Die Erfindung betrifft ein künstliches Blutgefäßsystem, auf dessen vorbeschichteten Oberflächen eine Substanz mit Zell- adhäsion aufgebracht ist.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des künstlichen Gefäßsystems, in welchem die innere Oberfläche des Gefäßsystems vorbeschichtet und in einem weiteren Verfah¬ rensschritt eine Substanz aufgebracht wird, die von bestimmten Zelladhäsionsrezeptoren gebunden wird.

Die chemische und physikalische Zusammensetzung von künstlichen Gefäßsystemen wird stetig weiterentwickelt und verbessert, da autologe Gefäßsysteme als Ersatz für natürliche Gefäßsysteme nur beschränkt verfügbar sind. Bei den Gefäßsystemen ist ins- besondere die innere Oberfläche, die zahlreiche mechanische und metabolische Eigenschaften aktiviert, von entscheidender Bedeu¬ tung. Dies gilt ganz besonders für künstliche Blutgefäßsysteme, denn die innere Oberfläche dieser Gefäßsysteme ist entscheidend für den störungsfreien Blutfluß und die Blutgerinnung.

So kann der Einsatz unbehandelter, synthetischer Gefäßtrans¬ plantate, die insbesondere in der Herz- und Gefäßchirurgie als Blutgefäßersatz verwendet werden, bei den Patienten einen Ver¬ schluß der Gefäßsysteme verursachen, die zu den bekannten, mög-_

licherweise auch letalen Konsequenzen, beispielsweise zu einem Schlaganfall, führen können.

Um derartige Störungen bei künstlichen Gefäßsystemen zu vermei- den, muß die innere Oberfläche entsprechend vorbehandelt wer¬ den. So werden bei künstlichen Gefäßprothesen Endothelzellen (EC) in das Innere des Systems eingebracht. Die Anlagerung einer natürlichen Endothelzellschicht an den Innenwänden der künstlichen Gefäßsysteme verringert die Gefahr einer Thrombose und somit die Verschlußrate der Kunstprothese.

Ein wesentlicher Nachteil besteht jedoch darin, daß die Adhä¬ sion von Zellen, insbesondere von Endothelzellen an die Innen¬ wände der synthetischen Materialien sehr gering ist. Die Endo- thelzellenbesiedlung an den Innenwänden wird jedoch gefördert, wenn dort vorher eine Substanz aufgebracht wird, die die ge¬ wünschte Zelladhäsion erhöht . Diese Substanzen werden dann von den Rezeptoren der Zellen, die angesiedelt werden sollen, er¬ kannt und gebunden. Bezüglich der Endothelzellenadhäsion bei künstlichen Blutgefäßen sind verschiedene Verfahren bekannt, die diese Adhäsion an den Innenwänden des Gefäßsystems ver¬ bessern. Die innere Oberfläche dieser synthetischen Blutgefä߬ systeme wird z.B. unter Verwendung verschiedener Matrixproteine zunächst vorbeschichtet.

Als Vorbeschichtungssubstanzen sind insbesondere Plasmaproteine wie Collagen und Laminin bekannt, die eine Adhäsion der Endo¬ thelzellen verbessern. Fibronektin, das auf PTFE-Oberflachen aufgebracht wird, gilt als die Haupterfolgssubstanz der Zell- adhäsion.

Sank et al. offenbaren ein Verfahren, in dem PTFE-Transplantate zunächst entweder mit Plasmaproteinen wie Gelatine, Laminin, Fibronektin und Collagen oder mit Peptiden, die eine RGD-

Sequenz enthalten, direkt beschichtet werden. Anschließend er¬ folgt die Besiedelung mit Endothelzellen (Sank et al . , Am J Surg 1992, Nr. 164, Seiten 199-204) .

In der europäischen Patentanmeldung EP 0 531 547 AI wird ein künstliches Blutgefäßsystem beschrieben, das mit einem Plasma¬ protein, das Endothelzellenadhäsion aufweist, beschichtet wird. Die verwendeten Proteine sind Collagen, Gelatin, Laminin und Fibronektin. Das Plasmaprotein wird an die Innenwände des syn- thetischen Materials des Gefäßsystems über funktionelle Hydroxid-, Carboxyl-Epoxy- oder Aminogruppen kovalent gebunden.

Auf diesen derart vorbeschichteten Innenwänden können dann Endothelzellen angesiedelt werden.

Einige dieser aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren weisen jedoch erhebliche Nachteile auf.

