技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种可用于预 防和 /或治疗丙型肝炎的氮杂环 丁酮化合物及其药物组合物、 以及使用它们来预防和 /或治疗丙肝病毒感染的方 法。 背景技术

HCV指的是丙型肝炎病毒， 属于黄病毒科， 是一种单股正链 RNA病毒， 是 导致肝脏疾病的主要原因之一。 尽管急性感染的病人表现为无症状， 但是大约 80%病人因无法清除病毒， 从而转变为慢性肝炎并伴随其它肝脏疾病， 包括肝脂 肪变形， 胰岛素抵抗， 肝纤维化， 肝硬化和肝细胞性肝癌 (Alter & Seeff (2000) semin. Liver Dis.20: 17-35)。

目前， HCV的全球感染人数达到 1.7亿，中国地区 HCV感染率大约为 3.2%。 慢性感染者中约 50% - 75%有活跃的病毒复制和肝脏炎症， 部分慢性肝炎可进展 为肝硬化、 肝衰竭或原发性肝癌， 成为主要的疾病死亡因素之一。 尽管 HCV感 染已成为严重的公共卫生问题，但是目前依然 没有有效的疫苗预防 HCV的感染。

HCV感染宿主细胞首先是病毒颗粒与细胞表面的 一系列受体结合， 然后由 受体介导的内吞作用来完成的。 这些受体包括四分子交联细胞膜蛋白 CD81(Pileri,et al.(1998) Science 282:938-41) , B 族 I 型清道夫受体（SR-B I) (Scavenger,et,al.(2002) EMBO 121:5017-25) , 紧 密 连 接 蛋 白 claudin- 1 (Evants,et,al.(2007) Nature 446:801-5) 和 紧 密 连 接 蛋 白 claudin-6(Liu,et,al.(2009) J.Virol.83:2011-4; Ploss,et al.(2009) Nature 457:882-6)。 病 毒颗粒与这些受体结合后， 通过在 HCV病毒包膜和核膜之间的网格蛋白介导内 吞 作 用 （Blanchard,et al.(2006) J.Virol.80 :6964-72;meertens,et al.(2006)J.Virol .80;11571-8)和 Π类蛋白融合来侵染宿主细胞。 此外， 低密度脂蛋 白 受体（Agndlo,et al.(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:12766-12771; Monazahian, et al.(1999) J. Med. Virol.57:223-229; Wunschmann ,et al.(2000) J. Virol. 74:100055-10062) , 去唾液酸糖蛋白受体 (Saunier, et al. (2003) J. Virol 77:546-559) , 原钙粘蛋白 p5(Womg - siaal, et al. (2008) 15 ^th international symposium on Hepatitis C Virus & Related Viruses. San Antonio, TX), 和糖胺聚糖 (heparan sulfate) (Barth, et al. (2003) J .Biol. Chem.278:41003-41012; Barth, et al. (2006) J . Virol. 80:10579-10590; Bartosch, et al.(2003) J.Exp. Med.197 :633-642) 参 与病毒的侵染， 但是目前还没有足够的证据证明这些蛋白是 HCV侵染宿主细胞 所必需的。研究已证明 HCV病毒颗粒并不是只在胆固醇上富集 (Aizaki,et al. (2008) J.Virol. 82:5715-24), 但胆固醇的缺失会降低病毒对细胞的侵染 （Aizaki, et al. (2008) supra; Kapadia, et al.(2007) J.Virol. 81:374-83)。

^临床上还没有批准的 HCV病毒侵入抑制剂，但是已有制剂能够抑制 HCV 病毒在体内的复制。 例如， 目前采用干扰素和利巴韦林联合治疗 HCV, 但是该 联合治疗有一定的毒副作用、 边际效应而使其适用范围受限 （Firpi & Nelson (2007) Arch. Med. Res. 38:678-690; Foster & Mathurin (2008) Antivir. Ther .13:3-8)。 此外， 在 US 2008/0161324 中描述了一系列抑制病毒复制的 HCV 病毒抑制剂。 但是， 这些化合物不能阻止 HCV病毒的侵染和传播。 因此， 从病 毒生命周期的其它方面 (如抑制病毒的侵入)寻找新型且有潜力的抗病� ��药物势在 必行。

发明内容

专利文献 WO2011017907A1 公开了具有下式 (I)结构的氮杂环丁酮化合物及 其制备方法与用途， 数据显示该式 (I)化合物是一种降血浆胆固醇剂， 用于降低血 浆胆固醇含量， 可治疗与

式 (I)

经本发明的发明人长期研究， 令人惊讶地发现， 该文献中公开的式 (I)化合物 可以有效防治丙肝病毒感染。

因此，

根据本发明的第一方面， 本发明提供了一种用于预防和 /或治疗肝炎病毒感 染， 尤其是丙型肝炎病毒的式 (I)化合物或其药学上可接受的盐： 式 (I)

其中

R ¹ 独立地选自 1-3个以下基团： 氢、 卤素、 三氟曱基、 氰基、 C _r C ₆ 烷基、 C ₂ -C ₆ 烯基、 （¾-( ₆ 环烷基、 羟基、 C _r C ₆ 烷氧基、 苄氧基和 -OCOR ⁷ ;

R ² 独立地选自 1-3个以下基团： 氢、 卤素、 三氟甲基、 氰基、 C _r C ₆ 烷基、 C ₂ -C ₆ 烯基、 C ₃ -C ₆ 环烷基、 羟基、 （，-^烷氧基、 C ₆ -C ₁₍₎ 芳氧基、 C ₆ - 。芳基甲氧 基和 -OCOR ⁷ ;

R ³ 独立地选自 1-3个以下基团： 氢、 卤素、 三氟甲基、 氰基、 d-C ₆ 烷基、 c ₂ -c ₆ 烯基、 c ₃ - c ₆ 环烷基、 c _r c ₆ 垸氧基和苄氧基；

R ⁴ 为氢、 C _r C ₆ 烷基、 C ₂ -C ₆ 烯基和 C ₃ -C ₆ 环烷基；

R ⁵ 为氢、 CrC ₆ ^基、 C ₂ -C ₆ 烯基和 C ₃ - C ₆ 环烷基；

R ⁶ 为氢或者 -COR ⁷ ;

！^为^^。烷基、 苯基或者取代苯基， 所述取代基选自： 卤素、 三氟甲基、 氰基、 羟基、 C _r C ₆ 烷基、 C ₂ -C ₆ 烯基、 C ₃ -C ₆ 环烷基和(^-( ₆ 烷氧基、 笨氧基和苄 氧基；

m为 0、 1、 2或者 3;

n为 1、 2或者 3;

其中， 碳碳双键为 Z构型或者 E构型。

在本发明的一个实施方案中， 式 (I)化合物中 R ² 独立地选自 1-3个以下基团： 氢、 卤素、 三氟甲基、 氰基、 C ₆ 烷基、 C ₂ -C ₆ ^基、 C _r C ₆ 环烷基、 羟基、 C C ₆ 烷氧基、 苄氧基和 -OCOR ⁷ ; R ⁷ 为 d-Cio烷基、 苯基或者取代苯基， 所述取代基 选自： ！¾素、 三氟曱基、 氰基、 羟基、 C _r C ₆ 烷基、 C ₂ -C ₆ 烯基、 C ₃ -C ₆ 环烷基和 C Cg燒氣基

