一：技术领域

本发明属中草药制药技术领域，具体涉及金 银花水提物其在制备预防 和治疗登革病毒的药物与保健品中的应用。

二： 背景技术

登革热是热带与亚热带地区的蚊虫传染病， 每年全球约有 5亿至 10 亿人感染病例， 大多为居住在城市或城镇郊区的居民。其感染 病症从 发烧疼痛的 dengue fever到严重内出血的 dengue hemorrhagic fever 与体内受损重创导致的休克型 dengue shock syndrome,估计在每年全 球 10亿人感染病例中因感染登革热而衍发为严重� ��出血的 dengue hemorrhagic fever约为 50万病例及 2万的死亡病例。 然而， 引起登 革热的登革病毒 dengue virus 其在体内会引起免疫相关的复杂反应， 因而导致至今治疗登革病毒相关的登革热疾病 只有' '头痛医头， 脚痛 医脚' '的治疗症状的''治标' '药， 而没有确实有效能抑制登革病毒活性 与增生数量的''治本"药或是疫苗。寻找治疗或 预防登革热的有效治疗 药为本研发的起因。

中草药金银花 (Lonicera japonica Thunb; honeysuckle)已知其具有治疗 感染发热症状的疗效。本发明在于进一歩的了 解饮用金银花水提物是 否能专门对抗 dengue virus 引起的疾病，金银花水提物是否能调控体 内抗病毒的 microRNA 免疫机制， 其调控的体内抗病毒的 microRNA 是否能抗登革病毒， 以及其抗病毒的机制。期望因此研究确立金银 花 治疗登革病毒的机制与功效， 佳惠全世界的患者。

三： 发明内容

本发明需要解决的问题是确立金银花可抗登 革病毒及其是以调控体 内抗病毒的 microRNA 免疫机制 (microRNA immunity)来对抗登革病 毒， 本发明的技术方案如下：

1. 以小鼠为实验动物模式， 按中医治疗方式喂食金银花水提物 (即中 医治病时病人所喝的金银花水提物， 俗称' '金银花茶 "； 制备方式为： 金银花干花苞 10克加水 500毫升， 大火煮开后文火煮 20分钟即可。 此为一次性服用剂量。 治疗期须早晚各服一剂， 连续服用 4天)， 然 后采血， 以 Solexa deep sequencing 测血中 microRNA表达谱的改变。

2. 将血中 microRNA表达谱中因喝金银花水提物而高表达的

microRNA做计算机分析预测其抗登革病毒 RNA genome的可能性及 其总量上的大幅度变化。此实验与分析证明金 银花水提物可同时调控 体内数个不同的 microRNA, 这些 microRNA 中有许多可直接以登革 病毒的各个基因为目标，因而推测喝金银花水 提物可因同时调高多种 抗登革病毒的 microRNA达到同时攻击抑制或调控登革病毒的功� ��， 并大大减少因病毒发生突变而产生的药作用点 失效的可能性，保证了 此金银花水提物在对抗不同品系的登革病毒的 有效性与疗方的持久 性。

3. 将筛选出的' '受金银花调控而高表达且计算机分析预测其� �有可能 可抗登革病毒 RNA genome的 microRNA" 以 RNA 合成方式大量复制 以便运用于细胞学研究。 在此我们采用 let-7a 为抗登革病毒 RNA genome的 microRNA代表 (biomarker) ,计算机分析预测其极有可能可 抗登革病毒 RNA genome的 NS1 gene 为目标基因。

4. 细胞学研究中， 我们以 luciferase assay, real time-PCR, Western blot, immunofluorescence cytochemistry分另 iji正明 let-7a可抑制含有登革病 毒 NS1 gene的载体的活性，可抑制活体登革病毒制造 NS1 gene 及生 成 NS1 蛋白质。 因而证实 let-7a确实可在细胞内抑制登革病毒 RNA genome的 NSl gene并从而抑制登革病毒制造 NS1 蛋白质， 影响病 毒的活性。

