Anordnung zur Quantifizierung von Zellen einer Zellsuspension Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur Quantifizierung von Zellen einer Zellsuspension mit einem Fluidkanal zur Leitung der Zellsuspension und einem magnetischen Sensor am Fluidkanal zur Zählung magnetisch markierter Zellen in der Zellsuspension .

Für die Einzelzelldetektion kann beispielsweise die optische Durchflusszytometrie verwendet werden. Diese bietet mit dem FACS-System (fluorescence activated cell sorting) eine Mög ^¬ lichkeit, fluoreszenzmarkierte Zellen von der Messsuspension zu separieren und weiterzuverwenden . Dabei werden die separierten Zellen je nach Markierung verschieden stark elektrisch aufgeladen und von geladenen Platten in verschiedene Auffangbehälter abgelenkt. Alternativ zur fluoreszenzbasierten Detektion kann auch die magnetbasierte Zelldetektion verwendet werden. Für eine se ^¬ lektive, magnetische Einzelzelldetektion werden die Zellen mit superparamagnetischen Markern markiert und über ein magnetoresistives Bauteil, beispielsweise GMR, transportiert. Ziel ist es, bei einer möglichst hohen Zellkonzentration die Analyten in kleinstmöglichem Abstand zueinander anzuordnen und einzeln detektieren zu können.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Anordnung und ein Verfahren anzugeben, mit denen eine magnetbasierte Einzelzelldetektion und zugleich eine Separation magnetisch markierter Zellen von unmarkierten Zellen ermöglicht wird.

Diese Aufgabe wird durch eine Anordnung mit den Merkmalen von Anspruch 1 gelöst. Hinsichtlich des Verfahrens wird die Auf ^¬ gabe durch ein Verfahren mit den Merkmalen von Anspruch 6 gelöst. Die Unteransprüche betreffen vorteilhafte Ausgestaltun ^¬ gen der Anordnung. Die erfindungsgemäße Anordnung zur Quantifizierung von Zellen einer Zellsuspension weist einen Fluidkanal zur Leitung der Zellsuspension auf. Weiterhin umfasst die Anordnung einen magnetischen Sensor am Fluidkanal. Dieser basiert insbesonde ^¬ re auf GMR, AMR o.ä. und ist zur Zählung magnetisch markierter Zellen in der Zellsuspension ausgestaltet. Zweckmäßig befindet sich der magnetische Sensor in direkter Nähe zum oder innerhalb des Fluidkanals.

Schließlich weist der Fluidkanal einen Anreicherungs-Bereich mit vergrößertem Querschnitt auf. An wenigstens einer Seite des Anreicherungs-Bereichs ist dabei ein Magnet angeordnet. Bei dem Magneten kann es sich um einen Elektromagneten han- dein. Bevorzugt kommt allerdings ein Permanentmagnet zum Ein ^¬ satz .

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Quantifizierung von Zellen einer Zellsuspension und Anreicherung magnetisch mar- kierter Zellen wird ein Fluidkanal mit einem ersten Querschnitt und mit einem Anreicherungs-Bereich mit gegenüber dem ersten Querschnitt vergrößertem zweiten Querschnitt bereitge ^¬ stellt, werden die Zellen im Fluidkanal zum Anreicherungs- Bereich und dort zu einem magnetischen Sensor zur Zählung magnetisch markierter Zellen in der Zellsuspension geführt und schließlich werden die Zellen im Anreicherungs-Bereich durch einen Magneten zu einer Seite des Fluidkanals gezogen.