So steht eine komplizierte und langanhaltende Vorbeschichtung, die vor der Zellbesiedlung stattfindet, einer klinischen An¬ wendung in breitem Umfang entgegen. Eine mögliche Übertragung von Virusinfektionen, die beispielsweise durch eine Vorbe¬ schichtung mit Humanplasmakomponenten, wie Fibrinkleber, er- folgen kann, sollte ebenfalls vermieden werden. Darüber hinaus ist eine intravaskuläre Anwendung der Plasmaproteine Thrombin und Fibrin hochgradig thrombogen und fördert möglicherweise eine Koagulation, sofern eine Endothelzellenmonoschicht nicht sofort nach der Endothelzellenbesiedlung erzielt ^" werden kann. Die bekannten Verfahren werden hauptsächlich verwendet, um Oberflächen aus Polytetrafluorethylen (PTFE) zu beschichten. Die Beschichtung von Oberflächen aus Dacron und Polyurethan wurde auch, wenn auch seltener, durchgeführt.

Die Adhäsion von Endothelzellen an Fibronektin und auch an Laminin und Tenascin ist auf eine Aminosäuresequenz zurückzu-

führen, die in diesen Plasmaproteinen enthalten ist. Diese Sub¬ stanz ist ein Peptid, das eine Arginin-Glycin-Asparagin (RGD) - Aminosäuresequenz enthält. Eine Substanz, die mindestens eine Arginin-Glycin-Asparagin-Aminosäuresequenz enthält, wird im folgenden RGD-enthaltende Substanz genannt. Diese Sequenz wird von Integrinrezeptoren der Endothelzelle und anderen Zellen erkannt (Takemoto et al . , ASAIO Transactions 1989; Nr. 35, Seiten 354-356) .

Gegenüber den natürlich vorkommenden Sequenzen in Plasmapro¬ teinen wird jedoch die Zellenhaftung durch synthetische, RGD- enthaltende Peptide erhöht . Dies wird auf die gegenüber den natürlichen Sequenzen unterschiedlichen Strukturen der synthe¬ tischen Peptide zurückgeführt. Darüber hinaus können synthe- tische, RGD-enthaltende Peptide für Zellrezeptoren selektiver sein als Peptide, die den natürlichen Sequenzen extrazellulärer Matrixproteine entsprechen. Substanzen, die eine RGD-Sequenz enthalten, werden von verschiedenen Zellrezeptoren, insbeson¬ dere von Endothelzellrezeptoren, erkannt und gebunden.

Wird die RGD-enthaltende Substanz direkt auf die synthetische, innere Gefäßoberfläche gebracht, so erfolgt nur eine zufällige, unspezifische und unvollständige Bindung der RGD-enthaltenden Substanz an das synthetische Material. Dies hat zur Folge, daß die Dichte der RGD-Sequenzen an den Innenwänden des Gefäßsy¬ stems sehr gering ist. Diese geringe Dichte hat wiederum nur eine geringe Zellenbesiedlung zur Folge. Ein störungsfreier Durchfluß durch das künstliche Gefäßsystem kann nicht gewähr¬ leistet werden. Die direkte Beschichtung der Gefäßoberfläche mit einer RGD-enthaltenden Substanz ist daher sowohl für die Zellenadhäsion und -retention als auch für die daraus resultie¬ renden metabolischen Eigenschaften des künstlichen Gefäßsystems als nicht optimal anzusehen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein künstliches Blutgefäßsystem zur Verfügung zu stellen, in welchem die

Adhäsion und Retention von Zellen, insbesondere von Endothel¬ zellen, gesteigert und verbessert wird. Der Einsatz derartiger künstlicher Blutgefäßsysteme bewirkt einen störungsfreien Blut- fluß, wodurch die Thrombosegefahr verringert und somit die Ver- schlußrate der künstlichen Gefäßprothese gesenkt wird.

Weiterhin ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines künstlichen Gefäßsystems zur Verfügung zu stellen, das zu einer deutlichen Erhöhung der Adhäsion und Retention von Zellen an der Innenwand der Ge¬ fäßsysteme und damit zu einer Verbesserung der metabolischen Eigenschaften der künstlichen Gefäßsysteme führt.

Zur Lösung dieser Aufgabe dienen die Merkmale der unabhängigen Ansprüche.

Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen defi¬ niert.

