La présente invention a pour objet de nouveaux fragment d'ADN et leur utilisation en tant que fragments d'ADN codant pour un peptide signal utile pour la sécrétion de protéines hétérologues par des cellules eucaryotes (animales ou végétales) ou procaryotes (bactéries), plus particulièrement des levures telles que des souches de Saccharomyces.

Lors de la préparation d'une protéine hétérologue par les techniques de l'ADN recombinant, un des objectifs souvent poursuivis est l'obtention d'un produit qui est sécrété dans le milieu de culture des cellules qui synthétisent la protéine hétérologue. En effet, dans le cas notamment de la préparation d'une protéine d'intérêt industriel, destinée à être produites en grande quantité, il est souhaitable, afin qu'elle conserve les propriétés désirées, que la protéine soit produite sous forme mature, c'est à dire dépourvue de tout acide aminé ou séquence peptidique supplémentaire demeurée fusionnée à la protéine. Par ailleurs, il peut être intéressant qu'elle soit sécrétée dans le milieu de culture afin de faciliter les opérations de récupération et purification.

Les protéines qui sont sécrétées par une cellule, en particulier par une cellule eucaryote, sont très généralement synthétisées sous forme d'un précurseur polypeptidique comprenant un fragment correspondant à la protéine mature (forme active) et un fragment N-terminal dit fragment "pré", aussi appelé peptide signal, qui intervient dans le mécanisme de sécrétion de la protéine par la cellule. En outre, ce précurseur polypeptidique peut comprendre un ou des fragments additionnels, appelés fragments "pro". Dans ce dernier cas, le précurseur polypeptidique est appelé précurseur "pré-pro" ou premier précurseur. Un fragment "pro" est, dans la majorité des cas, inséré entre le peptide signal et le fragment correspondant à la protéine mature, bien que ceci ne soit pas une règle absolue.

Un peptide signal initie (i) l'insertion de la protéine dans la membrane cellulaire, (ii) la translocation de la protéine au travers de la membrane cellulaire, ou (iii) l'entrée de la protéine dans le réticulum endoplasmique de la cellule en vue de la sécrétion de la protéine par la voie du réticulum endoplasmique. Une fois que le peptide signal a rempli son office, il est normalement détaché par clivage protéolytique pour libérer une protéine mature ou un deuxième précurseur appelé précurseur "pro" qui, tout comme le premier précurseur, n'a pas d'activité biologique, ou qui n'a pas l'activité complète de la protéine mature.

Un fragment "pro" est utile dans la mesure où il bloque ou modifie l'activité de la protéine, permettant ainsi de protéger la cellule contre les effets toxiques éventuels de la protéine ou de protéger la protéine contre d'éventuelles modifications ou dégradations. Il peut aussi intervenir dans une certaine mesure dans le mechanisme de sécrétion En fin du processus de sécrétion, le fragment "pro" du deuxième précurseur est détaché par clivage protéolytique pour libérer

une protéine mature (forme active).

A la jonction du fragment "pré" et du fragment "pro", ainsi que à la jonction du fragment "pro" et du fragment correspondant à la protéine mature, doit se trouver un site de clivage protéolytique qui est reconnu par une des protéases de la cellule dans laquelle la protéine est synthétisée. Ce site de clivage protéolytique est généralement constitué d'une séquence de 2 ou 3 acides aminés ou plus (appelée par la suite séquence de protéolyse) qui est accessible à la protéase sur le précurseur "pro" et qui, si elle existe sur le fragment correspondant à la protéine mature, n'est pas accessible. Trois cas sont a priori possibles, illustrés ci-dessous en référence à la jonction des fragments "pré" et "pro": ou bien la protéase coupe en tête de séquence et, par conséquent, la séquence de protéolyse doit se lire sur le fragment "pro"; ou bien la protéase coupe en queue de séquence et, par conséquent, la séquence de protéolyse doit se lire sur le fragment "pré"; ou bien la protéase coupe en milieu de séquence et, par conséquent, la séquence de protéolyse doit se lire à cheval sur les fragments " pré" et "pro".

Ces considérations s'appliquent bien sur de manière similaire au site de clivage placé à la jonction du fragment "pro" et du fragment correspondant à la protéine mature.

Pour la construction de précurseurs synthétiques par les méthodes du génie génétique on peut être amené à utiliser des fragments naturels (c'est-à-dire tels que trouvés dans la nature) et à insérer en bonne place un nouveau site de clivage protéolytique ou certains acides aminés de manière à reconstituer un nouveau site

de clivage protéolytique en association avec les fragments, ce nouveau site de clivage étant bien sur reconnu par une des protéases de la cellule dans laquelle le précurseur synthétique est exprimé.

Un exemple du type de synthèse et du mode de sécrétion décrit ci-dessus est illustré par le cas de la phéromone sexuelle de la levure S. cerevisiae, aussi appelé facteur α (codé à partir du gène MFαl ou MFα2). Le Facteur α est en effet synthétisé sous forme de précurseur "pré-pro" tel que décrit dans Kurjan et Herskowitz, Cell (1982) 30: 933. La séquence d'acides aminés du fragment "pré" du précurseur du Facteur α est Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe

Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala tandis que celle du fragment "pro" du précurseur du Facteur α est Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Asp.