Mit der erfindungsgemäßen Anordnung wird vorteilhaft er- reicht, dass neben der reinen Quantifizierung der markierten Zellen auch eine Separation der Zellen stattfindet. Hierzu sorgt der Magnet für eine Anreicherung der magnetisch markierten Zellen im Anreicherungs-Bereich. Da die nicht magnetisch markierten Zellen nicht auf das Magnetfeld reagieren, werden sie auch nicht angereichert und fließen ungehindert im Fluidkanal vom Magneten weg. Dabei ist es zweckmäßig, wenn der magnetische Sensor im Anreicherungs-Bereich angeordnet ist. So können vorteilhaft neben der Vermessung der Zellen auch eine nachfolgende Separation der Zellen und eine Entnahme der magnetisch markierten Zellen stattfinden. Dabei sind die magnetisch markierten Zellen angereichert und ein nachfolgender Schritt zur Sortierung magnetisch markierter Zellen von unmarkierten ist unnötig. Diese Vorgangsweise erleichtert oder erspart eine komplexe Probenaufbereitung, die in immer mit einem potentiellen Verlust des zu untersuchenden Zellmaterials verbunden ist. Dabei ist der Magnet bevorzugt so angeordnet, dass die Zellen im Anreicherungsbereich aus dem außerhalb des Anreicherungs ^¬ bereichs vorliegenden Querschnitt des Fluidkanals gezogen werden. Mit anderen Worten werden die Zellen aus der im Fluidkanal vorliegenden Strömung gezogen. Zellen, die sich in den strömungsberuhigten Teilen des Fluidkanals im Anreicherungs-Bereich aufhalten, sind wesentlich leichter durch die Krafteinwirkung des vom Magneten erzeugten Feldes beeinflussbar und werden nicht so leicht von der im Fluidkanal sonst vorliegenden Strömung fortgerissen.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn in Flussrichtung der Zell ^¬ suspension am Ende des Anreicherungs-Bereichs der Fluidkanal eine konkave Form aufweist, ausgestaltet zum Einfangen von magnetisch markierten Zellen, die vom Magneten in den Anrei- cherungs-Bereich gezogen sind. Mit anderen Worten weist der

Fluidkanal im Bereich erweiterten Querschnitts zu dessen Ende hin eine Tasche oder ähnliche Formgebung auf, die so gestal ^¬ tet ist, dass einmal dort hineingeführt Zellen weitgehend von der Strömung im Fluidkanal abgeschnitten sind und nur noch in den Fluidkanal gelangen könnten, indem sie sich gegen die anderweitig vorherrschende Strömung bewegen.

Ein bevorzugtes, jedoch keinesfalls einschränkendes Ausfüh ^¬ rungsbeispiel für die Erfindung wird nunmehr anhand der Figu- ren der Zeichnung näher erläutert. Dabei sind die Merkmale schematisiert dargestellt. Es zeigen Figur 1 eine Anordnung eines Si-basierten GMR-Sensors und eines Fluidkanals zur Zellquantifizierung und Anreicherung,

Figuren 2-4 die Anordnung im Betrieb,

Figur 5 Prozessschritte bei einer Verwendung der Anord ^¬ nung in der Hämatologie,

Figur 6 Prozessschritte bei einer Verwendung der Anord ^¬ nung in der Hämostase-Analytik .

Eine Anordnung 10 zur Einzelzelldetektion und anschließenden Separation der Zellen 17, 18 gemäß der Figur 1 besteht aus einer Mischkammer (nicht in Figur 1 dargestellt) und einem Fluidkanal 11 zur Anreicherung der Zellen und Führung über einen magnetoresistiven GMR-Sensor 12. Im Ausführungsbeispiel gemäß Figur 1 ist der GMR-Sensor 12 auf einem Silizium-Wafer aufgebracht, der wiederum auf einem Permanentmagneten 13 angeordnet ist.

Dabei weist der Fluidkanal 11 abseits des Permanentmagneten 13 einen ersten Querschnitt 14 auf. Im Bereich des Permanent ^¬ magneten 13 ist der Fluidkanal 11 verbreitert und weist einen zweiten Querschnitt 15 auf, der größer als der erste Quer ^¬ schnitt 14 ist. Die Erhöhung des Querschnitts 14 verbreitert den Fluidkanal 11 gerade so, dass er bis zum Silizium-Wafer mit dem GMR-Sensor 12 reicht. In den Bereichen mit dem ersten Querschnitt 14 weist der Fluidkanal 11 hingegen einen Abstand zum Permanentmagneten 13 auf.

Der Anreicherungsbereich 21, der sich durch den zweiten Quer- schnitt 15 ergibt, ist dabei in der Ansicht gemäß den Figuren 1 bis 4 nach Art eines Parallelogramms ausgebildet. Dadurch bildet sich in Flussrichtung der Zellen 17, 18 zum Ende des Anreicherungsbereichs 16 hin eine Art Tasche. Im vorliegenden Beispiel ist der Anreicherungsbereich 21 ausschließlich zu der Seite hin ausgebildet, die dem Permanentmagneten 13 zuge ^¬ wandt ist. In die anderen Richtungen ist der Fluidkanal 11 im Bereich mit zweitem Querschnitt 15 unverändert gegenüber dem Bereich mit dem ersten Querschnitt 14. Fig. 1 zeigt eine Menge von Zellen 17, 18. Ein Teil der Zel ^¬ len 17 ist nicht magnetisch markiert. Der Rest der Zellen 18 ist magnetisch markiert, beispielsweise mit superparamagneti- sehen Beads . Die markierten und unmarkierten Zellen 17, 18 sind miteinander vermischt und fließen im Fluidkanal 11 auf den Bereich mit vergrößertem Querschnitt 15 zu. Hierfür erzeugt eine Pumpe, die in Figur 1 nicht dargestellt ist, einen geeigneten Fluss im Fluidkanal 11.

