Die Erfindung betrifft ein Autoantigen, das sich zur Feststellung einer Thrombose¬ neigung eignet, eine ein solches Autoantigen kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Autoantigens und dessen Verwendung.

Arterielle und venöse Thrombose ist eine häufige Komplikation, die bei einer Vielzahl von Multiorganerkrankungen und insbesondere bei längerer Bettlägrigkeit auftritt. Bisher gibt es noch keine Möglichkeit, vorherzusagen, ob ein Mensch zu einer Thrombose neigt oder ob keine Thrombosegefahr besteht. Es wäre aber sehr wünschenswert, dies feststellen zu können, da dann nicht standardmäßig bei längerer Bettlägrigkeit Blutverdünnungsmittel verabreicht werden müßten und andererseits eine Person mit festgestellter Thromboseneigung sehr viel eingehender betreut und therapiert werden könnte.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu¬ stellen, mit dem eine Thromboseneigung festgestellt werden kann.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Bereitstellung der Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Autoantigen, das die Aminosäuresequenz von Fig. 2 oder ein funktionelles Derivat oder Fragment davon umfaßt.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß in Seren von Personen mit einer Thromboseneigung spezifische Autoantikörper vorliegen. Der Anmelder hat solche Seren zum Screenen einer humanen Lambda-Phagen- Expressionsbibliothek, z.B. gt 1 1 , Clontech # HL 1 123 b (vgl. Huynh, T.V. et al.,

DNA Cloning, (1985), IRL Press Ltd., Oxford, England, Band 1 ) verwendet und positive Phagen erhalten. Die Inserts dieser Phagen wurden subkloniert und se¬ quenziert, wodurch ein Insert, HMhk-D, gefunden wurde, das die in Fig. 1 angege¬ bene Sequenz aufweist. Diese Sequenz umfaßt die Nukleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz eines Autoantigens. Durch übliches PCR- Verfahren wurden Fragmente von HMhk-D hergestellt. Diese wurden mit vorste¬ henden Seren inkubiert, wodurch die Bindungsstelle der Autoantikörper auf die in Fig. 2 angegebene Sequenz des Autoantigens eingegrenzt wurde.

Der vorstehende Ausdruck "funktionelles Derivat oder Fragment der Aminosäurese¬ quenz von Fig. 2" umfaßt jegliches Derivat oder Fragment dieser Aminosäurese¬ quenz, gegen die ein Autoantikörper gebildet werden kann. Insbesondere betrifft der Ausdruck Epitope in der Aminosäuresequenz, die als Autoantigene wirken können. Auch kann die Aminosäuresequenz von Fig. 2 Additionen, Substitutionen und/oder Deletionen von ein oder mehreren Aminosäuren aufweisen, was auch für die funktionellen Derivate oder Fragmente gilt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine für ein vorstehendes Autoantigen kodierende Nukleinsäure. Dies kann eine RNA oder eine DNA sein. Letztere kann z.B. eine genomische DNA oder eine cDNA sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfaßt:

(a) die DNA von Fig. 2 oder einen Teil davon,

(b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA, oder

(c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.

Der Ausdruck "hybridisierende DNA" weist auf eine DNA hin, die unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA, mit einer DNA von (a) hybridisiert.

Die DNA von Fig. 2 wurde bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganis-

men und Zellkulturen) als pX-DIV1 unter DSM 9963 am 6. Mai 1995 hinterlegt.

Zur Herstellung einer erfindungsgemäßen DNA ist es günstig, eine humane Lamb- da-Phagen-Expressionsbibliothek, z.B. Λgt1 1 Clontech # HL 1 123 b (vgl. vor¬ stehend) mit Seren von Patienten mit einer Thromboseneigung zu screenen. Von positiven Phagen können dann die Inserts subkloniert und sequenziert werden, wodurch die Autoantigen-kodierenden Sequenzen erkannt werden können. Weiter¬ hin können die Bindungsstellen für die Autoantikörper eingegrenzt werden. Hierzu eignet es sich, durch ein PCR-Verfahren Fragmente der Phagen-Inserts herzustellen und diese mit den Seren zu inkubieren.

Eine erfindungsgemäße DNA kann in einem Vektor bzw. Expressionsvektor vor¬ liegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressions¬ vektors für E.coli sind dies z.B. Λgt1 1 , pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b, pXal und pQE31 . Für die Expression in Hefe sind z.B. pY100 und Ycpadl zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z.B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Baculovirus-Expressionsvektor pAc SG His NT-A.

Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um eine erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen um¬ fassen die E.coli-Stämme Y1089, HB101 , DH1 , x1776, JM101 , JM 109, BL21 und XL1 blue, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen Sf9.

Der Fachmann weiß, in welcher Weise eine erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inse¬ riert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA in Form eines Fusions¬ proteins exprimiert werden kann.

Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte

Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das exprimierte Auto¬ antigen zu isolieren und zu reinigen. Ein vorstehendes, rekombinant hergestelltes Autoantigen, das auch ein Fusionsprotein sein kann, ist somit ebenfalls Gegen¬ stand der Erfindung.

Erfindungsgemäße Autoantigene zeichnen sich dadurch aus, daß sie in Personen mit einer Thromboseneigung spezifische Autoantikörper erkennen. Sie eignen sich daher als Mittel zur Feststellung (Diagnose) einer Thromboseneigung. Eine solche Feststellung kann durch übliche Nachweisverfahren, insbesondere einen Western Blot, einen ELISA, eine Immunpräzipitation oder durch Immunfluoreszenz, erfolgen. Hierzu können die erfindungsgemäßen Autoantigene, wenn es angebracht ist, markiert sein oder in Kombination mit markierten, gegen sie gerichteten Anti¬ körpern eingesetzt werden. Auch können erfindungsgemäße Autoantigene in einem Biosensor-Verfahren verwendet werden.

Ferner können erfindungsgemäße Autoantigene in einem Kit vorliegen. Dieser kann die Autoantigene, wie in vorstehender Form angegeben, zusammen mit üblichen Zusatzstoffen, wie Puffer, Trägermaterial und Kontrollen, enthalten. Ein solcher Kit ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Darüberhinaus eignen sich erfindungsgemäße Autoantigene auch für therapeuti¬ sche Zwecke. Beispielsweise können durch sie Autoantikörper affinitätschromato- graphisch aus dem Kreislauf von Patienten mit einer Thromboseneigung entfernt werden. Auch ist an eine Entfernung von für eine Thromboseneigung spezifischen Autoantikörper-produzierenden Lymphozyten durch Kopplung der erfindungs¬ gemäßen Autoantigene an Zell-Toxine zu denken.

Des weiteren eignen sich erfindungsgemäße Nukleinsäuren, insbesondere DNAs, für diagnostische Zwecke aller Art. Auch können solche Nukleinsäuren für thera¬ peutische Maßnahmen verwendet werden. Beispielsweise können die Nukleinsäu¬ ren in übliche Expressionsvektoren inseriert werden und diese in Personen mit einer Thromboseneigung eingeschleust werden. Durch Expression der Nukleinsäuren

werden Autoantigene erhalten, die dann die Autoantikörper abfangen können.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Fig. 1 zeigt die Nukleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäurese¬ quenz eines erfindungsgemäßen, durch HMhk-D kodierten Autoanti¬ gens, und

Fig. 2 zeigt die Nukleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäurese¬ quenz der eingegrenzten Autoantikörper-Bindungsstelle des durch HMhk-D kodierten Autoantigens.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 : Herstellung einer erfindungsgemäßen DNA

Eine humane Lambda-Phagen-Expressionsbibliothek,Λgt1 1 Clontech # HL 1 123 b (vgl. vorstehend) wurde mit dem Serum einer eine Thromboseneigung aufweisen¬ den Person HM gescreent. Es wurden positive Phagen erhalten. Die Inserts (EcoRI- Fragmente) dieser Phagen wurden in einem Vektor, pUC 18 (vgl. Yanisch-Perron, C. et al., Gene 33,(1985), 103) subkloniert und dann sequenziert. Es wurde ein Insert, HMhk-D, identifiziert, das die in Fig. 1 angegebene Sequenz aufweist. Diese umfaßt die Nukleotid (Aminosäure)sequenz eines erfindungsgemäßen Autoanti¬ gens.

Durch ein übliches PCR-Verfahren wurden Fragmente von HMhk-D hergestellt.