Das künstliche Blutgefäßsystem besteht aus einem synthetischen Material, wie Polytetrafluorethylen (PTFE) , Polyurethan, Silicon und dergleichen. Die erfindungsgemäßen künstlichen Blutgefäßsysteme enthalten eine innere vorbeschichtete Ober¬ fläche, auf die eine Substanz mit Zellenadhäsionseigenschaften aufgebracht ist. Die Beschichtung der inneren Oberfläche umfaßt zwei miteinander umgesetzte Komponenten, nämlich eine erste makromolekulare Komponente mit mehr als einer primären Amino- gruppe, und eine zweite Komponente, die mindestens zwei reak¬ tive Gruppen, davon mindestens eine Aldehydgruppe aufweist. Besonders geeignet ist die Verwendung eines Poly-lysin-hydro- halogenids, vorzugsweise ein Poly-L-hydrohalogenid und ins¬ besondere ein Poly-L-lysin-hydrobromid. Vorzugsweise wird Glu- tardialdehyd als zweite Komponente eingesetzt. Die auf der vorbeschichteten, inneren Oberfläche aufgebrachte Substanz, die die Zellenadhäsion fördert, ist ein Oligosaccharid, -peptid oder -protein. Diese Substanzen weisen mindestens eine RGD-

Sequenz auf. Über diese RGD-Sequenz werden Zellrezeptoren, insbesondere Endothelzellrezeptoren gebunden.

Die erfindungsgemäßen künstlichen Blutgefäße bewirken gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten künstlichen Blutgefä߬ systemen eine erhöhte Zellenbesiedlung und -retention aufgrund der hohen Dichte der adhäsionsfordernden Substanzen. Dadurch verläuft der Blutfluß und die Blutgerinnung störungsfrei . Nach¬ teilige Auswirkungen, z.B. ein Verschluß der künstlichen Blut- gefäßsysteme, werden wirksam vermieden.

Aufgrund der erhöhten Zellenadhäsion und -retention eignet sich insbesondere das erfindungsgemäße künstliche Blutgefäßsystem als Ersatz für natürliche arterielle Gefäßsysteme. Die erfin- dungsgemäßen künstlichen Gefäßsysteme eignen sich insbesondere in der Herz- und Gefäßchirurgie als Ersatz für natürliche Ge¬ fäßsysteme.

Diese künstlichen Blutgefäßsysteme können beispielsweise unter Verwendung des erfinderischen Verfahrens - wie im folgenden be¬ schrieben - hergestellt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines künstli¬ chen Gefäßsystems bestehend aus einem synthetischen Material, in dem die innere Oberfläche vorbeschichtet wird und an¬ schließend eine Substanz aufgebracht wird, die von Zeiladhä¬ sionsrezeptoren erkannt und gebunden wird, umfaßt die folgenden Verfahrensschritte:

a) Das künstliche Gefäßsystem wird in einem ersten Verfah¬ rensschritt mit einer makromolekularen Komponente be¬ schichtet, die mehr als eine primäre Aminogruppe aufweisen muß.

b) In einem zweiten Verfahrensschritt wird die primäre Amino- gruppen enthaltende, makromolekulare Komponente mit einer

zweiten Komponente umgesetzt, die mindestens zwei reaktive Gruppen, davon mindestens eine Aldehydgruppe, enthält.

c) ^' Das durch die Schritte a) und b) vorbeschichtete, künst- liehe Gefäßsystem wird mit einer Substanz umgesetzt, die von bestimmten Zellrezeptoren erkannt und gebunden wird.

Vorwiegend besteht das erfindungsgemäße künstliche Gefäßsystem aus einem synthetischen Material, wie Polytetrafluorethylen (PTFE) , Polyurethan, Silicon und dgl . Im Verfahrensschritt a) wird die Innenwand des künstlichen Gefäßsystems mit der ersten makromolekularen Komponente beschichtet. Ein wesentlicher Aspekt des erfinderischen Verfahrens ist, daß die primären Ami- nogruppen der makromolekularen Komponente des Verfahrensschrit- tes a) in Seitenketten angeordnet sind. Vorzugsweise wird als makromolekulare Komponente Poly-lysin-hydrohalogenid, insbe¬ sondere Poly-L-lysin-hydrohalogenid, verwendet. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von Poly-L-lysin-hydrobromid.

Im Verfahrenssschritt b) wird diese makromolekulare Komponente mit einer zweiten Komponente umgesetzt, wobei die zweite Kompo¬ nente in einer molaren Menge verwendet wird, die geeignet ist, sämtliche primären Aminogruppen der ersten Komponente zu funk- tionalisieren. Besonders vorteilhaft ist hierbei die Verwendung von Glutardialdehyd. Das künstliche Gefäßsystem wird durch die Verfahrensschritte a) und b) innenseitig beschichtet. Nachdem die Vorbeschichtung der inneren Oberfläche erfolgt ist, wird im Verfahrensschritt c) wahlweise ein Peptid, Saccharid oder Pro¬ tein, auf die beschichtete Oberfläche aufgebracht, das die Zelladhäsion und -retention der gewünschten Zellen bewirkt. Diese Substanz kann ein Oligopeptid, -saccharid oder -protein sein. Sie muß wenigstens eine reaktive Gruppe enthalten, die mit dem derivatisierten Beschichtungsmaterial reagieren kann, z.B. primäre Aminogruppen.

