Singh, S. B. et al. (J. Org. Chem., 1995, 60, 7040) isolierten die Verbindung Oteromycin (1) aus nicht identifizierten Pilzen : Die Verbindung zeigt Endothelin-antagonistische Wirkungen.

R. R. West et al. (J. Antibiot. 1996, 49, 10, 967) beschreiben die Verbindung ZG-1494a, die aus Penicilium rubrum gewonnen wird : Die Verbindung ist wirksam als Thrombozyten-Aktivierungsfaktor-Acetyl- transferase-Inhibitor.

C. Wegner et al. (2000 Years of Natural Products Research-Past, Present and Future ; Amsterdam, NL/30. 07. 99 ; Posterbeitrag) beschrieben Verbindungen der Formeln wobei die Reste R nicht beschrieben wurden. Die Verbindungen wurden aus einem Pilz der Gattung Ascochyta salicorniae isoliert. Die antibakterielle, antifungale und antiplasmodiale Wirksamkeit der nicht näher bestimmten Verbindungen wurde teil- weise untersucht.

Die GB-A 23 06 476 sowie JACS 111 (1989), 8223 offenbaren die Verbindungen Equisetin und deren antivirale Wirkung : US-A 5759842 offenbart Phomasetin der folgenden Formel

und deren antivirale Wirkung.

Equisetin wird dabei aus einem Pilz der Gattung Fusarium (Fusarium equiseti) gewonnen. Phomasetin wird aus einem Pilz der Gattung Phoma gewonnen.

Den Erfindern der vorliegenden Erfindung gelang es, neue Naturstoffe aus einem Pilz der Gattung Ascochyta zu gewinnen, die antibakteriell wirksam sind.

Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel (I) worin Rl ausgewählt wird aus der Gruppe der Formeln R, R und R :

und R2(C1-C6) Alkyl ist, sowie pharmazeutisch verträgliche Salze davon.

Bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I'), worin Rl ausgewählt wird aus Gruppen der Formel R11', R12 und R13

und R2 (C1-C6) Alkyl ist. sowie pharmazeutisch verträgliche Salze davon.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) können in stereoisomeren Formen, die sich entweder wie Bild und Spiegelbild (Enantiomere), oder die sich nicht wie Bild und Spiegelbild (Diastereomere) verhalten, existieren. Die Erfindung betrifft sowohl die Enantiomeren oder Diastereomeren oder deren jeweilige Mischungen. Die Racemformen lassen sich ebenso wie die Diastereomeren in be- kannter Weise in die stereoisomer einheitlichen Bestandteile trennen. Gegebenenfalls lassen sich die Isomere durch an sich bekannte Verfahren ineinander überführen. Ferner können die Verbindungen in tautomeren Formen vorliegen und auch diese sind im Umfang der Erfindung enthalten.

Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen können Salze der erfindungsgemäßen Stoffe mit Mineralsäuren, Carbonsäuren oder Sulfon- säuren sein. Besonders bevorzugt sind z. B. Salze mit Chlorwasserstoffsäure, Brom- wasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfon- säure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure oder Benzoesäure.

Als Salze können Salze mit üblichen Basen genannt werden, wie beispielsweise Alkalimetallsalze (z. B. Natrium-oder Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z. B. Calcium- oder Magnesiumsalze) oder Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organi- schen Aminen wie beispielsweise Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Prokain, Dibenzylamin, N-Methylmorpholin, Dihydroabietylamin, 1-Ephenamin oder Methyl-piperidin.

(Cl-C6)-Alkyl steht für einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen (Cl-C4). Beispielsweise seien genannt : Methyl, Ethyl, n- Propyl, Isopropyl, n-Butyl, tert. Butyl, n-Pentyl und n-Hexyl. Besonders bevorzugt ist ein geradkettiger Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ((Cl-C4) Alkyl).

Die Verbindung, worin R2 = n-Butyl und Ri eine Gruppe der Formel R bzw. R ist, wird im folgenden als Verbindung (1) oder Ascosalipyrrolon A bezeichnet.