De manière surprenante, il a maintenant été trouvé que l'extrémité N- terminale du précurseur d'une enzyme de levure, cette extrémité N-terminale ayant la séquence d'acides aminés : Arg-Phe-Ser-ITιr-Thr- u-AJa-Thr-Ala-Ala-Tlιr-Ala-I^u-Phe-Phe-Thr-Ala-Ser-Gln-

Val-Ser-Ala, peut être utilisée à titre de peptide signal pour la sécrétion de protéines hétérologues, ainsi que différents variants de cette extrémité N-terminale. Par "protéine hétérologue" on signifie une protéine qui n'est pas produite naturellement par la cellule hôte ou bien qui est codée par une séquence qui ne provient pas de la cellule hôte.

Conformément à ceci, la présente invention à pour objet un fragment d'ADN

isolé qui code pour un peptide dont la séquence d'acides aminés présente un degré d'homologie d'au moins 60%, de manière préférentielle d'au moins 80%, avec la séquence d'acides aminés (I) ou (II), de préférence avec la séquence (II). Les séquences (I) et (II) sont comme suit: (I) Arg-Phe-Ser-Thr-Thr-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-Phe-Phe- Thr-

Ala-Ser-Gln.

(II) Arg-Phe-Ser-Thr-Thr-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-Phe-Phe- Thr- Ala-Ser-Gln-Val-Ser-Ala.

Par "fragment d'ADN isolé" on signifie un fragment d'ADN dont l'extrémité

3' n'est pas liée par liaison covalente à un fragment d'ADN codant pour une enzyme ayant une activité β-1,3 glucanase telle que en particulier décrite dans Klebl & Tanner, J. Bact, Nov 1989, T 1: 6259.

Plus particulièrement, un fragment d'ADN selon l'invention code pour un peptide comprenant la séquence d'acides aminés (III) suivante : ( III ) R _j -R _î -Ra-Thr-Thr-R^-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-Phe-

1 5 10

Phe-Thr-Ala-R ₅ -R ₆ 15 19 dans laquelle:

R _j est un acide aminé sélectionné parmi Arg et Lys, R ₂ et R ₆ sont chacun un acide aminé sélectionné de manière indépendante parmi Ala, Asn, Cys, Gin, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr et Val,

R ₃ et R ₅ sont chacun un acide aminé sélectionné de manière indépendante parmi Asp, Gly, Asn, Pro et Ser, et

R ₄ est un acide aminé sélectionné parmi Val, Leu, Ala, Cys, Phe, Ile et

Met.

De manière préférée, un fragment d'ADN selon l'invention code pour un peptide comprenant la séquence d'acides aminés (IV) suivante: (IV) R ₁ -R ₂ -R ₃ -Thr-Thr-R ₄ -Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-Phe-Phe-Thr-

AIa-R ₅ -R ₆ -R ₇ dans laquelle :

R _: est un acide aminé sélectionné parmi Arg et Lys, R ₂ et R ₆ sont chacun un acide aminé sélectionné de manière indépendante parmi Ala, Asn, Cys, Gin, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp,

Tyr et Val,

R ₃ et R ₅ sont chacun un acide aminé sélectionné de manière indépendante parmi Asp, Gly, Asn, Pro et Ser,

R ₄ est un acide aminé sélectionné parmi Val, Leu, Ala, Cys, Phe, Ile et Met,

R ₇ est une séquence de protéolyse.

R-^est préférentiellement une séquence de protéolyse R ₈ -R ₉ -R ₁₀ dans laquelle : R ₈ est un acide aminé sélectionné parmi Ala, Val, Ser, Cys, Gly, Ile, Leu,

Thr,

R ₉ est un acide aminé sélectionné parmi Ala, Arg, Cys, Gin, Gly, His, Ile,

Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr et Val et

R ₁₀ est un acide aminé sélectionné parmi Ala, Cys, Gly, Leu, Pro, Gin, Ser et Thr.

Selon l'invention, un fragment d'ADN préféré code pour un peptide comprenant une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi les séquences

d'acides aminés (V), (VI), (VII) et (VIII) suivantes :

(V) Arg-Phe-Ser-Thr-Thr-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-Phe-Phe- Thr- Ala-Ser-Gln

(VI) Arg-Phe-Ser-Thr-Thr-Val-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-Phe-Phe. -Thr- Ala-Ser-Gln

(VH) Arg-Phe-Ser-Thr-Thr-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-Phe-Phe- Thr-Ala-Ser-Gln-R ₇ dans laquelle R ₇ est tel que défini ci-dessus. (Vπi) Arg-Phe-Ser-Thr-Thr-Val-Ala-Thr-Ala-AIa-Thr-Ala-Leu-Phe-Phe- Thr-Ala-Ser-Gln-R ₇ dans laquelle R ₇ est tel que défini ci-dessus.

De manière tout à fait préférée, R ₇ est une séquence dans laquelle R ₈ est Val, R ₀ est Ser et R ₁₀ est Ala.