在优选的实施方案中， 式 (I)化合物中 R ¹ 独立地优选自 1-3个 [¾素原子， 更优 选自 1-3个氟或氯原子， 最优选氟原子。

在优选的实施方案中， 式 (I)化合物中 R ² 独立地优选自 1-3个羟基、 <^-( ₆ 烷 氧基或 - OCOR ⁷ 其中 R ⁷ 具有如上所述的定义； 更优选独立地选自 1-3个羟基， 甲 氧基、 苯氧基或 -OCOR ⁷ 。

在优选的实施方案中， 式 (I)化合物中 R ³ 独立地选自 1-3个! ¾素原子，更优选 自 1-3个氟或氯原子， 最优选氟。

在优选的实施方案中， 式 (I)化合物中 R ⁴ 优选为氢或 -C ₆ 烷基， 更优选为氢 或甲基。

在优选的实施方案中， 式 (I)化合物中 R ⁵ 优选为氢或 C _r C ₆ 綻基， 更优选为氢 或甲基。

在优选的实施方案中， 式 (I)化合物中 R ⁶ 优选为氢。

在优选的实施方案中， 式 (I)化合物中 R ⁶ 优选为 -COR ⁷ ; 其中 R ⁷ 具有如上所 述的定义， 更优选为 d- o烷基， 最优选甲基。

在优选的实施方案中， 式 (I)化合物中， m优选为 0或 1。 在优选的实施方案中， 式 (I)化合物中， n优选为 1。

在优选的实施方案中， 式 (I)化合物优选自：

(3R,4S)-4-(4-羟基苯基) -3-[3-对氟苯基 -4-羟基丁基 -2(Z)-烯 ]小(4-氟苯基 )-2- 氮杂环丁酮 (1-1 Z);

(3R,4S)-4-(4-羟基苯基) -3-[3-对氟苯基 -4-羟基丁基- 2(E)-烯] -1-(4-氟苯基 )-2- 氮杂环丁酮 (1-1 E);

(3R,4S)-4-(4-曱氧基苯基)- 3- (3-对氟苯基 -4-羟基丁基 -2(Z)-烯)小(4-氟苯 基) -2-氮杂环丁酮 (1-2 Z);

(3R,4S)-4-(4-甲氧基苯基)- 3-(3-对氟苯基 - 4-羟基丁基 -2(E)-烯) -1-(4-氣苯 基 )-2-氮杂环丁酮 (1-2 E);

(3R,4S)-4-(4-苯氧基苯基) - 3-(3-对氣苯基 -4-羟基丁基 -2(Z)-烯) -1-(4-氟苯 基) -2-氮杂环丁酮 (1-3 Z);

(3R,4S)- 4_(4-苯氧基苯基) -3-(3 -对氟苯基 -4-羟基丁基 -2(E)-烯 -(4-氟苯 基) -2-氮杂环丁酮 (1-3 E);

( _3R ,4S)-4- (4-苄氧基笨基) -3-(3 -对氟苯基 -4-羟基丁基 -2(Z)-烯 )- 1 -(4-氟苯 基) -2-氮杂环丁酮 (1-4 Z);

(3R ₉ 4S)-4-(4-苄氧基苯基) -3 -(3-对氟苯基 -4-羟基丁基 -2(E)-烯) - 1 -(4-氟苯 基)- 2-氮杂钚丁酮 (1-4 E);

(3R,4S)-4-(4-苯甲酰氧基苯基) -3-(3-对氟苯基 -4-羟基丁基 -2(Z)-烯) -1 -(4-氟苯 基:) -2-氮杂坏丁酮 (1-5 Z);

(3R,4S)-4-(4-乙酰氧基笨基 )- 3-(3-对氟苯基 -4-羟基丁基- 2(Z)-烯 )小(4-氟苯 基) -2-氮杂环丁酮 (1-6 Z);

(3R,4S)-4-(4-苯甲酰氧基苯基) -3-(3-对氟苯基 -4-羟基戊基 -2(Z)-烯)小(4-氟苯 基)- 2-氮杂环丁酮 (1-7 Z);

(3R，4S)-4_(4-羟基苯基) -3-(3-对氟苯基 -4-羟基戊基 -2(Z)-烯) -1-(4-氟苯基 )-2- 氮杂环丁酮 (1-8 Z);

(3R，4S)-4-(4-羟基苯基) -3-(3-对氟苯基 -4-羟基戊基 -2(E)-烯) -1-(4-氯苯基 )- 2- 氮杂环丁酮 (1-8 E);

(3R,4S)-4-(4-苯曱酰氧基苯基) -3 -(3-对氟苯基 -4-曱基 -4-羟基戊基 -2(Z)- 烯)小(4-氟苯基 )-2-氮杂环丁酮 （I- 9 Z);

( ³ R,4S)-4-(4-羟基苯基) -3 -(3 -对氟苯基 - ⁴ -甲基- ⁴ -羟基戊基- ² (Z)-烯)- 1 -(4-氟苯 基) -2-氮杂环丁酮 (I_10 Z);

(3R,4S)- 4-(4-乙酰氧基苯基 )-3-(3-对氟苯基- 4-乙酰氧基丁基 -2(Z)-烯) -1-(4-氟 苯基) -2-氮杂环丁酮 (1-11 Z);

(3R，4S)- 4-(4-羟基苯基) -3-(3-对氟苯基 -4-乙酰氧基丁基 - 2(Z)-烯)小(4-氟苯 基 )-2-氮杂环丁酮 (1-12 Z);

(3R，4S)-4-(4-羟基苯基) -3-(3-对氟苯基 -4-苯曱酰氧基丁基 -2(Z)-烯)小 (4-氟苯 基) -2-氮杂 ί不丁酮 (1-13 Z); (3R,4S)-4- (4-羟基苯基)- 3- (3-对氟苯基 -4-对氟苯曱酰氧基丁基 -2(Z)-烯) -l-(4- 氟苯基 )-2-氮杂环丁酮 (1-14 Z);

(3R,4S)-4-(4-羟基苯基) -3- (3-对氟苯基 -4-对甲苯甲酰氧基丁基 -2(Z)-烯)小 (4- 氟苯基 )-2-氮杂环丁酮 (1-15 Z);

(3R,4S)-4-(4-苯曱酰氧基苯基) -3_(3-对氟苯基 -4-乙酰氧基丁基 -2(Z)-烯)- 1-(4- 氟苯基 )-2-氮杂坏丁酮 (1-16 Z);

(3R,4S)-4-(4-甲氧基苯基) - 3- (3-对氟笨基- 4-乙酰氧基丁基 -2(Z)-烯)小 (4-氟苯 基) -2-氮杂环丁酮 (1-17 Z);

(3R,4S)-4-(4-甲氧基苯基) -3- (3-对氟苯基 -4-乙酰氧基丁基 -2(E)-烯)小 (4-氟苯 基) -2-氮杂环丁酮 (ί-17 Ε)。

最优选以下化合物：

(1-6 Ζ)

本发明所使用的部分术语定义如下：

"卤素 "是指氟、 氯、 溴和碘。 "烷基 "当作一基团或一基团的一部分时是指直链或� �带有支链的脂肪烃基 团。 最优先选择为 C _r C 梡基， 除非另有指明。 直链或带有支链的 d- 烷基 的实例包括， 但不限于： 甲基、 乙基、 正丙基、 2-丙基、 正丁基、 异丁基、 叔丁 基、 己基等。

"烯基 "作为一基团或一基团的一部分时是指至少含� �一个碳碳默键的脂肪 炫基团， 可为直链也可以带有支链。 最为优先选择的是 c ₂ -c ₆ 的烯基。 该基团可 在其主链中含有多个双键且其几何构型可各自 为 E或Z。 烯基基团的例子包括， 但不限于： 乙烯基、 丙烯基、 烯丙基、 丙烯基等。

