Противовирусное средство

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к бионеорганической химии и медицине, а именно к области получения противовирусных лекарственных препаратов, и может быть использовано в медицине и ветеринарии для лечения вирусных заболеваний.

Предшествующий уровень техники

Для лечения вирусных заболеваний обычно применяются интерфероны, интерлейкины и нуклеозиды. Такая терапия бывает эффективна в острой фазе заболевания, но часто является недостаточной при хроническом течении заболеваний.

Интерферонотерапия сопряжена с развитием побочных эффектов. Среди негативных проявлений проводимой терапии наиболее часто встречается гриппоподобный синдром, симптомы гастроинтестинальных и психогенных нарушений, признаки миелосупрессии, расстройства функций щитовидной и паращитовидной желез. Многие негативные реакции интерферонов потенцируются синтетическими модифицированными аналогами нуклеозидов (рибаверин, видарабин, рибомидил и др.), широко используемыми в терапии вирусных заболеваний.

Перечисленные осложнения терапии отмечаются в 10-42% клинических случаев хронического гепатита, что позволяет считать подобную терапию достаточно опасной по риску осложнений даже в условиях специализированных стационаров, и на текущий момент отсутствуют эффективные, малотоксичные средства лечения, в частности, хронических вирусных гепатитов, создание которых является одной из актуальных задач современной фармакологической и медицинской науки.

В патентах RU2153350, RU2153351 рассматривается фармакологическое решение по потенцированию противовирусной активности инозина предпочтительно с использованием координационного соединения цисплатина и окисленного глутатиона. Однако цисплатин представляет собой комплексное соединение платины (Pt), применение которой сопряжено с опасностью токсического и мутагенного действия, следовательно и применение содержащего его лекарственного средства ограничено. Сущность изобретения

Задачей данного изобретения является создание противовирусного средства широкого спектра действия, которое эффективно при хроническом течении заболеваний, и обладает минимальными побочными эффектами.

Данная задача решена тем, что предложена комбинация бис-(у-1_-глутамил)-

L-цистеинил-глицина или его соли, инозина и координационных соединений, образованных палладием, медью и (у-1_-глутамил)-1_-цистеинил-глицин� �м. Указанная комбинация далее обозначается как «средство по изобретению».

Предпочтительно, когда в этой комбинации бис-(у-1--глутамил)-1_-цистеинил- глицин представлен в виде динатриевой соли.

Целесообразно, когда мольное соотношение бис-(у-1_-глутамил)-Ь цистеинил-глицина динатриевая соль : инозин : палладий : медь находится в диапазоне 100-10000 : 100-10000 : 1-10 : 1-10, например 1000:1000:1 :1.

Целесообразно в качестве источника палладия выбирать цис- диаминодихлорпалладий, а в качестве источника меди - медь двухлористую.

В одном из воплощений изобретения комбинация может содержать катализатор на основе цис-диаминодихлорида палладия, меди двухлористой и (γ- 1_-глутамил)-1_-цистеинил-глицина, приготовленный in situ.

В альтернативном воплощении такой катализатор может быть приготовлен заранее.

Предложенная комбинация обладает противовирусной активностью, она может быть использована в терапии инфекционных, в частности вирусных, заболеваний.

Предложена также фармацевтическая композиция, включающая в себя указанную комбинацию и фармацевтически приемлемый эксципиент.

Такая фармацевтическая композиция обладает противовирусной активностью и может быть использована в терапии инфекционных, в частности вирусных, заболеваний.

Предложено также противовирусное средство, представляющее собой 'раствор указанной комбинации в ацетатном буфере.

Целесообразно, когда в указанном средстве мольное соотношение 6nc-(y-L- глутамил)-1_-цистеинил-глицина динатриевая соль : инозин : палладий : медь находится в диапазоне 100-10000 : 100-10000 : 1-10 : 1-10, например 1000:1000:1 :1.

Такое средство может быть использовано для лечения вируса, выбранного из группы, включающей в себя вирус гриппа, вирус гепатита С, вирус гепатита В вирус клещевого энцефалита, вирус лихорадки долины Рифт и вирус венесуэльского энцефалита лошадей.

Предложен также способ лечения вирусного заболевания у пациента, нуждающегося в этом, при котором пациенту вводят эффективное количество указанной комбинации, композиции или средства. Вирусное заболевание может быть выбрано из группы, включающей в себя грипп, гепатит С, гепатит В, клещевой энцефалит, лихорадку долины Рифт, венесуэльский энцефалит лошадей.

Описание графических материалов

На Фиг.1 представлен типовой профиль изменения динамики ИФНа в сыворотке крови экспериментальных животных после однократного введения средства по изобретению. По оси ординат указан уровень ИФНа в сыворотке крови (ЕД/мл). Звездочкой отмечены достоверные различия по сравнению с контролем при р<0,05.