Il est tout particulièrement préféré qu'un fragment d'ADN selon l'invention ait pour séquence nucleotidique l'une des séquences (IX), (X), (XI) et (XJQ) suivantes :

(LX) CGTTTCTCTACTACAGTCGCTACTGCAGCTACTGCG CTA TTTTTCACAGCCTCCCAA,

(X) CGTTTCTCTACTACACTCGCTACTGCAGCTACTGCGCTA TTTTTCACAGCCTCCCAA,

(XI) CGTTTCTCTACTACAGTCGCTACTGCAGCTACTGCGCTA TTTTTCACAGCCTCCCAAGTTTCAGCT, (XH) CGTTTCTCTACTACACTCGCTACTGCAGCTACTGCGCTA TTTTTCACAGCCTCCCAAGTTTCAGCT.

Les peptides codés par les fragment d'ADN selon l'invention comprennent une région hydrophobe possédant une structure en hélice α comprise entre l'acide aminé en position 3 et l'acide aminé en position 18. Cette structure contribue à les rendre aptes à une utilisation comme peptide signal. II est connu que la partie hydrophobe des séquences signal est composée en majorité des acides aminés Ala,

Cys, Phe, Ile, Leu, Met, Val. On peut donc aussi prévoir que certaines modifications d'acides aminés n'engendrent pas de modification dans l'aptitude du peptide signal à jouer son rôle.

Sous un autre aspect, l'invention propose par conséquent l'application d'un fragment d'ADN selon l'invention à titre de fragment d'ADN codant pour un peptide signal utile pour la sécrétion d'une protéine hétérologue par une cellule hôte dans laquelle la protéine hétérologue est synthétisée. D'une manière générale, l'invention peut être mise en oeuvre dans une cellule procaryote ou eucaryote, de préférence dans cette dernière. La cellule eucaryote peut être par exemple, une cellule de mammifère ou de levure. De manière tout à fait préférée, la sécrétion d'une protéine hétérologue à l'aide d'un peptide signal codé par un fragment selon l'invention est réalisée par une cellule de levure, par exemple du genre Saccharomyces, plus particulièrement de l'espèce S. cerevisiae.

Bien entendu, en tant que fragments d'ADN codant pour un peptide signal, les fragments d'ADN selon l'invention seront précédés d'un codon d'initiation de la traduction, généralement d'un codon codant pour une méthionine, en particulier un ATG.

Les fragments d'ADN selon l'invention peuvent être utilisés pour la construction d'une cassette d'expression d'une protéine, précédés du codon

d'initiation, seuls ou en combinaison avec d'autres composants, par exemple un fragment "pro". Ces fragments d'ADN peuvent être préparés par synthèse chimique, au moyen d'un synthétiseur d'oligonucléotides par une technique connue de l'homme du métier.

L'invention concerne également une cassette d'expression d'une protéine hétérologue comprenant un fragment d'ADN selon l'invention à titre de fragment d'ADN codant pour le peptide signal de la dite protéine hétérologue. De manière détaillée, une cassette d'expression selon l'invention qui comporte donc l'information nécessaire à la sécrétion d'une protéine hétérologue mature comprend, de façon séquentielle, au moins: a) un fragment d'ADN comportant des signaux d'initiation de transcription et de traduction, b) un fragment d'ADN selon l'invention, c) un fragment d'ADN codant pour une protéine hétérologue mature

(avec codon de fin de traduction).

Dans une première variante, on peut fusionner directement le fragment b) en phase avec le fragment c), dans la mesure où, à la jonction du fragment b) et du fragment c), il existe une séquence d'ADN codant pour un site de clivage protéolytique de manière à permettre la libération d'une protéine mature en fin du processus d'expression et de sécrétion.

De manière préférée, la séquence d'ADN codant pour un site de clivage protéolytique se lit sur le fragment b).

Dans une deuxième variante, une cassette d'expression selon l'invention comprend en outre un fragment d'ADN b') codant pour un fragment peptidique

"pro". Ce fragment b') est fusionné en phase avec le fragment b) et le fragment c), dans la mesure où, à la jonction des fragments b) et b') d'une part et des fragments b') et c) d'autre part, il existe une séquence d'ADN codant pour un site de clivage protéolytique.

De nombreux fragments b') peuvent être utilisés dans les cassettes selon l'invention. En particulier, divers fragments b') peuvent être construits de manière synthétique. A titre d'exemple, on indique ci-dessous la construction d'un fragment b') synthétique à partir de la séquence d'ADN codant pour le fragment "pro" du précurseur du Facteur α. Cette séquence peut être utilisée en totalité ou en partie.

Dans un mode de réalisation particulier, on utilise cette séquence délétée de la partie codant pour les acides aminés en position 3 à 42 sur le fragment "pro"; c'est-à-dire la séquence codant pour : Ala Pro Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Asp. Pour former le fragment b'), cette dernière séquence d'ADN est suivie d'une séquence codant pour (i) un peptide comprenant un site de clivage protéolytique ou (ii) un site de clivage protéolytique, ce dernier mode de réalisation étant préféré. Tout particulièrement, ce dernier site de clivage est Lys-Arg ou Arg-Arg, celui-ci étant reconnu par l'endopeptidase de levure yscF qui est codée par le gène KEX2 et qui coupe au niveau de l'extrémité C-terminale du dipeptide Lys-Arg ou Arg-Arg. En résumé, un fragment b') particulier code pour Ala Pro Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Asp Lys Arg.

