ANALYSES SANGUINES

L'invention se rapporte au domaine des appareils pour effectuer des analyses biomédicales, et en particulier des analyses sanguines. Plus particulièrement encore, l'invention porte sur un appareil et sur un dispositif consommable pour effectuer des analyses sanguines de manière délocalisée, c'est à dire en dehors d'un laboratoire spécialisé (dans la littérature anglo-saxonne on parle de « Point-of-care testing », c'est à dire d'analyses effectuées au « point de soin »). L'appareil et le dispositif consommable de l'invention conviennent notamment au diagnostic des pathologies du foie, et plus précisément des maladies fibrogènes.

Les fibroses du foie sont conventionnellement diagnostiquées par biopsie, une technique intrusive comportant un risque pour le patient. De nombreuses études ont été menées dans le but de permettre le diagnostic des fibroses à partir de marqueurs biochimiques pouvant être obtenus par analyse du sang.

Le document EP1311857 décrit un procédé et un kit de détermination d'un index de fibrose à partir d'un dosage de cinq marqueurs sanguins, ainsi que de l'âge et du sexe du patient. A cet effet, une prise de sang est réalisée pour ensuite être analysée in vitro dans un laboratoire. Un laborantin obtient alors des dosages qui une fois combinés permettent de déterminer un index sanguin. Un tel procédé impose l'utilisation de matériels et de compétences spécifiques ; à ce titre, les échantillons doivent être analysés dans un laboratoire d'analyse médicale externe nécessitant des techniques de conservation, de transport et de logistique adaptés dont la durée et le pourcentage d'erreur sont conséquents et fonctions de chaque étape.

De façon générale, lors d'une analyse sanguine, un délai minimum de diagnostic est souhaité afin de limiter l'aggravation de la pathologie.

Les articles : « Predicting Cirrhosis in Patients With Hepatitis B Based on Standard Laboratory Tests : Results of the HALT-C Cohort », A. S. F. Loket al., Hepatology, Vol. 42, No.2, pages.282 - 292 (2005); et

« Development of a Simple Noninvasive Index to Predict Significant Fibrosis in Patients With HIV/HCV Confection», R. K.Sterling et al. Hepatology.Vol. 43, No. 6, pages 1317 -1325 (2006) ; divulguent en particulier l'utilisation des marqueurs sanguins suivants : le rapport entre les dosages des transaminases AST (aspartate aminotransferase) et ALT (alanine aminotransferase) - voire le dosage de l'AST seule ; le comptage des plaquettes ou thrombocytes ; et la détermination de l'INR (« International Normalized Ratio », c'est à dire rapport international normalisé), qui est une mesure normalisée du temps de coagulation du sang.

Conventionnellement, ces paramètres sont déterminés par analyses effectuées en laboratoire, nécessitant l'intervention d'opérateurs spécialisés utilisant des équipements relativement lourds.

Les principales méthodes de dosage des transaminases plasmatiques sont basées sur des techniques optiques, électrochimiques, chromatographiques ou radiochimiques (voir, pour une revue, Huang et al.,

Sensors, 2006, 6:756-782). Les techniques optiques sont les plus couramment utilisées, et comprennent : la colorimétrie, la spectrophotométrie d'absorption UV à 340 nm et la fluorescence. Ces techniques doivent être mise en oeuvre dans un laboratoire d'analyses et utilisent généralement du sérum ou du plasma, ce qui signifie qu'une opération préalable de fractionnement, généralement par centrifugation, doit être mise en œuvre.

Il existe cependant un dispositif de biologie délocalisée permettant le dosage des transaminases par chromatographie à partir de sang total. Il s'agit du dispositif dénommé CholestechLDX (marque déposée) de la société Cholestech. Le dosage de l'AST et de l'ALT à l'aide de ce dispositif s'effectue à partir d'un échantillon de 35 μl de sang capillaire total et comprend les étapes suivantes : le sang est déposé dans le puits d'une cassette (consommable du dispositif) et migre par capillarité à travers un filtre retenant spécifiquement les globules rouges ; le plasma résultant est ensuite mis au contact de réactifs séchés sur une membrane, conduisant à une réaction colorimétrique ; un système optique mesure alors la couleur finale de la réaction par photométrie de réflectance, la coloration bleue mesurée étant d'une intensité proportionnelle à la concentration en transaminases présentes dans l'échantillon (voir les Demandes Internationales WO 2004/90555 et WO 2005/044429). La méthode couramment utilisée pour compter les thrombocytes est la cytométrie en flux d'impédance et/ou optique. Cette méthode nécessite un équipement relativement sophistiqué ; par conséquent, elle ne peut être mise en œuvre que dans un laboratoire spécialisé. En outre, elle nécessite un volume relativement important de sang (au moins de l'ordre de 100 μl) et une dilution importante de l'échantillon (plusieurs millier de fois).