Подробное описание изобретения

Средство по изобретению оказывает выраженный противовирусный эффект, а также интерфероногенный эффект.

Инозин представляет собой 1 ,9-Дигидро-9-бета-0-рибофуранозил-6� �-пурин- 6-он (рибофуранозилгипоксантин).

Инозин представляет собой анаболическое средство, стимулятор метаболических процессов, предшественник АТФ. Повышает энергетический баланс, улучшает коронарное кровообращение и обменные процессы в миокарде. Обладает антигипоксическим действием. Применяется при ИБС (инфаркт миокарда, стенокардия), кардиомиопатии, нарушениях ритма сердца, миокардите, миокардиодистрофии, заболеваниях печени (гепатит, цирроз печени, жировая дистрофия печени), язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, открытоугольной форме глаукомы.

Глутатион, гамма-глутаминил-цистеинил-глиц� �н, представляет собой трипептид, образованный остатками трёх аминокислот: глутаминовой кислоты, цистеина и глицина.

Глутатион содержится во всех живых организмах и имеет важное значение для окислительно-восстановительных реакций в связи со способностью сульфгидрильной группы (SH-) цистеина вступать в обратимую реакцию: - 2H

2GSH ^ GS - SG

+ 2H

Восстановленный глутатион (GSH) в данном описании обозначен как (γ-L- глутамил)-1_-цистеинил-глицин. Окисленная форма глутатиона (GSSG) обозначена как бис-(у-1_-глутамил)-1_-цистеинил-гли цин.

Если не указано иное, под глутатионом в данном описании подразумевается восстановленный глутатион.

Глутатион способен образовывать соли с катионами, в частности Na.

Комбинация по изобретению содержит d-металлы. Источниками d-металлов, палладия и меди, могут служить их различные соли, которые при растворении в воде приводят к образованию комплексных соединений. В частности, при внесении в водный раствор простых солей меди(Н), таких как CuCI ₂ или CuBr ₂ , происходит их аквотация, сопровождающаяся последующим гидролизом и образованием в растворе олигоядерных аквагидроксокомплексов меди(П). Палладий также может быть добавлен в виде его подходящих солей, в частности цис- диаминодихлорпалладия,

Реакция получения средства по изобретению GSSGNa ₂ /nH03HH/Pd/Cu = ответствует уравнению:

^* Pd(NH ₃ ) ₂ CI ₂ CuCI ₂

Получение средства по изобретению может быть реализовано несколькими способами.

Один из вариантов реализации процесса получения средства по изобретению заключается в предварительном получении палладиево-медного катализатора (координационных соединений палладия и меди и у-1.-глутамил-1-- цистеинил-глицина) (стадия 1 , пример 1) с последующим внесением полученного раствора катализатора в реакционную массу, проведением окисления,

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) смешиванием полученного раствора с раствором инозина, фильтрации и лиофилизации.

В другом варианте реализации предложен вариант получения палладиево- медного катализатора in situ (пример 2), с последующим проведением окисления, смешиванием полученного раствора с раствором инозина, фильтрации и лиофилизации.

В третьем варианте реализации (пример 3) предложен вариант раздельного получения, с введением дополнительной стадии вакуумно-сублимационной сушки (лиофилизации) раствора динатриевой соли бис-(у-1_-глутамил)-1_-цистеинил- глицина (содержащем коордиинационные соединения палладия и меди) , последующим растворением полученного лиофилизата, смешиванием с раствором инозиина, фильтрацией и лиофилизацией раствора средства по изобретению.

Последний вариант реализации, хоть и является более энерго- и материально-затратным обладает преимуществом связанным с отсутствием побочных процессов, а именно - процессов окисления инозина.

При каталитическом окислении тиолов RSH одной из наиболее важных функций палладия является образование координационных соединений - продуктов присоединения к иону палладия тиолат-ионов RS-, с последующим их окислением и разрушением координационного полиэдра.

Экспериментальные исследования каталитических систем с применением медно-палладиевых катализаторов показывает их значительно большую каталитическую эффективность по сравнению с биядерными тиолатмостиковыми соединениями палладия(М). В отличие от водных растворов окисленного глутатиона GSSG, содержащих тиолатные комплексы меди Cu' _k (SR) _m , водные растворы, содержащие Pd-Cu катализаторы, по данным ¹ Н ЯМР, ИК спектроскопии и ВЭЖХ устойчивы к процессам разложения.

Исследования показывают, что в Pd-Cu катализаторах соотношения Pd:Cu оптимально лежат в пределах от 1 :0.2 до 1 :2.

Для процессов мягкого селективного окисления GSH до GSSG, можно сделать вывод о том, что биядерные тиолатмостиковые комплексы палладия(И) выполняют основную функцию катализаторов окисления, а тиолатные комплексы меди(1) следует отнести к химическим сайтам, меняющим их каталитическую активность или, говоря иначе, управляющим их каталитической активностью.