La séquence a) comprend en particulier un promoteur fonctionnel dans la cellule dans laquelle on souhaite synthétiser la protéine hétérologue codée par le fragment c), de préférence un promoteur fonctionnel chez la levure. On peut citer par exemple des promoteurs constitutifs de levure dont la fonctionnalité a été

confirmée par la transcription de gènes codant pour des protéines hétérologues codant pour des protéines hétérologues tels que les promoteurs PGK, ENOl, MFαl, ou encore des promoteurs inductibles, tels que PH05, GAL1. Par exemple, lorsqu'on utilise dans la cassette d'expression des éléments du gène MFαl de levure, on pourra utiliser le promoteur du gène MFαl.

Enfin, les cassettes d'expression peuvent aussi comprendre un fragment d'ADN d) comportant des signaux de terminaison de la transcription, de préférence fonctionnels chez la levure, par exemple celui du gène PGK.

De façon générale, une cassette d'expression selon l'invention peut être introduite dans une cellule procaryote ou eucaryote, de préférence eucaryote telle que cellule de mammifère ou de levure; une cellule de levure étant tout particulièrement préférée. Cette introduction peut être réalisée en plaçant la cassette dans un plasmide à replication autonome ou dans une construction destinée à l'intégration pour être introduite directement dans le génome de la levure, de manière à obtenir dans les deux cas une cellule transformée.

Lorsque le plasmide est autonome, il comportera des éléments assurant sa partiton et sa replication; par exemple, une origine de replication telle que celle du plasmide 2μ de levure. En outre, le plasmide pourra comporter des éléments de sélection tels que le gène URA3 ou LEU2 qui assurent la complémentation de levure ura3 ou leu2. En particulier, on pourra avantageusement utiliser le gène URA3 délété de son promoteur (URA3-d).

Ces plasmides peuvent également comporter des éléments assurant leur replication dans les bactéries, lorsque le plasmide doit être un plasmide navette,

par exemple une origine de replication telle que celle du pBR322, un gène marqueur de sélection tel que Amp ^R et/ou d'autres éléments connus de l'homme du métier.

En accord avec ce qui précède, la présente invention concerne également une cellule transformée par (i) un fragment d'ADN selon l'invention ou (ii) une cassette d'expression selon l'invention, soit insérée dans un plasmide, soit intégrée dans le génome de la cellule.

Lorsque le promoteur est celui du gène MFαl, la cellule de levure transformée est de préférence de type sexuel MATα. On utilisera, par exemple, une souche de génotype ura3 ou leu2 ou autre, complémentée par le plasmide pour assurer le maintien du plasmide dans la levure par une pression de sélection appropriée.

Enfin, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'une protéine hétérologue, caractérisé en ce que l'on cultive un cellule selon l'invention et, en ce que l'on récupère la dite protéine dans le milieu de culture. Ce procédé s'applique à la préparation de toute protéine de nature hétérologue. Parmi ces protéines, on peut notamment citer l'hirudine ou des défensines, par exemple la défensine A.

Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé de sécrétion de l'hirudine sous forme mature à partir des souches de levures transformées selon l'invention.

L'invention s'applique tout particulièrement bien à la production d'hirudine, c'est pourquoi un des exemples illustratifs de l'invention concerne cette

protéine. En effet l'hirudine, dont la source principale se trouve dans les glandes salivaires des sangsues médicinales est un inhibiteur très spécifique et très efficace de la thrombine. Il s'agit donc d'un agent thérapeutique très intéressant dont l'utilisation en clinique exige une très grande pureté du produit, et qui est donc un candidat intéressant à la production par génie génétique.

Un certain nombre de variants naturels de l'hirudine ont été identifiés et désignés par HV1, HV2, HV3. Par la suite ces variants naturels ainsi que d'autres analogues ont été préparés par génie génétique dans diverses cellules hôtes, comme cela est décrit par exemple dans les publications européennes de brevet

EP-A-0200655, EP-A-0273800 au nom de la Demanderesse. La comparaison de l'hirudine synthétisée par Escherichia coli (E. coli) et par une levure du genre S. cerevisiae a montré que l'hirudine synthétisée par E. coli reste intracellulaire et doit donc être purifiée à partir d'un très grand nombre de polypeptides de E. coli. II est donc particulièrement intéressant de pouvoir faire exprimer un gène de l'hirudine dans la levure de façon à obtenir une hirudine sécrétée sous forme mature, et sans que la levure ne produise de substances pyrogènes ou toxiques pour l'homme.

L'invention s'applique donc à toutes les molécules d'hirudines, c'est à dire, variants naturels de l'hirudine tel quels ou ayant subi une ou plusieurs mutations tout en conservant leur activité antithrombotique, ce dernier type de variant étant appelé analogue. Les exemples ci-après concerneront plus particulièrement l'analogue désigné par rHV2Lys47 (pour recombinant variant HV2 ayant subi une mutation de l'acide aminé Asp en position 47 en acide aminé Lys), décrit dans la publication de brevet EP-A-02738000 déjà mentionnée.

