla 2 (continuación)

* Base de datos Swiss-Prot.

** Base de datos MASCOT Score

La Tabla 3 siguiente muestra que de las células de SiHa se identificaron un total de 44 proteínas. Las proteínas identificadas se distribuyeron de acuerdo con su patrón de expresión, 20 se encontraron sin diferencias en las tres edades tumorales evaluadas, 8 disminuyeron su abundancia durante PT, mientras que 16 mostraron un patrón creciente. Al analizar todas las proteínas identificadas en tumores de ambos tipos de células (Hela y SiHa), se encontró que 34 proteínas se compartieron entre los dos tipos de tumores, incluyendo 14 que muestran el mismo patrón de expresión.

Tabla 3. Total de proteínas expresadas en tumores de SiHa (días 30, 45 y 50)

Tabla 3 (Continuación)

* Base de datos Swiss-Prot.

** Base de datos MASCOT Score

Entre las proteínas con niveles de sobre expresión, se identificaron dos miembros de la familia Glutatión S-transferasa (GSTM3 y GSTP1). La GSTM3 se identificó en tumores de HeLa y la GSTP1 en tumores de SiHa (ver Figura 1C). Los niveles de expresión de ambas proteínas se confirmaron mediante análisis de inmunotransferencia ( ver Figura 1C ). Además, la inmunotransferencia reveló que en los tumores SiHa se observan ambas proteínas con patrones de sobre expresión. Sin embargo, en tumores de HeLa solo se confirmó la sobre expresión para GSTM3, y se encontró que GSTP1 no es detectable en ninguna etapa del tumor.

Análisis bioinformático Posteriormente se usaron las proteínas identificadas en ambos tumores para realizar un análisis de enriquecimiento funcional basado en los procesos biológicos de las ontologías génicas (Gene Ontology: GO. Las proteínas se agruparon según sus niveles de expresión y se sometieron a un análisis de enriquecimiento. Los resultados indicaron que las proteínas que aumentan sus niveles durante la PT están principalmente involucradas en anti-apoptótica, división celular, glucólisis, angiogénesis, reproducción viral y regulación de procesos apoptóticos (ver Checa-Rojas A., et al. GSTM3 and GSTP1: novel players driving tumor progression in cervical cáncer. Oncotarget. 2018; 9:21696- 21714). Además, incluyendo todas las proteínas identificadas, los resultados sugieren que durante la PT las rutas sobrerrepresentadas están relacionadas con la respuesta celular al estrés, las rutas de señalización MAPK6/MAPK4 y NU /NF-kappaB.

Por otro lado, el análisis de minería de datos reveló que GSTM3 y GSTP1 interactúan con las proteínas de los factores asociados al receptor del factor de necrosis tumoral (TRAF). Sin embargo, dicho análisis puede ser ampliado a otras proteínas. Específicamente, la interacción de GSTP1 con TRAF2 validado previamente en células HeLa (Wu, Y., Fan, Y., Xue, B., Luo, L., Shen, J., Zhang, S., ... Yin, Z. (2006). Human glutathione S-transferase Pl-1 interacts with TRAF2 and regulates TRAF2-ASK1 signáis. Oncogene, 25, 5787-5800), y GSTM3 se informó como interactor de TRAF6 (receptor del factor de necrosis tumoral asociado con el factor 6) (Rouillard, A. D., Gundersen, G. W., Fernandez, N. F., Wang, Z., Monteiro, C. D., McDermott, M. G., & Ma’ayan, A. (2016). The harmonizóme: a collection of processed dataseis gathered to serve and mine knowledge about genes and proteins. Database, 2016, bawlOO.) (ver Figura 3A). Para demostrar que esta interacción ocurre en condiciones fisiológicas, se observó la expresión de la TRAF6 en ambos tumores de CC (ver Figura 3B). Se observó que solo en los tumores HeLa se expresaba TRAF6. Después de eso, se llevó a cabo el análisis de interacción, por coinmunoprecipitación (IP). Se encontró que, GSTM3 coinmunoprecipita con TRAF6 y viceversa (ver Figura 3B). Por lo que se demuestra que GSTM3 está asociado con tumores TRAF6 CC.

Modulación de la señalización MAPK durante la PT

Dada la importancia de las proteínas TRAF sobre la activación corriente abajo de la cascada de la proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK), se analizó la versión fosforilada de NF-kB p65 (ser529), ERK, JNK y p38 mediante manchado (blot) western de las proteínas de la PT. Los resultados demostraron que la fosforilación de p38 y JNK se redujo a lo largo del tiempo en ambos tumores del CC, pero no en pNF-kB y pERK (ver Figura 3C). Los resultados indican que durante la PT los procesos apoptóticos son reprimidos y, por lo tanto, la proliferación celular se activa constantemente vía ERK y NF-kB. La figura 3A muestra la red de interacción que representa las interacciones presa GSTM3, las cuales pueden ser visualizadas por los límites de red. Este análisis se realizó para obtener las interacciones reportadas por la base de datos SysBiomics, en las cuales se observó que TRAF6 interactúa con GSTM3. En la figura 3B se observa la co-inmunoprecipoitación de GSTM3 y TRAF6. En el diagram de Venn proporcional de la figura 3D se observan las proteínas secretadas de las líneas de células de CC con 264 proteínas comunes y la figura 3E demuestra que dos proteínas fueron identificadas en proteínas secretadas que pueden activar la trayectoria de señal TLR4 expresada in vitro en HSP60 y HPS70. El manchado western de HSP70 y HSP60 activadores de TRL4 en las proteínas secretadas por los tumores de CC se muestra en la figura 3F. Además, se muestra que HSP60 fue expresada en los tumores de SiHa y HeLa a 50 días y la proteína HSP70 expresada en los tumores SiHa a 43 días, y los tumores Hela tumores a 30 y 50 días. Activadores endógenos secretados del receptor TLR4 en el CC

Por otra parte, se sabe que la activación de la ruta de TLR4 está impulsada por la presencia de lipopolisacáridos (LPS) a partir de infecciones bacterianas, pero también por activadores endógenos

como las proteínas de choque térmico HSP60 y HSP70. Para demostrar que las líneas celulares CC pueden expresar activadores endógenos del receptor tipo Toll 4 (TLR4), se realizó un análisis in vitro de las proteínas secretadas utilizando las líneas celulares HeLa y SiHa (ver Figura 3G). Las Tablas 4- 5 siguientes muestran los resultados obtenidos.

Las proteínas secretadas se analizaron mediante LC-MS / MS y se identificaron un total de 432 proteínas HeLa y 447 SiHa, de las cuales 264 eran comunes entre ambas líneas celulares (ver Figura 3D). Entre los activadores endógenos reportados para TLR4, se identificaron dos proteínas secretadas miembros de la familia de las proteínas de choque térmico, HSP60 y HSP70 para ambas líneas celulares (ver Figura 3E). Para determinar si estas proteínas también se expresaron durante la PT, enseguida se analizaron las proteínas secretadas ex vivo en tumores CC por manchado western (ver Figura 3F, Figura 3H). Los resultados se correlacionaron en experimentos in vivo y ex vivo, lo que indica que la secreción de HSP60 y HSP70 activan la señalización de TLR4. Ver Figura3C.