"环烷基"是指饱和或部分饱和的单环、 稠环或螺环之碳环。 以 3-6个碳原子 组成的环为优先选择。 实例包括， 但不限于： 环丙基、 环丁基、 环戊基、 环己基 等。

"烷氧基"是指 (烷基 -0-)的基团。 其中， 烷基见本文有关定义。 c _r c ₆ 的烷氧 基为优先选择。 其实例包括， 但不限于： 甲氧基、 乙氧基、 正丙氧基、 异丙氧基、 正丁氧基、 异丁氧基、 叔丁氧基等。

本发明包括式 (I)所表示的化合物及其可能的各种异构型式。 包括： 非镜像异 构体、 镜像异构体和 "Z"或" F'构型的几何异构体等。

此外， 术语"药学上可接受的盐"是指上述化合物能保� ��原有生物活性并且适 合于医药用途的某些盐类。 式 (I)所表示的化合物的药学上可接受的盐是与金 属形 成的盐。与式 (I)所表示的化合物形成药学上可接受的盐的金 属包括： 锂、钠、钾、 镁、 钙、 铝、 锌等。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种含 有上述式 (I)化合物的药物組合 物，其包括预防和 /或治疗有效剂量的式 (I)化合物或其药学上可接受的盐， 以及任 选的， 药学上可接受的载体。 根据本发明的另一方面， 在上述药物组合物中， 还 包含一种或多种其它能够抑制肝炎病毒感染的 活性成分， 比如 I型干扰素、 利巴 韦林、 病毒唑、 核甘酸类似物 R1479、 核甘酸抑制剂 R1626、 二苯基杂环化合物 等， 其中所述的 I型干扰素是 IFN-α或 lFN-β»

根据本发明的另一方面，本发明提供了上述式 (I)化合物或其药学上可接受的 盐在制备预防和 /或治疗肝炎病毒， 尤其是丙型肝炎病毒感染的药物中的用途。

根据本发明的另一方面，本发明提供了上述式 (I)化合物或其药学上可接受的 盐在制备减少或防止肝炎病毒， 尤其是丙型肝炎病毒进入细胞的药物中的用途 。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种预 防和 /或治疗肝炎病毒，尤其是 丙型肝炎病毒感染的方法， i亥方法包括给需要治疗的受试者施用有效剂� �的如上 所述的式 (I)化合物或其药学上可接受的盐， 或含有它们的药物组合物。

根据本发明的另一方面， 本发明提供了一种减少或防止肝炎病毒， 尤其是丙 型肝炎病毒进入细胞的方法，该方法包括使细 胞与有效剂量的上述式 (I)化合物或 其药学上可接受的盐， 或含有它们的药物组合物接触。

本发明描述了一种阻止肝病毒感染的方法。 i亥方法通过给予受试者有效剂量 的式 (I)化合物或者其药学上可接受的盐来阻止或降 低肝病毒对细胞的侵入。在本 专利的一个具体实施方案中， 所述受试者是肝移植者。

本发明作为治疗肝病毒感染协同药物组合物同 样也适用。此組合物含有式 (I) 化合物或其药学上可接受的盐， 以及至少一种其它能抑制肝病毒感染的药物。 其 中所述的其它抑制肝病毒感染药物选自 I型干扰素、 利巴韦林、 病毒唑、 核甘酸 类似物 R1479、 核甘酸抑制剂 R1626、 二苯基杂环化合物等。 在一个具体实施方 案中，其它抑制肝炎病毒感染药是 I型干扰素，而该 I型千扰素是 IFN-α或 IFN-P。

本发明也适用与一定有效剂量的其它药物或药 物组合物联合用药，协同作用 于被肝病毒感染的细胞， 有效地清除细胞内的肝病毒。

本发明描述的方法也适用于治疗肝病毒感染者 。本发明也适用与一定有效剂 量的其它药物或药物组合物联合用药， 协同作用于肝病毒感染者， 使得肝病毒感 染者得到治疗。 因此， 本发明的具体实施是提供一种预防肝炎病毒感 染的方法， 它主要是通过给予需要预防的"受试者"一定有� ��剂量的本发明的式 (I)化合物或 其药学上可接受的盐， 或含有它们的药物组合物从而降低或防止肝病 毒感染细 胞。 此处的 "受试者"可以指任何动物 (例如， 包括像人类这样的哺乳动物)。 此处 的"肝炎病毒感染，，主要是指肝炎病毒的吸� �和内化， 已经通过病毒复制和病毒持 续感染得到证实。 本发明中的"预防"是指防止或延緩 HCV相关临床症状的预防 性治疗。

在具体实施例中（图 3)， 本发明的化合物 (1-1 Z)与干扰素显示出协同作用， 本 发明的协同组合物指的是式 (I)化合物或者其药学上可接受的盐联合至少一 种抑 制肝病毒感染的抑制剂（例如： 抑制病毒基因的表达、 复制或抑制病毒颗粒的组 装和释放)的组合物。 本发明与其它药物组合物联合使用时总的治疗 效果大于它 们单独使用时的治疗效杲的总和。 因此， 根据本发明的一个具体实施方案， 联合 至少一种其它的抑制肝病毒感染的抑制剂指的 是病毒复制抑制剂。抑制肝病毒复 制的药物， 可以是已公布的、 针对病毒复制各个环节的抑制剂。 如， 通过降低病 毒各个复制钚节效率的抑制剂，或通过抑制病 毒复制过程中所需因子来抑制 HCV 病毒复制的抑制剂， 这些过程包括但不限于病毒基因组复制， 病毒 RNA转录， 和蛋白水解过程。

在本发明联合使用抑制肝病毒感染的抑制剂的 药物组合物中，或者在预防和 /或治疔的方法中， 所使用的肝病毒感染的抑制剂包括但不限于亚 氨基噻唑酮类 (US, 专利号 7183302)、 I型干扰素 (Zeuzem, et al, (1996), Hepatology, 23(2): 366-71), 病毒唑 (Gish (2006), J Antimicrob Chemother,5(l): 8-13), 核甘酸类似物 R1479(klumpp, et al, (2006) J Biol Chem, 281(7): 3793-3797), Telaprevir(Weisberg & Jacobson (2009 Clin Liver Dis,13(3):441-52; Serrazin , et al.(2007) Gastroenterology 132(5): 1767-77), Boceprevir(Mederacke, et al.(2009) Curr Opin. Investig. Drugs 10(2): 181-9),核甘酸抑制剂 R1626(Toniutoo, et al.(2008) IDrugs ll(10):738-49), ITMN- 191 (R7227; Seiwert,et al.(2008) Antimicrob. Agents Chemother. 52(12):4432-41), 可替代性的二苯基杂环化合物 (Huang, et al.(2008) Antimicrob. Angents Chemother. 52(4): 1419-29), beta-D-2-Deoxy-2-fluoro-2-C-methylcytidiine (PSI-6130;Asif, et al. (2007) Antimicrob. Angents Chemother. 51(8):2877-82), statins (Ikeda, et al. (2006) Hepatology 44(1): 117-25)， bisindolylmaleimides and indolocarbazoles(Murakami,et al. (2009) Antiviral Res. 83:112-117)。