L'invention s'applique également à la production de défensines. Les défensines, aussi appelées phormicines, sont des peptides originellement extraits de I'hémolymphe des certains insectes, les Diptères, qui ont une activité bactéricide sur les germes Gram-positifs. Ces défensines sont plus amplement décrites dans la demande de brevet européenne EP-A- 349 451. La défensine A est un peptide basique ayant pour séquence Ala Thr Cys Asp Leu Leu Ser Gly Thr Gly Ile Asn His Ser Ala Cys Ala Ala His Cys Leu Leu Arg Gly Asn Arg Gly Gly Tyr Cys Asn Gly Lys Gly Val Cys Val Cys Arg Asn. La défensine B ne diffère de la défensine A que par l'acide aminé en position 32 où une arginine remplace une glycine.

Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. Ces exemples seront illustrés par les figures suivantes : - la figure 1 représente la structure schématique du plasmide pTG2958. la figure 2 représente la structure schématique des vecteurs M13TG3839 et M13TG3841. Pour M13TG3839 les cadres hachurés aux extrémités correspondent à M13TG103 et pour M13TG3841 à M13TG3149. la figure 3 représente la structure schématique du vecteur M13TG3845. Le cadre hachuré correspond à M13TG3149. la figure 4 représente la structure schématique du plasmide pTG3828. la figure 5 représente la structure schématique du plasmide pTG3864.

EXEMPLE 1 : Construction des vecteurs d'expression de l'hirudine : pTG3864, pTG3867, pTG3894 et pTG3884.

A. Construction du vecteur M13TG3845 Le plasmide pTG2958 (figure 1) est peu différent du plasmide pTG1833 décrit dans la publication européenne de brevet EP-A-252854 porteur de la séquence codante pour rHV2Asp47. Le plasmide pTG2958 ne contient pas le site de restriction Hindïïl artificiellement introduit. Le plasmide pTG2958 contient :

- un fragment de 1217 paires de bases correspondant à la région 5' du gène MFαl (contenant le promoteur, la séquence codant pour le peptide signal, la région "pro" et une séquence codant pour le peptide Lys-Arg), et 4 paires de bases (site BglIF, traitement par Klenow),

- un fragment de 234 paires de bases contenant l'ADN complémentaire de rHV2Lys47, - un fragment de 243 paires de bases comprenant le terminateur PGK de levure,

- le fragment Pvuïï-EcoRI de pBR322 comprenant entre autres l'origine de replication de ce plasmide et le gène de résistance à l'ampicilline (2292 paires de bases),

- le fragment EcoRI-HindIII du plasmide 2μ de la levure (forme B), contenant le gène LEU2 de levure, sous forme délétée et inséré dans le site PstI,

- un fragment HindUI-Smal du gène URA3 de levure.

Le fragment Ncol-Ncol du vecteur pTG2958 qui porte les séquences

LEU2-d, 2μ et URA3 est remplacé par le fragment Ncol-Ncol de pTG2800 décrit dans la publication européenne de brevet EP-A-O268501 qui porte les séquences du plasmide 2μ et du gène URA3 délété de son promoteur (URA3-d) pour donner pTG2877.

Le vecteur M13TG3839 (figure 2) dérive de M13TG103 [Kieny, M.P. et

al. (1983) Gène 26, 91-99] dans lequel le fragment Hindiπ-HindEI de pTG2877 est introduit dans le même site. Un site de restriction Sali est introduit dans ce vecteur en aval du codon de terminaison de traduction de la région codant pour rHV2Lys47 par mutagénèse dirigée à l'aide de l'oligonucléotide suivant : 5' CAATGAAAAATGGTCGACTATCAATCATAG pour donner M13TG3839

Sali. Un site de restriction SphI est alors introduit en amont de la cassette d'expression en éliminant la séquence URA3-d par mutagénèse dirigée à l'aide de l'oligonucléotide suivant : 5 ' GACGGCCAGTGAATTGGCATGCTATTGATAAGATTTAAAG pour donner M13TG3840.

Le vecteur M13TG131 [Kieny M.P. et al. (1983) Gène 26, 91-99] est clivé par PstI, les extrémités rendues -franche par traitement à l'aide du fragment Kleno de l'ADN polymérase I pour être ensuite religué sur lui même pour donner M13TG3160. Ce vecteur est ensuite clivé par Smal et EcoRV puis religué pour donner M13TG3149.

Le fragment Sphl-Sall de M13TG3840 (décrit ci-dessus) portant la cassette d'expression de rHV2Lys47 (sans séquence terminatrice de transcription) est introduit dans le site Sphl-Sall de M13TG3149 pour donner M13TG3841 (figure 2). La séquence codant pour les acides aminés en position 3 à 42 sur le fragment "pro" du précurseur de MFαl est éliminée de M13TG3149 par mutagénèse dirigée et un site de restriction Smal introduit en utilisant l'oligonucléotide suivant : 5' CTCCGCATTAGCTGCrCCCGGGTTATTGTTTATAAAT, pour donner ce que l'on appelle par la suite une séquence "pro" délétée.