Un procédé très ancien de comptage des thrombocytes, désormais pratiquement désuet, comporte l'utilisation d'un hémocytomètre. Il s'agit d'un dispositif constitué par une veine fluidique réalisée en verre, sur laquelle est gravée une grille de comptage. Un échantillon de sang lysé, dilué au moins 100 fois et dont les cellules sont marquées par un agent de contraste non spécifique du type colorant de Giemsa ou de Wright, est introduit dans l'hémocytomètre, puis observé en microscopie, ce qui permet le comptage manuel des cellules d'intérêt. Cette méthode a été pratiquement abandonnée en raison de sa précision insuffisante et du travail long et fastidieux qu'elle demandait à un opérateur spécialisé pour identifier les plaquettes et les compter manuellement.

L'article de J. -S. Lin et al. « A PC-based imaging system for automated platelet identification », IEEE Transactions on Biomédical Engineering, Volume 39, N° 9, septembre 1992, pages 990 - 993 décrit un procédé d'indentification des plaquettes qui adhèrent à un substrat fonctionnalisé dans des conditions d'écoulement proches de celles rencontrées in vivo. Ce procédé, qui comporte un marquage fluorescent desdites plaquettes et l'utilisation d'un système informatique de traitement des images, ne permet pas de déterminer la concentration des plaquettes dans un échantillon sanguin car seules les cellules qui adhérent au substrat fonctionnalisé sont identifiées. Classiquement, la mesure du temps de coagulation sanguine comporte les étapes suivantes : dans un premier temps le sang est prélevé du patient dans un tube contenant un anticoagulant adapté permettant un délai raisonnable de transport entre le lieu de prélèvement et le lieu d'analyse (au minimum plusieurs minutes) sans que l'échantillon ne coagule ; ensuite, le plasma est extrait de l'échantillon de sang par centrifugation et mélangé dans les bonnes proportions avec différents réactifs nécessaires à l'inhibition de l'anticoagulant utilisé lors du prélèvement (par exemple, des ions calcium) et avec les réactifs nécessaires au déclenchement de la coagulation (par exemple, de la thromboplastine) suivant le facteur de coagulation étudié ; enfin, la mesure du temps de coagulation proprement dite est effectuée à l'aide de différents équipements.

Le document US 4,252,536 décrit un dispositif et un procédé optique de mesure du temps de coagulation. Ce dispositif et ce procédé se basent sur l'évolution de l'intensité d'un signal optique détecté du fait de la modification de la diffusion dans un échantillon de plasma lors de la formation d'un caillot de sang coagulé.

Le document US 3,635,678 décrit une autre méthode couramment utilisée, consistant à introduire dans l'échantillon de plasma une bille magnétique, mise en mouvement oscillatoire à l'aide d'un aimant ou électroaimant extérieur. L'observation du déplacement de la bille est réalisée par voie optique. La mesure du temps au bout duquel la bille se fige dans le plasma, immobilisée par le caillot qui se forme, correspond au temps de coagulation.

Ces méthodes de mesure du temps de coagulation ne conviennent pas à l'utilisation du sang total, qui est trop opaque. Le document US 6;352,630 décrit un procédé électrochimique de mesure du temps de coagulation. La mise en œuvre de ce procédé nécessite un consommable comportant des électrodes en contact avec l'échantillon biologique, un appareillage permettant la reprise de contacts électriques sur le consommable, et l'ajout audit échantillon d'agents électrochimiques permettant la mesure.

L'article de Yann Piederrière et al. « Evaluation of blood plasma coagulation dynamics by speckle analysis » décrit deux procédés d'étude de la dynamique de coagulation du sang par analyse de la granularité (ou des tavelures) laser. Ces procédés se basent sur l'observation du fait que les particules (plaquettes, protéines) en suspension dans le plasma diffractent et diffusent la lumière ; si un échantillon de plasma est éclairé par un faisceau laser, spatialement et temporellement cohérent, il en résulte un motif de granularité (ou de tavelures, « speckle » en anglais). A cause du mouvement incessant des particules, ce motif varie dans le temps, tant que le plasma reste liquide, puis se fige une fois le caillot formé. Dans le premier procédé décrit dans l'article précité, l'intensité lumineuse en correspondance d'un point du motif de granularité est enregistrée en fonction du temps. La mise en œuvre de ce procédé est assez délicate : en effet, la transparence du plasma diminue au cours du processus de coagulation ; il est donc nécessaire d'incrémenter l'intensité lumineuse d'éclairage au cours du temps, ou d'éclairer l'échantillon assez fortement pendant toute la durée d'acquisition, au risque de saturer le détecteur. En outre, comme seule l'intensité lumineuse en un point est considérée, le signal optique est faible - ce qui implique un rapport signal sur bruit insatisfaisant - à moins d'utiliser une intensité lumineuse d'éclairage relativement importante. Le deuxième procédé décrit comporte l'acquisition d'une série temporelle d'images du motif de granularité, et la détermination du contraste de chaque image. Avant la formation du caillot, le mouvement des particules en suspension « brouille » les images, et réduit leur contraste ; ce dernier augmente lorsque le motif de granularité se fige à cause de la coagulation du plasma. De l'aveu même des auteurs, cette méthode ne permet pas une détermination précise du temps de coagulation. Tous les procédés de mesure du temps de coagulation sanguine décrits ci-dessus utilisent du plasma, et ne peuvent pas fonctionner avec du sang total. Ils nécessitent donc une étape préalable de fractionnement du sang, qui ne peut être effectuée que dans un laboratoire spécialisé.