Die Verbindung, worin R2 = Methyl und R eine Gruppe der Formel R bzw. R 1' ist, wird im folgenden als Verbindung (2) oder Ascosalipyrrolon B bezeichnet.

Bei den Resten R1 erfolgt die Bindung an den Pyrrolonteil an dem mit dem Pfeil ge- kennzeichneten Bindungsstrich wie im folgenden veranschaulichend gezeigt :

In der Formel (1') mit ihren Resten R, R und R sind jeweils die relativen Konfigurationen gezeigt, die aus Resultaten von NOE Differenzmessungen abgeleitet werden können.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel (I) bzw. (I') nach Anspruch 1, worin R1 bzw. R1 die Gruppe der Formel R1 1 bzw. R1 1 ist, das die Fermentation eines Mikroorganismus der Gattung Ascochyta, die Isolierung der Verbindung aus der Kulturbrühe und gegebenenfalls die Umacetalisierung mit einem Alkohol der Formel R2-OH umfasst.

Bevorzugt wird das Verfahren mit dem Mikroorganismus Ascochyta sp. DSM 13086 durchgeführt.

Dieser Stamm wurde aus Algenmaterial, das aus der Nordsee bei Tönning in Deutschland gesammelt wurde, isoliert. Nach einer Sterilisation der Oberfläche mit 70 % igem Ethanol wurde das Algenmaterial mit sterilem Wasser gewaschen, in kleine Stücke geschnitten und dann auf Agarplatten mit Isolationsmedium (30 g/L zerkleinerte Ulva sp., 15 g/L Agar und 1000 mL Meerwasser, vom Sammelplatz der Alge entnommen ; nach dem Autoklavieren wurden die Antibiotika Benzylpenicillin und Streptomycinsulfat durch Sterilfiltration hinzugefiigt) ausgelegt. Pilzkolonien, die aus dem Algengewebe gewachsen sind, wurden auf ein Sporulationsmedium (1. 0 g Glucose, 0. 1 g Hefeextrakt, 0. 5 g Fleischpepton, enzymatisch aufgeschlossen, 15 g Agar und 1000 mL Meerwasser, pH 8) abgeimpft, um eine taxonomische Bestimmung des Isolates vornehmen zu können. Die Kultur bildet nach 12 Tagen Inkubation auf YM-Festmedien (D-Glucose 4 %, Malzextrakt 1 %, Hefeextrakt 0, 4 %, Difco Noble agar 1, 5 % ; pH 6. 3) charakteristische, braune, kugelförmige Pyknidien aus, die nach (Sutton, B. C. The coelomycetes. fungi Imperfecti with Pycnidia, Acervuli and Stromata. commonwealth Mycological Institute Kew, Surrey, England 1980, p. 408) die typischen Merkmale der Formgattung Ascochyta Lib.

1830 aufweisen.

Der Stamm ist hinterlegt unter der Zugangsnummern DSM 13086 (das Hinter- legungsdatum ist der 13. 10. 1999) unter dem Budapester Vertrag bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Deutschland.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin der neue Stamm Ascochyta sp. DSM 13086.

Es ist darauf hinzuweisen, dass die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbin- dungen, insbesondere der Verbindung (1) oder der Verbindung (2), nicht auf die Verwendung dieses besonderen Stammes beschränkt ist. Dieser ist hier nur für die

Zwecke der Veranschaulichung gegeben. Diese Erfindung schließt auch die Ver- wendung beliebiger Mutanten ein, die fähig sind, beispielsweise die Verbindungen (1) oder (2) zu erzeugen, einschließlich natürlicher Mutanten und künstlicher Mutanten, die in an sich bekannter Weise aus den genannten Mikroorganismen durch konventionelle Mittel erhalten werden können wie z. B. durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlung, Ultraviolettstrahlung, die Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro- N-nitrosoguanidin, 2-Aminopurin und ähnlichen oder durch Methoden der Gen- technologie.

Für die Zucht der Ascochyta sp. DSM 13086 und daher für die Herstellung der Verbindung (1) oder (2) können alle übliche Kulturverfahren angewendet werden, die zur Erzeugung einer ausreichenden Biomasse führen.