On obtient ainsi M13TG3842. Un site de restriction BamHI détruisant l'ATG du précurseur du facteur α est introduit dans ce vecteur par mutagénèse dirigée avec

l'oligonucléotide suivant :

5' AATATAAACGATTAAAAGGATCCGATTTCCITCAATTTTTA

On obtient alors M13TG3843. Après phosphorylation, les oligonucléotides suivants: 5 ' GATCCGTTTCTCTACTACAGTCGCTACTGCAGCTACTGCGCTATT

GCAAAGTGATGATGTCAGCGATG 5 ' et

5 ' TTTCACAGCCTCCCAAGTTTCAGCTGCTCCC ACGTCGATGACGCGATAAAAAGTGTCGGAGGGTTCAAAGTCGACGAGGG 5 ' sont insérés dans le vecteur M13TG3843 coupé par BamHI et Smal introduisant ainsi la séquence XI donc sans ATG. De manière à restaurer l'ATG, le site BamHI est éliminé par mutagénèse dirigée en utilisant l'oligonucléotide suivant :

5' AATATAAACGATTAAAAGAATGCGTTTCTCTACTACAGTC pour donner le vecteur M13TG3845 (figure 3) qui comporte : - le promoteur du gène MFαl, suivi d'un codon ATG, en tant que fragment a)

- la séquence XI en tant que fragment b),

- la séquence "pro" délétée du gène MFαl, suivi des codons codant pour Lys-Arg en tant que fragment b'),

- la séquence codant pour rHV2Lys47 en tant que fragment c), - une partie du vecteur M13TG3149.

B. Construction du plasmide pTG3864

Le plasmide pTG848 décrit dans la publication européenne de brevet EP-A-0252854 est digéré par Bgiπ puis religué pour donner pTG2886. Le grand fragment HindlLI-EcoRI de pTG2886 est ligué en présence de ligase T4 au fragment HindIÏÏ-EcoRI de 2,1 kb du plasmide pFLl [Parent, S.A. et al. (1985) Yeast L, 83-138] qui porte la séquence du plasmide 2μ de 5. cerevisiae pour donner le plasmide pTG2886 LEU2-d, URA3-d. Le fragment HindIII de 0,9 kb du

plasmide pTG2800 décrit dans la publication européenne de brevet EP-A-0258501 portant le gène URA3-d est alors inséré dans le site Hindlïï de ce plasmide pour donner pTG2886 URA3-d, delta LEU2-d. Le fragment Smal-BglII de M13TG131 [Kieny et al. (1983) Gène 26, 91-99] qui possède plusieurs sites de restriction est ensuite introduit dans ce plasmide pour donner pTG3828 (figure 4) qui comporte:

- la séquence du gène URA3 délétée de son promoteur (URA3-d),

- des sites de restriction venant de M13TG131 permettant l'insertion des éléments de l'expression d'un gène hétérologue, rHV2Lys47 dans le cas présent,

- le terminateur de transcription du gène PGK de levure - un fragment de pBR322 qui permet la replication et la sélection chez E. coli,

- un fragment du plasmide 2μ qui possède les éléments structuraux nécessaires à la replication et à l'équipartition mitotique dans la levure.

Le fragment Sphl-Sall du vecteur M13TG3845 (figure 3) est introduit dans le plasmide pTG3828 digéré par SphI et Sali pour donner le vecteur d'expression pTG3864 (figure 5).

C. Construction du vecteur d'expression pTG3867

Pour supprimer complètement la séquence codant pour le précurseur du gène MFαl on effectue une mutagénèse dirigée sur M13TG3845 (figure 3) à l'aide de l'oligonucléotide suivant :

5' GCCrCCCAAGTTTCAGCTATTACGTATACAGACTGC pour obtenir le vecteur M13TG3846. Le fragment Sphl-Sall de ce vecteur est introduit dans le plasmide pTG3828 (figure 4) digéré par SphI et Sali pour donner le vecteur d'expression pTG3867. Dans ce vecteur, la séquence XI et celle codant pour rHV2Lys47 sont adjacentes. Pour obtenir la structure schématique de ce plasmide, il suffit sur la figure 5 de retirer la séquence "pro" délétée de MFαl.

D. Construction du vecteur d'expression pTG3894

Un site Smal est créé dans la séquence codant pour le fragment "pro" du précurseur du facteur α par mutagénèse dirigée sur M13TG3841 (figure 2) grâce à l'oligonucléotide suivant : 5' TCCGCATTAGCTGCTCCCGGGAACACTACAACAGAA pour obtenir M13TG3869. Ce vecteur est ensuite digéré par SphI et Smal, le petit fragment est isolé et il est ligué au grand fragment SphI et Smal de M13TG3845 (figure 3) pour donner le vecteur M13TG3891. Le fragment Sphl-Sall de ce vecteur est introduit dans le plasmide pTG3828 (figure 4) ouvert aux sites SphI et Sali pour donner le vecteur d'expression pTG3894 qui comporte donc la séquence "pro" du précurseur du facteur α mutée. Pour obtenir la structure schématique de ce plasmide, il suffit sur la figure 5 de remplacer la séquence "pro" délétée de MFαl par la séquence "pro" mutée.

