Aus dem Stand der Technik sind eine Vielzahl von Düften unterschiedlicher Provenienz bekannt, mit denen von den Anwen- dern versucht wurde und wird, mittels mehr oder weniger wohl- riechender ätherischer öle, Parfüms oder Seifen den vermeint- lich ungenügenden eigenen Körpergeruch positiv zu beeinflus- sen. In den letzten Jahren sind Hinweise bekannt geworden, daß möglicherweise genetische Ursachen für den einem Individuum eigenen Geruch und damit auch für seine Attraktivität anderen Partnern gegenüber verantwortlich sind. Spezielle Untersuchun- gen an Probanden (Am. J. Hum. Genet. 61, 505-51 (1997) ließen erkennen, daß die Partnerwahl möglicherweise auf geruchlichem Wege über polymorphe Gene des Haupt-Histokompatibilitätskom- plexes (MHC bzw. HLA Komplex beim Menschen) (MHC = major hi- stocompatibility complex ; HLA = Human Leucocyte Antigen)) beeinflußt wird. HLA Gene liegen in einem Bereich von etwa 4. 000. 000 Basenpaaren (bp) auf dem menschlichen Chromosom 6.

Es ist bisher noch nicht gelungen, eine eindeutige olfakto- rische Zuordnung von Molekülen zu der Entwicklung eines indi- vidualspezifischen Geruches zu treffen. Es gibt allerdings Hinweise, daß MHC Moleküle ursächlich an der Erzeugung eines individualspezifischen Geruchsprofils beteiligt sind (Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 94, 2210-2214, 1997 ; Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 96, 1522-1525, 1999.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Duftkom- position zu entwickeln, die auf Basis einer Auswahl bestimmter Allele von olfaktorisch relevanten Genen und einer nachfolgen- den Behandlung ihrer Syntheseprodukte zu geruchsspezifischen Substanzen führt, die in Form von zwei getrennten Formulierun- gen unterschiedlichen Partnern unterschiedliche aber gegen- seitige Attraktivität verleihen sollen.

Erfindungsgemäß wird eine Duftkomposition bereitgestellt, die hergestellt ist nach einem Verfahren, bei dem man a) unter bekannten HLA Allelen der Klasse I ein Allel aus- wählt, das sich durch wenigstens ein Merkmal von anderen Alle- len der HLA Klasse I Moleküle unterscheidet, und das bei weni- ger als 5 % aller Personen der Weltbevölkerung auftritt ; oder b) HLA Allele der Klasse I auswählt, die durch Mutation be- reits vorhandener HLA Allele der Klasse I produziert wurden und natürlicherweise nicht vorkommen und somit eine Häufigkeit von 0 % haben ; und c) das Protein, für welches das ausgewählte Allel kodiert, einer Assemblierung in Anwesenheit von B2-Mikroglobulin (52m) unterzieht, wobei einkettige Konstrukte von HLA schweren Ket- ten der Klasse I und ß2m eingeschlossen sind, indem eine Viel- zahl unterschiedlicher Peptide mit einer Länge von typischer- weise 7 bis 12 Aminosäuren und mit freien N-und C-Termini zur Ausbildung von löslichen HLA Klasse I Molekülen, bestehend aus den extrazellulären Domänen a,, a2 und a3, ßzm und einem Peptid, entsteht, wobei das Peptid in einer von den extrazellulären Domänen al und a2 ausgebildeten Peptidbindungstasche des HLA Moleküls gebunden vorliegt ; und d). das gebildete HLA Klasse I Molekül mit dem gebundenen Pep- tid in einer Reinigungsstufe von den anderen Bestandteilen abtrennt ; und e) das gereinigte HLA Klasse I Molekül einer Fragmentierung mit einer oder mehreren Proteasen unterwirft ; und f) die bei der Fragmentierung entstandenen geruchlich aktiven Stoffe, gegebenenfalls nach vorheriger Abtrennung von den

anderen Stoffen, als Einzelkomponente oder als Mischung in eine kosmetische. Zubereitung einbringt.

Zum besseren Verständnis der Erfindung werden die nach- folgenden Erläuterungen zur intrakorporalen Bildung der HLA Klasse I Moleküle gegeben.