^本发明的具体实施方案中， 协同组合物， 包括至少一种 I型干扰素 (如， IFN- α或 IFN-β), 利巴韦林或 I型干扰素与利巴韦林的组合物。 本发明具体例中 协同组合物包括： 1)式 (I)化合物或者其药学上可接受的盐； 2)ί型干扰素或利巴韦 林； 3)丙肝病毒感染抑制剂。本发明所描述的 I型干扰素为一类蛋白干扰素家族， 该家族蛋白可抑制病毒复制、 细胞增殖及调节免疫应答。 其中有效的 α干扰素， 包括但不限于 Roferon A 干扰素（Hoffinan-La Roche, Nutley NJ) , 干扰素 a-2(Boehringer Ingelheim Pharmaceutical,Inc . , Ridgefield, CT) , rDNA- 干扰素 (Sumitomo,Japan)。目前， α干扰素 2b通过世界多数国家批准，广泛用于治疗 HCV。 美国专利文献 US4530901已对 a干扰素 2b进行了介绍。

本发明在使用中， 将所需的式 (I)化合物或其药学上可接受的盐， 或含有它们 的药物組合物， 优选协同组合物制成制剂给予受试者。 在制剂的配制中， 可根据 需要任选使用药学上可接受的载体。 这些载体是我们广泛熟知的， 如生理盐水、 纤维素、 乳糖、 焦糖、 甘露醇、 山梨醇和磷酸 4弓。 选择性添加物包括润滑剂、 粘 合剂， 如硅酸、 二氧化硅、 滑石粉、 硬脂酸、 硬脂酸镁、 硬脂酸 、 PEG; 崩解 剂， 如淀粉、 羧甲基淀粉、 交联聚乙烯吡咯烷酮、 琼脂、 海藻酸及其盐； 色素； 调味剂及融合剂。 色素或天然色素添加到药片或糖衣上， 如用于区分活性成分或 活性成分不同剂量。

在一个优选的实施方案中， 式 (I)化合物或其药学上可接受的盐和其它至少一 种抑制丙肝病毒感染的药物可以按适当比例用 一种或多种载体制成制剂。

一般来说， 药物有效成分占治疗给药总质量的 1-95%。 药物的剂型要适合不 同给药方式， 如口服、 注射 (静脉注射、 肌肉注射)、 直肠给药、 人体附属物给药、 透皮给药、 滴鼻、 阴道给药、 吸入给药、 皮肤局部给药 (贴剂）、 滴眼。 因此， 药 物的剂型包括片剂、 胶嚢剂、 丸剂、 粉针剂、 颗粒剂、 混悬剂、 乳剂、 溶液剂、 凝胶剂、 糊剂、 软膏剂、 乳青剂、 透皮贴剂、 栓剂、 注射剂、 输液、 吸入剂及气 雾剂。 制剂的制备可采用传统工艺（如， emington:The Science and Practice of Pharmacy, 20 ^th edition, 2000, ed. A. R. Gennaro, Lippincot Williams & Wilkins, Philadelphia, and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York) ₀

式 (I)化合物或者其药学上可接受的盐和其它至少 一种抑制丙肝病毒感染的 药物可以制成单方， 也可制成在一定时间内（分钟、 小时或一天)多次连续给药的 复方剂型。

给药剂量及联合给药方案取决于以下因素， 包括治疗方案、 肝炎病毒类型、 病毒传染性强度、 是以肝炎治疗还是预防病毒传染为主以及病患 的年龄、 体重、 身体健康状况。

本发明协同组合物可同时靶向作用于病毒的入 侵和病毒基因的表达、复制以 及病毒颗粒的组装和释放， 所以协同组合物可以用效的从细胞内清除肝炎 病毒和 治疗肝病毒感染。 因此， 本专利适应症包括清除细胞内的丙肝病毒。 采用本发明 的一定有效剂量的协同组合物作用于病毒感染 的细胞，可以有效地从细胞中清除 丙肝病毒。通过合理的治疗方案预期可降低 20%、 30%、 50%、 70%、 80%、 90%、 95%、 99%的肝细胞内的病毒负载量。 在本发明的一个具体实施方案中， 采用肝 细胞进行试验， 丙肝病毒能有效地从其宿主细胞中清除出去， 因此， 本发明适用 于丙肝病毒感染。

本发明的另一个具体实施方案通过给予感染丙 肝病毒患者有效剂量的协同 组合物用来治疗丙肝病毒感染， 可显著阻止或降低病毒复制及传播速率、 减少病 毒负载量 (如文中提到的病毒， 包括肝病毒 A， B, C, D, E), 至少减轻患者肝病 感染后的一种症状。 通过合理的治疗方案 (如前文提及抑制病毒在细胞内复制或 抑制感染的方案)预期可減慢病毒的复制和降� �至少 20%、 30%、 50%、 70%、 80%、 90%、 95%、 99%病毒负载量。

治疗受益者包括被诊断为感染丙肝病毒的患者 （如通过丙肝病毒标记物证 实）。 文献中报道有多种丙肝病毒检测标记物， 且专业人员可对这些标记物进行 检测。 例如， 可通过检测肝脏或血液中的丙肝病毒核酸或蛋 白来确诊丙型病毒感 染。

文中提到的本发明式 (ί)化合物在预防和 /或治疗肝炎病毒感染中的应用，其中 "有效剂量"指的是一定剂量的药物能够降低病� ��负载量或清除病毒， 进而减少、 緩解或消除可导致的癌症或肝硬化的慢性感染 (症状表现为肝肿大、 脾肿大、 黄 疸、 肌无力、 肝腹水、 脚踝浮肿)。

本发明中， 有效治疗剂量可通过参考文献报道的相关剂量 和方法进行确定。 例如， 根据文献报道选用适宜的动物模型进行试验确 定有效剂量， 如通过体内试 验检测药物对 HCV的抑制作用。 文献中已详实报道了大量此类模型试验的优势 和具体应用。 一旦药物在动物体内的实验被证实有效， 临床研究即可依据读动物 实验安全给药剂量和量效关系进行剂量设计。 此类临床实验可根据 Spilker((2000)Guid to Clinical Trials. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia)临 床实验指导方案进行设计。

本发明所述治疗方案的用药剂量可依据式 (I)化合临床 I期实验数据结果， 其 它干扰素或丙肝病毒抑制剂可采用其临床用药 的药理学、 毒理学方案作为参考。 用药剂量因病患个人差异而不同， 谨遵医嘱。

如果需要， 本发明化合物可用于机制研究来验证其它药物 组合物或单一药物 是否具有与本发明化合物或组合物相同的治疗 病毒感染的作用（文献报道方法检 测）。 例如， 候选药物可单独给药或联合给药 (如式 (I)化合物或者其药学上可接受 的盐)， 然后进行细胞 (如 Huh7、 Huh2、 Huh8, Sk-Hep- 1、 Huh7 lunet> HepG2、 WRL-68、 FCA-1、 LX- 1、 LX-2、 Hunh7-derived等干细胞系）水平检测。 经适当时 间， 病毒侵入细胞、 复制， 然后检验细胞内病毒数量。 如杲受试化合物或组合物 具有抑制病毒侵入 (如采用集落形成实验检测)、 复制或减少病毒数量的作用， 该 化合物或组合物就可用作治疗病毒感染疾病的 有效药物。