Die Verfahrensschritte a) und b) führen zu einer Beschichtung

der künstlichen Gefäßinnenwände, die aus zwei Komponenten be¬ steht. Hierbei hat sich gezeigt, daß die zweite Komponente der Beschichtung, die mindestens zwei reaktive Gruppen und davon mindestens eine Aldehydgruppe enthält, für die Erfindung be- sonders bedeutungsvoll ist. Diese Komponente wirkt als Ab¬ standshalter (spacer) zwischen der inneren Oberfläche des Gefäßsystems und den Zellrezeptoren der Zellen, die auf der Oberfläche angesiedelt werden. Die Zwei-Komponenten-Beschich¬ tung bewirkt eine gezielte Orientierung und Bindung der die Zelladhäsion bewirkenden Substanzen; denn über die im gleichen Abstand voneinander entfernten, regelmäßig angeordneten primä¬ ren NH ₂ -Gruppen der ersten Komponente erfolgt die gezielte Bin¬ dung der zweiten Komponente, die vorzugsweise ein Glutardialdehyd darstellt. Das Glutardialdehyd wird über die ersten Aldehydfunktionen an die primären Aminogruppen des mit Poly-lysin-hydrohalogenid, insbesondere mit Poly-L-lysin- hydrobromid, vorbeschichteten künstlichen Gefäßsystems gebun¬ den. Anschließend wird das vorbeschichtete Gefäßsystem mit einer Substanz umgesetzt, die eine spezifische Adhäsion gegen- über den Zellen aufweist, die angesiedelt werden sollen. Oligosaccharide, -peptide oder -proteine, die beispielsweise eine RGD-Sequenz enthalten, sind für die Adhäsion und Retention von Endothelzellen und anderen Zellen besonders geeigne . Die frei verfügbaren Aldehydfunktionen der Zwei-Komponenten-Be- Schichtung, die insbesondere von einem derivatisierten Poly- lysin bereitgestellt werden können, binden beispielsweise primäre Aminogruppen der verwendeten spezifische Zelladhäsion aufweisende Substanzen. Der Beschichtungsmechanismus des er¬ findungsgemäßen Verfahrens ist in den Figuren 1 a) bis c) wie- dergegeben.

Aufgrund des erfinderischen Verfahrens erfolgt keine zufalls¬ mäßige und unkoordinierte Bindung der die Zelladhäsion fördern¬ den Substanzen, insbesondere der RGD-Peptide oder Proteine. Die Bindung dieser Substanzen an die synthetischen Innenwände wird gezielt über die in regelmäßigen Abständen angeordneten

Aldehydfunktionen der zweiten Beschichtungskomponenten er¬ reicht . Die dadurch resultierende größere Dichte und Bestän¬ digkeit der biologisch aktiven Peptide oder Proteine führt gleichzeitig zu einer Steigerung der Zellenbesiedlung und Zellenretention. Die erhöhte Zellenbesiedlung an den Gefä߬ innenwänden wirkt einem Verschluß des Gefäßsystems entgegen. Die metabolischen Eigenschaften der künstlichen Gefäßsysteme werden erheblich verbessert.

Das folgende Ausführungsbeispiel erläutert die Erfindung, ohne sie jedoch einzuschränken.

Ausführungsbeispiel

1. Herstellung des künstlichen Gefäßsystems

Das PTFE-Transplantat (n = 5) wird im Verfahrensschritt a) mit 40 μm/ml Poly-L-lysin-hydrobromid (Sigma GmbH, Deisenhofen, BRD) in PBS (phosphat-gepufferte Salzlösung) gefüllt und bei Raumtemperatur 24 Stunden lang inkubiert, um eine Adsorption des Polypeptids am PTFE-Material zu ermöglichen. Nach dem Spülen des Transplantats mit PBS wird im Verfahrensschritt b) eine Lösung von 0,2 % Glutardialdehyd (Sigma GmbH, Deisenhofen, BRD) in PBS in die Transplantate instilliert und 10 Minuten stehengelassen. Das Transplantat wird erneut mit PBS gespült. Das derartig vorbeschichtete Transplantat wird im Verfahrens- schritt c) vollständig mit 100 μg/ml eines synthetischen, die Adhäsion von Endothelzellen fördernden Peptids in PBS (Gly-Arg- Gly-Asp-Ser-Pro-Lys) (Gibco, Life Technologies Inc., Gaithers- burg, USA) , das die RGD-Sequenz enthält, gefüllt und 60 Minuten lang stehen gelassen. Nach Entfernen der Peptidlösung wird eine Lösung mit 1 % Rinderserumalbumin (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) in PBS in die Transplantate 30 Minuten lang ein¬ gebracht, um mögliche ungebundene Aldehydstellen zu besetzen.