Los datos proteómicos de espectrometría de masa han sido depositados en ProteomeXchange Consortium vía el depósito de su asociado PRoteomics IDEntifications (PRIDE) con el identificador de conjunto de datos PXD005466. Tabla 4 Proteínas secretadas en células HeLa

Tabla 4 (Continuación)

P98160 Protefna núcleo de heparan sulfato proteoglicano de membrana basamento 468532 43 4 Q562R1 Protefna 2 similar a beta-actina o 2S6 1 P25098 Receptor de cínasa 1 beta-adrenergico o 34 3 P13929 Beta-enolasa 46902 216 2

Q96T60 polinudeotido fosfatasa/dnasa bifuncional 0 32 4

Q8N FC6 Biorientación de cromosomas en proteína 1 de división celular-similar 0 42 6

014514 Inhibidor 1 de angiogénesis especifica del cerebro 0 40 4

060241 Inhibidor 2 de angiogénesis especifica del cerebro 0 33 3

060242 Protefna 2 de cambio de nudéotido de guanina inhibido Brefeldin A 201909 32 4

060243 Protefna núcleo Brevican 99056 43 2

060244 Protefna 1 que contiene repetición WD y Bromodominio 0 64 4

060245 Carbamoil-fosfato sintasa (ammonia], mitocondrial 164835 133 3

060246 Catepsina 0 44524 220 6

060247 Catepsina Z 33846 167 4

060248 Substrato de enzima ABL1 y CDK5 0 41 1

060249 Protefna 2 asodada con subunidad de regulación CDK5 0 35 3

060250 Centlein 161504 47 3

060251 Protefna F centromero 367537 54 6

060252 Protefna E asociada con centromero 0 54 5

060253 Protefna 3S0 asociada con centrosoma 350716 45 5

060254 Proteína 1 de canal intracelular de doro 26906 128 2

060255 Colina O-acetiltransferasa 82483 33 4

060256 Protefna 1 de asociación CLIP 0 66 4

060257 Clusterin 52461 205 3

060258 Cofilin-1 18491 195 3

060259 Protefna 17 que contiene dominio de doble hélice 0 37 2

060260 Protefna 78 que contiene dominio de doble hélice 0 42 3

060261 Proteína 87 que contiene dominio de doble hélice 0 44 4

060262 Protefna 93 que contiene dominio de doble hélice 0 39 4

060263 Cadena alfa-l(lll) de colágeno 138479 33 4

060264 Cadena alfa-l(VII) de colágeno 295041 57 7

060265 Cadena alfa-l(XII) de colágeno 332941 1361 31

060266 Cadena alfa-l(XIV) de colágeno 0 47 1

060267 Cadena alfa-l(XXVII) de colágeno 0 45 7

060268 Cadena alfa-2(XI)de colágeno 171670 61 10

060269 Cadena alfa-3(VI) de colágeno 0 37 2

060270 Protefna 2 de unión a cortactina 0 60 3

060271 Protefna 1 que contiene dominio CUB y Sushi 388621 40 3

060272 Cubilin 398480 47 5

060273 Protefna 1 desasociada de NEDD8 asociado a Cullin 136289 174 1 060274 Cistatin-C 1S789 54 1

060275 Cadena pesada 1 de dineina 1 dtoplasmica 532072 54 6 060276 Dedicador de citocinesis de protefna 6 0 50 3 060277 Dermcidin 11277 66 1 060278 Oesmoplakin 331569 49 4

060279 Dihidrolipoil dehidrogenasa, mitocondrial 54143 177 6

060280 Homólog B de protefna 2 que interactúa con Disco 0 32 3

060281 DNA poli erasa theta 197474 35 4

060282 Subunidad catalítica de DNA polimerase zeta 0 43 5

060283 Subunidad catalítica de protein cinasa dependidnte de DNA 468788 65 9 Tabla 4 (Continuación)

Tabla 4 (Continuación)

060334 Proteína Ran nuclear de unión a GTP 24408 179 4

06033S Subunidad de proteína beta 2-similar a 1 de unión a nudéotido de Guanina 35055 32 2

060336 Proteína 1A/1B de 70 kDa de choque térmico 70009 639 2

060337 Proteína 1 de 70 koa de chouqe térmico similar 70331 345 1

060338 Proteína 6 de 70 kOa de choque térmico 70984 253 2

060339 Proteína de 71 kDa cogando de chouqe térmico 70854 661 1

060340 Proteína beta-1 de choque térmico 22768 79 4

060341 Proteína HSP 90-alfa de choque térmico 84607 874 12

060342 Proteína HSP 90-beta de choque térmico 83212 1010 10

060343 Hemicentin-1 613001 42 6

060344 Hemicentin-2 542265 47 5

060345 Subunidad alfa de hemoglobina 15248 56 2

060346 Subunidad beta de hemoglobina 15988 38 1

060347 Factro de crecimiento derivada de hepatoma 26772 63 2

060348 ribonudeoproteina A0 nuclear heterógena 0 46 1

060349 ribonudeoproteina Al nuclear heterógea 38723 113 1

060350 ribonudeoproteina Al-similar a 2 nuclear heterógena 34204 94 1

060351 ribonudeoproteina A3 nuclear heterógena 39571 57 1

060352 ribonudeoproteina 00 nuclear heterógena 38410 114 3

060353 ribonudeoproteinas A2/B1 nucleares heterógena 37407 217 3

0603S4 Histona H2A tipo 1 14083 134 1

060355 Histona H2A tipo 1-8/E 14127 134 1

060356 Histona H2A tipo 1-C 14097 134 1

060357 Histona H2A tipo 1-0 14099 134 1

060358 Histona H2A tipo 1-H 13898 134 1

060359 Histona H2A tipo 1-J 13928 134 1

060360 Histona H2A tipo 2-A 14087 134 1

060361 Histona H2A tipo 2-B 13987 58 1

060362 Histona H2A tipo 2-C 13980 134 1

060363 Histona H2A tipo 3 14113 134 1

060364 Histona H2A.J 14011 134 1

060365 Histona H2A.X 15135 58 1

060366 Histona H2B tipo 1-H 13884 100 4

060367 Histona H2B tipo 2-F 13912 100 4

060368 Histona H3.1 15394 158 6

060369 Histona H3.lt 15499 155 6

060370 Histona H3.2 15379 158 6

060371 Histona H3.3 15318 160 6

060372 Histona H3.3C 1S204 44 1

060373 Histona H4 11360 178 7

060374 Histona-lisina N-metiltransferasa MLL2 593017 49 6

060375 Histona-lisina N-metiltransferasa MLL3 0 42 6

060376 Histona-lisina N-metiltransferasa SETD1A 0 39 4

060377 Histona-lisina N-metiltransferasa, H3 lisina-36 y H4 lisina-20 especifica 0 42 5

060378 Proteína de corte-similar a 1 de homeosecuencia 0 38 3

060379 Homólogo de proteína que induce hidrocefalia 0 60 4

060380 Proteína que une IgGFc 571639 40 3

060381 Encima que degrada insulina 0 36 3

060382 Integrina alfa- 10 0 32 4

060383 Factor 3 que une mejorador de interleucina 95279 48 3 Tabla 4 (Continuación)

Tabla 4 (Continuación)