本发明可作为研究阐明病毒类疾病生物信号通 路的工具药。这类研究可进一 步开发治疗、 预防或减少病毒感染类疾病联合用药或单一用 药的药物。 采用文献 报道的生物信号通路研究方法， 本发明可用于确定病毒感染细胞 (如肝细胞)的信 号通路或感染信号网絡。 这些方法包括对本发明给药组与阴性对照组、 阳性对照 组或与其它单一药物联合、 复方药物联合给药组细胞组分进行检测分析， 亦可对 细胞或病毒活力 (如酶活力、 营养吸收和增殖)进行检测。 细胞組分分析包括基因 转录和蛋白表达。 通常使用的方法包括标准生化技术， 本发明专利的放射标记， 以及化合物与蛋白结合检测， 如二维凝胶电泳或基因表达谱。 一旦确定效果， 该 化合物可进行体内试验 (如基因敲除或转基因小鼠)来进一步验证化合� ��作为工具 药研究的有效性， 以及用于开发治疔病毒疾病的新药物、研究新 的治疗方案的有 效性。

具体试验方法包括但不限于实施例所述方法： 附图说明

图 1化合物 (1-1 Z)预防 HCV侵入 Huh7细胞： 根据实施例 2感染 HCV的 Huh7细胞经不同浓度的化合物 (1-1 Z)预处理 6小时后， 感染病毒 8h和 24h后细 胞内病毒含量。显示化合物 (1-1 Z)在 10uM〜40uM/L浓度下能有效抑制 HCV在细 胞内的内化。单层人肝癌细胞株 HuH7分别加入不同浓度的化合物 (I- 1 Z)预处理， 经浓度为 0.1FFU/CELL的源于 JFH- 1的 HCV病毒感染， 细胞感染病毒。 病毒在 感染 8h和 24h后， 洗涤细胞并分离 RNA, 测定病毒的含量。 采用实时荧光定 量 PCR(RT- qPCR)的方法来测定 HCV RNA的含量， 含量用 HCV RNA拷贝数 /ug 细胞总 R A来表示， GAPDH作为内参。 三次试验的实验结果用 means士 s.e.m. 表示， 阴性对照 (HCV R A含量在未感染的细胞中的检测）大约为 0.5-l.OxlO ² 拷 贝^ t/ug 细胞总 R A。 相对于对照组， 化合物 (1-1 Z)能够显箸性降低 HCV RNA 在细胞总 RNA中的含量 (PO.05, 单因素方差对结果分析， 并 t检验)。

图 2化合物 (1-1 Z)、化合物 (1-12 Z)、化合物 (ί- 6 Ζ)预防 HCV侵入 Huh7细胞： 根据实施例 2感染 HCV的 Huh7细胞经 20uM的化合物 (1-1 Z)、 化合物 (1-12∑)、 化合物 (1-6 Z)预处理 6小时后感染病毒 24h细胞内病毒含量。 显示化合物 (1-1 Z)、 化合物 (1-12 Z)、 化合物 (1-6 Z)能够有效抑制 HCV在细胞内的内化。 单层人肝癌 细胞株 Huh7分别加入 20uM/L化合物 (I- 1 Z)、化合物 (1-12 Z)、化合物 (1-6 Z)预处 理 6小时后， 经浓度为 0.1FFU/CELL的源于 JFH- 1的 HCV病毒感染 (JFH-1 , 从 日本一名丙型肝炎患者体内分离出一株 HCV全长基因序列）， 培养 24h, 洗涤细 胞并分离 RNA, 测定病毒的含量。 采用实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)的方法来测 定 HCV RNA的含量，含量用 HCV RNA拷贝 ug 细胞总 RNA来表示， GAPDH 作为内参。 三次独立实验的实验结果用 means士 s.e.m.表示 , 阴性对照 (HCV NA 含量在:^感染的细胞中的检测）大约为 0.5-l.OxlO ² 拷贝 ¾/ug 细胞总 RNA。相对 于对照组， 浓度为 20uM/L的化合物 (1-1 ΐ)、 化合物 (1-12 Ζ)、 化合物 (1-6 Ζ)能够 显著性降低 HCV RNA在细胞总 RNA中的含量 （PO.05 ,单因素方差对结果分析， 并 t检验)。

图 3化合物 (1-1 Z)与干扰素 -α协同治疗慢性 HCVcc感染：根据实施例 2慢性 HCVcc感染实验， Huh7细胞感染 HCV后经药物作用不同时间细胞内病毒含量。 显示化合物 (1-1 Z)与干扰素 -α具有协同作用， 能够降低 HCV慢性感染的人肝癌 细胞株 Ηχώ7的 RNA含量， 连续给药 60天后， 细胞内 HCV RNA含量接近于未 感染 HCV细胞的 HCV 11RNA背景值。 Huh7与含有 HCV感染性病毒颗粒的 JFH-1株共培养，病毒浓度为 0.1FFU/CELL。感染后继续培养 10天，使 HCV R A 含量达到一个持续稳定的状态。试验分为四组 分别为模型组，化合物 (1-1 Ζ)(20μΜ) 組， 干扰素 - ot(100 U/ml)组， 化合物 (1-1 Ζ)(20μΜ)和干扰素 -α(100 U/ml)联合用药 组。 给药期间继续保持细胞传代。 在实验过程中， 细胞开始给药治^后， 等量收 集三份细胞， 用实时定量 PCR对 HCV RNA进行定量检测， GAPDH作为内参， 含量用 HCV R A拷贝 ¾/ug细胞总 RNA来表示，三个复孔,实验结果用 means士 s.e.m.表示。

图 4慢性 HCVcc感染实验， IFN-ci移除后化合物 (1-1 Z)持续抑制 HCVcc增 殖： 根据实施例 2慢性 HCVcc感染实验， IFN-α移除后 Huh7细胞内 HCV RNA 含量变化， 显示干扰素 -α单独给药组， 化合物 (1-1 Ζ)和干扰素 -α联合用药组给药 60天后， 维持干扰素 -α或移除干扰素 -α, 继续治疗到 80天， 干扰素 -α单独给药 组细胞内 HCV RNA含量显著性上升， 而化合物 (1-1 Z)联合给药组无论是维持干 扰素 -α或移除干扰素 -α, 细胞内 HCV RNA含量未见上升， 接近于未感染 HCV 细胞的 HCV背景值。 在实验过程中， 细胞开始给药治疗后， 等量收集三份细胞， 用实时定量 PCR对 HCV RNA进行定量检测， GAPDH作为内参， 含量用 HCV RNA拷贝 Mig细胞总 RNA来表示， 三个复孔，实验结果用 means ± s.e.m.表示。 图上的实验结果分别代表两次独立试验。

图 5化合物 (I- 1 Z)预防 HCV对树駒感染第四周血液 HCV RNA含量： 根据 实施案例 4的树駒预防 HCV感染实险，树齣 15只，每组 5只，分别为未给药组， I-lZ lm/kg组， I-lZ 5m/kg组。 在 HCV感染前， 未给药组口服生理盐水， 给药组 每天给药 1次 (给药方式为口服给药)， 持续给药 2周， 两周后对树齣进行感染， 感染后停止给药。 感染后第二周至第六周抽血测定 HCV RNA, 实验结果表明， 与未给药的动物相比， 在第 4周时， I-lZ lm/kg组， 5只树齣体内 HCV RNA的 含量低于检测限， I- 1Z 5m/kg組仅有一只树駒体内 HCV RNA的含量检测到浓度 极低的 HCV RNA。