Im allgemeinen erfolgt das Animpfen von Ascochyta sp. DSM 13086 und die Fermentation zu den Verbindungen (1) bzw. (2) unabhängig von der Art der verwen- deten Behälter, Fermentatoren und Startbedingungen.

Die Fermentation des Pilzes verläuft erfolgreich bei 20°C in Festkultur über 40 Tage.

Das Medium nach Höller et al. (Höller, U., König, G. M., Wright, A. D. J. Nat. Prod.

1999, 62, 114-118) enthält 20 g/L Biomalzextrakt, 8 g/L Agar und 80% synthe- tisches Seewasser.

Auch andere Kulturmedien wie MGP und BAF-Medium [Stadler, M. Dissertation Universität Kaiserslautern, Deutschland, 1993] Hafermehl-Medium, Kartoffel- Dextrose-Nährlösung, CMG-Nährlösung und Maismehl-Medium [die Zusammen- setzung letztgenannter Kulturmedien sind z. B. angegeben im ATCC Media Handbook, American Type Culture Collection Rockville Md. USA 1984] sind ge- eignet, um die Verbindung (1) bzw. (2) zu erhalten. Hinsichtlich der bevorzugten Fermentationsbedingungen und Medien sei auf Beispiel 1 verwiesen.

Aus den Verbindungen der Formel (1) und (2) können in an sich bekannter Weise die übrigen Verbindungen der Formel (1) bzw. (1') hergestellt werden, in denen R2 nicht Methyl oder n-Butyl ist, durch Umsetzen mit einem Überschuss der entsprechenden Alkohole, bevorzugt im sauren Medium, wobei die Alkohole bevorzugt als Lösungs- mittel dienen. Die Verbindungen können zweckmäßig nach der Umsetzung durch HPLC isoliert werden.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) bzw. (I'), worin R bzw. R1 R12 bzw. R12' oder R13 bzw. R13 ist, das die katalytische Hydrierung der Verbindungen der Formel (I) bzw. (I'), worin RI bzw. R R11 bzw. R11 ist, umfasst.

Zweckmäßig wird dabei in an sich bekannter Weise unter Verwendung von Pd/C (10 %) als Katalysator hydriert. Dabei fallen hauptsächlich die vollständig hydrierten Derivate, entsprechend R bzw. R an. Die partiell hydrierten Derivate, entspre- chend R bzw. R, fallen als Nebenprodukt an. Die Verbindungen können durch HPLC isoliert werden.

Die Assays für die antibiotische Wirkung der Fermentationsextrakte im Medium nach Höller et al. (Höller, U., König, G. M., Wright, A. D. J Nat. Prod. 1999, 62, 114-118) zeigten, dass bei diesen Bedingungen Antibiotika mit starker antibakterieller Wirkung gebildet werden, und die HPLC-Analyse belegte, dass ein charakteristischer Metabolit des Pilzes, der der Verbindung (1) der Formel (I) bzw.

(I'), worin R1 bzw. R1 R11 bzw. R11' ist und R2 = n-Butyl ist, entsprach, in großen Mengen produziert wurde, während ein zweiter Metabolit entsprechend der Verbindung (2) der Formel (I) bzw. (I'), worin R1 bzw. R1 R11 bzw. R11' ist und R2 = Methyl ist, nur in geringen Mengen gebildet wurde. Beide neuen Metabolite, Verbindung (1) bzw. (2) wurden aus den bioaktiven Extrakten mit Hilfe der HPLC isoliert.

Die molekulare Formel der Verbindung (1), entsprechend der Verbindung der Formel (I) bzw. (I'), worin R1 bzw. R1 R11 bzw. R11 ist und R2 = n-Butyl ist, wurde durch Hochauflösung des ESI-MS als C27H41NO3 bestimmt.