060434 Cadena de L-lactato dehidrogenasa B 36615 552 3

060435 Proteína IB relacionada con receptor de lipoproteina de baja densidad 515159 45 7

060436 Proteína 4 relacionada con receptor de lipoproteina de baja densidad 0 38 5

060437 Proteína 6 relacionada con receptor de lipoproteina de baja densidad 180314 39 3

060438 Demetilasa SB especifica de lisina 175545 37 3

060439 Histona demetilasa IB específica de lisina 92039 37 5

060440 Malato dehidrogenasa, citoplasmica 36403 351 5

060441 Malato dehidrogenasa, itocondrial 35481 113 3

060442 Proteína asociada con gene MAX 0 47 6

060443 Inhibidor 1 de metaloprotelnasa 23156 90 2

060444 Metilcitosina dioxigenasa TET1 0 49 4

060445 Factor 1 que retícula microtubulo, isoterma 4 669721 50 7

060446 Factor 1 que retícula microtubulo-actina, ¡soformas 1/2/3/5 0 44 5

060447 Proteina cinasa 3 de serina/treonina asociada a microtubulo 143049 49 5

060448 Tumor supresor candidato 2 asociado a microtubulo 0 53 5

060449 Midasin 0 62 10

060450 Moesin 67778 719 6

060451 Mucin-16 0 59 5

060452 Mucin-19 597790 37 4

060453 Factor de crecimiento epidermal múltiple-similar a dominios de protein 6 161072 38 5

060454 Proteína 2 asociada con tumor de mieloma múltiple 29394 36 3

060455 Miosin-14 227863 38 2

060456 Miosin-3 223766 39 4

060457 Miosin-7B 221251 41 6

060458 Miosin-XV 395044 41 6

060459 Proteína 5 asociada a Nck 208409 41 6

060460 Nebulin 0 44 5

060461 Nesprin-1 1010398 39 8

060462 Neurobeachin-similar a proteina 2 0 39 4

060463 Proteína AHNAK asociada con diferenciación de neuroblasto 628699 76 9

060464 Neurofibro ina 0 37 4

060465 Homólogo de proteína 3 de muesca del sitio neurogénico 0 37 4

060466 Neuron navegador 1 0 43 4

060467 Neuronal pentraxin-1 47093 240 10

060468 Proteína 1 de aparato mitótico nuclear 238115 81 6

060469 Nudeosido difosfato cinasa A 17138 348 9

060470 Nudeosido difosfato cinasa B 17287 284 7

060471 Factor de subunidad BPTF que remodela nudeosoma 338054 36 5

060472 Obg-similara ATPase 1 44715 118 1

060473 Obscurin 867940 45 6

060474 Partición defectuosa 6 homologo gamma 0 33 3

060475 Peptidil-prolil cis-trans isomerasa A 18001 285 3

060476 Peptidil-prolil cis-trans isomerasa FKBP4 51772 278 7

060477 Pericentrin 0 39 6

060478 Homólogo de peroxidasina 0 34 4

060479 Peroxiredoxin-1 22096 317 2

060480 Peroxiredoxin-2 21878 378 8

060481 Peroxiredoxin-4 30521 205 5

060482 Peroxiredoxin-6 25019 237 5

060483 Proteína 1 que une fosfatidiletanolamina 21044 252 4 Tabla 4 (Continuación)

060484 Subunidad beta que contiene dominio fosfatldilinositol-4-fosfato 3-cinasa C2 o 40 3

060485 Fosfaglucomutasa-1 61411 240 6

060486 Fosfoglicerato cinasa 1 44586 668 1

060487 Fosfoglicerato mutasa 1 28786 13S 5

060488 Fosfbserina aminotransferasa 40397 128 3

060489 Miembro 2 de familia G que contiene dominio de homología Pleckstrin 147877 39 4 060490 Plectina 531466 93 5 060491 Plexin-Al 210933 44 4

060492 Proteína 1-similar a 1 de enfermedad de riñon policistico 0 55 4 060493 Policistin-1 0 53 5 060494 Poliubiquitin-B 25746 158 3 060495 Poliubiquitin-C 76982 148 3

060496 Familia miembro E de dominio POTE ankirina 121286 444 4 060497 Prelamin-A/C 74095 123 2

060498 Probable ARN helicasa dependiente de ATP DDX41 0 35 3 060499 Probable ARN helicasa dependiente de ATP DDX60-similar a 35 2 060500 Probable proteína ligasa HERC1 de E3 ubiquitin-similar o 37 3 060S01 Probable proteína ligasa MYCBP2 de E3 ubiquitin 509759 60 5 060502 Probable terminal hidrolasa FAF-Y de terminal ubiquitin carboxil 0 33 4 060503 Profilin-1 15045 179 4

060504 Proteína 1 relacionada con receptor de lipoproteína de probaja densidad 504276 46 9

060505 Proproteina convertasa subtilisinaAexina tipo 9 74239 340 5

060506 Proteasoma subunidad alfa tipo-1 29537 188 7

060507 Proteasoma subunidad alfa tipo-2 25882 178 6

060508 Proteasoma subunidad alfa tipo-3 28415 196 5

060509 Proteasoma subunidad alfa tipo-6 27382 303 8

060510 Proteasoma subunidad alfa tipo-7 27870 464 9

060511 Proteasoma subunidad beta tipo-1 26472 125 3

060512 Proteasoma subunidad beta tipo-3 22933 150 5

060513 Proteasoma subunidad beta tipo-4 29185 93 3

060514 Proteasoma subunidad beta tipo-5 28462 355 7

060515 Proteasoma subunidad beta tipo-6 25341 155 3

060516 Proteina AHNAK2 0 38 5

060517 Proteina arginina N-metiltransferasa 3 0 S9 1

060518 Proteina bassoon 416214 46 3

060519 Proteina Daple 228091 37 5

060520 Proteina disulfuro-isomerasa 57081 98 5

060621 Proteina disulfuro-isomerasa A3 56747 635 13

060522 Proteina disulfuro-isomerasa A6 48091 172 3

060523 Proteina FAM179A 111084 33 3

060524 Homólogo de proteina "fagot" 0 34 6

060525 Proteina irregular-2 133277 42 2 060526 Proteina "flautín" 566309 44 4

060527 Proteina Shroom2 176302 34 6

060528 Proteina Shroom3 216724 45 1

060529 Proteina compañera-1 0 34 3

060530 Proteina SZT2 0 38 6

060531 Proteina TANC1 0 46 5

060532 Proteina-arginina deiminasa tipo-1 74618 42 1

060533 Protocadherina Fat 1 0 33 6 Tabla 4 (Continuación)

Tabla 4 (Continuación)

060584 Proteína 1 de receptor Transferrina 84818 896 4

060585 Proteína asociada a dominio transformación/transcripción 437318 52 7

060586 Proteína 2 que contiene transformación doble hélice acídica 309237 36 6

060587 Retículo endoplás ico transicíonal ATPasa 89266 338 1

060588 Transquetolasa 67835 965 5

060589 Proteína Treade 0 42 5 060590 Triosefosfata ¡so erasa 26653 703 16

060591 Proteína de dominio triple funcional 0 51 4

060592 Cadena de tubulina alfa-lB 50120 715 1S

060593 Cadena de tubulina alfa-lC 49863 715 15

060594 Cadena de tubulina alfa-4A 49892 39 2

060595 Cadena de tubulina alfa-8 50062 39 2

060596 Cadena de tubulina beta 49639 442 9

060597 Cadena de tubulina beta-3 50400 245 5

060598 Cadena de tubulina beta-8 49744 102 3

060599 Proteína S27a de ubiquitin-40S ribosomal 17953 167 3 060600 Proteína L40 de ubíquitin-60S ribosomal 14719 167 3

060601 Proteína C4orf37 sin caracterizar 50628 32 3 060602 Proteina KIAA0802 sin caracterizar 0 50 6 060603 Proteina KIAA1109 sin caracterizar 0 59 6 060604 Proteina KIAA1614 sin caracterizar 0 40 6 060605 Proteína C19orfl0 de UPF0556 18783 218 7 060606 Urotensina-2 0 34 1 060607 Utrofina 394220 38 4

060608 Proteína 13D asociada a la proteína vacuolar 491535 44 4

060609 Vinculina 123722 358 9

060610 Factor von Willebrand 309058 38 5 060611 Proteína 3 que contiene repetición WD y dominio FYVE 0 38 5

060612 Proteína 35 que contiene repeteción WD 0 36 2 060613 Proteína KIAA1875 que contiene repetición WD 180192 38 4 060614 Proteína 2 que contiene repeticón de enlace Xin actina 0 36 5 060615 Proteína 13 que contiene dominio CCCH de dedo de zinc 0 44 6 060616 Proteína 142 de dedo de zinc 187758 34 3 060617 Proteína 469 de dedo de zinc 409949 44 5

Tabla 5 Proteínas secretadas en células SiHa.