Anschließend wird das Transplantat mit PBS gewaschen.

2. Endothelzellenbesiedlung

Auf dem RGD-Peptid-beschichteten Gefäßsystem wird eine En- dothelzellenkultur angelegt, die aus einer Oberflächenvene, z.B. aus der Saphene eines Erwachsenen (AHSVEC) , gewonnen wird. Endothelzellen der zweiten bis dritten Kulturpassage werden mit Trypsin behandelt, zentrifugiert und im vollständigen Nähr- medium resuspendiert. Ein aliquoter Teil wird zur Zellzählung in einem Hemocytometer verwendet und die Zellsuspension auf eine Zelldichte von 1,2 x 10 ⁵ Endothelzellen/cm ² eingestellt, um die verfügbare Prothesenoberfläche von 6,3 cm ² zu bedecken. Das Transplantat wird mittels einer Spritze mit der Endothel- zellensuspension gefüllt, an beiden Enden verschlossen und 30 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator in einer Atmosphä¬ re aus 5 % Kohlendioxid/95 % Luft bei einer Temperatur von 37 °C inkubiert. Nach 15 Minuten werden die Transplantatsegmente einmal um 180 ° gedreht. Am Ende des Besiedlungsvorgangs werden die Transplantate mit dem Nährmedium gespült.

Vergleichsversuche

Es wurde ein Vergleich der Endothelzellenadhäsion und -reten- tion auf unbeschichteten, mit Plasmaproteinen beschichteten, erfindungsgemäß beschichteten und mit Polylysin/Glutardialdehyd (ohne RGD) beschichteten PTFE-Gefäßsystemen durchgeführt.

Die Gruppe 1 stellt ein unbeschichtetes PTFE-Gefäßsystem dar. Ein mit Humanfibronektin beschichtetes PTFE-Transplantat wird als Gruppe 2 bezeichnet . Die Vergleichsgruppen 1 und 2 sind nach den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren herge¬ stellt worden.

Gruppe 3 ist ein erfindungsgemäßes vorbeschichtetes Blutgefä߬ system, das wie im Ausführungsbeispiel beschrieben hergestellt

wurde .

Gruppe 4 ist ein vorbeschichtetes Blutgefäßsystem, das gemäß den erfindungsgemäßen Verfahrensschritten a) und b) hergestellt wurde. Eine RGD enthaltende Substanz mit Zelladhäsion ist jedoch nicht vorhanden.

Bei den Versuchen zur Bestimmung der Endothelzellenadhäsion und -retention an den Gefäßinnenwänden vor und nach Perfusion der PTFE-Gefäßsysteme der Gruppe 1, 2, 3 und 4 wurden mit Endothel¬ zellen besiedelt . Am Ende des Besiedlungsvorganges wurden die Transplantate der Gruppen 1, 2, 3 und 4 kurz mit Nährmedium gespült. Anschließend wurde jeweils ein Luer-Verbindungsstück entfernt und ein definiertes Segment einer Länge von 1 cm der Gruppen 1, 2, 3 und 4 für eine Untersuchung im Rasterelektro¬ nenmikroskop (REM) präpariert.

Dann wurden die Luer-Verbindungsstücke ersetzt, und die Trans¬ plantate in einen künstlichen Strömungskreislauf eingesetzt, um den Widerstand gegen Scherspannung sowie die Zellretention einer angelegten Endothelzellensaat auf den PTFE-Oberflächen zu bestimmen (siehe Figur 2) . Ein pulsierender Fluß wurde unter Verwendung einer Walzenpumpe (Medax, Kiel, BRD) eines Kardiotomiebehälters, ausgestattet mit einem Perfusions- mediumfilter und einem Luftblasenfilter (Sorin Biomedica, Saluggia, Italien) und eines extrakorporalen Standard- Perfusionsschlauches (Jostra, Hirrlingen, BRD) in einem ge¬ schlossenen, sterilen System erzeugt. Die mit einer Zellkultur versehenen PTFE-Transplantate, die in einem speziell ent- wickelten Glasrohr eingeschlossen waren, wurden über die vorher eingefügten Luer-Verbindungsstücke in den Kreislauf integriert . Das System wurde mit 500 ml Nährmedium M-199, 10 % Humanserum und Antibiotika gefüllt. Dem Perfusionsmedium wurden keine Endothelzellenwachstumsfaktoren zugegeben und die Temperatur wurde während der Durchführung mittels eines Wasserbades auf 37

O'Cf gehalten. Vor der Verwendung des Systems wurde das ^"