Es ist bekannt, daß Säugetier die Fähigkeit besitzen, zwischen ihrem eigenen Gewebe und dem anderer Spezies sowie auch dem anderer Individuen ihrer eigenen Spezies zu unter- scheiden. Mit Hilfe von Transplantationsstudien bei der Maus konnten auf dem Chromosom 17 in der H-2 Region unterschiedli- che Gene identifiziert werden, die für eine rasche Abstoßung des fremden Gewebes ursächlich verantwortlich sind. Dieser Genkomplex ist seitdem als Haupt-Histokompatibilitätskomplex (MHC) bekannt. Der menschliche MHC befindet sich auf dem kur- zen Arm des Chromosoms 6 und wird als HLA (Human Leukocyte Antigen) Komplex bezeichnet. Er enthält unter anderem die Gene für die MHC Klasse I Proteine HLA-A, HLA-B und HLA-C sowie die HLA Klasse II Proteine. HLA Moleküle binden intrazellulär Peptide, die beim Abbau cytosolischer (typischerweise MHC Klasse I) oder extrazellulärer Proteine (typischerweise MHC Klasse II) entstehen, und transportieren sie an die Zellober- fläche. Dort können HLA/Peptid Komplexe von den T-Lymphozyten des Immunsystems erkannt werden. Weitere im MHC kodierte Gen- produkte sind an der Bildung von Peptidfragmenten und deren Transport beteiligt.

HLA Klasse I Moleküle bestehen aus einer membranveranker- ten schweren Kette (43 kDa) und einer nichtkovalent assoziier- ten leichten Kette, dem ß2-Mikroglobulin (ß2m ; 12 kDa ; siehe Fig. 1). Die schwere Kette setzt sich aus drei extrazellulären Domänen (a1, a2, a3) mit je etwa 90 Aminosäuren, einem etwa 25 Aminosäure langen transmembranalen Bereich und einer C-termi- nalen, cytoplasmatischen Region zusammen. Das konservierte Asparagin an Position 86 der a1-Domäne ist bei allen HLA Klas- se I Proteinen N-glykosyliert. ß2-Mikroglobulin ist nicht mem- brangebunden und besitzt nur eine Domäne.

Aus röntgenkristallografischen Untersuchungen (siehe z. B.

J. Mol. Biol. Vol. 285, 645-653, 1999) ist die in Fig. 2 darge- stellte dreidimensionale Struktur der HLA Klasse I Moleküle bekannt. ß2-Mikroglobulin und die membran-proximale Domäne der schweren Kette (a3), die die für Moleküle der Immunglobulin- Superfamilie charakteristische Faltung besitzen, stutzen und stabilisieren die von der a1-und a2-Domane gemeinsam gebildete Peptidbindungsspalte, in der das Peptid zwischen zwei a-Heli- ces, die auf einer von 8 antiparallelen ß-Strängen gebildeten Fläche liegen, eingeschlossen wird (Fig. 3).

Die schwere HLA Kette unterliegt einem hohen Polymorphis- mus, ß2m hingegen ist in allen HLA Klasse I Molekülen iden- tisch und wird außerhalb des HLA Komplexes auf dem Chromosom 15 kodiert. Bisher sind etwa 70 HLA-A Allele, etwa 200 HLA-B Allele und etwa 70 HLA-C Allele bekannt, von denen jedes Indi- viduum maximal zwei Allele pro Genlocus exprimieren kann. Die Variabilität der Allele ist fast vollständig auf die a-und a2-Domänen beschränkt und betrifft hauptsächlich Aminosäuren, deren Seitenketten in die Peptidbindungsspalte oder zum T-Zell Rezeptor zeigen.

Der Boden der Peptidbindungsspalte besteht aus 6 unter- schiedlich stark ausgeprägten Vertiefungen oder Taschen, die von den Aminosäure-Seitenketten des HLA-Proteins gebildet werden. Die präsentierten Peptide weisen in der Regel eine Länge von 8 oder 9 Aminosäuren auf und werden in einer ge- streckten Konformation gebunden (siehe Fig. 3). Ein konser- viertes Netzwerk an Wasserstoffbrücken positioniert die freien N-und C-Termini in den Taschen an den Enden der Bindungsspal- te und bestimmt somit die Orientierung der Peptide. Zusätzli- che allelspezifische Kontakte bestehen zwischen den Seiten- ketten des Peptids und den polymorphen Aminosäuren des HLA Proteins. Die von letzterem gebildeten Taschen können einzelne Aminosäurereste des Peptides, die nach unten in die Bindung- spalte zeigen, vollständig aufnehmen. Diese Seitenketten wer- den auch als"anchor residues"bezeichnet, da sie das Peptid fest in der Bindungsspalte verankern. Jedes HLA Protein be-

sitzt mindestens eine von polymorphen Aminosäuren geformte, tiefe Tasche, die spezifisch für das jeweilige Allel ist. Nur Peptide mit passenden"anchor residues"können gebunden wer- den.