Figur 2 zeigt die Situation zu einem Zeitpunkt, an dem die Zellen 17, 18 den Bereich mit vergrößertem Querschnitt 15 fast erreicht haben. Die magnetisch markierten Zellen 18 werden unter dem Einfluss des Permanentmagneten 13 zunächst in Richtung des Permanentmagneten gezogen und auf der entsprechenden Seite des Fluidkanals 11 konzentriert.

Figur 3 zeigt die Situation zu einem Zeitpunkt, an dem die Zellen 17, 18 den Bereich mit vergrößertem Querschnitt 15 er- reichen. Sie durchlaufen dort - von der Störung durch den

Permanentmagneten 13 abgesehen - die gedachte Fortsetzung 20 des Fluidkanals 11 im Bereich mit dem zweiten Querschnitt 15. Die magnetisch markierten Zellen 18 werden jedoch unter dem Einfluss des Permanentmagneten 13 weiter aus der gedachten Fortsetzung 20 des Fluidkanals 11 herausgezogen in den Anreicherungsbereich 21. Dabei ist es auch möglich, dass vereinzelte nicht markierte Zellen 17 durch gegenseitige Reibung mitgezogen werden. Die Mehrzahl der unmarkierten Zellen 17 verbleibt jedoch in der gedachten Fortsetzung 20 und wird durch die Strömung im Fluidkanal 11 weiter fortgetragen.

Die magnetisch markierten Zellen 18 werden von der Strömung über den GMR-Sensor 12 getragen und lösen dadurch Signale aus, anhand derer eine Zählung der markierten Zellen möglich ist.

Figur 3 zeigt die Situation zu einem späteren Zeitpunkt, an dem die Zellen 17, 18 das Ende des Bereichs mit vergrößertem b

Querschnitt 15 erreichen. Zu diesem Zeitpunkt sammeln sich die markierten Zellen 18 in der Tasche im Anreicherungsbe ^¬ reich 21 und könnten von dort aus nur noch in den Fluidkanal 11 zurück, indem sie sich entgegen der Strömung bewegen. Sie verbleiben daher weitgehend in der Tasche im Anreichungsbe- reich 21. Die unmarkierten Zellen 17 jedoch werden mit der Strömung im Fluidkanal 11 fortgetragen.

Im Ergebnis findet somit durch die beschriebene Anordnung 10 eine starke Anreicherung der markierten Zellen 18 im Anreicherungsbereich 21 statt. Nicht markierte Zellen 17 werden fortgespült. Die markierten Zellen 18 können in der Folge beispielsweise entnommen werden und zur Durchführung von Folgeuntersuchungen verwendet werden. Vorteilhaft kann dadurch bei bestimmten Testfolgen eine erhebliche Verkürzung der Arbeitsschritte erreicht werden. Hierfür kann in der Anordnung 10 beispielsweise ein Septum 22 (Durchstichmembran) vorgesehen sein. Ein Beispiel für eine solche Testfolge ist eine Untersuchung der Lymphozytopenie, also der zu geringen Anzahl an Lymphocy- ten. Die Anordnung 10 ist dabei innerhalb eines Point-of- Care-Geräts realisiert. Die Lymphozytopenie kann beispiels ^¬ weise auftreten bei der Einnahme von Kortikoiden im Zuge ei- ner HIV Infektion (CD4+ T-Helferzellen) , großem Stress, rheumatischer Athritis oder einer idiopathischen CD4+ Lymphozytopenie (weniger als 300 CD4+ T-Zellen/μΙ Blut) .