Tabla 5 (Continuación)

Tabla 5 (Continuación)

Tabla 5 (Continuación)

P34931 Proteína 1 de 70k0a de choque térmlco-slmllar 70913 381 8

P34932 Proteína 4 de 70kDa de choque térmico 95525 76 3

P17066 Proteína 6 de 70k0a de choque térmico 71608 320 5

P11142 Proteína de 71k0a cognado de choque térmico 71294 704 12

Q12931 Proteína de 75kDa de choque térmico, ltocondrlal 80654 108 2

P04792 Proteína beta-1 de choque térmico 22858 95 2

P07900 Proteína HSP 90-alfa de choque térmico 85333 367 11

P08238 Proteína HSP 90-beta de choque térmico 0 518 3

P54652 Proteína 2 de 70kDa relacionada de choque térmico 70428 398 7

Q96RW7 Hemicentin-1 624433 47 6

Q8NDA2 Hemicentin-2 SS0S21 53 4

P096S1 Ribonudeoproteina Al nuclear heterogénea 38933 117 3

Q32PS1 Ribonudeoproteina Al nuclear heterogénea-similar 2 34471 117 3

P61978 Ribonudeoproteina K nuclear heterogénea 51426 117 3

P22626 Ribonudeoproteinas A2/B1 nucleares heterogéneas 37576 122 4

09 UQL6 Historia deacetilasa 5 0 50 2

P0C0S8 Histona H2A tipo 1 14099 103 1

P04908 Histona H2A tipo 1-B/E 14143 103 1

093077 Histona H2A tipo 1-C 14113 103 1

P20671 Histona H2A tipo 1-0 14115 103 1

Q96KKS Histona H2A tipo 1-H 13914 103 1

099878 Histona H2A tipo 1-J 13944 103 1

Q6FI13 Histona H2A tipo 2-A 14119 103 1

016777 Histona H2A tipo 2-C 14012 103 1

Q7L7L0 Histona H2A tipo 3 14129 103 1

Q9BTM1 Histona H2AJ 14027 103 1

Q71UI9 Histona H2A.V 13517 SS 1

POCOSS Histona H2A.Z 13561 55 1

Q96A08 Histona H2B tipo 1-A 14207 41 2

P33778 Histona H2B tipo 1-B 13990 110 2

P62807 Histona H2B tipo 1-C/E/F/G/l 13946 148 2

P58876 Histona H2B tipo 1-0 13976 148 2

093079 Histona H2B tipo 1-H 13932 148 2

P06899 Histona H2B tipo 1-J 13944 110 2

060814 Histona H2B tipo 1-K 13930 148 2

099880 Histona H2B tipo 1-L 13992 148 2

099879 Histona H2B tipo 1-M 14029 148 2

099877 Histona H2B tipo 1-N 13962 148 2

P23S27 Histona H2B tipo 1-0 13946 110 2

Q16778 Histona H2B tipo 2-E 13960 110 2

QSQNW6 Histona H2B tipo 2-F 13960 148 2

Q8N257 Histona H2B tipo 3-B 13948 1S6 2

P57053 Histona H2B tipo F-S 13984 148 2

P68431 Histona H3.1 1SSS7 64 3

016695 Histona H3.lt 15677 64 3

Q71DI3 Histona H3.2 15484 64 3

P84243 Histona H3.3 15408 66 3

Q6NXT2 Histona H3.3C 15350 66 3

P62805 Histona H4 11392 155 4

014686 Histona-lislna N-metiltransferasa MLL2 601158 69 6 Tabla 5 (Continuación)

Tabla 5 (Continuación)

Tabla 5 (Continuación)

Tabla 5 (Continuación)

Tabla 5 (Continuación)

Q8TER0 Proteína 1 que contiene dominio similar a Sushi, nidogen y EGF 158397 53 S

Q9Y490 Talin-1 272726 40 4

Q9Y4G6 Talln-2 274829 56 4

QSTCY1 Tau-tubulin cinasa 1 0 33 1

P78371 Subunidad beta de proteína 1 complejo T 58040 35 1

PS0991 Subunidad delta de protelna 1 complejo T 58650 77 2

P48643 Subunidad epsilon de protelna 1 complejo T 60481 93 3

Q99832 Subunidad eta de proteína complejo T 60107 71 1

P49368 Subunidad gamma de proteína 1 complejo T 61427 231 5

P50990 Subunidad theta de proteína 1 complejo T 60450 70 5

P40227 Subunidad teta de proteína 1 complejo T 58676 141 S

Q99973 Componente 1 de proteína de telomerasa 0 41 4

Q9UK24 Teneurin-1 0 36 6

Q9HBL0 Tensin-1 187026 52 3

Q5SRH9 Proteína 39A de repetición de tetratricopeptido 0 32 3

P10S99 Tioredoxina 12063 40 2

Q16881 Tioredoxin reductasa 1, citoplasmica 71841 36 4

P07202 Peroxidasa tiroidea 104851 65 6

Q8WZ42 Titin 3849990 140 36

P31629 Factor HIVEP2 de transcripción 0 44 S

P02786 Proteína 1 receptor de transferina 85506 115 4

Q15S82 Transformación de proteína ig-h3 inducida por factor-beta de crecimiento 75496 52 1

P5S072 Retículo ATPase endoplasmico transisional 90282 449 11

P29401 Transquetolasa 68739 742 1

P60174 Triosefosfato isomerase 26986 441 3

P07477 Tripsin-1 27159 44 2

P68363 Cadena de tubulina alfa-lB 50964 432 1

Q9BQE3 Cadena de tubulina alfa-lC 50708 430 1

P68366 Cadena de tubulina alfa-4A 50810 238 1

Q9NY6S Cadena de tubulina alfa-8 50906 138 1

P07437 Cadena de tubulina beta 50375 400 1

Q9H4B7 Cadena de tubulina beta-1 51147 103 2

P68371 Cadena de tubulina beta-2C 50551 54 1

P42684 Tirosina-protein cinasa ABL2 12967S 54 5

P22314 Enzima que activa ubiquitina-similar a modificador 119260 163 10

Q5TEA3 Protein C20orfl94 sin caracterizar 134101 44 4

Q9Y4BS Protein KIAA0802 sin caracterizar 0 37 4

Q9Y2FS Protein KIAA0947 sin caracterizar 0 49 5

Q2LD37 Protein KIAA1109 sin caracterizar 561392 47 6

Q5VZ46 Protein KIAA1614 sin caracterizar 127754 35 3

075445 Userina S87S41 47 5

P46939 Utrofina 0 37 7

Q709C8 Proteína 13C asociada a clasificación de proteína vacuolar 0 62 4

Q96QK1 Proteína 35 asociada a clasificación ed proteína vacuolar 92765 88 2

P18206 Vinculina 0 56 3

043497 Subunidad alfa-lG de canal de calcio tipo T dependiente de voltage 266470 34 5

075191 Xilulosa cinasa 0 34 4

Q96IG9 Proteína 469 de dedo de zinc 414696 43 7

Q9Y493 Zonadhesina 0 36 3 GSTM3 interactúa con E7 de HPV18

Debido a que en Mileo, A. M., Abbni2zese, C., Mattarocci, S., Bellacchio, E., Pisano, P., Federico,

A . Paggi, M. G. (2009). Human Papillomavirus-16 E7 Interacts with Glutathione S-Transferase

P1 and Enhances Its Role in Cell Survival. PLoS ONE, 4(10) está demostrado que la proteína GSTP1 interactúa con la proteína E7 del HPV16 y esta interacción mejora la supervivencia de las células, para saber si la GSTM3 puede interactuar con la E7 del HPV 18, se procedió a realizar una alineación de superposición estructural entre las proteínas GSTP1 y GSTM3 y de las proteínas E7 del HPV 16 y 18 utilizando el programa MAMMOTH, seguido por el software suizo PDB Viewer (Deep View) v4.1 para visualizar los resultados (ver Figura 4A). La alineación mostró regiones conservadas y no conservadas al comparar las distancias entre los carbonos alfa y las secuencias de la cadena principal de aminoácidos.

Para demostrar esta interacción, se generó una construcción de un vector para expresar una proteína GSTM3 humana recombinante con una etiqueta histidina añadida en el extremo N-terminal (N-6x His-tag) en S. cerevisiae (ver Figura 41, Tabla 6). GSTM3 se identificó a través de manchado western de anti-His y el análisis de la huella digital de la masa de los péptidos (ver Figuras 4B, Figura 41). Después de capturar a la proteína recombinante de la GSTM3, se incubó con un extracto proteico de células HeLa (HPV18-positivo) (ver Figura 4J). La proteína E7 de HPV18 coeluyó con GSTM3 N-6x-his-tag y se identificó usando un anticuerpo específico mediante manchado western (ver Figura 4B). Para verificar esta interacción, se generó una construcción E7 de HPV18 en S. cerevisiae , pero fue posible obtener una cepa estable que expresara la proteína. Enseguida se generó una construcción en el plásmido que expresara una proteina recombinante de E7 de HPV 18 C-6x- his-tag en la línea celular HeLa y realizaba un ensayo de interacción de proteínas (“pull-down”) (ver Figura 4K). Los resultados mostraron que la GSTM3 puede interactuar con HPV 18 E7 (ver Figuras 4C, Figura 4L) y que esta interacción actúa de manera similar a la interacción entre las proteínas GSTP1 y E7 del HPV16 (ver Figura 4A).