Dans ce contexte, l'invention vise à permettre de s'affranchir des problèmes précités pour obtenir des données représentatives des marqueurs compris dans un échantillon sanguin de façon quasi-instantanée et in-situ en vue de réduire le risque d'erreur qui est généralement lié au délai d'analyse. Plus précisément, l'invention vise à procurer un système de biologie délocalisée permettant de déterminer trois ou quatre marqueurs significatifs pour le diagnostic des fibroses du foie (dosage AST et/ou ALT, comptage des plaquettes, temps de coagulation) à partir d'un échantillon de sang total. Un tel système comprend un dispositif consommable, de préférence de type puce microfluidique, et un appareil dans lequel le dispositif consommable peut être introduit et qui réalise de manière automatique ou semi-automatique les analyses nécessaires. Avantageusement un tel système peut fonctionner de manière autonome, sans besoin d'autres appareils (à l'exception d'un dispositif de prélèvement du sang, par exemple de type aiguille ou lancette) et sans nécessiter l'intervention d'un opérateur qualifié.

Un dispositif consommable selon l'invention comporte une pluralité de chambres fluidiques susceptibles de recevoir un échantillon de sang total à analyser et dont au moins certaines ont au moins une paroi transparente, caractérisé en ce qu'il comprend au moins trois chambres ou groupes de chambres fluidiques contenant chacune un réactif ou un ensemble de réactifs aptes à permettre, respectivement : le suivi d'une décroissance de la fluorescence d'un composé chimique induite par une chaîne de réactions biochimiques dans laquelle intervient une enzyme plasmatique ; le marquage spécifique des thrombocytes par un marqueur fluorescent, et leur inactivation ; et la coagulation du sang.

Avantageusement un tel dispositif consommable peut comporter également une quatrième chambre ou groupe de chambres fluidiques contenant un ensemble de réactifs adaptés pour permettre le suivi d'une décroissance de la fluorescence d'un composé chimique induite par une chaîne de réactions biochimiques dans laquelle intervient une deuxième enzyme plasmatique .

Selon des modes de réalisation particuliers de l'invention : Lesdits réactifs peuvent être à l'état sec ou lyophilisé. - Lesdites chambres fluidiques peuvent être intégrées dans une puce fluidique.

Le dispositif peut comporter au moins un premier groupe de deux chambres fluidiques reliées par un conduit dit secondaire, dans lequel : - une première chambre dudit groupe contient : un premier substrat d'une enzyme plasmatique à doser ; une ou plusieurs enzymes catalytiques ayant comme substrat l'un des produits obtenus au cours de la réaction enzymatique catalysée par ladite enzyme plasmatique ; et un cofacteur fluorescent de ladite ou desdites enzymes catalytiques ; et une deuxième chambre dudit groupe a au moins une paroi transparente et contient un deuxième substrat susceptible d'initier ladite réaction enzymatique ; moyennant quoi ladite enzyme plasmatique peut être dosée par suivi de la décroissance de la fluorescence dudit cofacteur à l'intérieur de ladite deuxième chambre.

En particulier, lorsque l'enzyme plasmatique à doser est l'AST : ledit premier substrat peut être le L-aspartate ; ledit deuxième substrat peut être l'α-cétoglutarate ; ledit cofacteur peut être le NADH ; et lesdites enzymes catalytiques peuvent être choisies parmi : les malate-déshydrogénases et les malate déshydrogénases associées aux lactates déshydrogénases ; moyennant quoi l'enzyme plasmatique aspartate amino transférase (AST) peut être dosée par suivi de la décroissance de la fluorescence du NADH à l'intérieur de ladite deuxième chambre.

En variante ou en complément, lorsque l'enzyme plasmatique à doser est l'ALT : - ledit premier substrat peut être la L-alanine ; ledit deuxième substrat peut être l'α-cétoglutarate ; ledit cofacteur peut être le NADH ; lesdites enzymes catalytiques peuvent être choisies parmi les lactates déshydrogénases ; moyennant quoi l'enzyme plasmatique alanine amino transférase (ALT) peut être dosée par suivi de la décroissance de la fluorescence du NADH à l'intérieur de ladite deuxième chambre.

Ladite ou lesdites premières chambres peuvent contenir également du phosphate de pyridoxal. - Le dispositif consommable peut comporter au moins une vanne microfluidique pour commander l'écoulement du sang à travers lesdits conduits secondaires.

Le dispositif peut comporter une chambre fluidique ayant au moins une paroi transparente et contentant : - des marqueurs fluorescents susceptibles de se lier spécifiquement avec les thrombocytes ; et un agent inhibiteur de l'activation desdits thrombocytes ; moyennant quoi les thrombocytes peuvent être observés par microscopie à épifluorescence et comptés automatiquement par des moyens informatiques de traitement des données.