Das 13C NMR Spektrum enthält 27 Signale (vgl. Tabelle 1). Durch Interpretation der spektroskopischen 1 3C NMR Versuche ('H entkoppelt sowie DEPT) war es offen- sichtlich, dass fünf der acht Doppelbindungsäquivalente, die sich durch die Molekül- formel von 1 ergaben, den drei Doppelbindungen 8 155. 8 (d, C-20), 137. 0 (s, C-19), 132. 4 (s, C-2), 128. 6 (d, C-1), 135. 2 (s, C-14), 122. 7 (d, C-15) zugeordnet werden konnten sowie zwei den Doppelbindungen der Carbonylgruppen b 201. 9 (s, C-18), 167. 5 (s, C-23). Da dies die einzigen Doppelbindungen des Moleküls sind, resultiert ein trizyklisches Molekül. Weiteres Auswerten der'H und 13C NMR Spektren zeigte weiterhin die Präsenz von fünf Methylengruppen, eine in direkter Nachbarschaft zu Sauerstoff (C-24), sechs tertiäre Kohlenstoffatome, davon zwei in direkter Nach- barschaft zu Methylgruppen 8 0. 67, H3-12 ; 0. 91, H3-11, fünf weitere Methylgruppen 8 1. 57, H3-28 ; 1. 42, H3-13 ; 0. 89, H3-27 ; 1. 42, H3-16 ; 1. 47, H3-17, sowie ein quartäres Kohlenstoffatom in Nachbarschaft zu Sauerstoff und Stickstoff 8 87. 1, (C-21). Aus dem'H-'H-COSY Spektrum konnten Fragmente von 1 entschlüsselt werden. Demnach wurden'H-'H Kopplungen zwischen H3-12 und H-6, zwischen H- 6 und H2-7, zwischen H2-7 und H-8, zwischen H-8 und H2-9, zwischen H2-9 und H- 10, zwischen H-10 und H-1, zwischen H-10 und H-5, zwischen H-5 und H-4, zwischen H-4 und H-3 sowie zwischen H-8 und H3-11 beobachtet. Crosspeaks zwischen den Resonanzen von H-15 und H3-16 zeigten das Koppeln der Protonen an.

Weiterhin konnten'H-'H long-range Kopplungen zwischen H-1 und H3-13, H-1 und H-3, H-3 und H3-17 sowie zwischen H-15 und H3-16 bestimmt werden. Zusätzliche 'H-'H Kopplungen lagen zwischen dem Proton, das an Stickstoff gebunden ist (H-22) und H-20, zwischen H2-24 und H2-25, H2-25 und H2-26, sowie H2-26 und H2-27 vor. Diese Fragmente konnten zur Struktur von 1 durch Crosspeaks aus dem lH-l3C HMBC Spektrum miteinander verbunden werden. Demnach sind diagnostisch wichtige long-range Korrelationen von der Resonanz von H3-12 zu der von C-5, C-6 und C-7 beobachtet worden, so dass auf einen 10-gliedrigen Ring geschlossen

werden konnte. HMBC Korrelationen zwischen der Resonanz von H3-13 und denen von C-1, C-2 und C-3 klärte die Position von CH3-13 an C-2 eindeutig. Long-range Korrelationen von der Resonanz von H3-17 zu denen von C-3, C-14 und C-15 plaziert die 2-Butyl Einheit an C-3. Dies wurde zusätzlich durch heteronukleare lH- '3C Korrelationen bestätigt, die zwischen den Resonanzen von H-20 und den Resonanzen von C-18, C-19, C-21, C-23, und C-28, sowie von der Resonanz des NH Protons (N-22) zu allen Kohlenstoffatomen des Dihydropyrrolon-Ringsystems beobachtet werden konnte, dies waren C-19, C-20, C-21 und C-23. Weiterhin wurde diese Strukturaufklärung durch'H-13C long-range Kopplungen zwischen den Resonanzen von H3-28 und C-19, C-20, C-21 sowie C-24 bestätigt. Die Verbindung zwischen der Butoxylgruppe und C-21 war durch die'H-13C HMBC Korrelation zwischen der Resonanz von H-24 und der von C-21 offensichtlich. Die fehlenden Verbindungen zwischen C-4, C-18 und C-19, ergaben sich als logische Schlussfolgerung. Die relative Stereochemie von 1 wurde mit Hilfe der Ergebnisse von NOE Differenzmessungen aufgeklärt. Demnach verursachte ein Einstrahlen bei der Resonanzfrequenz von H-5 eine Vergrößerung der Resonanz von H-10 sowie umgekehrt, welches eine cis-Verknüpfung des Decalins anzeigt. Weiterhin wurde dabei eine Vergrößerung der Resonanz von H-3 beobachtet, die beweist, dass H-3 eine (3-Position hat sowie die 2-Butyl Einheit eine a-Position. H-4 ist ebenfalls in einer ß-Position, da ein NOE zwischen H-4 und H-10 beobachtet werden konnte.