Tabla 6 Lista de cebadores utilizados para generar proteina GSTM3 recombinante.

Nombre Secuencia S' > 3'

M3-1 ATGTCGTGCGAGTCGTCTATGGTTCTCGGGTACTGGGATATTCGTGGGCTGGCGCACGCC ATCCGCCTGCTCCTGG

M3-2 CATAGTCAGGAGCTTCCCCGCACGTGTACCGTTTCTCCTCATAAGAGGTATCCGTGAACT CCAGGAGCAGGCGGATGG

M3-3 GGAAGCTCCTGACTA TGA TCGAAGCCAA TGGCTGGATGTGAAA nCAAGCTAGACCTGGACmCCTAA TCTGCCCTACC

M3-4 GCTTGCGAGCGATGTAGCGCAAGATGGCATTGCTCTGGGTGATCnGTTCTTCCCATCCAG GAGGTAGGGCAGATTAGG

M3-S GCTACATCGCTCGCAAGCACAACATGTGTGGTGAGACTGAAGAAGAAAAGATTCGAGTGG ACATCATAGAGAACC

M3-6 CAGTTTTTCGTGGTCAGAGCTGTAACAGAGCCnATCAGTTGTGTGCGGAAATCCATTACT TGGTTCTCTATGATGTCC 3-7 GCTCTGACCACGAAAAACTGAAGCCTCAGTACTTGGAAGAGCTACCTGGACAACTGAAAC AATTCTCCATGTTTCT6G

M3-8 GGTGAGAAAATCCACAAAGGTGAGCrmCCCCGGCAAACCATGAGAATTTCCCCAGAAACA TGGAGAATTG

M3-9 CCmGTGGA TUTCTCACCTA TGATA TCTTGGA TCAGAACCGTA TA mGACCCCAAGTGCCTGGA TGAGUCC

M3-10 CCMGTGCCTGGATGAGTTCCCAAACCTGAAGGCmCATGTGCCGTmGAGGCTTTGGAGAAA ATCGCTGCC

M3-11 CCACTGGGCCATCTTGnGTTGATGGGCATCTTGCAGAACTGATCAGACTGTAAGTAGGCA GCGATTTTCTCCAAAGC

M3-12 CCATCAACAACAAGATGGCCCAGTGGGGCAACAAGCCTATATGCTGA

GSTM3-H¡ndlll ATAGAC AAGCTT AACAAAATGTCTGGGTCGTCG CACCATCACCACCATCAT TCGTGCGAGTCGTCTATGG

GSTM3 BamHI ATACAA GGATCC TCAGCATATAGGCTTGTTGC

GSTM3-HindIII. Este oligonucleótido contiene el sitio de restricción Hindm (en negrillas), secuencia consenso de levadura en el sitio de inicio de translación y codones para 6 histidinas (negrillas y subrayado).

GSTM3-BamHI. Este oligonucleótido contiene el sitio de restricción BamHI (negrillas).

Cebadores utilizados para amplificación y clonación del gene HPV18 E7

E718-1 ATG CAT GGA CCTAAG GCA ACC ATT

E718-2* CTG CTG GGA TGCACA CCA

E7-18-H¡nd III ATA CAA AAG CTTATG CAT GGA CCTAA

E7HPV18-his* GAT GGT GAT GAT G CT GCT GG

Univ His-Tag BamH I* TAC GTG GAT CCTAGT GGT GAT GGT G

E7-18-Hind III. Este oligo contiene el sitio de restricción Hind IP (negrillas) y secuencia inicial de HPV 18 (negrillas).

E7HPV18-his. Este oligo contiene un fragmento de secuencia 6x histidine (negrillas). Univ His-Tag BamH I. Este oligo contiene el sitio de restricción BamHI (negrillas) y fragmento de secuencia de 6x histidina (negrillas y subrayado).

Una vez demostrada la interacción de la proteína GSTM3 con la proteína E7 del HPV18 se evalúo la relevancia de esta interacción en la supervivencia celular. Para este objetivo, se desarrolló un ensayo de sensibilidad al estrés con UV en una línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 la cual es negativa para HPV, y la expresión de las proteínas GSTM3 y GSTP1 (ver Figura 4G). Utilizando proteínas recombinantes de las GST y de la E7 de HPV18 se realizó un análisis de fenotipo mediante complementación exógena de las proteínas (PAEP). Este análisis demostró que bajo estrés de radiación UV (15 segundos UV, IC50), las células GSTM3/HPV18 E7 exhibieron una tasa de supervivencia de 84.1%, mientras que las células GSTP1/GSTM3/E7 exhibieron una tasa de supervivencia de 93.7% después de un periodo de recuperación de 24 horas. Estos resultados indican que existe un efecto sinérgico entre las GST y las proteínas virales (ver Figura 4D). Se realizó un ensayo in vitro donde las líneas celulares de CC y las líneas celulares negativas se expusieron a 6 mM cisplatino. Esta concentración de cisplatino mato por completo a la línea celular MDA-MB-231 al 4to día del tratamiento. Para la línea celular HaCaT el total de células muertas fue al 6to día (ver Figura 4E). Sorprendentemente, las líneas celulares que coexpresan GST y HPV E7 sobrevivieron durante al menos ocho días después del tratamiento (SiHa 17% y HeLa 24% de confluencia) (ver Figura 4E). Para demostrar que lainteracción GST/HPV 18 E7 era responsable de esta resistencia, se realizó un ensayo PAEP usando las células MDA-MB-231 que incluyendo las proteínas recombinantes GSTM3, GSTP1 y E7 de HPV18. Los resultados confirmaron que las líneas celulares

que expresan miembros de la familia de proteínas GST y E7 de HPV tienen una ventaja en términos de supervivencia celular cuando se tratan con un agente xenobiótico (ver Figuras 4E, 4F). Se observó un aumento en la supervivencia de las células que expresan cualquiera de estas proteínas (HPV18 E7, GSTM3 o GSTP1); sin embargo, el mayor incremento en la supervivencia se observó cuando tanto GST como HPV18 E7 estaban presentes (ver Figura 4F).

“Inhibición de los genes” {knock-down) GST in vitro e in vivo usando oligonucleótidos de antisentido

A manera de ejemplo, sin ser limitativo, se diseñaron los oligonucleótidos antisentido de vivo- morfolinos para inhibir los blancos terapéuticos de las GSTs que parten de la región 5’UTR de los ARN mensajeros de las GSTM3 y GSTP1 y el codón de inicio ATG e incluyen 25 nucleótidos, pero esta región no es limitante pudiendo utilizar un rango de 15-50 nucleótidos, preferiblemente de 18 a 30, más preferiblemente de 20 a 25, y las bases 1 - 773, preferiblemente cercanas al codón de inicio, del gen GSTP1 y para GSTM3 desde la base 1- 4144, preferiblemente cercana al codón de inicio, con una similitud de 100-50% de ambas secuencias.

Es obvio que un diestro en la técnica puede emplear cualquier modificación química de las secuencias de ARN o ADN para inhibir a las GSTs, por ejemplo: 2’MOE, 2’MO, PNA, LNA, Fosforotioato, 2’-F, etc. que se encuentran disponibles comercialmente. Las GST preferidas en la presente invención, sin por ello ser limitantes de la misma, son GSTM3 y GSTP1 con la secuencia de oligonucléotidos antisentido (O AS) 5’-TAGACGACTCGCACGACATGGTGAC-3’ (56% CG-) y 5’-AATAGACCACGGTGTAGGGCGGCAT-3’ (56% CG), respectivamente.