Таким образом, сочетание функциональных биядерных палладиевых координационных соединений, например формулы с бидентатномостиковой координацией глутатиона с управляющим сайтом типа {Cu k(SR) _m }, образующимся из солей меди СиХ ₂ (где Х= СГ или Вг ^" ), превращающихся в среде тиолов в соответствующие тиолатные производные комплексов меди(1), показывает один из наиболее эффективных подходов к управлению активностью каталитических систем на основе комплексов палладия Pd ₂ " и Си ¹ .

Образование комплексного соединения, включающего Си, Pd и GSH в сопоставимых количествах, обеспечивает биологический эффект предложенной комбинации.

Для получения фармацевтических композиций по изобретению используют фармацевтически приемлемые эксципиенты. В частности, это неорганические или органические носители. Лактоза, кукурузный крахмал или его производные, тальк, стеариновая кислота или ее соли и т.п. могут быть использованы, например, в качестве таких носителей для таблеток, таблеток, покрытых оболочкой, драже и твердых желатиновых капсул. Подходящими носителями для мягких желатиновых капсул являются, например, растительные масла, воски, жиры, полутвердые и жидкие полиолы и т.п. Подходящими носителями для получения растворов и сиропов являются, например, вода, полиолы, сахароза, инвертный сахар, глюкоза и т.п. Подходящими носителями для суппозиториев являются, например, природные или отвержденные масла, воски, жиры, полужидкие или жидкие полиолы и т.п.

Кроме того, фармацевтические композиции могут содержать консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, смачивающие вещества, эмульгаторы, подсластители, красители, корригенты, соли для регулирования осмотического давления, буферы, маскирующие агенты или антиоксиданты и другие, необходимые компоненты.

В общем, все продукты и способы по изобретению альтернативно могут включать в себя, состоять или по существу состоять из любых подходящих компонентов и стадий, раскрытых в данном описании или известных специалисту из уровня техники, и такие продукты или способы по изобретению могут дополнительно или альтернативно исключать какой-либо компонент, или стадию, или объект, который использован в продукте или способе, известном из уровня техники, или который не является необходимым для достижения технического результата данного изобретения. ПРИМЕРЫ

Далее изобретение поясняется конкретными примерами. Пример 1. Получение средства по изобретению

Стадия 1. 20 мг (94.6 мкмоль) L HC-[Pd(NH ₃ ) ₂ CI ₂ ] на холоду диспергируют в 20 мл дистиллированной воды, в полученную суспензию вносят 30 мг GSH (97.6 мкмоль) и перемешивают до образования светло-желтого гомогенного раствора.

Стадия 2. В ранее полученную реакционную смесь приливают 5 мл раствора, содержащего 14.52 мг (85.2 мкмоль) дигидрата хлорида меди(Н). рН полученного желто-зеленого раствора катализатора доводят до значения 5.5 - 6.0 0.01 М раствором гидроксида натрия.

Стадия 3.

В стеклянный стакан отвешивают 58.19 г (0.189 моль) GSH, приливают при перемешивании 200 мл дистиллированной воды, охлаждают до 10-15°С. Отдельно растворяют в 50-60 мл дистиллированной воды 7.57 г NaOH (0.189 моль) и полученный раствор приливают к суспензии GSH при интенсивном перемешивании и не позволяя реакционной массе разогреваться выше 15-20°С и перемешивают до образования прозрачного гомогенного раствора. Если необходимо рН реакционной смеси корректируют до 5.5-6.0 0.01 М раствором гидроксида натрия. В полученную реакционную систему приливают ранее приготовленный раствор катализатора, стакан переносят на ледяную баню (5-10°С) и небольшими порциями, в течении 45- 60 мин приливают 100-102 мл (~ 0.1 моля) 1 М свежеприготовленного раствора пероксида водорода при интенсивном перемешивании. Полноту протекания реакции контролируют методом ВЭЖХ.

Отдельно в 150 мл горячей дистиллированной воды (60-70 °С) растворяют 25.38 г (0.095 моль) рибофуранозилгипоксантина (инозин). После полного растворения раствор охлаждают до комнатной температуры и приливают к реакционной смеси. После стерилизующей фильтрации раствор замораживают и подвергают вакуумно-сублимационной (лиофильной) сушке.

В полученном препарате мольное соотношение GSSG - инозин - палладий - медь составляет 1000-1000-1-0.9.