Dies wird auch durch eine Vergrößerung der Resonanz von H-20 bestätigt, die durch Einstrahlen bei H-15 verursacht wird-dies ist nur möglich, wenn beide Einheiten auf der gleichen Seite liegen. Eine Einstrahlung bei der Resonanzfrequenz von H-3 verursachte eine Vergrößerung der Resonanz von H-15 sowie umgekehrt, wodurch eine E-Konfiguration der Doppelbindung zwischen C-14 und C-15 in der Seitenkette an C-3 entsteht. Eine Vergrößerung der Resonanz von H-3 resultierte ebenfalls durch ein Einstrahlen der Resonanzfrequenz von H-10. Ein Einstrahlen bei der Resonanz- frequenz von H-10 verursachte gleichfalls eine Vergrößerung der Resonanz von H-6.

Dadurch wurde gezeigt, dass H-3, H-5, H-6 und H-10 auf der gleichen Seite stehen sowie, dass H-6 axial ist und in (3-Position steht. Schließlich wurde die a-Position von H3-11 durch NOE Korrelation zwischen H-8 und H-10 bestimmt. Die Konfigura-

tion an C-21 bleibt unbestimmt, da sie nicht in Beziehung zu den anderen chiralen Zentren im Molekül gesetzt werden konnte Die relative Konfiguration der chiralen Kohlenstoffatome ist demnach 3R*, 4S*, 5S*, 6S*, 8R*, 10R*. Die Verbindung (1) ist der neue Naturstoff 3- [1, 2, 4a, 5, 6, 7, 8, 8a-octahydro-3, 6, 8-trimethyl-2- [ (-1-methyl- 1-propyl] 1-naphtyl] carbonyl-5-butoxy-1, 5-dihydro-5-methyl-2H-pyrrol-2-on.

Die molekulare Formel der Verbindung (2), entsprechend der Verbindung der Formel (1) bzw. (I'), worin R1 bzw. R1 R11 bzw. R11 ist und R2 Methyl ist, wurde durch vergleichende Analyse der'H-NMR-Daten mit denen von Verbindung (1) abgeleitet (vgl. Tabelle 1). Der einzige Unterschied zwischen den beiden Datensätzen zeigt sich in der Abwesenheit des Resonanzsignals von H2-24, H2-25, H2-26 und H3-27 (0-Butyl Einheit), stattdessen ist für die Verbindung (2) das Resonanzsignal einer Methoxygruppe vorhanden (b 3. 1, 3H, s). Dieser Strukturvorschlag wurde durch HR EIMS-, IR-und UV-Messungen bekräftigt. Das Molekül ist demnach am besten als 3- [1, 2, 4a, 5, 6, 7, 8, 8a-octahydro-3, 6, 8-trimethyl-2- [ (E)-1-methyl-1-propyl] l- naphtyl] carbonyl-1, 5-dihydro-5-methoxy 5-methyl-2H-pyrrol-2-on beschrieben.

Die Bestimmung der molekulare Masse zu C24H35NO3 mittels hochauflösender Massenspektrometrie bestätigt die abgeleitete Struktur.

