以下、本発明について詳しく説明する。� ��下、「エリスロバクター(Erythrobacter)JPCC O種 1884株(受託番号NITE BP-341)」のことを「エリス ロバクターJPCC O種1884株」又は「JPCC O 1884株 」と略記することがある。また、本発明にお いて、アスタキサンチンとは、その構造異性 体(シス体)も含むものとする。また、以下「� ��造異性体」とは、ずべて「シス体」のこと� ��指す。

<エリスロバクターJPCC O種1884株の獲得>
 海洋環境やマングローブ林より採取した海� ��、泥、水などからアスタキサンチンを産生� ��る微生物の獲得を試みた。酵母エキスを5.0g /l、ペプトンを1.0g/l、グルコースを5.0g/lをと� ��るようにそれぞれ人工海水(千寿製薬)に添� �して作製した寒天プレートに、100μlのサン� �ルを塗布した。

 25℃の条件下で7~10日間静置培養を行い、� ��レンジ、赤色のコロニーを形成する海洋微� ��物を獲得した。これらの微生物を単菌化す� ��ため、5mlの上記成分を含む液体培地中に獲� ��した海洋微生物を植菌し、震とう培養(150rpm )を行い生育させ、寒天プレートに塗布し、� �ロニーを形成させる操作を繰り返すことで� �菌化した。

 約800株の海洋細菌からなる菌体粉末0.3mg� �らクロロホルム:メタノール=1:1(v:v)の溶液で� ��素を抽出し、アスタキサンチンのスクリー� ��ングを行った。

 アスタキサンチンの有無については、TLC( 薄層クロマトグラフィー)を用いて評価した� �その結果、アスタキサンチンをはじめとす� �各種カロチノイド色素を産生する株を同定� �、エリスロバクターJPCC O種1884株を獲得した 。

 エリスロバクターJPCC O種1884株は、国内� �託として2007年3月19日付けで、独立行政法人� ��業技術総合研究所特許生物寄託センター(日 本国千葉県木更津かずさ鎌足2-5-8)へ寄託した (受託番号NITE P-341 原寄託)。そして、上記原 寄託について2008年2月29日にブダペスト条約� �基づく寄託への移管請求が当局により受領� �れ、受託番号NITE BP-341が付与されている。 

<エリスロバクターJPCC O種1884株の同定>
 エリスロバクターJPCC O種1884株の同定は、� �式会社テクノスルガに委託して実施した。� �記方法で獲得した検体を用いて、「形態的� �質」、「培養的性質」、「生理学的性質」� �「糖類からの酸生成/ガス酸性」および「そ� ��他の生理学的性質」を確認し、「塩基配列� ��の同定および系統解析を行った。「形態的� ��質」を表1に、「培養的性質」を表2に、「� �理学的性質」を表3に、「糖類からの酸生成/ ガス酸性」を表4に、「その他の生理学的性� �」を表5に、「16SrDNAの塩基配列」を配列番号 1にそれぞれ示す。

 なお、表1~5において、(1)ゼラチン液化、グ� ��ム染色性については、文献「BARROW,(G.I.) and� �FELTHAM,(R.K.A):Cowan and Steel’s Manual for the Id entification of Medical Bacteria.3rd edition.1993,Cambri dge University Press.」を参考にした。
 また、(2)リトマス・ミルクでの培養条件、M Rテスト、デンプンの加水分解、クエン酸の� �用、無機窒素源の利用、カタラーゼ、オキ� �ダーゼ、O-Fテスト(酸化/発酵)、糖類からの� �生成/ガス酸性については、文献「坂崎利一� ��吉崎悦郎、三木寛二:新細菌培地学講座・下 ,第二版.1998,近大出版,東京」を参考にした。
 また、(3)硝酸塩の還元、脱窒反応、VPテス� �、インドール産生、硫化水素の生成、ウレ� �ーゼ活性、その他の生理学的性質について� �、「細菌同定キットAPI20E,(bioMerieux,France)」を 使用した。