En particulier, lesdits marqueurs fluorescents peuvent être des anticorps, eux-mêmes marqués par un fluorophore, susceptibles de se lier aux thrombocytes. L'agent inhibiteur de l'activation des thrombocytes peut avantageusement être choisi entre : de la prostaglandine E1 , du

Dipyridamole, du Clopydogrel, de la Ticlopidine et de l'acide acétylsalicylique.

Le dispositif consommable peut comporter également une chambre fluidique ayant au moins une paroi transparente et contenant un facteur de coagulation du sang. Ledit facteur de coagulation du sang peut être en particulier de la thromboplastine.

Les chambres fluidiques d'un dispositif consommable selon l'invention peuvent présenter une épaisseur comprise entre 15 μm et 1000 μm, et de préférence entre 20 μm et 200 μm, et un volume interne de quelques microlitres.

Lesdites chambres ou groupes de chambres fluidiques peuvent être reliées par l'intermédiaire de conduits dits primaires à une cuvette de collecte commune susceptible de recevoir un échantillon de sang, lesdits conduits étant adaptés pour permettre une répartition dudit échantillon entre les différentes chambres ou groupes de chambres fluidiques. Le dispositif consommable peut alors comporter également des vannes microfluidiques pour commander l'écoulement du sang de la cuvette auxdites chambres ou groupes de chambres fluidiques à travers lesdits conduits primaires. Ladite cuvette peut avoir un volume interne compris entre 5 μl et 50 μl et de préférence entre 10 μl et 20 μl.

Au moins certaines desdites chambres fluidiques peuvent présenter un orifice pour permette l'injection d'un diluant du sang.

Le dispositif consommable peut comporter également une réserve intégrée d'un liquide susceptible d'être utilisé comme diluant du sang, et des conduits fluidiques pour amener ce liquide de la réserve intégrée auxdites chambres.

Le dispositif consommable peut comporter également des moyens pour permettre le couplage desdites chambres fluidiques à une pompe extérieure.

Un appareil (ou « lecteur ») selon l'invention pour effectuer automatiquement des analyses sanguines comporte : un réceptacle pour un dispositif consommable tel que décrit plus haut ; un premier système optique pour diriger un faisceau de lumière d'excitation vers au moins une chambre fluidique dudit dispositif consommable, et pour suivre la décroissance de la fluorescence d'un composé chimique contenu dans ladite chambre ; un deuxième système optique pour diriger un faisceau de lumière d'excitation de fluorescence vers une autre chambre dudit dispositif consommable et pour acquérir au moins une image d'une portion du contenu de ladite chambre par microscopie à épifluorescence ; et un troisième système optique pour diriger un faisceau de lumière cohérente vers une autre chambre dudit dispositif consommable et pour acquérir une séquence d'images de tavelures résultant de l'interaction dudit faisceau de lumière cohérente avec le contenu de ladite chambre. II peut comporter également des moyens de traitement des données coopérant avec lesdits systèmes optiques et adaptés pour : doser une enzyme plasmatique à partir d'un signal de variation temporelle de fluorescence généré par ledit premier système optique ; - compter automatiquement les thrombocytes présents dans la ou les images acquises par ledit deuxième système optique ; et déterminer un temps de coagulation du sang par calcul d'une fonction de corrélation entre images de tavelures acquises à des temps différents par ledit troisième système optique. D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite en référence aux dessins annexés donnés à titre d'exemple et qui représentent, respectivement :

Les figures 1A et 1 B, deux représentations schématiques - en plan et en coupe respectivement - d'un dispositif consommable selon un mode de réalisation de l'invention ; Les figures 2A et 2B, deux représentations schématiques - en coupe longitudinale transversale respectivement - d'un appareil selon un mode de réalisation de l'invention ; et

La figure 3, un schéma fonctionnel de l'appareil des figures 2A et 2B.

Le dispositif consommable et l'appareil de l'invention permettent de mettre en œuvre simultanément trois mesures distinctes sur un échantillon de sang total permettant de déterminer les marqueurs sanguins voulus. Plus précisément : - Le dosage des transaminases (ou, plus généralement, d'autres enzymes plasmatiques présentant un intérêt médical, telles que la pyruvate kinase, la créatine kinase et la glycérol kinase) est effectuée par suivi d'une décroissance de la fluorescence d'un composé chimique induite par une chaîne de réactions biochimiques dans laquelle intervient ladite enzyme plasmatique. La mise en oeuvre d'un tel procédé de dosage a été décrite dans la Demande de brevet en France n° 09 01894 déposée le 20 avril 2009 au nom du Commissariat à l'Energie Atomique et non encore publiée.

La détermination du temps de coagulation est effectuée par une méthode optique décrite dans la Demande de brevet en France n° 09-01435 déposée le 26 mars 2009 et non encore publiée. Cette méthode comporte : l'éclairage d'un échantillon dudit fluide avec un faisceau de lumière cohérente ; l'acquisition d'une série temporelle d'images d'un motif de granularité engendré par l'interaction entre ledit échantillon et ledit faisceau de lumière spatialement cohérente ; et le traitement de ladite série temporelle d'images pour calculer une fonction représentative de la variation dudit motif de granularité entre deux ou plusieurs images de la série (avantageusement, une fonction de corrélation).