Die Verbindungen der Formel (I) zeigen antibakterielle Wirksamkeit. Im Agar- diffusionstest [Zähner, H. Biologie der Antibiotika, Springer Verlag Heidelberg, 1965) zeigten 50 ug der Verbindung (1) einen Hemmhof gegen Bacillus megaterium von 5 mm. Sie sind daher auch geeignet für die Herstellung von Arzneimitteln zur Bekämpfung bakterieller Infektionen bei Menschen oder Tieren. Beispiele von pathogenen Bakterien, gegen die sie wirksam sind, sind z. B. Staphylokokken, Streptokokken, Enterokokken und Pneumokokken.

Der MHK-Werte (pg/ml) wurden unter Verwendung des Agar-Verdünnungstests auf Iso-Sensitest-Agar (Oxoid) bestimmt. Es wurden 104-105 Bakterien pro Inokula- tionspunkt inokuliert. Nach der Inokulation durch einen Denley-Inokulator wurden

die Agar-Platten für ungefähr 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Als MHK-Wert wurde die niedrigste Konzentration genommen, bei der das Wachstum der Bakterien als Kolonie vollständig inhibiert wurde. Der MHK-Wert der Verbindung (1), d. h.

Ascosalipyrrolon (1) gegen Staphylococcus aureus 133 wurde zu 12, 5 llg/ml be- stimmt.

Darüber hinaus wird erwartet, dass die Verbindungen der Formel (I) über anti- plasmodiale, antifungale, insektizide, antivirale und cytostatische Wirksamkeit ver- fügen.

Zur vorliegenden Erfindung gehören pharmazeutische Zubereitungen, die neben nicht-toxischen, inerten, pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen eine oder mehrere erfindungsgemäße Verbindungen enthalten, oder die aus einem oder mehreren erfindungsgemäßen Wirkstoffen bestehen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zubereitungen.

Der oder die Wirkstoffe können gegebenenfalls in einem oder mehreren der oben angegebenen Trägerstoffe auch in mikroverkapselter Form vorliegen.

Die therapeutisch wirksamen Verbindungen sollen in den oben aufgeführten pharma- zeutischen Zubereitungen vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0, 1 bis 99, 5, vorzugsweise von etwa 0, 5 bis 95 Gew.-% der Gesamtmischung, vorhanden sein.

Die oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können außer den erfin- dungsgemäßen Verbindungen auch weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten.

Im allgemeinen hat es sich sowohl in der Human-als auch in der Veterinärmedizin als vorteilhaft erwiesen, den oder die erfindungsgemäßen Wirkstoffe in Gesamt- mengen von etwa 0, 5 bis etwa 500, vorzugsweise 5 bis 100 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden, gegebenenfalls in Form mehrerer Einzelgaben, zur Erzielung der ge- wünschen Ergebnisse zu verabreichen. Eine Einzelgabe enthält den oder die erfin-

dungsgemäßen Wirkstoffe vorzugsweise in Mengen von etwa 1 bis etwa 80, insbe- sondere 3 bis 30 mg/kg, Körpergewicht.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zum Zweck der Erweiterung des Wirkungsspektrums und um eine Wirkungssteigerung zu erreichen, auch mit anderen Antibiotika kombiniert werden.

Beispiele Beispiel 1 (Verbindung (1) oder Ascosalipyrrolon A, Verbindung (2) oder Ascosalipyrrolon B) H n . 22NO 21 23 21 t° 19 25 2 8 17 ; 12 18 17 1 6 3 14 H H 15 16 11 , 8 9 H 2 13 Ascosalipyrrolon A (Verbindung (1)) H N 21 23 24 O/19 0 20 19 12 IS 6 H 4 6 : 4 H H 15 16 12 18 17 Ascosalipyrrolon B (Verbindung (2)) a) Fermentation Der Stamm DSM 13086 wurde als Standkultur kultiviert. Das Medium enthielt 20 g/1 Biomalt Kraftnahrung, (Villa Natura, Gesundprodukte GmbH, D-55606 Kirn), 8 g/1

Agar und 80 % synthetisches Meerwasser wie bei Höller et al (Höller, U., König, G. M., Wright, A. D. J. Nat. Prod. 1999, 62, 114-118) beschrieben.

Sterilisation bei 121°C für 20 Minuten, pH-Wert wurde nicht eingestellt.