[規則26に基づく差替え 23.04.2008]

[規則26に基づく差替え 23.04.2008]

[規則26に基づく差替え 23.04.2008]

(塩基配列)
 エリスロバクターJPCC O種1884株(受託番号NITE  BP-341)の16SrDNAを、公知の方法により同定し� �結果、配列番号1に示す塩基配列であること� ��判った。

(系統解析)
 解析ソフトウェアとしてCLUSTAL W(THOMPSON(J.D.) ,HIGGINS(D.G.) and GIBSON(T.J.),Nucleic Acids Research,1 994,22:4673-4680.参照)、MEGA ver3.1(KUMAR,(S.),TAMURA,(K .) and NEI,(M.),Briefings in Bioinformatics,2004,5,150-1 63.参照)を用い、得られた16SrDNAの塩基配列を� ��アポロンDB細菌基準株データベース(株式会� ��テクノスルガ)、国際塩基配列データベース (GenBank/DDBJ/EMBL)から取得した塩基配列情報と� �合して、分子系統解析を行った。
 その結果得られた分子系統樹を図1に示す。

 得られた検体は、α-プロテオバクテリア(α- Proteobacteria)に属する桿菌で、カタラーゼおよ びオキシダーゼを有する偏性好気性細菌であ る。
 BLAST(ALTSCHUL,(S.F.),MADDEN,(T.F.),SCHAFFER,(A.A.),ZHANG, (J.),ZHANG,(Z.),MILLER,(W.),and LIPMAN,(D.J.),Nucleic Acid s Research,1997,25:3389-3402.参照)を用いた細菌基� �株データベースに対する相同性検索の結果� �前記検体の16SrDNAの塩基配列は、エリスロバ� ��ター アクイマリス(Erythrobacter aquimaris)SW-110 株の16SrDNAの塩基配列に対し、97.8%と最も高い 相同性を示した。また、国際塩基配列データ ベースに対する相同性検索においても、前記 検体は、エリスロバクター由来の16SrDNAの塩� �配列に対し高い相同性を示した。このこと� �ら、前記検体は、エリスロバクター属に含� �れる可能性が高いと考えられた。
 分子系統解析の結果、前記検体は、エリス� ��バクターの基準種であるエリスロバクター� �ロンガス(Erythrobacter longus)と系統枝を形成し 、エリスロバクター ロンガスの系統枝にお� ��るブートストラップ値は81%と比較的高く、� ��の外側に位置するエリスロバクター アク� �マリスの系統枝におけるブートストラップ� �も80%を示すことから、これら3株の位置は比� ��的安定していると考えられた。このことか� ��、前記検体は、エリスロバクターに含まれ� ��既知種ではエリスロバクター ロンガスや� �リスロバクター アクイマリスに近縁と考え られる。しかし、前記検体の16SrDNAの塩基配� �は、これら2種の16SrDNAの塩基配列と完全には 一致しておらず、前記検体とこれら2種の系� �枝と、他のエリスロバクターに属する種の� �統枝を比較すると、前記検体がこれら2種の� ��ちらかと同種となる可能性は低いと考えら� ��た。
 以上より、分子系統解析の結果、前記検体� ��エリスロバクター属の新種(エリスロバクタ ーJPCC O種1884株(受託番号NITE BP-341)であると� �断された。