Para los ensayos in vitro e in vivo se disolvieron ambos oligonucleótidos antisentido en buffer de fosfatos salinos PBS estéril a pH 7,5. Con el fin de evaluar el efecto de GSTM3 y GSTP1 en líneas celulares del CC, se procedió a inhibir la expresión de ambas proteínas por medio de oligonucleótidos antisentido (OAS) y se usó como control una secuencia aleatoria. Para evaluar la inhibición de las GSTs, se evaluaron ocho dosis para cada oligonucleótido antisentido (OAS) en cultivo con dos líneas celulares, HeLa y HaCaT (control negativo). Las concentraciones utilizadas fueron entre el rango de desde 10 a 1 280 ng/mL y fueron incorporadas al medio de cultivo. Posteriormente se evaluó la proliferación celular en tres diferentes tiempos a las 24, 48 y 72 horas. Se observó que las células HaCaT no se vieron afectadas por el tratamiento con ningún oligonucleótido antisentido, durante el período de análisis. Sin embargo, se notó una ligera pérdida de supervivencia con la dosis más alta (1 280 ng/mL). En las células HeLa, se observaron pérdidas de viabilidad después de 48 horas de tratamiento en todas las dosis de OAS- GSTM3 (ver Figura 5A). Después de 72 horas, las dosis más altas de tratamiento (640 y 1 280 ng/mL) mostraron una supervivencia inferior al 10% en comparación con las células de control. Se obtuvieron resultados similares para el tratamiento con OAS-GSTP1 en ambas células. Para evaluar la respuesta celular en otras líneas celulares, se seleccionó la dosis de 640 ng/mL, debido a que ésta es la dosis más alta que no afectó a la línea celular HaCaT. Además, se realizó el tratamiento con 640 ng/mL en la línea celular de CC SiHa (ver Figura 5B). Se obtuvo una respuesta muy similar entre líneas celulares de cáncer, indicando con ello que ambas proteínas GST son esenciales para la supervivencia celular en el CC, pero no para las células de HaCaT (no cancerosas). Para validar la efectividad del tratamiento de eliminación, se realizó un análisis de transferencia por manchado western en las tres líneas celulares para ambas proteínas (ver Figuras 5D-5E). La inmunotransferencia reveló que ambas proteínas estaban de hecho reguladas negativamente durante todos los tiempos del tratamiento en las tres líneas celulares. Además, se evaluó la viabilidad celular en las tres líneas celulares después de 24 y 48 horas de tratamiento a la dosis de 640 ng/mL de los dos oligonucleótidos antisentido (ver Figura 5C). Se llevó a cabo un ensayo de células vivas/muertas basado en la tinción de Syto9/ioduro de propidio. Los resultados confirmaron que las células HaCaT no se vieron afectadas por el tratamiento. Ambas células cancerosas se vieron afectadas de forma similar. En conjunto, estos resultados demuestran que las células HaCaT poseen un mecanismo alternativo de mantenimiento celular que ve comprometidas a las células de CC.

Para los ensayos in vivo, 15 días después de la inoculación de tumores en ratones, se inyectaron seis dosis de 400 ng/ 500pL por vía intratumoral, cada tercer día. En el día 30 se colectaron los tumores para su posterior análisis. Se usó un oligonucleótido antisentido aleatorio como control en ambos ensayos in vitro e in vivo. Las secuencias de los oligonucleótidos antisentido empleados en las Figuras 6A-6E.

La pérdida de GST inhibe la progresión del tumor en el cáncer de cuello uterino

Para demostrar la importancia de las GST durante la progresión tumoral (PT), se examinaron los efectos de los tratamientos con los oligonucleótidos antisentido en un modelo murino (ver Figura 6A). Para esto, se utilizaron los oligonucleótidos antisentido (OAS-GSTM3, OAS-GSTP1, y OAS- Control) y se trataron cuatro líneas de celulares de CC (líneas dos HPV16-positivas, SiHa y CaSki,y dos líneas de HPV18-positivas, HeLa y Calo), así como dos líneas celulares diferentes al CC, una de cáncer de mama (MDA-MB-231) y una de colon (COLO 205). Los resultados de los análisis in vivo e in vitro se correlacionaron entre sí, mostrando una disminución drástica del volumen en las líneas de células tumorales de CC (ver Figuras 6B-6C). Sin embargo, los resultados para los tumores de HeLa fueron diferentes de los realizados in vitro. Los tumores de HeLa solo expresaron GSTM3, pero no GSTP1 (ver Figuras 5D-5E). Por lo que, el tratamiento con OAS-GSTP1 en los tumores de HeLa no afectó la PT, lo que confirmó que GSTP1 no se expresa en estos tumores. Por otro lado, el tratamiento con OAS-GSTM3 en los tumores de HeLa disminuyeron drásticamente el volumen tumoral. En comparación con el tratamiento con el oligonucleótido antisentido control, el volumen tumoral de HeLa con OAS-GSTM3 fue 14 veces menor (ver Figuras 6B-6E).

En los tumores de CaLo, se encontró que ambas proteínas expresadas GSTM3 y GSTP1 (ver Figuras 6D-6E). El tratamiento de estos tumores con los oligonucleótidos antisentido contra GSTM3 y GSTP1 dieron como resultado una disminución del volumen del tumor de 10 y 6 veces, respectivamente (ver Figuras 6B-6C). En el caso de los tumores de SiHa, que expresan ambas proteínas (ver Figuras 6D-6E), se observó que las mayores disminuciones en el volumen tumoral después del tratamiento con ambos oligonucleótidos antisentido fueron disminuciones de 43 y 62 veces para OAS-GSTM3 y OAS-GSTP1, respectivamente (ver Figuras 6B-6C). Los tumores controles de la línea celular de CaSki también expresaron ambas proteínas. En los tumores tratados, se observó que los niveles de GSTM3 y GSTP1 no disminuyeron tanto como en otros tumores que expresaron estas proteínas (ver Figuras 6D-6E). El tratamiento con OAS-GSTP-1 dio como resultado una reducción del volumen del tumor de 2.6 veces en comparación con el control. En el caso del tratamiento con OAS-GSTM3 , no se observaron diferencias significativas entre el volumen de los tumores control y los tumores tratados con OAS-GSTM3 (ver Figuras 6B-6C). La baja eficacia en la inhibición de la expresión proteica por el tratamiento, particularmente para GSTM3, fue responsable de la poca respuesta en la reducción tumoral, por lo que el GSTM3 remanente es suficiente para proporcionar un efecto protector a las células tumorales.

Además, también se estudió la respuesta al tratamiento de los tumores de dos líneas celulares de diferentes orígenes, MDA-MB-231 de cáncer de mama y COLO de cáncer de colon. Ambos tumores exhibieron una baja expresión de GSTP1 en comparación con los tumores CC (ver Figuras 6D-6E). Sin embargo, los tumores COLO tratados tenían niveles 1,9 veces menores que el control (ver Figuras 6B-6C). En el caso de MDA-MB-231, los niveles de GSTP1 apenas eran detectables en los tumores de control y, como consecuencia, el tratamiento con OAS-GSTP1 no afectó la PT (ver Figuras 6B-6C). Los tumores de ambas líneas celulares (COLO y MDA) expresaron GSTM3 y en ambos casos, el tratamiento con el oligonucleótido antisentido redujo significativamente los niveles de la proteina.

GSTM3 y GSTP1 regulan las proteínas MAP cinasas pJNK y pp38.

Se analizaron los efectos de la desactivación de la GSTM3 y GSTP1 sobre la activación de pJNK y pp38 y la fosforilación de p65 y pERK (de la vía de NF- B) durante la PT del CC (ver Figuras 7A- 7H). Se analizó la expresión de la proteína a través de ensayos inmunohistoquímicos en todos los tumores CC tratados con oligonucleótidos antisentido (OAS-GSTM3, OAS-GSTP1 y OAS-control). Los tratamientos con OAS-GST dieron como resultado la fosforilación y activación de pJNK y pp 8 MAP cinasas. Los tumores HeLa que solo expresan GSTM3 y, por lo tanto, solo respondieron al tratamiento con el oligonucleótido antisentido OAS-GSTM3, mostrando un aumento de la fosforilación de JNK y p38 (ver Figuras 7A-7B). Por otro lado, los tumores de CaLo y SiHa, solo mostraron fosforilación de p38, con los dos tratamientos OAS-GSTM3 y OAS-GSTP1; CaLo (ver Figuras 7C-7D); y SiHa (ver Figuras 7E-7F). Para los tumores de CaSki, ambas MAPK se regularon positivamente tras el tratamiento con OAS-GST (ver Figuras 7G-7H).