Die Fermentation wurde unter Verwendung von 8 Fernbach-und 12 Penicillinkolben durchgeführt, die 250 bzw. 500 ml des o. g. Mediums enthielten, das mit einer Suspension von Ascochyta sp. (eine Impföse auf ca. 5 ml autoklaviertes Wasser) Kultur inokuliert wurde.

Die Fermentation wurde bei einer Inkubationstemperatur von 20°C als Standkultur 40 Tage durchgeführt. Das Myzel wurde vom Kultur-Agar mechanisch abgetrennt und anschließend wie unten (Beispiel 2) beschrieben extrahiert. b) Extraktion, Anreicherung und Isolierung Die Verbindungen (1) und (2) wurden aus dem vereinigten feuchten Myzel von 8 Fernbach-und 12 Penicillinkolben, das wie zuvor unter a) beschrieben hergestellt worden war, isoliert. Das feuchte Myzel wurde mechanisch von dem Kulturagar ab- getrennt und zunächst mit Methanol (6. 5 L) und anschließend mit EtOAc (Ethylacetat, 6. 5 L) extrahiert, nachdem es mit einem Ultra Turrax T 25 bei 8000 U/min-1 mechanisch aufgeschlossen worden war. Das Kulturmedium wurde zu- nächst mit 24 L EtOAc und anschließend mit 24 L n-Butanol extrahiert, nachdem es mit H20 verdünnt und mit dem Ultra Turrax T 25 gemixt worden ist. Der resul- tierende EtOAc Extrakt (11. 4 g) wurde mit einer Kombination chromatographischer Techniken aufgetrennt. Zunächst wurde eine Grobauftrennung durch das Aufgeben auf eine Kieselgelsäule erzielt (vacuum liquid chromatography, VLC), bei der ein Elutionsgradient von CH2CI2 (Dichlormethan) über EtOAc zu MeOH (Methanol) benutzt wurde. Es wurden 17 Fraktion von je ca. 250 mL erhalten. Fraktion 4 (85 mg, eluiert mit EtOAc/CH2Cl2 1 : 9), in der sich die antimikrobielle Aktivität konzentrierte, wurde einer weiteren Auftrennung mit einer Kieselgelsäule unter-

worfen, bei der ein isokratisches Eluentengemisch von EtOAc/MeOH 95 : 5 benutzt wurde, durch das 115 Fraktionen erhalten wurden. Fraktionen 4-6 davon wurden nach TLC (Dünnschichtchromatographie) Untersuchung vereinigt (32 mg) und ergaben nach einem weiteren Aufreinigungsschritt mit RP-18 HPLC (Spherisorb SOD S2 5um, 8 mmx25 cm) und einem Eluenten von Acetonitril/Wasser 85 : 15 die Substanzen 1 (8. 7 mg, 1. 1 mg/L) und 2 (0. 8 mg, 0. 1 mg/L).

Physikalische Daten der Verbindung (1) : Verbindung (1) wurde als farbloses amorphes Pulver erhalten ; [a] 2°D=-51. 3° (c=0. 16, EtOH) ; UV (EtOH) (log c) 211 (4. 1), 225 sh (3. 89), 267 (3. 08) ; IR (Film) vmax 3300, 1710, 1630 cm ; EIMS m/z 427 [M+] (88), 409 (26), 392 (44), 354 (72), 239 (54), 231 (60), 201 (88), 175 (44), 159 (72), 135 (54), 124 (100), 105 (92), 91 (66), 69 (58), 55 (80) ; HREIMS m/z 427. 309 (ber. : C27H41NO3 427. 309).