5. 小鼠模式研究中， real time PCR 证实喝金银花水提物的小鼠其血 液中 let-7a会在开始喝后的第 2天呈现高表达，并呈周期改变至 8天。

6. 小鼠模式研究中， 我们采用' '先注射登革病毒入鼠大脑内使其感染 登革病毒， 再喝金银花水提物"以研究金银花水提物对感� �登革病毒 的疗效。

实验证明金银花水提物可抑制登革病毒在脑 内制造 NSl gene ,并明显 降低其所生成的 NS1 蛋白质， 与减少感染鼠脑内的登革病毒数量。 感染鼠的疾病征兆比较轻微， 存活期较长。 感染鼠体内 let-7a表达量 呈现组织特异性： 在血液中比阴性对照组高， 在脑中大为减少。 喝金 银花水提物而没感染登革病毒的鼠其血中脑中 let-7a 表达量提高。感 染鼠喝金银花水提物者虽然其脑内 NS1 与其脑内的登革病毒数量下 降， 但其体内 let-7a表达量在血与脑中和感染鼠没喝金银花水 提物者 相当。我们推测此为金银花调控的各个免疫系 统与病毒感染的竞争关 系。此实验建议金银花水提物其活性成份与体 内调控机制以直接与间 接的方式达到抑制登革病毒的疗效。其可作用 于抑制足以引起致命性 出血型登革热与休克型登革热的登革病毒剂量 ，但其对改变病毒引起 的细胞素风暴 (cytokine storm)相关的病兆影响较微。 我们依此认为金 银花为能确实有效能抑制登革病毒活性与增生 数量的"治本' '药，在治 疗登革热时可进一步尝试将金银花与现有的一 些治疗病兆症状的"治 标"药配伍以达到 "标， 本"兼治的效果。

7. 小鼠模式研究中， 我们采用''先喝金银花水提物， 再注射登革病毒 入鼠大脑内使其感染登革病毒"以研究金银花� �提物对预防防治登革 病毒的疗效。

实验证明金银花水提物可抑制登革病毒在脑 内制造 NSl gene ,其在没 有明显降低其所生成的 NS1 蛋白质状况下， 可减少感染鼠脑内的登 革病毒数量。 感染鼠的疾病征兆没有明显的比较轻微。 感染鼠体内 let-7a表达量呈现组织特异性： 在血液和脑中与阴性对照组相当。 喝 金银花水提物而没感染登革病毒的鼠其血中 let-7a 与阴性对照组相 当， 其脑中 let-7a被高表达。 感染鼠喝金银花水提物者虽然其脑内 NSl gene 与其脑内的登革病毒数量下降，但其体内 let-7a表达量在血 中呈现被抑制状态， 在脑中和感染鼠没喝金银花水提物者相当。我 们 推测此为金银花调控的各个免疫系统与病毒感 染的竞争关系。此实验 建议金银花水提物其活性成份与体内调控机制 以直接与间接的方式 达到抑制登革病毒的疗效。其可作用于抑制足 以弓 I起致命性出血型登 革热与休克型登革热的登革病毒剂量，但其不 改变病毒引起的细胞素 风暴相关的病兆。我们依此认为金银花为能确 实有效抑制登革病毒活 性与增生数量的"治本"药，在治疗登革热时可� ��一步尝试将金银花与 现有的一些治疗病兆症状的 "治标 "药配伍以达到"标， 本"兼治的效 呈。 本发明与现有技术相比，其有益效果是证实喝 金银花水提物可调控体 内抗登革病毒 microRNA 免疫系统 （microRNA immunity)，其中的抗登 革病毒 microRNA let-7a的高表达可抑制登革病毒的活性。金银花 水提 物可同时调控多个不同的抗登革病毒 microRNA, 金银花水提物从而 以直接与间接的方式达到抑制登革病毒的活性 与数量及治疗登革热 的疗效。此研究确立金银花治疗登革病毒的机 制与功效为能确实有效 抑制登革病毒活性与增生数量的"治本' '药。依此我们认为在治疗登革 热时可进一歩尝试将金银花与现有的一些治疗 病兆症状的''治标' '药 配伍以达到' '标，本''兼治的效果。本发明所要求金银花水 提物和 let-7a microRNA可制备成预防和治疗抗登革病毒的药物� �� 也可治备成抗登 革热的保健食品。