图 6化合物 (1-1 Z)预防 HCV感染树駒第二周至第六周 HCV感染阳性检出 频次： 根据实施案例 4的树齣预防 HCV感染实验， 树齣 15只， 每组 5只， 分别 为未给药组， I- lZ lm/kg组， I-lZ 5m7kg组。 在 HCV感染前， 未给药组口服生理 盐水， 给药组每天给药 1次 (给药方式为口服给药）， 持续给药 2周， 两周后对树 齣进行感染， 感染后停止给药。 感染后第二周至第六周抽血测定 HCV RNA, 第 二周至第六周血液 HCV RNA阳性检测显示， I- lZ lm/kg组， I-lZ 5m/kg组的体 内阳性感染检出频次显著性低于未给药组，未 给药组阳性感染共检出 12次， I- 1Z lm/kg组阳性感染检出 3次， I-1Z 5m/kg组阳性感染检出 2次。

图 7树齣感染 HCV同时化合物 (1-1 Z)给药抑制 HCV对树駒的感染： 根据实 施案例 4的树駒同时给药试验： 实验树駒 10只， 每组 5只， 在 HCV感染时同时 给药， 未给药组每天口服生理盐水，给药组每天给药 1次 (给药方式为口服给药）， I-1Z 3mg/kg, 持续给药 2周， 给药两周后停止给药。 在 HCV感染前一天， 感染 后连续 4周每周抽血，在第 4周时，与未给药的动物相比， 60%树齣体内 HCV RNA 的含量低于检测限。 具体实施方式

式 (I)化合物按照 WO2011017907A1中所述的制备方法进行制备。

实施例 1 : 方法

HCVcc 病毒培养。 Huh7细胞 (CCTCC);丙型肝炎复制子 JFH-1 , sg2a, sglb (由 浙江大学附属医院馈赠)； JFH-1 经 Xbal酶切线性化， 体外用 TRANSCRIPT T7( OC¾ US，；)试剂盒转录，采用改良电转化的方法转 染细胞 ( rieger， et al. (2001) J. VIRO;. 75(10):4614-24)。所有细胞以 DMEM完全培养基培 (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA)， 10%胎牛血清 (Gibco), 100 单位的青霉素和链霉素， 2mM L- 谷氨酰胺 (Gibco)。 HCVcc病毒保存通过用 0.1FFU/细胞的感染复数 (ΜΟί)病毒感 染无病毒的 Huh7细胞， 18天后， 收集经电转体外转录的 JFH-1 R A的 Huh7细 胞上清所得。

试剂： 重组人干扰素 2a(ROCH,US)和 β因子 (MERK,GM)用含有 10%胎牛血 清的 DMEM重悬使浓度到达 50υ/μ1。全部转移到试管中， -80。C保存。化合物 (1-1 Z)用 DMSO稀释到 20mM, 4。C保存。

急性 HCV病毒感染实验。 细胞生长组： Huh7细胞以 4χ 10 ³ /孔接种于 96孔 板 (CORNING, US),培养 24小时。细胞不生长组： Huh7细胞接种于 96孔 BIOCOAT 培养板中（BD Biosciences), 细胞密度为 8x l0 ³ /孔。 当细胞汇合度达到 90%, 将培 养基换成 200μ1含有 l%(v/v)DMSO(Sigma)的 DMEM完全培养基， 继续培养 20 天， 每 2天换一次培养基 (Sa z, Jr.&Chisari(2006). J.Virol. 80:10253-7; Choi ₅ et al. (2009)xenobiotica39:205-17)o细胞用感染复数为 1或 0.1 FFU的 HCVcc电转感染， 感染 12小时。 实验设计三组， 1)细胞在感染之前用浓度分别为 40、 20、 10、 5μΜ 的化合物 (1-1 Ζ)处理 6小时 (感染前给药），设置阴性对照； 2)在细胞感染病毒同时 立即加入浓度分别为 40、 20、 10、 5μΜ的化合物 (I-1 Z), 共同培养 12小时（同时 感染同时给药）； 3)细胞在感染 HCVcc病毒后立即加入浓度分别为 40、 20、 10、 5μΜ化合物 (1-1 Z)处理 60小时 (感染后给药）。指标检测： 1)HCV RNA含量分析， 总 RNA用 l x核酸裂解纯化试剂 (Invitrogen)在感染之后裂解三个孔， 提取 RNA 进行 RT-qPCR分析。 2)HCV病毒包膜蛋白 E2检测， 移除培养基， 用 4%的多聚 甲醛 (w/v)(sigma)固定 72小时， 对 HCV病毒 E2包膜蛋白免疫组化分析。

慢性 HCVcc感染实 -险。 细胞生长组： Huh7细胞接种于 T75(Coming)细胞培 养瓶中， 接种量为 ΙχΙΟ ⁶ 个， 以 0.01FFU/细胞感染复数的 HCVcc ( JFH -1 )感染 细胞 ， 继续培养 12天使 HCV RNA达到稳态水平。 第 12天， 细胞按 1: 4比例 接种于 4个 T25(Coming)细胞培养瓶中，培养 24小时后 , 4瓶细胞分别用 DMEM 完全培养基、 含 IFN-a(100U/ml)的 DMEM完全培养基、 含化合物 (1-1 Ζ)(20μΜ) 的 DMEM完全培养基、同时包含 IFN- a(100U/ml)和化合物 (I- 1 Ζ)(20μΜ)的 DMEM 完全培养基培养。 实验中每两天更换培养基， 细胞长满前， 用胰蛋白酶消化， 1:3 传代， 保持细胞活力。 每次传代时， 收集细胞， 1200转 /min， 离心 5分钟， 总 RNA用核酸提取试剂（Invitrogen)提取， 反转录后， 进行 RT-qPCR检测。

细胞不生长组： Huh7细胞， 接种于 48孔 BIOCOAT培 ^板中 (BD), 细胞接 种密度为 ΙχΙΟ ⁴ 个 /孔， 在含 1%DMS0环境中培养 20天， 细胞用 0.01 FFU/细胞 感染复数的 JFH-1 HCVcc进行侵染， 14天后使 HCV RNA达到稳悉水平。 在侵 染后第 14天， 同细胞生长组， 细胞用 DMEM完全培养基、 含 IFN-a(100U/ml) 的 DMEM完全培养基、 含化合物 (1-1 Ζ)(20μΜ;)的 DMEM完全培养基、 同时包含 IFN-a(100U/ml)和化合物 (1-1 Ζ)(20μΜ)的 DMEM完全培养基培养。每两天更换培 养基。 培养至设定时间， 从三平行孔中用 RNA核酸提取试剂 (Invitrogen)提取总 RNA, 反转录后， 进行 RT-qPCR检测。

RNA提取和 RT-qPCR检测。 细胞总 RNA用核酸提取试剂 (Invitrogen)提取 总 RNA, 操作步骤如说明书所示。 每微克纯化 RNA用 K1622反转录试剂盒 (Thermo)进行 cDNA合成， 随后用 CFX CONNECT (BIO- rad)定量 PCR仪进行 SYBR green定量 RT-qPCR。 PCR循环包括 95°C 10分钟的变性， 随后 40个扩增 循环 (95°C , 15s)以及退火 /延伸 (60°C , lmin)。 HCV JFH-1和 GAPDH转录水平的 测定是依据 JFH- 1 HCV cDNA或人 GAPDH基因的质粒的各自系列稀幹后制备的 标准曲线算出。 用于检测 GAPDH和 HCV的 PCR引物是： 人 GAPDH, 5'-GAA GGT GAA GGT CGGAGT C-3， (正向引物) (Seq.ID.No.l)和 5，-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3， (反向引物）（Seq.ID.No.2); JFH-1 HCV , 5'-TCT GCG GAA CCG GTG AGT A-3' (正向引物）（Seq.ID.No.3)和 5'-TCA GGC AGT ACC ACA AGG C-3， (反向引物）（Seq.ID.No.4)。