Perfusionsmedium bei 37 "C in einer Atmosphäre von 5 % C0 ₂ /95 % Raumluft inkubiert. Der Druck wurde eingestellt und konstant auf 35 / 5 mm Quecksilber (Hg) gehalten, was 30 Pulsierungen pro Minute ergab. Gemessen wurde der Druck mit einem Membran- meßwandler und einem Druckmonitor (Hewlett Packard, Andover, USA) . Die Geschwindigkeit des Strömungskreislaufs betrug 100 ml/Minute, die eine Stunde lang beibehalten wurde. Nach der Perfusion wurden beide Luer-Verbindungsstücke aus den je¬ weiligen Transplantaten der Gruppen 1, 2, 3 und 4 entfernt, ein bestimmtes Transplantat-Segment herausgeschnitten und für die Rasterelektronenmikroskopie präpariert .

Zur Präparierung der entnommenen Transplantat-Segmente für die Rasterelektronenmikroskopie (REM) wurden folgende Schritte unternommen:

1 cm lange Proben von durchströmten Transplantaten enthaltend die Zellsaat werden mittels Rasterelektronenmikroskopie be¬ züglich ihrer Quantifizierung und Morphologie untersucht.

Gleich nach der Präparierung aus den künstlichen Gefäßsystemen werden die Proben mindestens 4 Stunden lang in 3,5 % Glutar¬ dialdehyd fixiert und mit Phosphatpufferlösung gespült . An¬ schließend erfolgt eine Nachfixierung von 2 Stunden in 2 % Osmiumtetroxid in Pufferlösung. Nach Dehydratisierung mittels verschiedener Ethanollösungen werden die Proben mit flüssigem C0 ₂ bis zu ihrem kritischen Punkt getrocknet, in einem Vakuum¬ verdampfer mit Gold/Palladium sputterbeschichtet und mit einem Rasterelektronenmikroskop (Philips XL 20, Kassel,- BRD) , das bei einer Beschleunigungsspannung von 25 kV betrieben wird, unter¬ sucht.

Ergebnisse der Verσleichsversuche

Eine Zusammenfassung der Ergebnisse der Rasterelektronenmikro¬ skopie ist in den Figuren 3 bis 5 dargestellt.

Die Ergebnisse der Vergleichsversuche für die Gruppen 1, 2 und 3 zeigen, daß die Endothelzelladhäsion und -retention auf er¬ findungsgemäß vorbeschichteten PTFE-Gefäßprothesen nach erfolg¬ ter Besiedlung (Fig. 3a, 4a, 5a) und Perfusion (Fig. 3b, 4b, 5b) in einem künstlichen Strömungskreislauf gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten unbeschichteten und beschich¬ teten PTFE-Gefäßprothesen erheblich gesteigert und verbessert werden.

Zelladhäsion und -retention auf den Transplantaten vor und nach der Perfusion

Gruppe 1: In unbeschichteten PTFE-Gefäßsystemen waren 30 Mi¬ nuten nach der Zellbesiedlung von 1,2 x 10 ⁵ AHSVEC / cm ² 14,9 % ± 3,1 % der Fläche mit Endothelzellen bedeckt. Nach der Per¬ fusion betrug die Endothelzelladhäsion 2,0 % ± 1,0 %. Die Zellretention betrug 13,9 % ± 7,9 % (siehe Figuren 6 und 7) .

Gruppe 2 : Durch die Vorbeschichtung von PTFE-Transplantaten mit Humanfibronektin ergab sich eine Endothelzelladhäsion nach der Endothelzellenbesiedlung von 26,0 % ± 3,3 %. Nach der Perfusion im künstlichen Stromkreislauf betrug die Endothelzelladhäsion 11,8 % ± 1,6 %. Die berechnete Zellretention betrug 45,5 % ± 2,1 %. Sowohl die Endothelzelladhäsion als auch die -retention waren im Vergleich zu Gruppe 1 erheblich höher (siehe Figuren 6 und 7) .

Gruppe 3 : Bei den erfindungsgemäß vorbehandelten PTFE-Gefäß- systemen wurde eine Endothelzelladhäsion von 30,6 % ± 2,1 % beobachtet. Die Perfusion der PTFE-Transplantate führte zu einer Endothelzelladhäsion von 19,3 % ± 2,8 %. Die Endothel- zellretention betrug 62,9 % + 7,5 %. Im Vergleich zu Gruppe 1 und Gruppe 2 (siehe Figuren 6 und 7) ergab sich somit eine weitere erhebliche Steigerung der Endothelzelladhäsion und -re- tention. Primär ist dieses bessere Ergebnis auf die erfindungs¬ gemäße Vorbeschichtungstechnik zurückzuführen. In dem von Sank'