GSTM3 y GSTP1 regulan la supervivencia celular mediante la inactivación de NF-kB y pERK Se examinó la inactivación de la proteína ERK y p65 NF-kB (ver Figuras 7A-7H). Los tumores de HeLa tratados con OAS-GSTM3 mostraron inactivación de ambas proteínas (ver Figuras 7A-7B). En los tumores de CaLo solo pERK se inactivó después del tratamiento con cualquiera de los oligonucleótidos antisentido para GST (ver Figuras 7C-7D). Para los tumores de SiHa solo se inactivó NF-kB por cualquiera de los tratamientos (ver Figuras 7E-7F). En los tumores de CaSki, ambas proteínas se inactivaron después de cualquier tratamiento (ver Figuras 7G-7H). La inhibición de las proteínas GSTM3 y GSTP1 indujeron la apoptosis y disminución en la supervivencia celular a través de las vías de NFKB y MAP-cinasas.

Análisis de expresión de GST en muestras de tejido de pacientes CC

Se realizó un estudio de seguimiento de 13 pacientes con CC qué se habían sometido a quimioterapia (ver Figuras 8E-8F). Los análisis de expresión de proteínas se realizaron para GSTM3 y GSTP1 usando inmunohistoquímica (IHC). En este estudio, se analizó el porcentaje de la región de interés (ROI) que era inmunopositiva. Sorprendentemente, todos los pacientes expresaron ambas proteínas, pero con gran variabilidad con respecto al porcentaje de la ROI (ver Figura 8A, Figuras 8E-8F). Se categorizaron arbitrariamente a los pacientes en tres grupos en función al porcentaje de ROI: débil, moderado y alto para GSTM3 y GSTP1 (ver Figuras 8B-8C). Enseguida, se realizó un análisis de asociación de la expresión de GST y la supervivencia del paciente y se generaron dos grupos: débil-moderado para GSTM3 y moderado para GSTP1 (DM-M), y otro grupo con valores moderados-altos para GSTM3 y valores altos para GSTP1 (MA-A) (ver Figura 8D). Los resultados mostraron que la expresión de GSTM3 y GSTP1 podría influir significativamente en la supervivencia de los pacientes con CC. Se observa una clara correlación entre la supervivencia del paciente y la expresión de las proteínas GST. Los pacientes que mostraron una expresión débil a moderada (DM-M) mostraron una tasa de supervivencia significativamente más alta que los pacientes que exhibieron una expresión de GST moderada a alta (MA-A) (ver Figura 8D). Los resultados se muestran en la Tabla 7 siguiente. Tabla 7 ROI de proteínas GSTs de pacientes con CC

Los resultados obtenidos indican que pacientes con cáncer de cérvix expresaban las proteínas GSTM3 y GSTPl, y que la expresión de las muestras de tejido está relacionada con la supervivencia. Por lo que se concluye que el aumento de estas proteínas está involucrado con la prognosis del paciente siendo desfavorable esta sobre expresión.

La presente invención proporciona evidencias para la identificación e inhibición de la expresión de la GSTM3 y la GSTP1. En los resultados de los cultivos, las células cancerosas de cérvix se vieron afectadas drásticamente por el bloqueo de ambas GST, mientras que las células controles HaCaT (no cancerosas) no se vieron afectadas por la inhibición de estas proteínas, por lo cual la GSTM3 y la GSTPl son cruciales para la supervivencia y la proliferación de células cancerosas en cultivo. En tumores inoculados, se observó que en aquellas líneas celulares de CC que expresaban al menos una de estas proteínas, el volumen del tumor disminuía drásticamente después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido.

La presente invención demuestra que la inhibición de GSTM3 o GSTP1 activa la señalización de JNK y p38, la cual conduce a las células a apoptosis y, por lo tanto, disminuye el volumen del tumor. Por otro lado, se observó que la inactivación de NF-kB y/o ERK después de la inhibición de las GST inhiben la supervivencia celular.

La presente invención muestra que existe una fuerte asociación de la sobre expresión de las proteínas GSTM3 y GSTP1 y la supervivencia de los pacientes. Los resultados obtenidos in vitro e in vivo concuerdan con los datos clínicos, ya que, la supervivencia de los pacientes con CC se asoció con altos niveles de proteína GST (ver Figura 7C). Estos datos también estuvieron de acuerdo con estudios sobre la vejiga y el cáncer de colon en los que se encontró que la sobre expresión de la proteína GSTM3 se asociaba con una tasa de supervivencia reducida de los pacientes. Por lo que, la presente invención presenta un mecanismo mediante el cual, las células de CC utilizan las proteínas GST para evitar la apoptosis y activar la supervivencia y proliferación celular. Además, esta respuesta se ve afectada por la inhibición de estas proteínas (ver Figura 9).

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos permitirán entender aún más la presente invención así como mostrar el mejor método de llevar a cabo la misma. Deberá de entenderse que dichos ejemplos son ilustrativos de la presente invención y no limitantes en manera alguna del alcance de la misma. Las referencias citadas en la presente se deben de interpretar como que están expresamente incorporadas en ésta. Deberá también entenderse que los métodos y técnicas de extracción de proteínas, e inmunodetección, así como los protocolos para la preparación de muestras, la electroforesis en gel bidimensional preparativa, el análisis de imágenes y la identificación de proteínas a través de la espectrometría de masa MALDI, que no estén específicamente descritos en los ejemplos, están reportados en la bibliografía mencionada y son conocidos por los diestros en la técnica. Por ejemplo, la extracción de proteínas fenólicas se describe en Hurkman, W. J., & Tanaka, C. K. (1986). Solubilization of plañí membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis. Plant physiology, 81(3), 802-806; Encamación, S., Guzmán, Y., Dunn, M. F., Hernández, M., Vargas, M. del C., & Mora, J. (2003). Proteome analysis of aerobio and fermentative metabolism in Rhizobium etli CE3. In Proteomics (Vol 3, bll 1077-1085), Klose, J., & Kobalz, U. (1995). Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis, 16(6), 1034-1059.

Generación de tumores

Se utilizaron ratones desnudos atímicos hembras de 4-6 semanas de edad (BALB/c Nu/Nu) y se inyectaron subcutáneamente con 10 ⁷ células tumorales en 500 pL de medio RPMI 1640 sin FBS y se colectaron en 30, 45 y 50 días. Los tumores se midieron usando un calibrador Vemier, y el volumen del tumor fue obtenido calculando el volumen de un elipsoide como p / 6 (L * W * H), donde L: largo, W: ancho y H.

Extracción de proteína tumoral, análisis proteómico y espectrometría de masas.

Las muestras del tejido tumoral se extrajeron macerándolas en nitrógeno líquido y un cóctel de inhibidor de proteasa y fosfatasas, seguido de sonicación en hielo, para enseguida realizar la extracción de proteínas fenólicas mediante extracción con buffer RIPA. Posteriormente se realiza el análisis de expresión proteica usando anticuerpos anti-GSTM3 y anti-GSTPl para después visualizarlas mediante técnicas de inmunodetección como: manchado western (western blot), inmunohistoquímica, ELISA, etc.

Extracción de proteínas extracelulares IR vitro y ex vivo.

Las líneas celulares se cultivaron con RPMI 1640 avanzado libre de suero hasta 70-80% de confluencia. El medio se retiró y se enjuagaron tres veces con solución salina estéril: NaCl al 0,9% (p/v). Después de los lavados, se añadió medio RPMI 1640 libre de FBS sin fenol rojo fresco (Gibco), y se incubó durante 20 h. Más tarde, el medio se recuperó y se centrifugó a 2.000 g durante 5 minutos. El sobrenadante se pasó a través de una membrana de PVDF de 0,22 pm de tamaño de poro (Millex, Millipore) y se almacenó a -70°C hasta su uso posterior. Para las proteínas extracelulares de tumores de los xenoinjertos, los tumores HeLa y SiHa se inocularon con 10 ⁷ células. Después de 30 , 45 y 50 días después de la inoculación , se recogieron los tumores y se lavaron 3 veces con solución salina. El procedimiento seguido para extraer proteínas secretadas de tumores se realizó como se describió previamente para las células en cultivo y el sobrenadante se almacenó a -70°C hasta su uso posterior.