Diese Fragmente wurden mit dem Serum vorstehender Person inkubiert. Bei

Verwendung der Primer:

GGC CTG CAG TTA GTC ATC TTT TGG CTT G

Pstl-Linker

GGC GAA TTC AGC TCC AAA GCA CCT AAG

EcoRI-Linker wurde ein Fragment, HMhk-DIV, erhalten, das mit dem Serum reagierte. Dieses

Fragment ist ohne seine beiden Linker in Fig. 2 angegeben. Seine Sequenz umfaßt die Nukleotid (Aminosäure)sequenz der eingegrenzten Autoantikörper-Bindungs¬ stelle des durch HMhk-D kodierten Autoantigens.

Beispiel 2: Expression einer erfindungsgemäßen DNA

1. Expression in E.coli

1 .1 Das Insert HMhk-D von Beispiel 1 wurde in die EcoRI-Stelle des Expressions¬ vektors pXal (vgl. Produktinformation von Boehringer Mannheim) inseriert, wodurch das Expressionsplasmid pX-D erhalten wurde. Dieses kodiert für ein Fusionsprotein aus einem ß Gal-Anteil (N-terminaler Fusionspartner) und dem erfindungsgemäßen Autoantigen von Fig. 1 (C-terminaler Fusions¬ partner). pX-D wurde zur Transformation von E.coli XL1 blue (vgl. Bullock, W.O. et al., Bio Techniques 5, (1987), 376-278) verwendet. Es wurde das vorstehende Fusionsprotein erhalten. Sein Nachweis erfolgte durch einen gegen den ß Gal-Anteil gerichteten Antikörper bzw. durch einen gegen das Autoantigen gerichteten Antikörper.

1.2 Das Insert HMhk-DIV von Beispiel 1 wurde zwischen die EcoRI- und Pstl- Stellen von pXal (vgl. vorstehend 1.1 ) inseriert, wodurch das Expressions¬ plasmid pX-DIV1 erhalten wurde. Dieses Expressionsplasmid wurde bei der DSM unter DSM 9963 am 6. Mai 1995 hinterlegt. pX-DIV1 kodiert für ein Fusionsprotein aus einem ß Gal-Anteil (N-terminaler Fusionspartner) und dem erfindungsgemäßen Autoantigen von Fig. 2 (C-terminaler Fusions¬ partner). pX-DIV1 wurde zur Transformation von E.coli XL1 blue (vgl. vor¬ stehend 1 .1 ) verwendet. Es wurde das vorstehende Fusionsprotein erhalten. Sein Nachweis erfolgte wie vorstehend unter 1 .1 .

2. Expression in Insektenzellen

Das Insert HMhk-D von Beispiel 1 wurde in die EcoRI-Stelle des Expressionsvektors

pAc SG His NT-A, B, C (vgl. Produktinformation der Firma PharMingen, Dianova, Raboisen) inseriert, wodurch das Expressionsplasmid pAc-D erhalten wurde. Dieses kodiert für ein Fusionsprotein aus einem Histidin-Anteil (N-terminaler Fusionspartner) und dem erfindungsgemäßen Autoantigen von Fig. 1 (C-terminaler Fusionspartner). pAc-D wurde zur Transformation von Sf9-Insektenzellen (vgl. Produktionformation vorstehend) verwendet. Es wurde das vorstehende Fusions¬ protein erhalten. Sein Nachweis erfolgte durch einen gegen den Histidin-Anteil gerichteten Antikörper bzw. durch einen gegen das Autoantigen gerichteten Antikörper.

Beispiel 3: Nachweis von Autoantikörpern durch ein erfindungsgemäßes Auto¬ antigen

Das exprimierte Fusionsprotein von Beispiel 2, 1 .1 bzw. Beispiel 2, 2. wurde einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und auf eine PVDF-Membran über¬ tragen. Die Membran wurde nach üblichen Verfahren abgesättigt und mit Seren von vorstehender Person HM wie auch von Personen ohne Thromboseneigung in einer Verdünnung von 1 :100 1 h bei 25°C inkubiert. Nach mehreren Wasch¬ schritten mit PBS (0,05% Tween 20) wurde ein käuflicher POD-konjugierter Anti¬ human Ig-Antikörper (1 :1000, DAKO) zugegeben und ebenfalls 1 h inkubiert. Die Nachweisreaktion erfolgte nach mehreren Waschschritten mit dem POD-Substrat AEC (Aminoethylcarbazol, Sigma) nach Herstellerangaben, bis Banden sichtbar waren.

Es zeigte sich, daß das erfindungsgemäße Autoantigen spezifische Autoantikörper im Serum einer eine Thromboseneigung aufweisenden Person erkennt.