- Le comptage des thrombocytes est effectué par une méthode optique décrite dans la Demande de brevet en France n° 09 02087 déposée le 29 avril 2009 au nom du Commissariat à l'Energie Atomique et non encore publiée. Cette méthode comporte : le mélange dudit échantillon avec des marqueurs fluorescents susceptibles de se lier spécifiquement avec les thrombocytes et un agent inhibiteur de l'activation desdits thrombocytes ; l'introduction de l'échantillon dans une chambre fluidique ayant au moins une face transparente ; l'acquisition d'au moins une image numérique dudit échantillon par microscopie à fluorescence ; et le comptage des thrombocytes présents dans ladite ou dans chaque image par des moyens informatiques de traitement des images.

Comme le montrent les figures 1 A et 1 B ₁ un dispositif consommable selon un mode de réalisation de l'invention se présente sous la forme d'une puce microfluidique P comportant une pluralité de chambres fluidiques Ci - C ₆ . La puce P comporte un substrat S, par exemple en verre, en silice fondue ou en matière plastique biocompatible, dans lequel sont gravées les chambres fluidiques ainsi que des conduits, et une plaque de couverture CV déposée au-dessus dudit substrat. Pour pouvoir effectuer des mesures de type optique, il est nécessaire qu'au moins l'un parmi le substrat S et la plaque de couverture CV soit transparent dans le visible et de préférence également dans le proche UV, ou présente des fenêtres transparentes au niveau des chambres fluidiques.

Si la plaque de couverture est transparente, le substrat peut être réfléchissant - par exemple réalisé en silicium, un oxyde ou un nitrure de silicium, ou présentant un revêtement réfléchissant. De même, si le substrat est transparent, c'est la plaque de couverture qui peut être réfléchissante.

Les chambres fluidiques C ₁ - C ₆ présentent typiquement un volume interne de l'ordre de quelques μl et une épaisseur de l'ordre de 15 à 1000 μm et de préférence de l'ordre de 20 à 200 μm. Une telle faible épaisseur est nécessaire afin de pouvoir effectuer des mesures de type optique sur du sang total, qui absorbe et diffuse fortement la lumière. Une épaisseur inférieur à 15 μm, cependant, rendrait difficile le remplissage des chambres, car certaines cellules du sang présentent un diamètre presque du même ordre de grandeur (quelques micromètres). Il n'est pas nécessaire que toutes les chambres aient la même épaisseur : au contraire, les dimensions de chaque chambre peuvent être optimisées en fonction de la mesure spécifique qui doit être réalisée sur l'échantillon sanguin correspondant.

Les chambres fluidiques Ci, C3, C ₅ et C ₆ sont reliées par des conduits microfluidiques respectifs CPi - CP ₄ , dits conduits « primaires », à une cuvette de collecte CC comportant un orifice d'injection Ol permettant son remplissage par un échantillon de sang, éventuellement contenant un anticoagulant. En variante, un anticoagulant tel que du ETDA (acide éthylène- diamine-tétraacétique) peut être contenu à l'état sec ou liquide dans la cuvette CC. La capacité de la cuvette CC est typiquement comprise entre 5 μl et 50 μl et de préférence entre 10 μl et 20 μl, de manière à pouvoir assurer le remplissage des six chambres fluidiques Ci - Ce.

Si l'anticoagulant est du citrate de sodium liquide à 0,109 mole/litre, la cuvette CC peut contenir typiquement 1 volume d'anticoagulant (par exemple, 5 μl) pour 9 volumes de sang (par exemple, 45 μl). Si l'anticoagulant est l'EDTA solide, on pourra utiliser 1 ,8 mg d'anticoagulant pour 1 ml de sang total, soit 0,09 mg pour 50 μl de sang.

Les chambres fluidiques C ₂ et C ₄ sont reliées aux chambres C ₁ et C ₃ respectivement par l'intermédiaire des conduits « secondaires » CSi et CS ₂ . Ainsi, le sang provenant de la cuvette CC ne peut parvenir auxdites chambres C ₂ et C ₄ qu'après avoir traversé les chambres C ₁ et C ₃ .

La puce microfluidique P peut comporter également un réservoir RD rempli avec un diluant tel que du PBS (phosphate buffer saline), pouvant être amené aux chambres fluidiques par l'intermédiaire de conduits microfluidiques respectifs CD. En variante, le diluant requis pour effectuer les différentes mesures peut être injecté directement dans les chambres depuis l'extérieur par l'intermédiaire d'orifices prévus à cet effet.