Identificación de proteínas secretadas a través de LC-MS/MS

La identificación de las proteínas secretadas en las líneas celulares fue separada en SDS-PAGE. Los péptidos generados se analizaron en un sistema nanoLC-MS / MS (Q-TOF Synapt G2 MS; Waters), la identiñcación de los péptidos y proteínas se realizó a través de la interfaz MASCOT Distiller (Matrix Science), y la base de datos Swiss-Prot y NCBI.

Análisis del péptido señal Para el análisis del péptido señal se utilizó un programa bioinformático llamado SignalP 4.1, que predice la presencia y la localización de los sitios del péptido de señal en secuencias de aminoácido. El método predice e identifica los sitios de exportación del péptido de señal basada en características fisicoquímicas y una combinación de redes neurales (NN) y modelos escondidos de Markov (HMM).

Coinmunoprecipitación e inmunomanchado (inmunoblot)

El tumor HeLa se recogió a los 50 días y se almacenó a 80°C hasta su uso. Después de la muestra tumoral se maceraron en nitrógeno líquido y se Usaron con 500 pL bufifer RIPA (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, NP40 al l°/o, deoxicolato de sodio al 0,1%, NaCl 140 mM) y se suplementaron con inhibidores de proteasa y fosfatasa (10 mM b-glicerofosfato, 10 mM Na ₃ V0 ₄ , 10 mM de fluoruro de sodio). Los Usados celulares totales se centrifugaron a 13,000 g durante 5 min para sedimentar el material insoluble. Los Usados se incuban 2 horas con proteína A sefarosa, se normaUzaron para la concentración de proteína total (10pg de proteína) usando SDS - PAGE. Los anticuerpos candidatos a proteínas (GSTM3 y TRAF6) se inmunoprecipitaron incubando Usados con 6 pL de sefarosa conjugada con anticuerpo durante la noche a 4°C. Las perlas se lavaron 3 veces con 500 pL buffer de lisis. Las proteínas coinmunoprecipitantes se resolvieron en SDS-PAGE al 12%. Los niveles de GSTM3 y TRAF6 se detectaron mediante inmunotransferencia usando anti-anticuerpos previamente descritos.

Los anticuerpos comerciales para analizar las proteínas en manchado western (western blot) se seleccionaron de anticuerpos anti-GSTM3 (Abcam, ab67530, 1:10,000), anti-GSTPl (Abcam, ab53943, 1:10,000), anti-TLR4 (Biolegen, 312804, 1:10,000), anti-TRAF6 (Abcam, abl3853, 1:10,000), anti-NF-Kb P65 (SC-378, 1:1,000), anti IKB-a (SC-371, 1:1,000), anti-JNK (sc-1648, 1:1,000), antiERK (sc-94, 1: 1,000), anti p38 (sc-535, 1:1,000), anti-NF-kB fosfo p65 (sc-101752, 1: 1,000), anti-fosfo-JNK (sc-6254, 1:1,000), anti-fosfo-ERK (sc-7383, 1:1,000), fosfo-p38 (sc-7973, 1 :1,000), anti-fosfo-IKB-a (Cell signaling, 1:1,000), anti-HSP70 y HSP60 (Biolegen, 648005 y 681502, 1:10,000), HPV18 E7 (Abcam, ab38743, 1:1,000), anticuerpo anti-His tag (Invitrogen, 372900, 1:5,000). Se Usan las células en un buffer que contiene Tris 100 mM (pH 8.6); 4% de SDS; 100 mM DTT; un cóctel inhibidor de proteasa. Para garantizar la lisis se da pulsos con un sonicador durante 1 segundo para la fragmentación del ADN. Las proteínas se separan por electroforesis en SDS-PAGE del 12% al 15%, y se transñeren a membranas de nitrocelulosa usando un sistema semiseco. Las membranas ya transferidas se bloquean con leche descremada al 5% o con albúmina sérica bovina en un buffer disolución salina con Tris que contenía Tween 20 (TBST) durante 15 minutos a 4°C, se lavaron tres veces en TBST. Posteriormente, se retira la albúmina o la leche descremada y se lava 3 veces con TBST, para después incubarla la membrana con el anticuerpo primario (anti-GSTM3 o anti-GSTPl) a 4°C durante toda la noche, y probaron con anticuerpo primario diluido e incubado a 4°C durante la noche. Después de retirar el anticuerpo primario las membranas fueron incubadas con un anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa durante 2 h para después ser revelada la membrana con una solución de Carbazol (27,2% de Carbazol Stock, 72,6% de buffer de acetato, 0,2% de H202), Carbazol Stock: N, N-Dimetilformamida > 98% y 3-Amino-9- etilcarbazol (Sigma-Aldrich) en una proporción 1:8 (p/v) para generar una tinción de color rojo/marrón. Las cuantiñcaciones relativas se realizaron con el software ImageJ.

Para analizar muestras de tejido por inmunohistoquímica (IHC) se analiza el porcentaje de la región de interés (ROI) que es la región que da positivo a la expresión de las GSTs. Los registros médicos fueron revisados, teniendo en cuenta el historial médico previo del paciente. Todos los casos fueron sometidos a un análisis inmunohistoquímico utilizando anti-GSTM3 (Abcam, ab67530, 1:1,000) y, anti-GSTPl (Abcam, ab53943, 1:1,000). Los bloques de parafina se muestrearon a un espesor de tejido de 5 pin y se produjeron por duplicado para cada portaobjetos. El análisis se realizó en un inmunocontenedor automatizado (Ventana Medical Systems). Tres partes del tumor se evaluaron por separado en cada muestra, al igual que la presencia de tinción en las células tumorales. En este estudio, analizamos el porcentaje de la región de interés (ROI) teñida por los anticuerpos, según lo estimado utilizando el software CellSens (Olympus). Las muestras se dividieron en dos grupos para evaluar la asociación de la expresión de proteínas y la supervivencia del paciente: (W-M) que consistía en un débil ROI para GSTM3 y moderada ROI para GSTP1; y (MH-H) el cual agrupa a ROI moderado/alto para GSTM3 y alto ROI para GSTP1. Se emplearon curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para este análisis utilizando XLSTAT, con el CI de Greenwood y un nivel de significación del 95%.

Con el fin de evaluar el efecto de GSTM3 y GSTP1 en las células de CC, se inhibió la expresión de ambas proteínas mediante el uso de oligonucleótidos antisentido (OAS). Se diseñaron tres OAS, dos para bloquear específicamente a las proteínas y uno con una secuencia aleatoria como control negativo (OAS-GSTM3, OAS-GSTP1 y OAS-Control). Primero se evaluaron ocho dosis para cada O AS en cultivo con dos líneas celulares, HeLa (cáncer cérvico uterino) y HaCaT (control negativo al cáncer). Las dosis utilizadas fueron desde 10 a 1 280 ng/mL totales incorporadas al medio de cultivo. Y posteriormente, evaluamos la proliferación celular en tres diferentes tiempos a las 24, 48 y 72 horas. En este experimento, se observó que las células HaCaT no se vieron afectadas por el tratamiento con OAS-GSTM3 durante el período de análisis. Solo se notó una ligera pérdida de supervivencia con la dosis más alta (1 280 ng/mL). En las células HeLa, se notaron pérdidas de viabilidad después de 48 horas de tratamiento en todas las dosis de OAS-GSTM3 (ver Figura 5A). Después de 72 horas, las dosis más altas de tratamiento (640 y 1 280 ng mL) mostraron una supervivencia inferior al 10% en comparación con las células de control. Se obtuvieron resultados similares para el tratamiento con OAS-GSTP1 en ambas células.

Una vez identificada la expresión proteica de las GSTM3 y/o GSTP1 en el tejido tumoral se procede administrar los oligonucleótidos antisentido específicos (por ejemplo: 2’0-Me, 2Ό-MOE, vivo- Morfolino, Morfolinos, LNA, PNA, entre otros) para realizar el silenciamiento de las proteínas GSTs, las cuales inducirán la muerte celular tumoral.

A pesar de que la presente invención ha sido descrita con particularidad de acuerdo con ciertas de las modalidades preferidas, los ejemplos deberán de ser interpretados solo como ilustrativos de la invención y no con el propósito de limitar la misma. Las referencias citadas en la presente son expresamente incorporadas para referencia.

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