,

Пример 2. Получение средства по изобретению

ЗЗОг (1 ,074 моль) восстановленного глутатиона суспендируют в 3100 мл воды. К полученной суспензии добавляют 42,96 г (1 ,074 моль) гидрооксида натрия в виде 16% водного раствора при постоянном перемешивании и охлаждении. К полученному раствору добавляют 0,1135 г (0,537 ммоль) цис- диаминодихлорпалладия и 0,0915 г (0,537 ммоль) хлорида меди 2-водного и тщательно перемешивая добавляют 304,5г 6% раствора (0,537 моль) лерекиси водорода, контролируя температуру (не более 15°С). После добавления перекиси полученный раствор выдерживают при комнатной температуре 1 ,5 часа. 144 г (0,537моль) инозина растворенного в минимальном количестве воды добавляют к полученному раствору окисленного глутатиона, фильтруют через фильтр 0,22μ и лиофилизируют. Выход бис-(у-1_-глутамил)-1_-цистеинил-гли цина рибофуранозил- гипоксантина-динатрия : цис-диаминодихлорпалладий : медь двухлористая (в соотношении 10ОО: 1 :1) составляет 99%. Пример 3. Получение средства по изобретению

Стадия 1

ЗЗОг (1 ,074моль) восстановленного глутатиона суспендируют в 3100мл воды. К полученной суспензии добавляют 42,96г (1 ,074моль) гидрооксида натрия в виде 16% водного раствора. Затем реакционную массу охлаждают и добавляют 0,1 35г (0,537ммоль) цис-диаминодихлорпалладия и 0,0915г (0,537ммоль) хлорида меди 2-водного. К полученному раствору добавляют 304, 5г 6% р-ра (0,537моль) перекиси водорода, контролируя температуру (не более 15°С). Полученный раствор выдерживают при комнатной температуре 1 ,5 часа. Фильтруют через фильтр 0,22 μ и лиофилизируют. Получают 365г динатриевой соли 6nc-(v-L- глутамил)-1_-цистеинил-глицина (содержание воды 4%, Pd - 57мг, Си - 34 мг).

Стадия 2

Лиофилизированную динатриевую соль бис-(у-1_-глутамил)-1_-цистеинил- глицина с предыдущей стадии растворяют в минимальном количестве воды и добавляют к раствору инозина (144г, 0,537 моль) в воде. Полученный раствор фильтруют через фильтр 0,22μ и лиофилизируют. Выход для 2-х стадий 98%.

Пример 4. Получение лекарственной формы средства по изобретению

В емкости для приготовления раствора вместимостью 1 ,0 л к 0,8 л воды для инъекций добавляют 13,6 г ацетата натрия 3-водного, 60 г субстанции средства по изобретению и перемешивают до растворения с последующим доведением общего объема до 1 ,0 л. Определяют значение рН с помощью рН-метра и доводят 20% уксусной кислотой до рН 6,0±0,2. Проводят стерилизующую фильтрацию с использование стерилизующего фильтра с размером пор 0,22 мкм и проводят розлив (1 мл - 1 ампула) стеклянные ампулы. В результате получают 970 ампул (с учетом потерь), содержащих композицию для внутривенного или внутримышечного введения, соответствующую требованиям нормативной документации в течение 3 лет и имеющей следующий состав:

Средство по изобретению 60 г

Ацетат натрия, 3-водный 13,6 г

Уксусная кислота ДО рН 6,0

Вода до 1000 мл

Пример 5. Терапевтическое действие in vivo средства по изобретению, при лечении заболеваний, вызванных патогенными ДНК и РНК вирусами

Инозин характеризует широкий спектр фармакологической активности, включая противовирусное действие, которое может быть усилено его сочетанием с другими биологически активными молекулами. В патентах RU2153350, RU2153351 рассматривается фармакологическое решение по потенцированию противовирусной активности инозина предпочтительно с использованием координационного соединения цисплатина и окисленного глутатиона. Эффект потенцирования достигается за счет способности координационного соединения цисплатина и окисленного глутатиона катализировать комплекс реакций окислительной модификации мишени, повышая ее сродство к воздействию инозина. Если механизм потенцирования противовирусного эффекта инозина связан с каталитической активностью координационных соединений, то средство по изобретению должно оказывать подобное, более выраженное действие, так как в его составе присутствует координационное соединение с более высокой каталитической активностью в сравнении с координационным соединением цисплатина и окисленного глутатиона.