et al . durchgeführten Verfahren werden die RGD-Peptide ohn Vorbeschichtung direkt auf das PTFE-Material aufgebracht. Wei¬ tere untergeordnete Unterschiede bestehen darin, daß Sank e al. ein anderes RGD-Peptid in einer geringeren Konzentratio unter Verwendung von PTFE-Patch anstatt Rohrprothesen einge¬ setzt haben. Die geringere Peptidkonzentration und die Ver¬ wendung eines PTFE-Patch führen auch zu dem von Sank et al. festgestellten Ergebnis, daß eine Endothelzellenadhäsion au RGD-Piptid beschichtetem PTFE geringfügig niedriger ist, al auf Fibronektin-beschichtetem PTFE. Die Ergebnisse bezüglic der Zelladhäsion der Gruppe 1 und 2 der beschriebenen Ver¬ gleichsversuche stehen im Gegensatz dazu.

Gruppe 4 : Durch die Vorbeschichtung von PTFE-Transplantate gemäß den erfindungsgemäßen Verfahrensschritten mi Polylysin/Glutardialdehyd (eine RGD enthaltende Substanz mi Zelladhäsion ist jedoch nicht vorhanden) ergab sich ein Endothelzelladhäsion nach der Endothelzellenbesiedlung von 10,5 % ± 1,1 % . Nach der Perfusion im künstlichen Strom- kreislauf betrug die Endothelzelladhäsion 0,7 % ± 0,2 %. Di berechnete Zellretention betrug 6,6 % ± 1,5 %. Sowohl di Endothelzelladhäsion als auch die -retention waren im Vergleic zu Gruppe 3 erheblich niedriger (siehe Figuren 6 und 7) .

Die verbesserten Ergebnisse bezüglich der Zelladhäsion un Zellretention der erfindungsgemäßen künstlichen Gefäßsystem sind auf das Vorbeschichtungsverfahren der Erfindung zurückzu¬ führen. In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden zwei Zwi schenschritte angewandt, um die zelladhäsionsfordernde Substan mit der Innenwand der Gefäßsystemoberfläche zu verbinden. Die führt zu einer starken biochemischen Bindung der adhäsions fördernden Substanz mit dem Transplantat und einer erhöhte Widerstandsfähigkeit gegenüber Scherspannung. Die adhäsionsfor dernde Substanz wird über die noch verfügbare Aldehydgruppe de zweiten Komponente an die künstlichen Innenwände gebunden. Pro teine und Peptide mit mindestens einer RGD-Sequenz werde

beispielsweise über primäre Aminogruppen an die zweite Be- schichtungskomponente gebunden.

Der Vergleich der Gruppen 1, 2, 3 und 4 zeigt, daß die Gruppe 3, die den erfindungsgemäßen künstlichen Blutgefäßsystemen ent¬ spricht, eine höhere Widerstandsfähigkeit gegenüber Scherspan¬ nung aufweist . Diese erhöhte Widerstandsfähigkeit wurde anhand des Ausmaßes der Endothelzelladhäsion und -retention nach der Perfusion in dem künstlichen Stromkreislauf ermittelt. Während auf den mit RGD-Peptid-beschichteten erfindungsgemäßen Tran¬ splantaten 19,3 % ± 2,8 % Endothelzelladhäsion nach der Perfu¬ sion festgestellt wurde, betrug diese bei Fibronektin-beschich- teten Transplantaten nur 11,8 % ± 1,6 %. Auf unbeschichteten Transplantaten betrug die Endothelzelladhäsion nach der Perfu- sion 2,0 % ± 1,0 %. Auf mit ausschließlich mit Polylysin/- Glutardialdehyd beschichteten Transplantaten betrug die Endo¬ thelzelladhäsion nach der Perfusion lediglich 0,7 % ± 0,2 %.

Bei unbeschichteten Transplantaten waren nach einer einstün- digen Scherspannung nur noch 13,9 % ± 7,9 % der ursprünglich anhaftenden Endothelzellen vorhanden. Auf Fibronektin-beschich- teten Transplantaten wurde eine Endothelzellretention von 45,5 % ± 2,1 % gemessen. Auf mit ausschließlich mit Polylysin/- Glutardialdehyd beschichteten Transplantaten betrug die Endo- thelzellretention 6,6 % + 1,5 %. Die bei weitem höchste Endo¬ thelzellretention von 62,9 % ± 7,5 % zeigte sich wiederum bei PTFE-Transplantaten, die erfindungsgemäß vorbeschichtet waren.