<アスタキサンチン産生細菌、細菌培養物� �アスタキサンチン含有組成物およびアスタ� �サンチンの製造方法>
 本発明の細菌は、16SrDNAの塩基配列が、配列 番号1に示す塩基配列か、又は配列番号1に示� ��塩基配列と96%以上の相同性を有する塩基配� ��であるエリスロバクターJPCC O種の細菌を包 含する。このような細菌は、エリスロバクタ ーJPCC O種1884株(受託番号NITE BP-341)と同種の� �であると考えられるからである。16SrDNAの塩� ��配列が、配列番号1に示す塩基配列と96%以上 の相同性を有する塩基配列であるエリスロバ クターJPCC O種の細菌には、例えば、エリス� �バクターJPCC O種1884株(受託番号NITE BP-341)の1 6SrDNAの塩基配列に対して、化学物質を作用さ せる手法や遺伝子組み換え等の公知の手法で 変異を導入することで得られた細菌も包含さ れる。
 また、産生する組成物中に占めるアドニキ� ��ンチン含有量が35質量%以上、アスタキサン� ��ン含有量が5質量%以上であるエリスロバク� �ー属に属する細菌も本発明の細菌である。� �記するように、このような色素を高含有量� �産生する細菌は、利用価値が高い。

 本発明のアスタキサンチンの製造方法は、� ��記本発明の細菌(以下、「本細菌」と略記す ることがある)を培養する工程を有する。
 本細菌を用いてアスタキサンチンを製造す� ��方法を、以下に例示する。
 本細菌を培養するための培地は、本細菌の� ��育に必要な炭素源、窒素源、無機塩、微量� ��素(ビタミン、微量金属)等を含むものであ� �ば特に限定されない。
 より具体的には、炭素源として、例えば、� ��ルコース、シュークロース等の糖類、エタ� ��ールやグリセロールなどのアルコール類を� ��げることができる。添加量は、添加する炭� ��源にもよるが、概ね0.5~3.0質量%程度とすれ� �良い。

 窒素源としては、例えば、硝酸ナトリウ� ��、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、� ��酸カリウム、塩化アンモニウム、尿素など� ��硝酸体窒素、アンモニア窒素体のいずれか� ��することができる。添加量は添加する窒素� ��にもよるが、概ね0.01~0.1質量%程度とすれば� ��い。

 無機塩類としては、例えば、塩化ナトリ� ��ム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩� ��カリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ素化� ��リウム、塩化ストロンチウム、ホウ酸、ケ� ��酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、リン酸� ��カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナ� ��リウム、リン酸二ナトリウム、塩化鉄、塩� ��マンガン、硫酸マンガン、塩化マグネシウ� ��、硫酸銅などを用いることができる。添加� ��は、添加する無機塩の種類にもよるが、0.00 1~0.01質量%程度とすれば良い。

 また、特殊な必要物質として、酵母エキス� ��ペプトン、トリプトンなどを用いることが� ��きる。これら特殊な必要物質の添加量は添� ��する物質にもよるが、0.01~0.5質量%程度とす� ��ば良い。
 その他、本発明の効果を損なわない範囲に� ��いて、培地にはその他の成分を含有させて� ��良い。
 本細菌の培養に用いる培地として、市販品� ��用いても良く、好ましいものとして、例え� ��、マリンブロス培地(Difco社製)が挙げられる 。

 本細菌の培養を行う際は、培地は公知の方� ��に従って滅菌しておくことが好ましい。
 培地のpHは、6.0~8.0に調整することが好まし� ��。そして、培養温度は20~35℃であることが� �ましい。培養時間は特に限定されないが、� �常、2~4日であることが好ましい。培養法と� �ては、震とう培養または通気培養が好まし� �。そして、培養中に培地は撹拌することが� �ましい。培地への植菌量は特に限定されな� �が、0.1~5容量%であることが好ましい。

 次いで、培養された本細菌からアスタキ� ��ンチンを得る。例えば、本細菌を培養して� ��られる細菌培養物から直接、または遠心分� ��により回収された沈殿物より、有機溶媒で� ��スタキサンチンを抽出することができる。� ��菌培養物は、凍結乾燥などの手法により乾� ��菌体としてから溶媒抽出に供しても良い。� ��こで用いる溶媒は、アスタキサンチンが十� ��に溶解するものであれば良く、一種の溶媒� ��単独で用いても良いし、複数種の溶媒を混� ��した混合溶媒でも良い。