四： 附图说明

图 1. 金银花可调控小鼠血中 microRNA表达谱。 Solexa sequencing 数 据 (以统计学的 standard deviation 标准偏差数据显示)。其中各个高表 达且能抗登革病毒 DV2 PL046 RNA genome的目标基因的 microRNA有 特别注明。

图 2. 金银花可高表达小鼠血中抗登革病毒 microRNA表达量总量。 Solexa sequencing 数据以统计图呈现。 图 3. Iet-7a 可抗登革病毒 RNA genome的 NS1 gene 为目标基因。 图 4. Iet-7a可在细胞内抑制登革病毒 RNA genome的 NS1 gene并从而 抑制登革病毒制造 NS1 蛋白质。 （a).以表达量载体做细胞学实验， let-7a 的量越高，对登革病毒基因表达抑制力越大。 (b).左图显示 let-7a 对正常的登革病毒 NS1基因有抑制力，右图显示 let-7a对突变的登革 病毒 NS1基因失去抑制力； 因此证明 let-7a确实是作用在登革病毒 NS1基因上。 （c, d, e).当细胞感染活的登革病毒时， let-7a也有同样的 抑制病毒活性的能力， let-7a量越高， 活病毒能制造的 NS1 gene就越 少 (c)， 其制出的 NS1 protein 量也下降 (d, e)。 let-7a对登革病毒引起 的不正常细胞 Ras protein表达也具有抑制作用 (d)。

图 5. 金银花调控体内抗登革病毒的 let-7a microRNA在血中的量呈周 期改变: let-7a的量于喝后第 2天上升， 呈周期性改变至 8天。

图 6. 采用"先注射登革病毒入鼠大脑内使其感染登� �病毒，再喝金银 花水提物' '以研究金银花水提物对感染登革病毒的疗效� � 金银花水提 物可抑制登革病毒在脑内制造 NSl gene (d) , 降低其所生成的 NS1 蛋 白质 （e)，减少感染鼠脑内的登革病毒数量 （f)。喝金银花水提物的感 染鼠其存活期较长 （a)， 疾病征兆比较轻微 （b, c)。 感染鼠体内 let-7a 表达量呈现组织特异性 （g, h)， 据此推测金银花调控的各个免疫系统 与病毒感染呈竞争关系，此实验建议金银花水 提物其活性成份与体内 调控机制以直接与间接的方式达到抑制登革病 毒的疗效。但对改变病 毒引起的细胞素风暴相关的病兆影响较微。

图 7. 采用"先喝金银花水提物，再注射登革病毒入� �大脑内使其感染 登革病毒' '以研究金银花水提物对预防防治登革病毒的� �效。 金银花 水提物可抑制登革病毒在脑内制造 NS1 gene (d)， 在不降低其所生成 的 NS1 蛋白质状况下减少感染鼠脑内的登革病毒数量 （e, f)。 感染鼠 的疾病征兆改变不明显 （a, b, c)。 感染鼠体内 let-7a表达量呈现组织 特异性 （g, h)， 据此推测金银花调控的各个免疫系统与病毒感 染呈竞 争关系，此实验建议金银花水提物其活性成份 与体内调控机制以直接 与间接的方式达到抑制登革病毒的疗效。但不 改变病毒引起的细胞素 风暴相关的病兆。