L'écoulement du sang à travers les conduits CP ₁ - CP ₄ de la cuvette de collecte vers les chambres fluidiques C ₁ - C ₄ , et des chambres C ₁ , C ₃ vers les chambres C ₂ , C ₄ peut avantageusement être régulé par des vannes microfluidiques V. Le document FR 2 897 282 décrit des vannes de ce type. Il en va de même pour l'écoulement du diluant de la réserve RD vers lesdites chambres fluidiques à travers les conduits CD. L'avancée des fluides (sang, diluant) dans les conduits de fa puce P peut se faire par capillarité, ou sous l'effet d'une pompe. Par exemple, l'orifice Ol permet, outre l'injection de l'échantillon de sang dans la cuvette CC, le couplage de ladite cuvette à une pompe à seringue poussant le sang vers les chambres fluidiques. La réserve de diluant RD peut également être pourvue d'un tel orifice. Des évents prévus dans les chambres fluidiques permettent d'évacuer l'air lorsque lesdites chambres se remplissent de sang et/ou de diluant.

Les chambres fluidiques Ci - C ₆ contiennent chacune un réactif - ou un ensemble de réactifs - de préférence à l'état sec ou lyophilisé apte à permettre la détermination d'un marqueur sanguin respectifs.

Les chambres Ci et C ₂ permettent conjointement le dosage de la transaminase aspartate amino transférase (AST). Pour ce faire, la chambre Ci contient : - un premier substrat de l'aspartate amino transférase, tel que le L-aspartate ; une ou plusieurs enzymes catalytiques ayant comme substrat l'un des produits obtenus au cours de la réaction enzymatique catalysée par l'aspartate amino transférase, telle qu'une malate- déshydrogénase éventuellement associée à une lactate déshydrogénase ; du NADH (nicotinamide adénine dinucléotide), agissant comme cofacteur de ladite enzyme ; et optionnellement, du phosphate de pyridoxal qui sert de cofacteur de la transaminase à doser et permet ainsi d'assurer que l'on mesure le maximum de l'activité catalytique de la transaminase en la saturant.

La chambre C ₂ contient un deuxième substrat susceptible d'initier la réaction enzymatique catalysée par l'aspartate amino transférase, tel que l'α-cétoglutarate. Les chambres Ci et C ₂ présentent typiquement un volume interne de quelques microlitres Pour effectuer le dosage de l'aspartate amino trans-férase on commence par transférer une première quantité de sang de la cuvette CC vers la première chambre Ci et une deuxième quantité de diluant de la réserve RD vers cette même chambre. Le facteur de dilution peut aller de zéro (pas de dilution) jusqu'à 1/12 ^e environ. Ainsi, pour un volume de sang total compris entre 0,1 μl et 50 μl, le volume final (après dilution éventuelle) peut être compris entre 0,1 μl (pas de dilution) et 600 μl (dilution à 1/12 ^e ).

Les deux liquides et les réactifs présents dans la chambre sont mélangés, par exemple par des vibrations ultrasoniques, et laissés incuber pendant un temps de 2 à 30 minutes, de préférence 5 minutes. Ensuite, le mélange est transféré vers la deuxième chambre C ₂ où l'α- cétoglutarate déclenche une chaîne de réactions biochimiques qui oxyde le NADH le convertissant en NAD ⁺ . Or, le NADH absorbe la lumière à une longueur d'onde de 340 nm et fluoresce à 460 nm, ce qui n'est pas le cas du NAD ⁺ . Le suivi de la décroissance de la fluorescence permet ainsi de déterminer la concentration de l'aspartate amino transférase, seule inconnue.

Le dosage des transaminases par suivi de la décroissance de la fluorescence est connue de l'art antérieur, voir en particulier les documents

US 3,925,162, US 5,612,178 et WO 91/013169. Classiquement, cependant, une telle mesure est réalisée sur du plasma ou sérum afin de s'affranchir de la forte absorption optique des globules rouges. Les inventeurs se sont rendu compte que la faible épaisseur de la chambre C ₂ permet une sédimentation desdits globules rouges dans un temps de l'ordre de quelques minutes, ce qui rend superflue une opération préalable de fractionnement du sang. Même sous agitation (et donc dans des conditions qui ne permettent pas la sédimentation), la faible épaisseur de la chambre évite que le dosage soit trop perturbé par l'absorption des globules rouges.

Par exemple, pour le dosage de I ¹ AST dans 1 μL de sang total la chambre C ₁ peut contenir: - 382, 9μg de L-aspartate ;

- 1 ,8.10 ^"3 μg de lactate déshydrogénase ;

- 6,6.10 ^"4 μg de malate déshydrogénase ; - 0,77μg de NADH et

- 318,1 μg de phosphate de pyridoxal ; et la chambre C ₂ 32,6μg d'α-cétoglutarate.

Les chambres C ₃ et C ₄ permettent conjointement le dosage de la transaminase alanine amino transférase (ALT). Pour ce faire, la chambre C ₃ contient : un premier substrat de l'alanine amino transférase, tel que le L- alanine ; une ou plusieurs enzymes catalytiques ayant comme substrat l'un des produits obtenus au cours de la réaction enzymatique catalysée par l'aspartate amino transférase, telle qu'une lactate déshydrogénase ; du NADH, agissant comme cofacteur de ladite enzyme catalytique ; et - optionnellement, du phosphate de pyridoxal qui sert de cofacteur de la transaminase à doser.