Цель исследования: определение терапевтической эффективности средства по изобретению в лечении различных вирусных инфекций. Исследуемые соединения бис-(у-1_-глутамил)-1_-цистеинил-гли цина рибофуранозилгипоксантина- динатрия : цис-диаминодихлорпалладий : медь двухлористая (в соотношении 1000: 1 :1 ) (средство по изобретению)

бис-(у-1_-глутамил)-1.-цистеинил-гли цина рибофуранозилгипоксантина- динатрия: цис-диаминодихлорплатина (референс 1) Арбидол лекарственная форма, серия 970609 (референс 2) Экспериментальная модель

- вирус венесуэльского энцефалита лошадей (ВЭЛ) - патогенный штамм Тринидад. Накопление вируссодержащего материала для последующего заражения лабораторных животных осуществляли с использованием 9-1 1 дневных развивающихся куриных эмбрионов - 30-50 шт. Первоначально готовили пять последовательных десятикратных разведений вируссодержащей суспензии. По 0,2 мл каждого разведения вируссодержащей суспензии вносили в аллантоисную полость развивающихся куриных эмбрионов. Место инъекции вируссодержащей суспензии покрывали расплавленным парафином. Затем развивающиеся куриные эмбрионы помещают в термостат при температуре (37±0,5)°С на 18 ч, периодически оценивая их жизнеспособность с помощью овоскопа. По истечении времени инкубации в термостате оценивали жизнеспособность развивающихся куриных эмбрионов и из «тушек» живых эмбрионов готовили 10 % суспензию вируссодержащего материала с использованием физиологического раствора с добавлением антибиотиков (пенициллин из расчета 100 ЕД на 1 , мл, стрептомицин - 200 ЕД на 1 мл). Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 1 ,5-2,0 тыс. об. /мин и температуре плюс (3±0,5) °С. Надосадочную жидкость разливали во флаконы объемом 1 ,0 мл и использовали для дальнейшего заражения экспериментальных животных мышей. Исходный титр вируса 10 ⁷ -10 ⁸ ЛД ₅ о/мл

- вирус лихорадки долины Рифт (ЛДР) - патогенный штамм 8-87. Накопление вируссодержащего материала для заражения лабораторных животных осуществляют с использование 3-5-дневных мышей-сосунков - 10-15 гол. Первоначально готовили пять последовательных десятикратных разведений вируссодержащего материала. По 0,02 мл каждого разведения вводили в мозг мышам-сосункам, за которыми устанавливали наблюдение в течение 24-48 ч, по окончании которого животных забивали эфиром, извлекали головной мозг и депонировали его по три образца в пенициллиновые флаконы, которые хранили в морозильной камере при температуре минус (20±0,5) °С. В дальнейшем, 10 % суспензию головного мозга использовали в качестве вируссодержащего материала. Исходный титр вируса 10 ⁵ - 10 ⁶ ЛД ₅₀ /мл;

- вирус клещевого энцефалита (КЭ), - патогенный штамм Абсетаров. Накопление вируссодержащего материала для заражения лабораторных животных проводили на мышах-сосунках. Первоначально готовили пять последовательных десятикратных разведений вируссодержащего материала, которым служил центрифугат 10 % суспензии мозга зараженных ранее мышей или регидратированный из лиофильного состояния вируссодержащий материал. По 0,02 мл каждого разведения вводили в мозг мышам-сосункам, за которыми устанавливали наблюдение в течение 24-48 ч, по окончании которого животных забивали эфиром, извлекали головной мозг и депонировали его по три образца в пенициллиновые флаконы, которые хранили в морозильной камере при температуре минус (20±0,5) °С. В дальнейшем, 10 % суспензию головного мозга использовали в качестве вируссодержащего материала. Исходный титр вируса 10 ² - 10 ³ ЛД ₅₀ /мл.

- вирус гриппа А штамм A/Aichi/02/68 (H ₃ N ₂ ). Получение вируссодержащего материала проводили на 9-1 1 -суточных развивающихся куриных эмбрионах. Последующее накопление вируссодержащего материала для заражения лабораторных животных осуществляли с использованием 5 мышей, которые были заражены вирус-содержащей аллантоисной жидкостью, содержащей патогенные штаммы A/Aichi/02/68 (H ₃ N ₂ ). На 3 сутки после заражения их легкие были изолированы, гомогенизированы в 10-кратном объеме стерильного физиологического раствора, после чего инфекционная активность вируса в гомогенате была определена в отдельном эксперименте при помощи титрования по летальности _t на животных. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча (Am.J. Нуд. ,1938,27:493-497).

Исследования по оценке эффективности средства по изобретению выполнены на белых неинбредных мышах-самцах массой 16-18 г (360 голов).

Применительно к каждому возбудителю величину ЛД ₅₀ определяли на белых неинбредных мышах с расчетом этого критерия по методу Кербера в модификации И.П.Ашмарина и А.А.Воробьева.

Эффективность изучаемых препаратов определяли по сопоставлению величин показателей выживаемости животных в подопытных ^" (получавших соответствующие препараты) и контрольных группах. Процент выживших животных в подопытных и контрольных группах определяли по таблицам Генеса B.C. При этом наблюдение за инфицированными животными проводили в течение 21 суток, ежедневно регистрируя число живых и павших в подопытных и контрольных группах. Методы статистической обработки результатов

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили на персональном компьютере, используя специальные программы, реализующие традиционные статистические методы.