Beide Ketten eines HLA Klasse I Moleküls werden in der Zelle getrennt synthetisiert und cotranslational in das Endo- plasmatische Retikulum (ER) befördert. Hier erfolgt die Assem- blierung der schweren Kette (HC, Heavy Chain) mit ß2-Mikroglo- bulin (ß2m) und einem Peptid zu funktionellen Komplexen. An diesem koordinierten Faltungsprozeß sind eine Reihe unter- schiedlicher Proteine beteiligt. (Immunol. Today 21, (2000) 83- 88.

Dieser intrazelluläre Vorgang kann in vitro in ähnlicher Weise nachvollzogen werden, indem die drei Komponenten des trimolekularen Endproduktes, d. h. eines HLA Klasse I Moleküls, in einem geeigneten Medium miteinander zur Interaktion ge- bracht werden. Es ist in diesem Zusammenhang möglich, die für diese drei Komponenten kodierenden DNA-Moleküle in einem, zwei oder drei Ronstrukten zur Expression zu bringen, so daß die drei Komponenten entweder einzeln oder als dimeres bzw. als trimeres Protein zur weiteren Verarbeitung vorliegen können.

Unter den bekannten Allelen wird eine Auswahl dergestalt ge- troffen, daß einem möglichst seltenen Allel (d. h. bei weniger als 5 % aller Personen der Weltbevölkerung vorkommend) der Vorzug vor einem in der Bevölkerung häufiger vorkommenden Allel gegeben wird. Die Allele HLA-A6601 bzw. HLA-B*7301 können als Beispiel dienen, da sie extrem selten vorkommen (bei unter l % der Mitteleuropäer). Es ist hierbei zu beach- ten, daß Sequenzunterschiede zwischen HLA Klasse I Allelen in aller Regel mehr als nur eine einzige Nukleotidposition be- treffen, so daß die entsprechenden Proteinprodukte sich in einer variablen Anzahl von Aminosäuren unterscheiden können.

Diese Unterschiede führen charakteristischerweise zu unter- schiedlichem Peptidbindungsverhalten. Als Beispiel sollen die beiden HLA Moleküle HLA-B35 und HLA-B53 dienen, die sich nur durch das Vorhandensein der Bw6- (B35) bzw. Bw4- (B53) Deter-

minante unterscheiden, d. h. durch fünf geänderte Aminosäuren.

Die gebundenen Peptide enthalten in der Regel als C-terminalen "Anchor"ein Tyrosin (B35), während mehrere Aminosäuren als C- Terminus des Peptids von HLA-B53 Molekülen toleriert werden.

Der andere"Anchor"in der Peptidposition 2 ist hingegen bei beiden Molekülen ein Prolin, bedingt durch die Identität der Moleküle im Bereich der B-Tasche, welche dieses Prolin bindet.

Die für die Auswahl von Allelen und Peptiden relevanten Daten sind dem Fachmann und der Allgemeinheit zugänglich (u. a. im Internet unter http ://www. ebi. ac. uk/imgt/hla/ für DNA-und Proteinsequenzen von HLA Molekülen ; ftp ://ftp. wehi. deu. au/pubEbiology/mhcnen/oder http//134. 2. 96. 221/scripts/hlaserver. dll/home. htm für Peptid- sequenzen). Daraus kann der Fachmann auch entnehmen, welche Allele welche Merkmale tragen und mit welcher Häufigkeit sie auftreten.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, artifizielle HLA Klasse I Allele zu konstruieren und die da- zugehörigen Proteine zu synthetisieren, welche in der mensch- lichen Bevölkerung nach heutiger Kenntnis nicht vorkommen und die gegebenenfalls ein geändertes Peptidbindungsverhalten haben. So ist es möglich, durch in vitro-Mutagenese die B- Tasche des HLA-B27 Moleküls, die preferentiell ein Arginin der Peptidposition 2 bindet, durch die B-Tasche des HLA-A2 Mole- küls zu ersetzen, was zur Bindung von Peptiden führt, die eine hydrophobe Aminosäure, z. B. Leucin, in der Peptidposition 2 enthalten. Der Begriff"Allele"erfaßt daher sowohl natürliche als auch artifizielle Allele.