细胞外病毒感 滴度实验。 Huh7细胞上清液用 DMEM完全培养基 10倍梯 度稀释， 取 ΙΟΟμΙ用来浸染接种于 96孔板 (BD Biosciences)中的细胞， 细胞密度 为 4xl0 ³ /孔， 每个浓度 3个复孔。 37°C孵育 24h, 然后加入 150μ1含 0.4%甲基纤 维素 (w/v)(Fhika BioChemika, Switzerland)的 DMEM完全培养基， 甲基纤维素终 浓度为 0.25%。 浸染 72h后， 吸出培养基， 细胞用 4%多聚甲醛 (Sigma)进行固定， 然后对 HCV E2包膜蛋白进行免疫組织化学染色。 免疫组化步驟： 细胞先用含有 0.3%(v/v)过氧化氢 (Fisher, Fairlawn, NJ)的 1χ磷酸盐緩冲液 PBS ( pH7.2 )进行 孵育，封闭内源性过氧化物酶。 随后用 lx磷酸盐緩冲液 PBS ( pH7.2 )漂洗三次， 细胞用含 0.5%(v/v)TRITON X-lOO(Fisher), 3%(w/v)牛血清蛋白 (BSA)(Sigma)和 10%(v/v)胎牛血清封闭 1小时。随后用 lx含 0.5%(v/v)TRITON X-100、3%(w/v)BSA 及 1:500稀释的人抗 HCV E2单克隆抗体 C1 的 PBS室温孵育。 结合的 C1用 1:1000稀释的 HRP偶联的抗人抗体 (Pierce, IL)孵育 1小时， 接着与 AEC检测底 物 (BD Biosciences)孵育 30分钟。 细胞用蒸镏水清洗， 然后在 Onlympus 1X5显微 镜下观察， 病毒的感染滴度用 FFU每毫升上清液 (FFU / ml)表示， 即最高稀释水 平检测到 HCV E2阳性的三个复孔平均数。

Westem Blot检测。 收集细胞， 用含有蛋白酶抑制剂的 Cocktail(Roch,IPA)的 TRITON X-100裂解液 (TRITON X-100, 50 mM TRis-HCl, PH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA)裂解细胞。取 50微克蛋白质进行 SDS-PAGE电泳中，然后转印到尼 龙硝基纤维素膜 ( O-RAD电泳仪， US)上。 接着用 5%脱脂奶粉封闭 2小时， 然 后用 1 :1000稀释的小鼠抗 HCV NS3单克隆抗体 (9-G2Clone, ViroGen, Watertown, MA)孵育，用含 0.05% 吐温 20 的 PBS清洗 3次，用辣根过氧化物酶偶联的山羊 抗小鼠抗体 (Pierce, Rockford, Illinois)孵育， 然后再次清洗。 用 SUPERSIGNAL 化学发光底物 (Pierce)检测蛋白抗体复合物。

细胞增殖和细胞毒性生物荧光检测。 细胞增殖 ATP检测试剂盒 (Peomega, US), 它是检测细胞内 ATP含量作为细胞活力和增殖的检测方法。 按照说明书方 法使用 cdltiter-glo@luminesent cell viability assay试剂盒进行检测。 实验步驅： 加入 lOOul的 ATP检测试剂到 lOOul培养的阴性对照组和药物处理组细胞振荡 15 分钟， 进行荧光检测。 为评价药物引起的细胞毒性， 使用了一种检测受损细胞释 放的人丙氨酸转移酶 (ALT)的 ELISA试剂盒 (上海索宝来生物科技有限公司）， 按 照试剂盒使用说明书的操作方法进行检测， 结果表明， 在 1- 40μΜ浓度范围内化 合物 (1-1 Ζ)处理 Huh7细胞 12 h无细胞毒作用。

数据统计。 用平均值士平均值的标准误差 (sem)表示数据。 通过图氏检验 (GRAPHPAD, San Diego, CA)的单方向分析 (ANOVA)差异确定显著性差异。 实施例 2: 化合物 (Ί-1 Ζ)、 化合物 α-12 Ζ)、 化合物 (I-6 Z)阻止 HCV病毒侵入细胞 式 (I)化合物为氮杂环丁酮类药物， 是一种抗高血脂， 降低胆固醇的药物， 实 验结果表明它可在体内抑制胆固醇的吸收， 在金黄地鼠， 猴子上具有降低血桨低 密度脂蛋白（LDL)和总胆固醇 (WO2011017907A1)的作用，在人上同样具有降低血 浆低密度脂蛋白 (LDL)和总胆固醇的作用。感染的 HCV病毒颗粒富集在细胞内的 胆固醇中 (Aizaki, et al.(2008)J.Virol.82:5715-24),推测式 (I)化合物具有抑制 HCV 病毒侵入细胞的作用。 同样，化合物 (1-1 Z)抑制 HCV进入细胞的活性可通过检测 细胞内 HCV病灶的数量来进行译价。 Huh7 细胞接种感染复数 (MOI)为 1.0或 O.lFFU/ceil的源自细胞培养的 HCV(HCVcc), 设感染前给药， 感染同时给药， 感 染后给药三个组， 用递增浓度为 (0,5,10,20和 40μΜ)化合物 (1-1 Z)进行处理。 感染 前 6h给药处理然后去除化合物再感染病毒 6h或不去除化合物感染病毒 6h,相对 于未处理细胞 (0 μΜ 1-1), 化合物 (1-1 Ζ)显著性降低 HCV病灶数， 并存在剂量效 应。 特别是与未处理的培养相比， 分别用 10, 20, 40 μΜ化合物 (1-1 Z)预先处理 细胞时， 感染病毒 24小时后检测细胞内病毒含量， 分别抑制 30%, 89.9%和 97% 的 HCV病灶形成 (图 1)， 而当用 HCVcc分别和 10, 20, 40 μΜ化合物 (1-1 Ζ)共 同孵育细胞时， 观察到分别为 92%， 95%, 99%的抑制率。 然而， 当感染后 (感染 后给药)在细胞中加入化合物 (1-1 Z)时， 抑制程度显著性降低。

感染前 6h分别用 20μΜ化合物 (I-1 Z)、化合物 (1-12 Z)、化合物 (1-6 Z)预先处 理细胞，感染病毒 24小时后检测细胞内病毒含量，化合物分别抑� �� 88.3%、 73.2% 和 23.5%的 HCV病灶形成 (图 2)。

与前给药再感染组一样， 定量检测感染后给药组 24、 48和 72 h时的 HCV RNA水平， HCV感染抑制作用呈现剂量效应和感染时间效应 。 细胞病毒感染前 6 h用 20 μΜ化合物 (1-1 Ζ)处理后， 至少在 48 h内化合物 (1-1 Z)能够保护细胞免 受病毒的感染。 感染同时给药组也有效的抑制 HCV感染， 与阻止病毒侵入细胞 实验结果一致。 感染后加入化合物 (1-1 Z)不能有效保护细胞免受病毒的感染， 仅 在感染后 72小时检测到 HCV RNA水平轻微降低。