Результаты изучения противовирусной активности средства по изобретению

На всех экспериментальных моделях особо опасных вирусных инфекций (ООВИ) и гриппа эффективность средства по изобретению и препаратов сравнения оценивали при их применении по двум схемам:

- за 24 ч до заражения, одновременно с заражением, через 24 ч, 48 ч и 72 ч после заражения (схема N° 1 - экстренной профилактики);

- одновременно с заражением, через 24 ч, 48 ч и 72 ч после заражения (схема 2 - раннего этиотропного лечения). "

Средство по изобретению и референс 1 вводили подкожно в объеме 0,5 мл в разовой дозе 30 мг/кг массы тела (10 мкг/мышь). '

В качестве референс-препарата при лечении гриппозной инфекции использовали арбидол лекарственная форма, серия 970609 (референс 2) который вводили через 1 ч после заражения и далее перорально в течение пяти суток 1 раз в сутки в дозе 60 мг/кг.

Эффективность средства по изобретению при экспериментальной вирусной инфекции венесуэльском энцефаломиелите.

Результаты проведенных исследований приведены в таблице 1.

Таблица 1

Эффективность средства по изобретению в качестве препарата экстренной профилактики и этиотропного лечения экспериментальной вирусной инфекции - венесуэльского энцефаломиелита

2 10 0 100 ^* референс 1 1 12 10 60 40

2 10 40 60

2 12 10 50 50

2 10 40 60

Контроль Не 12 10 100 0 заражения вводили

Не 2 10 100 0 вводили

* - различия с показателями в контроле достоверны при р<0,05.

Представленные в таблице 1 данные свидетельствуют о том, что оцениваемые препараты оказывали протективное действие в отношении экспериментального ВЭЛ. Наиболее эффективным в данных условиях оказалось средство по изобретению. При этом, если препарат применяли по схеме 1 (за 24 ч до заражения, одновременно с заражением, через 24 ч, 48 ч и 72 ч после заражения), то вне зависимости от заражающей дозы вируса ВЭЛ выживаемость инфицированных мышей находилась на уровне 100 % на фоне 100 % летальности в контроле. Если же препарат применяли по схеме 2 (одновременно с заражением, через 24 ч, 48 ч и 72 ч после заражения), то в этих условиях в зависимости от заражающей дозы возбудителя протективный эффект находился на уровне 100 % (при заражении возбудителем в дозе 12 ЛД ₅₀ ) и 100 % (при заражении возбудителем в дозе 2 ЛД ₅₀ ). При применении референса 1 показатели защиты в зависимости от заражающей дозы возбудителя были на 40-60 % ниже, чем при применении средства по изобретению.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что среди оцененных препаратов наиболее эффективной в отношении экспериментальной инфекции ВЭЛ оказалось средство по изобретению. Средство по изобретению, применяемое по схеме экстренной профилактики, обеспечивало защиту 100 % инфицированных животных на фоне 100 % летальности в контроле.

Эффективность средства по изобретению при экспериментальной вирусной инфекции - лихорадки долины Рифт.

Результаты проведенных исследований приведены в таблице 2. Таблица 2

Эффективность средства по изобретению в качестве препарата экстренной профилактики и этиотропного лечения экспериментальной вирусной инфекции - лихорадки долины Рифт

Представленные в таблице 2 данные свидетельствуют о том, что наилучший протективный и терапевтический эффект в отношении ЛДР был получен при применении средства по изобретению. Вне зависимости от схемы применения препарат обеспечивал 100 % защиту инфицированных мышей на фоне 100 % летальности в контроле. Референс 1 в данных условиях был малоэффективен.

Эффективность средства по изобретению при экспериментальной вирусной инфекции - экспериментальном клещевом энцефалите.

Результаты исследований приведены в таблице 3. Таблица 3

Эффективность средства по изобретению в качестве препарата экстренной профилактики и этиотропного лечения экспериментальной вирусной инфекции - экспериментального клещевого энцефалита

Как следует из представленных данных, все оцененные препараты при применении у животных, инфицированных возбудителем в дозе 2 ЛД ₅₀ , проявляли практически одинаковую защитную эффективность, обеспечивая выживаемость 80-100 % инфицированных мышей на фоне их 100 % летальности в контроле. В то же время, если препараты применяли у животных, инфицированных возбудителем в дозе 12 ЛД ₅ о, то в этих условиях средство по изобретению оказало более выраженное действие.

Эффективность средства по изобретению при экспериментальной вирусной инфекции - грипп (патогенный штамм A/Aichi/02/68).

Результаты исследований приведены в таблице 4. Таблица 4

Эффективность средства по изобретению в качестве препарата экстренной профилактики и этиотропного лечения экспериментальной вирусной инфекции - грипп (патогенный штамм A/Aichi/02/68).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что средство по изобретению по выраженности специфической активности в отношении гриппозной инфекции у белых мышей, интраназально инфицированных вирусом гриппа, штамм A/Aichi/02/68 (H3N2), выше чем у Арбидола.