La chambre C ₄ contient un deuxième substrat susceptible d'initier la réaction enzymatique catalysée par l'alanine amino transférase, tel que l'α-cétoglutarate. Par exemple, pour le dosage de l'ALT dans 1 μL de sang total la chambre C ₃ peut contenir:

- 534, 3μg de L-alanine ;

- 1 ,5.10 ^"3 μg de lactate déshydrogénase ;

- 1 ,53μg de NADH et - 0,32μg de phosphate de pyridoxal ; et la chambre C ₄ , 40,7μg d'α-cétoglutarate. Le dosage de I ¹ ALT se fait par suivi de la décroissance de la fluorescence du NADH, comme décrit ci-dessus pour l'AST.

On remarquera que les chambres C ₂ et C ₄ doivent présenter au moins une paroi ou une fenêtre transparente dans la plage spectrale entre

300nm et 600nm, de préférence entre 340 nm et 460 nm pour permettre l'excitation et la détection de la fluorescence. Par contre, il n'existe aucune contrainte spécifique quant aux propriétés optiques des chambres C ₁ et C ₃ .

Les chambres Ci et C ₃ peuvent également contenir un anticoagulant, si ce dernier n'est pas prévu à l'intérieur de la cuvette de collecte CC.

La chambre C ₅ est destinée à permettre le comptage des thrombocytes ou plaquettes. Elle doit comporter au moins une paroi transparente, ou pourvue d'une fenêtre transparente, et contenir : des marqueurs fluorescents susceptibles de se lier spécifiquement avec les thrombocytes ; et un agent inhibiteur de l'activation desdits thrombocytes. Les marqueurs fluorescents peuvent être des anticorps, par exemple I'anti-CD61 , couplés à des fluorophores tels que l'iso thio cyanate de fluoresceine (ou FITC), la protéine de peridinine chlorophylle (ou PerCP), la R-phycoérythrine (ou R-PE), etc.

L'agent inhibiteur de l'activation (ou anti-activant) peut être de la Prostaglandine E1 , du Dipyridamole, du Clopidogrel, de la Ticlopidine, de l'acide acétylsalicylique (ou aspirine). Tout autre anti-agrégeant plaquettaire peut être utilisé, ayant par exemple comme mode d'action : - l'augmentation des taux des nucléotides cycliques ; l'inhibition du métabolisme de l'acide arachidonique ; l'inhibition des récepteurs membranaires ; l'inhibition des processus d'activation (inhibition des canaux calciques, inhibition de la calmoduline, inhibition du cytosquelette, ...) ; l'inhibition de la formation et/ou de l'action de la thrombine ; etc.

Pour effectuer le comptage des thrombocytes, on commence par transférer une première quantité de sang de la cuvette CC vers la première chambre C ₅ et une deuxième quantité de diluant de la réserve RD vers cette même chambre ou l'inverse. Les deux liquides et les réactifs présents dans la chambre sont mélangés, par exemple par des vibrations ultrasoniques, et laissés incuber dans l'obscurité pendant 15 minutes. Ensuite, la chambre est éclairée par un faisceau de lumière d'excitation des marqueurs fluorescents des thrombocytes, et est observée par microscopie à épifluorescence. On obtient ainsi des images numériques dans lesquelles les thrombocytes marqués apparaissent comme des points lumineux, isolés grâce à l'agent anti-activant qui empêche leur agrégation, sur un fond plus sombre. Ensuite, la ou les images sont traitées par un ordinateur de la manière suivante : - leur contraste est rehaussé, et leur luminosité est réglée par l'utilisateur ou automatiquement ; un seuil de binarisation est défini, de manière à convertir les images d'un format à niveaux de gris à un format binaire noir et blanc ; et le nombre d'objets (points blancs, ou noirs si on travaille en négatif) est compté directement, de manière automatique.

En faisant l'hypothèse que chaque objet sur l'image représente un et un seul thrombocyte, on détermine ainsi un nombre de cellules pour chaque fenêtre d'observation. La moyenne des valeurs ainsi déterminées est enfin convertie en nombre de cellules par unité de volume grâce à l'estimation du volume de la chambre fluidique correspondant à une fenêtre d'observation du microscope.

L'utilisation d'un anti-activant est essentielle pour empêcher que les thrombocytes forment des agrégats, ce qui empêcherait leur comptage. La faible épaisseur de la chambre fluidique C ₅ (typiquement entre 15 μm et 60 μm) permet de minimiser les risques de « chevauchement » de thrombocytes sur l'image. La dilution de l'échantillon poursuit le même objectif : elle n'est pas essentielle, mais simplifie le traitement d'images. En même temps, une dilution excessive devrait être évitée pour ne pas dégrader la statistique de comptage. De manière indicative, un taux de dilution compris entre 0 (pas de dilution) et 50 s'avère adapté. A titre d'exemple, une chambre C ₅ ayant un volume interne de l'ordre de 3 μl (30 μm d'épaisseur, forme carrée avec côtés de 1 cm) peut contenir 0,5 μl d'anticorps marqués et 25 nanolitres (ni) de prostglandine E1

(agent d'inactivation), le restant de son volume interne étant rempli à 90% par du diluant (PBS) et à 10% par du sang complet (environ 250 ni).