 より具体的には、極性の高いアセトン、メ� ��ノール、酢酸エチルや、ヘキサン、ジクロ� ��メタン、クロロホルムなどの非極性溶媒を� ��独で、または混合して用いることができる� ��特に好ましい溶媒として、クロロホルムお� ��びメタノールの混合溶媒が挙げられる。こ� ��らの混合比は特に限定されるものではない� ��、クロロホルム:メタノール=0.5:1.5~1.5:0.5(v/v) であることが好ましい。
 さらに、シリカゲルなどの充填剤、抽出に� ��いたものと同様の溶媒を用いて、カラムク� ��マトグラフィーによりアスタキサンチンを� ��製しても良い。

 得られた組成物中の成分は、例えば、そ� ��分析データを公知化合物の分析データと比� ��することで同定できる。分析法としては、� ��造に関するデータが取得できるものであれ� ��いずれでも良く、例えば、HPLC、IR、NMR、LC/M Sなど通常汎用される分析法で良い。また、� �えば、HPLCにより分析時に検量線を作成して� ��けば、得られた組成物中の各成分の含有量� ��定量できる。

 本細菌から採取される組成物には、本細菌� ��産生した成分として、アスタキサンチン以� ��にも、β-カロチンがアスタキサンチンに変� ��される過程で生じる種々の有用なカロチノ� ��ド色素が含有される。前記組成物中に含有� ��れる色素として、具体的には、アスタキサ� ��チン、アドニキサンチン、ゼアキサンチン� ��アドニルビン、カンタキサンチン、ハイド� ��エキネノン、β-クリプトキサンチン、エキ� ��ノン、β-カロチンなどが挙げられる。
 なかでも、アスタキサンチンは、産生され� ��全色素中の含有量が5質量%以上と高濃度で� �る。また、通常のアスタキサンチン産生能� �有する細菌が産生するアスタキサンチンは� �ほとんどがトランス体であるのに対し、本� �菌が産生するアスタキサンチンには、シス� �が10質量%以上含まれている。
 さらに、アドニキサンチンも、産生される� ��色素中の含有量が35質量%以上と特に高濃度� ��ある。
 したがって、本細菌から採取された組成物� ��、通常のアスタキサンチン産生能を有する� ��菌が産生する組成物よりも有用性が高い。

 本細菌を培養して得られる培養物、また� ��本細菌の乾燥菌体、凍結菌体、溶媒抽出物� ��もしくは粉砕・破砕処理物を、動物プラン� ��トンの培養物へ添加して捕食させ、これを� ��収することにより、アスタキサンチンを製� ��することもできる。この製造方法によれば� ��アスタキサンチン等のカロチノイド色素が� ��縮された飼料を提供することも可能になる� ��

 前記動物プランクトンとしては、例えば� ��ワムシ、アルテミア、ミジンコなどを挙げ� ��ことができる。これらの動物プランクトン� ��、本細菌を捕食させることにより生物学的� ��縮が行われ、その結果得られる動物プラン� ��トンの培養物は、従来の細菌の培養によっ� ��産生されるアスタキサンチン等のカロチノ� ��ド色素に比較して、格段に濃縮されたもの� ��あり、その利用価値は高い。

 動物プランクトンによる濃縮を利用した� ��スタキサンチン等の製造方法により得られ� ��飼料は、養殖魚において好適に用いること� ��できる。稚魚の中にはカロチノイド色素を� ��有する甲殻類プランクトンを摂餌している� ��のがあり、この摂餌により魚の色が影響さ� ��ることが知られている。従って、これらの� ��魚類を養殖する際に、上記方法で製造され� ��飼料を色揚げ用飼料として給餌すると、動� ��プランクトンにより濃縮されたカロチノイ� ��色素等を給餌することが可能になることに� ��り、従来よりも効率的に魚の色揚げを行う� ��とができる。