Заключение

Совокупность результатов проведенных исследований позволяет сделать заключение о том, что средство по изобретению характеризует профилактическое и терапевтическое действие в отношении различных вирусных заболеваний, вызываемых как ДНК, так и РНК вирусами.

Пример 6. Определение способности средства по изобретению индуцировать продукцию интерферона

Терапевтическая эффективность средства по изобретению в отношении различных вирусных заболеваний, вызываемых как ДНК, так и РНК вирусами в числе прочего может быть обусловлена его способностью увеличивать эндогенную продукцию интерферона, биологически активного вещества, обладающего выраженной противовирусной активностью.

Цель исследования: Определение способности средства по изобретению стимулировать продукцию интерферона.

Исследуемое соединение: - бис-( γ- L-глутамил)- L - цистеинил-глицина рибофуранозилгипоксантина-дина� �рия цис-диаминодихлорпалладий медь двухлористая (в соотношении 1000:1 :1) (средство по изобретению)

Методика эксперимента

Оценку интерфероногенных свойств средства по изобретению проводили методом титрования интерферона альфа (ИФНа) в сыворотке крови подопытных животных, получавших средство по изобретению в дозе 30 мг/кг, эффективной по результатам опытов (см. пример 3). Препарат вводили однократно подкожно. В контрольной группе мышей применяли подкожное введение плацебо (0,85 % раствор хлорида натрия). Забор крови у мышей подопытных (получали один из оцениваемых препаратов) и контрольной групп производили в стерильных условиях из ретроорбитального синуса через 2, 4, 8, 16, 24, 32, 36, 40 и 48 ч после инъекции препарата. В одной пробе объединяли кровь от пяти мышей. Динамику накопления интерферона исследовали в сыворотках, приготовленных по стандартной методике. Для титрования активности ИФНа в сыворотке крови экспериментальных животных была использована культура клеток L-929 (перевиваемая культура клеток мышиных фибробластов), 153-й пассаж, полученная из Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург). Титрование ИФНа в полученных пробах проводили микрометодом. Культуру клеток L-929, разведенную ростовой средой до необходимой концентрации (3-4 10 ⁵ клеток/мл), вносили в лунки 96-луночных пластиковых панелей и инкубировали в термостате в течение 24 ч. На протяжении всего процесса титрования инкубация клеточных культур проходит при одинаковых условиях: температуре плюс 37 °С в атмосфере с 5% С0 ₂ и 98 % влажности. После образования на дне лунок клеточного монослоя ростовую среду из панели удаляют и вносят поддерживающую среду, в которой производят последовательные двукратные разведения тестируемых проб (в парных лунках). По окончании суточной инкубации тестируемые пробы удаляют и вносят тест-вирус ЕМС в рабочем разведении (100 ЦПД ₅₀ ). Через сутки производят учет результатов с помощью инвертированного микроскопа. Титр ИФН - величина, обратная последнему разведению сыворотки, в котором наблюдается 50 % защита от ЦПД тест-вируса. Результаты исследования

Динамика изменений ИФНав сыворотке крови экспериментальных животных после однократного введения средства по изобретению представлена на Фиг.1.

Как следует из полученных данных уровень ИФНа начинал увеличиваться через два часа с момента введения средства по изобретению в 5-6 раз, достигал максимума в течении 16-24 часов, превышая фоновые значения в 45 - 50 раз, возвращаясь к нормальным величинам к 48 часам после воздействия средства по изобретению. Динамика изменения уровня ИФНа свидетельствует о наличии интерфероногенной активности у средства по изобретению. Эндогенный ИФНа обладает определенным преимуществом перед препаратами экзогенного интерферона: при введении в организм интерфероногенов вырабатывается интерферон, не обладающий антигенностью; не возникает негативных эффектов, присущих препаратам экзогенного ИФНа; синтез индуцированного ИФНа в организме сбалансирован и подвергается контрольно-регуляторным механизмам (репрессор-трансляции), обеспечивающим защиту организма от перенасыщения интерфероном; однократное введение интерфероногенов обеспечивает относительно длительную циркуляцию эндогенного ИФНа. Действие средства по изобретению соответствует перечисленным эффектам интерфероногенов.

Таким образом, средство по изобретению характеризует способность усиливать продукцию интерферона альфа.

Пример 7. Терапевтическая эффективность средства по изобретению - GSSGNag/инозин/РоУСи при хроническом вирусном гепатите С (ХВГС)

Пациентка N1 : 48 лет.

Диагноз: ХВГС, фаза репликации (PCR HCV+ - 3,60x10 ⁷ копий/мл = 9,00x10 ⁶

IU/мл), умеренно выраженная степень активности. Хронический аутоиммунный тиреоидит. Гипотиреоз.