'H und 13c NMR : s. Tabelle 1 sowie Abb. 1 HPLC : Rt = 17. 0 min [Säulenmaterial : RP-18 HPLC (Spherisorb SOD S2 5um, 8 mmx25 cm), Laufmittel A : Acetonitril 85 T, Laufmittel B : Wasser 15 T ; isokratisches Gemisch ; Fluss, 3. 5 ml/min ; Detektion mit RI-Detektor] Physikalische Daten der Verbindung (2) : Verbindung (2) wurde als farbloses Pulver erhalten ; OD=-O. O. (c=0. 05, EtOH) ; UV (EtOH) BmaX (log E) 207 (4. 38), 225 (4. 08), 273 (3. 24) ; IR (Film) v, aux 3580, 1725, 1605 cm ; EIMS m/z 385 [M+], 352 (40), 336 (32), 293 (36), 239 (38), 231 (45), 201 (52), 175 (28), 159 (36), 149 (100), 124 (46), 109 (42), 71 (44), 57 (58) ; HREIMS m/z 385. 261 (berechnet für C24H5NO3 385. 261).

'H und 13C NMR : s. Tabelle 1 HPLC : Rt= 10. 2 min [Säulenmaterial : RP-18 HPLC (Spherisorb SOD S2 5um, 8 mmx25 cm), Laufmittel A : Acetonitril 85 T, Laufmittel B : Wasser 15 T ; isokratisches Gemisch ; Fluss, 3. 5 ml/min ; Detektion mit RI-Detektor]

Tabelle 1 : 1H-(600 MHz, CDC13) und'3C (150 MHz, CDCl3) NMR-Daten der Verbindung (1) sowie 1H NMR Daten (200 MHz, CDCl3) für Verbindung (2).

Position. 8 C von 1 C-Typ"8 H von 1 8 H von 2 HMBCb von 1 NOEC von 1 1 128. 6 CH 5. 58 (d, 5. 57 (d) 3, 5, 10, 13 9, 10 J=6. 1 Hz) 2 132. 4 C---- 3 57. 5 CH 2. 87 (brd, 2. 86 (d) 1, 2, 14, 15 15 J=7. 6 Hz) 4 43. 2 CH 4. 07 (brm) 4. 08 (brm)-1, 7, 20 5 41. 6 CH 2. 32 (m) 2.31 (brm) 3, 6, 10 6 37. 0 CH 1. 73 (m) 1. 69 7 38. 5 CH2 1. 17 (ddd) 1. 19 1. 29 (ddd) 1. 28 J=12, 5 Hz 8 32. 9 CH 1. 44 (m) 1. 44 (m) 9 39. 0 CH2 1. 65 (brd, 1. 55 J=13. 0 Hz) 0. 91 0. 95 (ddd, J=13. 0 Hz) 10 39. 4 CH 2. 07 (brm) 2. 08 (m) 1, 2, 4, 9 5, 6, 9 11 22. 4 CH3 0. 91 (d, 0. 92 (d) 2, 8 ; 9 J=6. 6 Hz) 12 23. 5 CH3 0. 67 (d, 0. 68 (d) 5, 6, 7 J=7. 4 Hz) 13 21. 0 CH3 1. 42 (brs) 1. 41 (brs) 14 135. 2 C---- 15 122. 7 CH 5. 12 (m) 5. 11 (m) 1, 3, 16 3, 20 16 13. 2 CH3 1. 42 (brs) 1. 43 (brs) 17 11. 9 CH3 1. 47 (brs) 1. 46 (brs) 18 201. 9 C--- 19 137. 0 C---- 20 155. 8 CH 7. 38 (m) 7. 32 (m) 18, 19, 21, 23, 4, 24 28 21 87. 1 C---- 23 167. 5 C--- 24 63. 2 CH2 3. 33 (m) 3. 09 (s) 21, 25, 26 3. 07 (m) (-OCH3) 25 32. 0 CH2 1. 46 (m) 26 19. 2 CH2 1. 32 (m) 27 13. 8 CH3 0. 89 (t,-25, 26 J=7. 3 Hz) 28 25. 1 CH3 1. 57 (s) 1. 58 (s)-20, 24 22 (NH)--5. 91 (brs) 5. 65 (brs) 19, 20, 21, 23 20, 24, 28 'Zahl der gebundenen Protonen, durch DEPT bestimmt.

Protonen, die long-range Kopplungen zu Kohlenstoffatomen zeigen.

Cvergrößertes Protonensignal, durch NOE Differenzmessungen bestimmt.