Nach der Auswahl erfolgt erfindungsgemäß die Synthese des löslichen, extrazellulären Anteils des Proteins (der Proteine) d. h. der al. a2 und a3 Domänen, und dann die in vitro-Assem- blierung in der Weise, daB bei Vorhandensein von B2m in einer Rekonstitutionslösung bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 40 °C das Protein des ausgewählten HLA Allels in einen Peptidpool mit unterschiedlichen Peptiden aus 7 bis 12 Amino- säuren, vorzugsweise 8 bis 9 Aminosäuren, eingebracht und für

einen Zeitraum von 1 bis 7 Tagen inkubiert wird. Der Peptid- pool enthält insbesondere Peptide mit geeigneten"Anchors" (Ankeraminosäuren, s. o.), etwa Prolin an Position 2 und Tyro- sin an Position 8 oder 9 eines Peptids im Falle des HLA-B35 Moleküls. Als ein solches Peptid kann beispielsweise einge- setzt werden das Oktamer VPLRPMTY oder das Nonamer LPPLDITPY (J. Mol. Biol. 285, 645-653, 1999).

Das rekonstituierte, trimere HLA Klasse I Molekül wird anschließend chromatografisch, z. B. durch Hochleistungs-Flüs- sigchromatografie (HPLC) oder durch FPLC von den weiteren Bestandteilen des Gemisches, wie ungebundene Peptide, ß2m usw. abgetrennt. Die korrekte Faltung des rekonstituierten Moleküls und damit native Konformation wird z. B mit Hilfe von konforma- tionsabhängigen Antikörpern im ELISA-Test und mittels Immun- präzipitation nachgewiesen (Eur. J. Immunol. Vol. 23, 734-738, 1993 ; Hum. Immunol. 61, 408-418, 2000).

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird das nach Punkt c) oder d) gebildete HLA Klasse I Molekül vor der nachfolgenden Fragmentierung für einen Zeitraum von 1-36 Stunden, vorzugsweise 18-36 Stunden bei 4 bis 40 °C, vorzugs- weise 37 °C in ein Warmblüterserum gegeben, vorzugsweise in ein Mäuseserum, insbesondere in ein Serum von ß2m (-/-) Mäusen.

Dadurch werden gegebenenfalls weitere Substanzen an das HLA Molekül gebunden.

Bei der anschließenden Fragmentierung des gereinigten HLA Klasse I Moleküls kann eine Vielzahl von Proteasen verwendet werden.

Bevorzugt werden die Proteasen ausgewählt unter Proteina- sen wie Serin-Proteinasen, Cystein-Proteinasen, Aspartat-Pro- teinasen und Metall-Proteinasen sowie auch Peptidasen, wie Aminopeptidasen, Dipeptidasen, Dipeptidylcarboxypeptidasen, Carboxypeptidasen, Omega-Peptidasen. Bevorzugt ist z. B. Pro- nase von Streptomyces griseus (Sigma Pronase, Typ XIV), Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 96, 1522-1525, 1999.

Die Fragmentierung mit Pronase kann beispielsweise bei Raumtemperatur für 2 Stunden erfolgen, wobei die Konzentration

in Abhängigkeit von den experimentellen Gegebenheiten variie- ren kann.

Zur Rekonstitution löslicher HLA-A oder HLA-B/Peptid Komplexe kann gegebenenfalls ein Rekonstitutionspuffer hin- zugegeben werden, beispielsweise 400 mM L-Arg-HCl, 2 mM EDTA, 5 mM reduziertes Gluthation, 0, 55 mM oxidiertes Gluthation, 100mM Tris/HCl, pH 7, 5.

Nach Abtrennung der geruchlich aktiven Stoffe, beispiels- weise durch chromatographische Verfahren (HPLC, FPLC) oder immunologische Verfahren, können diese Stoffe in entsprechen- den Konzentrationen in kosmetische Zubereitungen wie Parfüms, Emulsionen, Seifen, ble, Gele, Cremes und dergleichen einge- bracht werden. Derartige Formulierungen bilden ebenfalls einen Gegenstand der Erfindung.