Figur 5 zeigt Zustände der Zellen 17, 18, die in diesem Bei- spiel für die Quantifizierung durch bestimmte Messschritte erreicht werden. Ein erster Zustand 501 ist erreicht, nachdem die Zellen 17, 18, sowohl markierte wie unmarkierte in einer ersten Flussrichtung 52 über den GMR-Sensor 12 geführt wurden. Sie sind dabei bereits wie für die Figuren 1 bis 4 be- schrieben separiert und im Anreicherungsbereich 21 zum Permanentmagneten 13 gezogen worden. Dabei sind die Zellen 17, 18 an einem Ende des Anreicherungsbereichs 21 konzentriert. Sodann wird eine Umkehr der Flussrichtung vorgenommen und somit fließen die Zellen 17, 18 in einer zweiten Flussrichtung 52 zum anderen Ende des Anreicherungsbereichs 21. Dabei über ^¬ queren sie wieder den GMR-Sensor 12 und dabei ergibt sich der zweite Zustand 502. Sie können dabei ein weiteres Mal gezählt werden. Die magnetischen Führungsstrukturen 51 sorgen dabei bei den magnetische markierten Zellen 18 für eine Ausrichtung der Zellen 18 zur Mitte des Anreicherungsbereichs 21 hin, so dass diese Zellen zunehmend einzeln und nacheinander über den GMR-Sensor geführt werden. Die unmarkierten Zellen 17 reagieren auf die magnetischen Führungsstrukturen 51 nicht und können so - separiert von den markierten Zellen 18 - eher den Anreicherungsbereich 21 wieder verlassen. Der dritte Zustand 503 ergibt sich, wenn bei umgekehrter

Flussrichtung alle Zellen 17, 18 wieder am Ende des Anreicherungsbereichs 21 versammelt sind. Dann wird die Flussrichtung wiederum umgekehrt. In der Folge ergibt sich der vierte Zu ^¬ stand 504, bei dem die Zellen 17, 18 - beeinflusst von den magnetischen Führungsstrukturen 51 - wieder den GMR-Sensor 12 passieren und ein drittes Mal gezählt werden. Die mehrfache Zählung erlaubt eine statistische Auswertung der Ergebnisse und somit eine erhöhte Genauigkeit gegenüber der einmaligen Zählung .

Hierbei können die zu untersuchenden Zellen 17, 18 nach der Quantifizierung in der Anordnung 10 zur weiteren Nachuntersuchung durch das Septum 22 entnommen werden. Ein Beispiel einer solchen Nachuntersuchung ist im Zusammenhang mit HIV- Infektionen beispielsweise die Folgende: Im Frühstadium einer HIV-Infektion ist die Anzahl an sich frei im Blut befindlichen Viren sehr gering und meist nicht erkennbar. Jedoch können CD4+ Zellen, die infiziert sind, bereits eine Vorstufe von HI-Viren nach einer Infektion enthalten (Proviren) . In diesem Stadium der Infektion ist noch keine auffällige Anzahl der CD4+ Zellen messbar (auffällig: unter 500/μ1 - normal: 600-1600/μ1) und die Symptome der Infektion sind von einer herkömmlichen Grippe nicht zu unterscheiden. Wenn nun CD4+ Zellen in der vorgestellten Erfindung gezählt werden, können diese anschließend entnommen und auf eine mögliche HIV-In ^¬ fektion im frühen Stadium hin weiter getestet werden. In einem weiteren Beispiel wird die Anordnung 10 ebenfalls als Teil eines Point-of-Care-Geräts zur Messung von Thrombo ^¬ zyten verwendet, um den Vorgang der Hämostase zu untersuchen. Dabei ist die Anzahl der Thrombozyten besonders im Zusammenhang einer Thrombozytopenie, d.h. einer zu geringen Anzahl an Thrombozyten, sehr wichtig. Bekannte Methoden erfassen entweder nur die relative Änderung der Thrombozytenzahl (zellulärer Ast der Hämostase) oder nur den plasmatischen Ast der Blutgerinnung, also ohne die Anzahl der Thrombozyten zu erfassen .

Die hier beschriebene Anordnung 10 ist in der Lage, beide Äs ^¬ te der Hämostase (zellulär und plasmatisch) zu messen, indem zu Beginn der Messung die Zahl der Thrombozyten bestimmt wird. Die Schritte der Vermessung und die Zustände, die dabei auftreten, sind in Figur 6 dargestellt. Die Zellen 17, 18 der Zellsuspension werden dabei zu Anfang mehrmals über den Sensorbereich geleitet wie schon zu Figur 5 beschrieben.

Im weiteren Zeitverlauf bilden sich Zellaggregate 630 und zu- letzt ein Gerinnsel mit Fibrin 640 aus. Dabei kann die Anzahl der Thrombozyten, ihre Aktivierung und die Entstehung von Aggregationen z.B. mit magnetoresistiven Methoden erfasst werden. Die Ausbildung eines Gerinnsels kann z.B. durch zusätzliche Oberflächensensitive Impedanzsensoren erreicht werden. Dabei wird die Probe mehrmals über den Sensor geführt, wobei sich im weiteren Zeitverlauf immer mehr Zellen an der Oberfläche ablagern, was durch eine Zunahme der Impedanz gekennzeichnet ist.