E. Construction du vecteur d'expression pTG3884

La séquence XI est modifiée par mutagénèse dirigée sur M13TG3845 en utilisant l'oligonucléotide suivant : 5' GTTTCTCTACTACACTCGCTACTGC La modification d'une seule base donne la séquence XII et induit le remplacement d'une valine par une leucine en tant qu'acide aminé R ₄ du peptide signal. On obtient ainsi le bactériophage M13TG3846. Le fragment Sphl-Sall de M13TG3846 est introduit dans le plasmide pTG3828 (figure 4) ouvert aux sites SphI et Sali pour donner le vecteur d'expression pTG3884 qui comporte :

- la séquence du gène URA3 délétée de son promoteur (URA3-d), - le promoteur du gène MFαl, suivi d'un codon ATG, en tant que fragment a),

- la séquence XII en tant que fragment b),

- la séquence "pro" délétée du gène MFαl, suivi des codons codant pout Lys-

Arg, en tant que fragment b'),

- la séquence codant pour rHV2Lys47 en tant que fragment c),

- le terminateur du gène codant pour PGK de la levure.

- un fragment de pBR322, - un fragment du plasmide 2μ.

EXEMPLE 2 : Production de rHV2Lys47 dans le surnageant de culture en fonction du plasmide utilisé.

Une souche de levure de l'espèce Saccharomyces cerevisiae de génotype

MATα, ura3-251,-373,-328, leu2-3,-112, his3, pep4-3 est transformée par les plasmides pTG3864, pTG3867, pTG3894 et pTG3884 par la méthode de l'acétate de lithium [Ito, H. et al. J. Bactériol. (1983) 153: 163] et les prototrophes Ura+ sont sélectionnés. Ils sont ensuite mis en culture en erlenmeyer à 30°C sur un milieu sélectif (0,7% de bases azotées pour levures (Yeast Nitrogen Base), 0,5% de casamino acides et 1% de glucose). Après 48 heures de culture, on sépare cellules et surnageant par centrifugation et l'activité inhibitrice de la thrombine est déterminée dans le surnageant en utilisant le test colorimétrique (activité protéolytique sur un substrat synthétique, le chromozyme TH - Boehringer Mannheim). Le tableau I présente les résultats des dosages; chaque valeur correspond à la moyenne de deux expériences indépendantes. L'activité de rHV2Lys47 est exprimée en ATU/ml de surnageant.

Tableau I

Plasmide ATU/ml

pTG3894 40 pTG3864 50 pTG3867 130 pTG3884 125

Dans tous les cas on mesure une activité anti-thrombine. La protéine rHV2Lys47 produite par la levure est donc excrétée dans le surnageant. De plus elle est sécrétée sous forme active. Les meilleurs résultats sont obtenus pour les souches transformées par pTG3884 et pTG3867.

Le contenu en protéine des surnageants est analysé par HPLC. Le pic majeur obtenu correspond bien à celui de rHV2Lys47 (sous sa forme à 65 acides aminés) et la détermination de la séquence N-terminale confirme l'obtention d'une molécule correctement synthétisée.

EXEMPLE 3 : Construction d'un vecteur d'expression de la défensine A d'insectes : pTG4826.

A. Synthèse d'une séquence d'ADN codant pour la défensine A d'insecte.

La synthèse se fait en deux blocs assemblés grâce à leurs extrémités cohésives Kpnl. Le premier bloc comprend 3 oligonucléotides numérotés de 1 à 3 et le second bloc, 6 oligonucléotides numérotés de 4 à 9. Leur séquence et la position des oligonucléotides (dernière ligne du tableau; les ronds représentent la partie 5' de l'oligonucléotide) sont donnés dans le tableau IL

TABLEAUII

La séquence obtenue est la suivante

HindIII +1 Kpnl

10 AGC TTG GAC AAG AGA GCT ACC TGT GAC TTG TTG TCC GGT ACC

Ala Thr Cys Asp Leu Leu Ser Gly Thr

20 GGT ATT AAC CAC TCC GCT TGT GCT GCT CAC TGT TTG TTG AGA Gly Ile Asn His Ser Ala Cys Ala Ala His Cys Leu Leu Arg

30 GGT AAC AGA GGT GGC TAC TGT AAC GGT AAG GGT GTT TGT GTT Gly Asn Arg Gly Gly Tyr Cys Asn Gly Lys Gly Val Cys Val 40 BamHI-EcoRI

TGT AGA AAC TAA GGATCCG Cys Arg Asn

La synthèse du premier bloc utilise les oligonucléotides 4, 5, 6, 7, 8 et 9 et s'effectue de la façon suivante :

- les oligonucléotides 5, 6, 7 et 8 sont tout d'abord phosphorylés à leur extrémités 5' pour éviter la formation de polymères au cours de l'assemblage. Pour chacun de ces oligonucléotides, 100 picomoles sont traitées à la polynucléotide kinase, 2 unités dans un volume final de 20 μl de Tris HC1 60 μM à pH 7,5; 10 μM de MgCl ₂ ; 8 μM de dithiothréitol (tampon de kination) contenant 3,3 picomoles d'ATPγ marqué avec ³² P (5000 Ci/mmole). Après 15 minutes d'incubation à 37°C, 5 μmoles d'ATP non marqué sont ajoutées.