Eine Besonderheit der erfindungsgemäßen Duftkomposition besteht darin, daß sie aus zwei getrennt formulierten Produk- ten bestehen kann. Es können auch drei getrennte Produkte formuliert werden.

In der bevorzugten erfindungsgemäßen Duftkomposition bildet das nach Anspruch 1 hergestellte Produkt eine kombina- torische Einheit mit einem zweiten Produkt, das ebenfalls nach dem Verfahren gemäß'Anspruch l hergestellt ist mit der Maßga- be, daß das ausgewählte Allel für das zweite Produkt ein ande- res Allel ist als das Allel für das erste Produkt. Dabei un- terscheidet sich das Allel für das zweite Produkt ebenfalls durch wenigstens ein Merkmal von anderen Allelen der HLA Klas- se I Moleküle. Dieses Merkmal ist ein sog. seltenes Merkmal, das bei weniger als 5 %, vorzugsweise weniger als 1 % der Weltbevölkerung auftritt (Allelfrequenz).

Die kombinatorische Einheit umfaßt zwei Duftformulierun- gen, von denen jeweils eine für unterschiedliche Partner, vor- zugsweise unterschiedliche Partner verschiedenen Geschlechtes vorgesehen oder zuzuordnen ist.

Bevorzugte Duftkompositionen sind dadurch gekennzeichnet, daß die Allele HLA-A*6601 und HLA-B*7301 ; die Allele HLA-B*1301 und HLA-B*2709 ;

die Allele HLA-B*2705 mit Ersatz der"B"-Tasche durch die"B"- Tasche des HLA-A 0201 Allels und HLA-B*7301 ; als Ausgangsstoffe für getrennte Duftkompositionen eingesetzt werden. Dabei bilden die genannten Allelpaare Ausgangsstoffe für entsprechende Duftkompositionspaare z. B. A und B, von denen der Duft A dem Partner A und der Duft B dem Partner B zugeordnet wird, um die Attraktivität der Partner A und B füreinander zu erhöhen.

Die Erfindung wird nachstehend durch Beispiele näher erläutert. In den dazugehörigen Zeichnungen zeigen Fig. 1 eine schematische Darstellung eines HLA Klasse I Mole- kül mit extrazellulären Domänen a,., ce2, a3 ; die membranveran- kerte schwere Kette ist nicht kovalent mit ß2m assoziiert.

Fig. 2 eine Struktur des extrazellulären Anteils eines HLA Klasse I Moleküls.

Fig. 3 einen Blick von oben auf die Peptidbindungstasche mit dem zickzackförmig eingebundenen Peptid (HLA-B*3501, mit Pep- tid LPPLDITPY).

Beispiel 1 Herstellung der Duftkomponente A Induktion LB-Medium = 10 g Bacto-Tryptoni 5 g Yeast Extract, 10 g NaCl gelöst in 1 1 ddH2O.

300 ml LB/Amp-Medium wurden in einem 1 1 Kolben mit 3 ml Über- nacht-Kultur (bei Raumtemperatur) angeimpft und bei 37 °C bis zu einer OD560 von 0, 7 bei 300 U/Min. geschüttelt. Nach Ein- stellen der IPTG (IPTG = Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) Konzentration auf 0, 4 mM wuchsen die Bakterien weitere 4 Stun- den bei 37 °C, bevor sie bei 2700 g für 20 Minuten zentrifu- giert wurden. Das Pellet wurde zur Präparation von"Inclusion Bodies"eingesetzt.

Zur Identifizierung proteinexprimierender Klone nach einer Transformation wurde eine Induktion in kleinerem Maßstab durchgeführt. Hierbei wurden je 200 « l LB/Amp in einer 96 Loch Zell-Kulturplatte (Costar) mit einer Kolonie. angeimpft und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 100 gl

abgenommen und mit 100 ßl LB/Amp/2xIPTG in eine neue Vertie- fung gefüllt und 4 Stunden bei 37 °C stehengelassen. Anschlie- Bend wurde die Kultur in einem Eppendorfgefäß zentrifugiert, die Bakterien in 100 gl SDS-Probenpuffer aufgenommen (SDS = Natriumlaurylsulfat), 10 Minuten bei 95 °C lysiert und ein Aliquot auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Proteinex - primierende Klone zeigten eine zusätzlich Bande.