La chambre C ₅ peut également contenir un anticoagulant, si ce dernier n'est pas prévu à l'intérieur de la cuvette de collecte CC.

La chambre C ₆ est destinée à permettre la mesure du temps de coagulation du sang. Pour ce faire, elle doit contenir un facteur de coagulation du sang, par exemple la thromboplastine, et le cas échéant un inhibiteur de l'anticoagulant contenu dans la cuvette de collecte CC, par exemple du chlorure de calcium.

Un faisceau de lumière cohérente, issu d'un laser He-Ne ou à semi-conducteur, est dirigé sur l'échantillon de sang contenu dans la chambre CQ à travers une paroi ou fenêtre transparente de cette dernière, et une image d'un motif de granularité (ou tavelures) engendré par l'interaction entre ledit échantillon et le faisceau lumineux est acquis par une caméra CCD. Le temps de coagulation est déterminé par le calcul d'une fonction représentative de la variation dudit motif de granularité entre deux ou plusieurs images acquises à des instants différents - typiquement une fonction de corrélation. Le principe de la mesure est que, tant que le sang reste liquide, le motif de granularité varie sensiblement entre deux acquisitions d'images (faible corrélation). Puis, lorsque le sang coagule, le motif de granularité tend à se figer et la corrélation entre images augmente. Typiquement, la chambre C ₆ peut présenter une épaisseur comprise entre 20 μm et 1 mm, et de préférence entre 30 μm et 300 μm, pour un volume interne de quelques microlitres ou dizaines de microlitres. Le sang provenant de la cuvette CC peut remplir environ entre un tiers et la moitié du volume interne de la chambre, le volume restant étant occupé par les réactifs lyophilisés (facteur de coagulation et, éventuellement, inhibiteur de l'anticoagulant) et le diluant nécessaire à les solubiliser. Typiquement, la chambre C ₆ devrait contenir environ 2 μg de thromboplastine pour 1 μl de sang total. Le facteur de dilution peut être compris entre 0 (pas de dilution) et 10.

La puce microfluidique P est destinée à coopérer avec un appareil L se présentant comme un « lecteur », dans laquelle ladite puce peut être introduite. L'appareil L comporte un réceptacle R pouvant recevoir ladite puce P, situé à l'intérieur une enceinte thermorégulée ETH à 37°C qui est montée au-dessus d'un agitateur par vibration ultrasoniques AU permettant d'homogénéiser le contenu des différentes chambres. Quatre têtes de lecture TL1 , TL2, TL3 et TL4 coopèrent avec les chambres C ₂ , C ₄ , C ₅ et C ₆ de la puce, respectivement, pour effectuer les mesures optiques décrites ci-dessus.

Comme le montre schématiquement la figure 3, une source de lumière LE1 , émettant à 340 nm, dirige deux faisceaux de rayonnement ultraviolet vers les chambres C ₂ et C ₄ pour exciter la fluorescence du NADH, qui est détectée par deux capteurs respectifs DF1 et DF2.

Une deuxième source de lumière d'excitation dirige un autre faisceau de lumière ultraviolette ou bleu vers la chambre C ₅ pour exciter la fluorescence des marqueurs fixés aux thrombocytes (par exemple, si le fluorophore est la FITC, la lumière d'excitation doit avoir une longueur d'onde comprise entre 470nm et 490nm). Une caméra CCD1 collecte une image des cellules marquées à travers un système optique de microscopie à épifluorescence MEF.

Enfin, un laser à semi-conducteur LS dirige un faisceau de lumière cohérente vers la chambre C ₆ . Une caméra CCD2 acquiert, avec une cadence comprise entre 0,5 Hz et quelques Hz, des images de tavelures qui permettent la détermination du temps de coagulation.

La figure 3 illustre schématiquement un mode de réalisation dans lequel toutes les mesures sont réalisées par réflexion : la plaque de couverture CV est transparente ou comporte des fenêtres transparentes (par exemple en verre ou en quartz), tandis que le substrat peut être réfléchissant ou comporter un revêtement réfléchissant (par exemple, réalisé en silicium). Des moyens informatiques du traitement des données permettent d'extraire des mesures brutes les valeurs recherchées des marqueurs sanguins, de les afficher sur un écran et le cas échéant de les imprimer. Le lecteur L peut comporter également des moyens d'actionnement des vannes microfluidiques V de la puce P et/ou une ou plusieurs pompes forçant le déplacement du sang et éventuellement du diluant dans les conduits de cette dernière. Optionnellement, le lecteur peut également comporter des aiguilles pour injecter un diluant directement dans les chambres Ci - C ₆ si une réserve de diluant n'est pas prévue à l'intérieur de la puce.

Le fonctionnement de l'appareil L peut être piloté par un processeur embarqué ou par un ordinateur externe, dont ledit appareil constitue un périphérique.