Больна на протяжении 20 лет.

В анамнезе непереносимость специфической противовирусной терапии, включая пегилированный интерферон, рибавирин и другие противовирусные препараты, индукторы интерферона. Постоянно принимает L-Тироксин 150 мг - утром, раз в сутки.

Жалобы: слабость, ощущение тяжести в правом подреберье, привкус во рту, отсутствие аппетита, плохой сон, раздражительность.

Последние пять лет часто отмечала появление ноющих болей в правом подреберье, слабость, периодическое изменение цвета мочи. После обследования (результаты табл.5, 3 столбик), проведено лечение в дневном стационаре, лекарственная форма средства по изобретению, 60 мг - внутримышечно, 3 раза в неделю, с двухдневным перерывом (суббота, воскресенье).

Таблица 5.

Динамика изменения значений лабораторно диагностических показателей на фоне терапии лекарственной формой средства по изобретению

Показатель Рефферентное До Через 4 Через 12 Через значение лечения недели недель 24

недели

1 2 3 4 5 6

Вирусная нагрузка 9,60x10' 3.03 х10 ^ь 1.42 x10 ^й 2.65 PCR HCV хЮ ³ (копий/мл)

Биохимический анализ крови

АЛТ (U/L) 0-45 194 156 95 64

ACT (U/L) 5-34 206 198 112 83

ГГТП (U/L) 9 - 36 216,75 186,24 164,65 96,20

ALP(U/L) До 240 302 298 246 180

Билирубин общий 0,2-1 ,2 6,45 3,31 1 ,45 0,96 (мг/дл)

Билирубин прямой 0-0,5 4,45 1 ,52 1 ,02 0.44 (мг/дл)

Общий белок (г/дл) 6,4-8,3 6,0 6,3 6,7 7,4

Альбумин (г/дл) 3,2-5,0 3,2 3,5 3,7 4,2

Глобулины (г/дл) 2,7-3,3 2,8 2,7 3,0 3,0

Алб./Глоб. 1 ,2-2,0 1 ,14 1 ,3 1 ,23 1 ,4

Ферритин (нг/мл) 6-223 446,73 394,66 356,07 256,21

Железо крови 25 - 156 201 ,2 200,07 184,27 159,87 мкг/дл

Анализ крови

Эритроциты 4,0-5,6 3,58 3,67 4,98 4,82 х10 ¹² /Л Гемоглобин (г/дл) 12-16 8,7 9,3 10.1 11 ,8

Гематокрит(%) 27-31 21 27 27 31

Лейкоциты х10 ⁹ /Л 4-11 3,6 3,62 4,8 5,2

Нейтрофилы (%) 45-70 40 44,9 50 56 базофилы (%) 0,5-1 0 0,6 0,8 1

Эозинофилы (%) 1-5 1 2,4 2,2 2

Моноциты (%) 1-8 4 4,3 4 3

Лимфоциты (%) 25-40 55 48,1 43 38

Тромбоциты 180-320 90,2 133 159 212 (х10 ⁹ /л)

Свертывающая система крови

Протромбиновое 10-12,5 17,3 15,3 14,1 11 ,1 время (сек)

Активированное 20-36 42 40 36 30 парциальное

протромбиновое

время(сек)

Тромбиновое 10-13,5 17,6 16,0 13,9 12,8 время(сек)

Парциальное 10-12 17,4 16,1 12,7 11 ,9 тромбиновое

время(сек)

Длительность менее 4 минут 8 8 6 4 кровотечения (мин)

Время 5-10 мин 9 9 8,3 8 свертывания крови

(мин)

Лекарственная форма средства по изобретению хорошо переносится. После инъекции пациентка отмечает прилив сил, улучшение настроения. Объективным критерием ответа на терапию является динамика изменения вирусной нагрузки, которая через месяц уменьшилась в три раза, через три месяца в 6о раз и более чем на четыре логарифма через шесть месяцев терапии. Снижение вирусной нагрузки сочеталось со снижением интенсивности реакций цитолиза (нормализация трансаминаз к завершению терапии), восстановлением физиологически оптимальной функциональной активности гепатоцитов (нормализация уровня белка, значений показателей Пигментного и других видов обмена). Терапевтическое действие препарата привело к нормализации клеточного состава крови, активности состояния свертывающей системы.

При обследовании печень выступает на 0,5 см из-под реберной дуги. Край печени мягкий, безболезненный.

Из особенностей восприятия терапии следует отметить то, что через каждые три недели требовалось уменьшения дозы L-Тироксина. К завершению терапии доза L-Тироксина была снижена в два раза.

Таким образом, использование лекарственной формы средства по изобретению позволило провести терапию хронического вирусного гепатита С при непереносимости средств специфической противовирусной терапии, что является одним из доказательств противовирусной активности средства по изобретению.