五： 具体实施方式

1. 金银花调控小鼠血中 microRNA表达谱与其计算机预测。

参考中医金银花治发烧感染的医方与中华人 民共和国药典，将人喝的 剂量与体重之比例换算成小鼠喝的剂量 (即以一般成人约 50kg的体重 须 10克金银花干花苞为一次性剂量，换算成体重� �� 25克的小鼠就须 0.005克金银花干花苞为一次性剂量。 小鼠喝的金银花水提物的一次 性剂量为 0.2毫升)，然后按照中医的金银花治疗方式煮� �银花水提物 并依其医疗方式喂食小鼠 (一日两次， 连续喝 4天)。然后采血，抽 RNA, 交予深圳华大基因公司（BGI, www.genomics.cn)进行 microRNA的 Solexa deep sequencing与数据分析形成表达谱。 表达谱中高表达的 microRNA 先与 miRBase (the microRNA database, www.mirbase.org) 数据库做比对以确认鼠与人相同的 microRNA,再与 ViTa (virus' miRNA target, vita.mbc.nctu.edu.tw/index.php)数据库做比对预测可� �登革病 毒 dengue virus type 2 PL046 sequence (accession number AJ968413) RNA genome的 microRNA。然后以统计方式分析了解喝金银花水� ��物 对提高血中抗登革病毒的 microRNA其量上的改变。 见附图 1, 2。

2. 细胞学实验证明抗登革病毒的 microRNA可抑制病毒活性。

我们以可受金银花调控而高表达且计算机预 测可抗登革病毒的 microRNA let-7a为研究对象， 以其预测的登革病毒的 NS1 gene 为目 标基因做细胞学研究。我们以 Huh7 肝癌细胞株为细胞模式，运用 real time-PCR 测基因表达量， Western blot 测蛋白质表达量，

immunofluorescence cytochemistry测病毒蛋白质在细胞中的分布位置 与是否被表达来分别证明： (1). Iet-7a可抑制含有登革病毒 NSl gene的 载体的活性， 但不能抑制含有登革病毒 NSl gene突变体的载体的活 性， 因而证明 let-7a 是直接抑制目标基因 NS1。 （2). Iet-7a 可抑制活 体登革病毒制造 NSl gene 及生成 NS1 蛋白质。 见附图 3, 4。

3. 金银花调控体内抗登革病毒的 let-7a microRNA在血中的量呈周期 改变。

小鼠模式研究中，按照中医的金银花治疗方 式煮金银花水提物并依其 医疗方式喂食小鼠 (一日两次， 连续喝 4天)， 并于第 0, 2, 4, 6, 8 日采 血以 real time PCR 测 let-7a 的表达量， 对照组为喝水的小鼠。 real time PCR 实验证实喝金银花水提物的小鼠其血液中 let-7a的量呈周 期改变至 8天。 见附图 5。

4. 研究金银花水提物对感染登革病毒的疗效。

小鼠模式研究中， 采用 "先注射登革病毒入鼠大脑内使其感染登革病 毒， 再喝金银花水提物' '的方式以研究金银花水提物对感染登革病毒 的疗效。 ICR 品系的小鼠于出生后第 6日接受大脑注射足以引起致命 性出血型登革热与休克型登革热的登革病毒剂 量以使其感染，第 7日 开始喝金银花水提物，连续喝 4天；于出生后第 12日以 real time-PCR 测 NS1 与 let-7a 基因表达量， Western blot 测 NS1 蛋白质表达量， PFU forming assay (空斑形成单位） 测感染鼠其脑中释放的登革病毒 数量。 于出生后第 6-13日测鼠的体重， 死亡率， 疾病症状指标。 见 附图 6。

5. 研究金银花水提物对预防防治登革病毒的疗效 。

小鼠模式研究中， 采用"先喝金银花水提物， 再注射登革病毒入鼠大 脑内使其感染登革病毒' '的方式以研究金银花水提物对预防防治登革 病毒的疗效。 ICR 品系的小鼠于出生后第 4日开始喝金银花水提物， 连续喝 4天；于出生后第 7日接受大脑注射足以引起致命性出血型登 革热与休克型登革热的登革病毒剂量以使其感 染， 于出生后第 13日 以 real time-PCR 测 NS1 与 let-7a 基因表达量， Western blot 测 NS1 蛋白质表达量， PFU forming assay 测感染鼠其脑中释放的登革病毒数 量。 于出生后第 7-14日测鼠的体重， 死亡率， 疾病症状指标。 见附 图 7。