PrEparation von"Inclusion Bodies" Fremde Proteine werden in bakterien häufig als denaturiertes Präzipitat im Zytoplasma abgelagert. Diese"Inclusion Bodies" lassen sich nach dem Zellaufschluß durch mehrere Zentrif. uga- tionsschritte reinigen, in Harnstoff lösen und dann zu funk- tionellen Proteinen rekonstituieren.

Das nach der Bakterieninduktion gewonnene Pellet wurde in 10 ml Lysepuffer (25 % Sucrose/ImM EDTA/50 mM Tris/HCl, pH 8, 0) und 1mM Phenylmethansulfonsäurefluorid aufgenommen und über Nacht bei-20 °C eingefroren oder sofort weiterverarbei- tet. Nach Zugabe von 0, 5 ml Lysozym (10 mg/ml Lyspuffer) und Inkubation für 30 Minuten auf Eis nahm die Lösung auf Grund der DNS-Freisetzung eine viskose Konsistenz an. Der Zusatz von MgCl2 (auf 10 mM), MnCl2 (auf 1 mM) und DNase I (auf 10 ßg/ml) verflüssigte das Lysat wieder. Nach einer Zentrifugation für 10 Min bei 10. 000 g wurde das Pellet in 10 ml Detergenspuffer (0, 2 M NaCl/1 % Desoxycholsäure (Sigma)/1 % Nonidet P-40 (Sigma)/2 mM EDTA/2 mM DTT (Dithiothreitol)/20 mM Tris/HCl, pH 7, 5) mittels Ultraschall resuspendiert und nach einer Inku- bation für 10 Minuten auf Eis erneut zentrifugiert. Die Inclu- sion Bodies wurden 4x in Tritonpuffer (100 mM NaCl/lmM EDTA/ 2mM DTT/0, 5% TritonX100 (Serva)/S0 mM Tris/HCl, pH 8, 0) gewaschen und in 4 ml 20 mM Tris/HC1, pH 7, 5/ 150 mM NaCl/10 mM DTT aufgenommen.

Rekonstitution des funktionellen HLA/Peptid-Komplexe Das funktionelle Molekül HLA A6601 wurde aus der in Harnstoff gelösten schweren Kette (a1, a2, a3 Domäne), ß2-Mikro- globulin und dem

T R Peptid X XXXXXX nach dem Verdünnungsprotokoll von V K Garboczi et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 89, 3429-3433, 1992) rekonstituiert.

Die in Form von"Inclusion Bodies"gereinigten Unterein- heiten wurden in frisch angesetztem und filtriertem Harnstoff- puffer (50 % Harnstoff/50 mM NaCl/20 mM Tris/HCl, pH 7, 5) gelöst (30 Min bei Raumtemperatur im Schüttler), zentrifugiert (20 Min, 10. 000 g) und ihre Konzentration bestimmt. Beide Ket- ten wurden vereinigt, mit Harnstoffpuffer auf 5 ml aufgefüllt und in 200 ml Rekonstitutionspuffer (400 mM 1-Arginin/HC1 (Sigma)/2mM EDTA/5 mM reduziertes Gluthathion/0, 5 mM oxi- diertes Gluthation, 100mM Tris/HCl, pH 7, 5), der das Peptid enthielt, verdünnt. Die Endkonzentration der HLA Kette betrug 1 gM, die des ß2-Mikroglobulins 2 gM und des Peptides 10 gM.

Der Ansatz verblieb für 36 Stunden bei 4 °C und wurde nach Konzentrierung auf 1 ml mit Hilfe von Centriprep-10 Konzen- trierröhrchen (Amicon) auf einer Gelfiltrationssäule aufge- trennt.

Gelfiltration Die Reinigung des HLA/Peptid-Komplexes erfolgte mittels einer mit 20 mM Tris/HCl, pH 7, 5/ 150 mM NaCl äquilibrierten Super- dex-75-HR Säule (Pharmacia), auf der der konzentrierte Resti- tutionsansatz bei einer Flußrate von 1 ml/min aufgetrennt wurde.