- après incubation à 37°C pendant 30 min. 75 picomoles des oligonucléotides 5, 6, 7 et 8 sont mélangés, chauffés à 95°C pendant 3 min., puis les oligonucléotides 4 et 9 sont ajoutés dans un volume final de 90 μmoles de tampon de kination décrit ci-dessus. L'ensemble est chauffé à 95°C pendant 3 min. puis refroidi lentement en 2 heures à 37°C.

- 25 picomoles de ces oligonucléotides hybrides sont soumis au traitement par la ligase T4 pendant une heure à 15°C. Ce mélange réactionnel (1 picomole) est ensuite ajouté à 50 ng du du bactériophage M13TG131 [Kieny M.P. et al.

(1983) Gène 26, 91-99] traité par EcoRI et Kpnl (1 heure à 15°C). Le mélange de ligation est utilisé pour transformer les cellules compétentes de la souche E. coli JM103 [Messing J. et al. (1981), Nucleic Acid Res. 9, 309]. Un clone présentant la séquence recherchée est isolé, il est appelé M13TG3821. La synthèse du second bloc utilise les oligonucléotides 1, 2 et 3 et s'effectue selon la même procédure que celle décrite pour la synthèse du premier

bloc. Dans ce cas, seul l'oligonucléotide 2 est phosphorylé à son extrémité 5'.

Ce second bloc est clone entre les sites HindlII et Kpnl du bactériophage M13TG3821 et un clone portant la séquence d'ADN codant pour la défensine A (figure 5) est isolé, il est appelé M13TG3849.

B. Construction du plasmide d'expression de la défensine A: pTG4839.

Le fragment SphI - Smal de 1045 paires de bases du bactériophage M13TG3846 décrit précédemment (Exemple 1, E.) est transféré dans le vecteur M13TG3869 décrit précédemment (Exemple 1, D.) préalablement digéré par SphI et Smal. On obtient ainsi le vecteur M13TG4803 qui porte : le promoteur du gène MFαl, suivi d'un codon ATG, la séquence XII,

- la séquence "pro" mutée du gène MFαl suivi des codons codant pour Lys-Arg,

- la séquence codant pour rHV2Lys47. Afin de remplacer la séquence codant pour rHV2Lys47 par celle codant pour la défensine A d'insecte on introduit un site HindlII dans la séquence codant pour "pro" mutée de MFαl à l'aide de l'oligonucléotide de séquence :

5' GAAGGGGTAAGCTTGGATAAA

Puis on introduit le fragment HindlU - BamHI de M13TG3849 décrit précédemment (Exemple 3, A.) qui porte la séquence synthétique codant pour la défensine A dans ce vecteur préalablement traité par HindlII et BamHI pour éliminer la séquence codant pour rHV2Lys47.

Le fragment Sphl-Sall de M13TG4813 est introduit dans le plasmide pTG3828 (figure 4) ouvert aux sites SphI et Sali pour donner le vecteur d'expression pTG4839 qui comporte :

- la séquence du gène URA3 délétée de son promoteur (URA3-d),

- le promoteur du gène MFαl, suivi d'un ATG,

- la séquence XII,

- la séquence "pro" mutée du gène MFαl suivi des codons codant pour Lys-Arg,

- la séquence synthétique codant pour la défensine A d'insectes, le terminateur du gène codant pour PGK de la levure. - un fragment de pBR322,

- un fragment du plasmide 2μ.

EXEMPLE 4 : Production de défensine A dans le surnageant de culture.

Une souche de levure de l'espèce Saccharomyces cerevisiae de génotype

MATα, ura3-251,-373,-328, leu2-3,-112, his3, pep4-3 est transformée par le plasmide pTG4839 par la méthode de l'acétate de lithium [Ito, H. et al. J. Bactériol. (1983) 153: 163] et les prototrophes Ura+ sont sélectionnés. Ils sont ensuite mis en culture en erlenmeyer à 30°C sur un milieu sélectif (0,7% de bases azotées pour levures (Yeast Nitrogen Base), 0,5% de casamino acides et 1% de glucose). Après 48 heures de culture, on sépare cellules et surnageant par centrifugation et le surnageant est filtré sur un filtre de 22 μ puis passé sur cartouche Sep-Pak C18. Le matériel fixé est élue avec 60% d'acétonitrile, 0,1% d'acide trifluoro acétique dans de l'eau et séché sous vide. L'activité antibactérienne de la défensine A est ensuite mise en évidence par un test d'étalement sur agar ou sur gélose ensemencé de germes bactériens (Micrococcus luteus) conformément à la procédure décrite par Lambert et al. (1989) PNAS 86: 262-266.

Dans le surnageant des levures transformées par le plasmide pTG4839 on détecte effectivement une activité antibactérienne. La protéine défensine A produite par la levure est donc excrétée dans le surnageant. De plus elle est sécrétée sous forme active.

Le contenu en protéine des surnageants est analysé par HPLC. Le pic majeur obtenu correspond bien à celui de la défensine A d'insecte et la détermination de la séquence de la protéine confirme l'obtention d'une molécule correctement synthétisée.