Gegenüber dem Stand der Technik ist die Zelladhäsion und -re- tention von Endothelzellen auf erfindungsgemäß beschichteten Gefäßsystemen erheblich erhöht. Die erfindungsgemäßen beschich¬ teten Gefäßsysteme verringern bzw. vermeiden aufgrund ihrer verbesserten metabolischen Eigenschaften Störungen und Neben¬ effekte, die beispielsweise durch Kontakt des zirkulierenden BlutStromes mit dem Kunststoffmaterial entstehen. Die gegenüber dem Stand der Technik verbesserten metabolischen Eigenschaften

sind auf eine erhöhte Dichte der biologisch aktiven Substanzen, die die Zelladhäsion fördern, zurückzuführen. Die erfinderi¬ schen Gefäßsysteme ersetzen insbesondere in der Herz- und Gefäßchirurgie die natürlichen Gefäße im Herz- und Kreislauf- System.

Beschreibung der Figuren

Figur 1 : Schematische Darstellung biochemischer Reaktionen im erfindungsgemäßen Verfahren. Glutardialdehyd bindet sich über Aldehydfunktionen an die primäre Aminogruppe von Polylysin, mit welchem das PTFE-Material vorbeschichtet ist (a) . Die verfügba¬ ren Aldehydfunktionen des derivatisierten Polylysin können pri¬ märe Aminogruppen der synthetischen, adhäsionsfordernden RGD- Peptide (b) binden. Endothelzellen interagieren durch die Inte- grinfamilie von Zeil-Matrix-Rezeptoren mit der an die Innenwand des Gefäßsystems gebundenen RGD-Sequenz und haften an dem PTFE- Transplantat (c) an.

Figur 2 : Schematische Darstellung des künstlichen Stromkreis¬ laufs. Kardiotomiebehälter (1) mit Luftblasenfilter (2), Per- fusionsmediumfilter (3) , Wasserbad (4) , extrakorporalem Per¬ fusionsschlauch (5) , Membranmeßwandler (6) , Druck- und Tempe¬ raturmonitor (7) , Glasrohr, welches das Transplantat um- schließt, mit Ein- und Auslaß für das umgebende Medium (8) , mit Zellen besiedeltes PTFE-Transplantat (9) , Temperaturmeßwandler (10) , Walzenpumpe (11) , Durchströmungsnährmedium (12) , Einlaß für C0 ₂ -Einstellung (13) , Einlaß für Nährmedium (14) . Die Pfeile zeigen in die Flußrichtung.

Figur 3 : Rasterelektronenmikrographie eines unbeschichteten PTFE-Transplantats nach einer 30-minütigen Endothelzellenbe- siedlung (1,2 x 10 ⁵ EC/cm ² ) (Fig. 3 a) und nach einer einstün¬ digen Perfusion in einem Strömungskreislauf (100 ml/Min.) (Fig. 3 b) . Ursprüngliche Vergrößerung x 618.

Figur 4 : Rasterelektronenmikrographie eines mit Fibronektin-be- schichteten PTFE-Transplantats nach 30 Minuten Endothelzellen¬ besiedlung (1,2 x 10 ⁵ EC/cm ² ) (Fig. 4 a) und nach einer ein¬ stündigen Perfusion in dem Strömungskreislauf (100 ml/Min.) (Fig. 4 b) . Ursprüngliche Vergrößerung x 618.

Figur 5 : Rasterelektronenmikrographie eines PTFE-Transplantats, das mit adhäsionsforderndem RGD-Peptid beschichtet ist, 30 Mi¬ nuten nach Endothelzellenbesiedlung (1,2 x 10 ⁵ EC/cm ² ) (Fig. 5 a) und nach einer Stunde Perfusion in dem Strömungskreislauf (100 ml/Min.) (Fig. 5 b) . Ursprüngliche Vergrößerung x 618.

Figur 6 : Vergleich der Endothelzelladhäsion auf unbeschich¬ teten, mit Fibronektin (HFN) beschichteten, mit Polylysin/- Glutardialdehyd (PL/GA; ohne RGD) und mit adhäsionsforderndem

RGD-Peptid (RGD) beschichteten PTFE-Transplantaten. Die mit EC bedeckte Fläche (%) 30 Minuten nach Endothelzellenbesiedlung

(1,2 x 10 ⁵ EC/cm ² ) und nach Perfusion in einem Flußkreislauf

(100 ml/Min.) . Berechnete Standardabweichung in Klammern.

Figur 7: Vergleich der EC-Retention (adhärente Zellen nach Per¬ fusion / ursprüngliche adhärente Zellen nach der Besiedlung) auf unbeschichteten, mit Fibronektin (HFN) beschichteten, mit Polylysin/Glutardialdehyd (PL/GA; ohne RGD) und mit adhäsions- förderndem RGD-Peptid (RGD) beschichteten PTFE-Transplantaten. Berechnete Standardabweichung in Klammern.