Fragmentierung 1mg des gereinigten HLA/Peptid-Komplexes in 1ml Puffer (20 mM Tris/HCl, pH 7, 5/150 mM NaCl) wird entweder direkt mit bakte- rieller Pronase Typ XIV aus Streptomyces griseus versetzt (Endkonzentration 0, 1 mg/ml) oder in Serum von B2m (-/-) Mäu- sen, die auf Grund defekter Gene für ßm kein ß2m-Protein mehr produzieren können, gegeben (Endkonzentration des HLA/Peptid- Komplexes lmg/ml). Vor Zugabe des Enzyms kann eine Inkubation der HLA/Peptid-Komplexe im Serum bei 4-40 °C für bis zu 24 Stunden erfolgen ; dann wird mit bakterieller Pronase Typ XIV

aus Streptomyces griseus versetzt (Endkonzentration 2 mg/ml).

Die Degradation der Proteine wird bei Raumtemperatur für 2 Stunden durchgeführt. Andere Konzentrationen des HLA/Peptid- Komplexes und des Enzyms sowie der Degradationszeit und-tem- peratur sind. möglich. Die fragmentierten Proteine werden ent- weder bei-80 °C eingefroren oder direkt weiterverarbeitet.

Abtrennung Die Abtrennung der geruchlich inaktiven Bestandteile kann mit- tels Sephadex G-100 im Batch-Verfahren erfolgen. Hierbei wird die Probe, welche die degradierten Proteine enthält, mit Se- phadex (1/10 des Volumens) gemischt, 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und kurz zentrifugiert. Der überstand enthält die geruchlich aktiven Bestandteile der Probe.

Auf diese Weise erhielt man die Duftkomponente A.

Beispiel 2 Herstellung der Duftkomponente B Es wurde wie im Beispiel 1 gearbeitet, jedoch als Allel wurde HLAB*7301 und als Peptid XRXXXXXXP ausgewählt. Die nach- folgenden Schritte entsprachen denen des Beispiels 1 und man erhielt nach der Fragmentierung und Abtrennung die Duftkom- ponente B.

Beispiel 3 ParfEmkomposition (Eau de Parfume) Komposition A Bei Raumtemperatur wurden die folgenden Bestandteile mitein- ander vermischt (Gewichtsprozent).

Duftkomponente A 11 % Ethanol q. s. ad 100 Wasser 1 % Color blue 0, 05 % Gleichzeitig wurden die folgenden Bestandteile miteinander vermischt.

Komposition B Duftkomponente B 10 % Ethanol q.s. ad 100

Wasser 1 % Color yellow 0, 06 % Beide Kompositionen wurden danach 10 Tage bei 5 bis 10 °C gelagert und als eine Verkaufseinheit konfektioniert. An- schließend wurde Komposition A einem Partner einer Lebensge- meinschaft und Komposition B dem anderen Partner der Lebens- gemeinschaft zur Verfügung gestellt. Beide Partner beurteilten den Duft des jeweils anderen Partners als sehr erotisch und anziehend.

Beispiel 4 Gesichts-und Körpercreme TEIL A Phase A (In Gewichtsprozent) Propylene Glycol Dicaprylate 4 Cetearyl Isononanoate 2, 5 Shea Butter 1, 0 Dimethicone 1, 2 Phase B.

Wasser-q. s. ad 100 Glycerine 3 Phase C Konservierungsmittel 0, 5 Duftkomponente A 1, 5 Farbstoff orange 0, 08 Die Phase A wurde auf 70 C erwärmt und Phase B ebenfalls separat auf 70 ° C erwärmt. Danach wurden beide Phasen mitein- ander vermischt und das Gemisch auf 40 °C abgekühlt. Dann erfolgte die Zugabe der Phase C, und das Gesamtgemisch wurde homogenisiert.

TEIL B Die gleiche Zusammensetzung der Phasen A und B wie in TEIL A von Beispiel 4 wurde genommen..

Phase C Konservierungsmittel 0, 5 Duftkomponente B 1, 5

Farbstoff blau 0, 08 Die Verarbeitung erfolgte wie für den TEIL A von Beispiel 4.

Die TEILE A und B der Creme von Beispiel 4 wurden zusammen als eine Verkaufseinheit konfektioniert. Anschließend wurde TEIL A einem Partner einer Lebensgemeinschaft und TEIL B dem ande- ren Partner der Lebensgemeinschaft zur Verfügung gestellt.

Beide Partner beurteilten den Duft des jeweils anderen Part- ners als sehr attraktiv und anziehend.