为确保观察到的抑制作用不是因为化合物 (1-1 Z)诱导的细胞增殖或细胞毒性 所导致， 化合物 (1-1 Z)梯度浓度处理细胞后， 测定细胞内的 ATP, 计算 Huh7细 胞活力、 增殖， 检测培养液 ALT水平， 评价化合物对细胞的毒性。 这些结杲证 明使用任何剂量的化合物 (I- 1 Z)处理细胞不能抑制细胞增殖或引起细胞内毒� ��。 此外， 用不生长组的 Huh7细胞培养进行了相似的实验， 得到了类似的结果， 这 种不生长组的 Huh7细胞更好的模拟了体内肝细胞的未分裂状� �。 此外， 为测定 观察的 HCV抑制作用的特异性,评价了化合物 (1-1 Z)抑制另一种黄病毒登革热病 毒 (DNV, 中国科学院武汉病毒研究所)进入细胞的 ^用。 与 HCV不同， 用 10， 20, 40 μΜ化合物 (1-1 Z)处理细胞， 未观察到明显的 DNV斑形成的减少。 因此， 以上结果表明 ,化合物 (1-1 Ζ)是 HCVcc感染早期阶段的一种有效的和特异性的抑 制剂。

化合物 (1-1 Z)未抑制 HCV R A复制实验。 已知的其它抗高血脂降胆固醇药 物是作用于胆固醇生物合成途径而不是抑制游 离的胆固醇摄取， 化合物 (1-1 Z)抑 制 HCV复制实验直接通过用剂量递增的化合物 (1-1 Z)处理转染了 HCV基因 2a 或者 lb亚属 (sg)的复制子的 Huh7细胞， 平行实验阳性对照： 洛伐他汀， 胆固醇 生物合成抑制剂， 能够降低 HCV sglb RNA复制 (Kapadia & Chisari (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:2561-6; Ye, et al. (2003) Proc. Natq. Acad. SCi. USA 100:15865-70; Tobert (2003) Nat. Rev. Drug Discov. 2:517-26 )和抑制 HCVcc颗粒 分泌 (Kapadia & Chisari (2005) supra)。 与前文所述， 进行 RT-qPCR检测， 感染 病毒的细胞经 72小时后药物处理后， 洛伐他汀降低 sglb RNA水平 22倍， 但对 sg2a RNA水平无效。相比之下，用化合物 (1-1 Z)递增剂量处理，未观察到细胞 sglb 或 sg2a HCV RNA定显著性降低。 药物处理 24 h和 48 h得到了相似的结果。 另 外， 当对 HCVcc灶形成抑制剂评价时， 感染前给药， 感染同时给药， 感染后给 药组加入洛伐他汀没有影响。 因此， 这些结果同时表明胆固醇生物合成抑制剂， 如洛伐他汀， 抑制 HCV RNA复制和颗粒外出， 不像化合物 (1-1 Z)那样， 它们不 影响 HCV侵入。

为证明化合物 (1-1 Z)是否抑制 HCV与细胞结合或随后的内化，检测了 HCVcc 感染的细胞未处理组和化合物 (1-1 Z)处理組的细胞内 HCV RNA和相关蛋白质。 与化合物 (I-l Z)不能抑制病毒颗粒结合的细胞一样，在细胞� ��染病毒后， 8 h未经 或经式 (I)化合物处理后， 各组细胞所检测的 HCV RNA水平相近。 不同的是， 就 阻止 HCV侵入细胞作用上， 在化合物 (I-l Z)处理组后面时间点未观察到 HCV RNA扩增和 NS5A蛋白质的表达,试验结果表明虽然 HCV能有效的与化合物 (1-1 Z)处理的 Huh7细胞结合， 但结合后进一步感染启动步骢被阻断了。

自从 1980年度以来， IFN- α已经作为慢性 HCV治疗的基础药物， 我们考察 了干扰素和化合物 (I-l Ζ)对慢性感染 HCVcc病毒的 Huh7细胞的联合作用。 具体 步骤： 感染了 HCVcc病毒的 Huh7细胞培养 12天， 使 HCV RNA达到稳定状态 水平。 平行实验， 阴性对照组 (除未加药物外， 其他处理方式与给药组一致)， 式 (I)化合物给药组， IFN-a组， IFN-a和化合物 (I-l Z)联合给药组组， 细胞达到 90% 汇合度时 1: 3传代，维持培养大约 60天。与阴性对照组，单独加入化合物 (1-1 Z) 没有降低细胞内的 HCV稳态的 RNA水平 , 而单独加入 IFN- a(100 U/ml)组第 30 天后细胞内的 HCV RNA水平 P条低 2个数量级。尤其当 IFN-a和 20 μΜ化合物 (I- 1 Ζ)联合应用时（图 3), 表现出强大的协同效应。 通过处理后培养 30天， IFN-a和 20 μΜ化合物 (I-l Z)联合应用有效降低 HCV RNA至背景值(≥4数量级减少量)， 该结果表明联合给药治愈了慢性病毒感染的细 胞。

为证实药物对 HCV清除率， 在 60天时， 终止药物治疗， 并开始连续监测 HCV RNA水平 20天。 在加入 100U/ml IFN-a组的细胞 HCV RNA水平立即反弹 到阴性对照组的水平（图 4), 而在 lOOU/ml IFN-a和化合物 (1-1 Ζ)(20 μΜ)联合给 药组的细胞 HCV RNA未出现反弹 (图 4)， HCV蛋白免疫组化染色试验也证实了 这一点。与 IFN-a单独给药组相比， IFN-a与化合物 (1-1 Z)联用给药慢性感染 HCV 的不生长的 Huh7细胞后， 第 60天后， 变现出显著的协同作用， 降低 HCV RNA 水平一个数量级以上。

我们也进行了单独使用 IFN-p(20U/mi)或联合给药 (20或 40 μΜ化合物 (I-l Ζ) 和 20U/ml IFN-β联合给药）的药效学研究。 药物处理感染 HCV的细胞 8周，每周 收集 3个复孔的细胞内 RNA, RT-qPCR方法检测 HCV RNA。 实验结果表明， 化合物 (I-l Z)单独给药组未减少 HCV感染 (即稳定状态下的细胞内 HCV RNA水 平)。 与阴性对照组比较， IFN- β单独给药组从第 3周到第 8周， 显著性降低细胞 内 HCV R A水平 (大约 100倍)，证明了 IFN-β具有抑制慢性 HCV感染的药理学 活性。 值得注意的是， 当 IFN- β和 20或 40 μΜ化合物 (I-l Ζ)联合给药时观察到 了显著性的协同效应。 与 HCV培养组 (阴性对照组)相比， 尤其是 IFN-P(20U/ml) 和 40 μΜ化合物 (1-1 Ζ)联合给药， 在加药后第 4周， 协同显著性降低 HCV RNA 水平 (>10000倍)， 在加药后第 6周到第 8周， 协同降低 HCV RNA水平到 >50000 倍。 检测的 HCV RNA拷贝数水平与正常细胞的本底值相近， 表明药物治愈了因 HCV感染的细胞。 这说明观察到的抑制作用不是因治疗引起的细 胞毒作用的所 致， 而是药物发挥了治疗作用。

总之， 这些数据表明， 无论宿主肝细胞增殖水平如何， 在体外实验中， 化合 物 (I-l Z)与 IFN-a或 IFN-β的能够协同显著性减少慢性 HCV的感染。 因此， 不论 是单独治疗， 还是作为目前的 HCV干扰素治疗方案的一种辅助疗法， 式 (I)化合 物均可应用在 HCV感染的预防或治疗中。

实施例 3: 化合物 (1-1 Z)的体内活性

丙型肝炎病毒感染及相关预防或治疗感染的丙 型肝炎病毒感染的药物研究， 因缺乏丙型肝炎病毒感染的小动物模型的缺乏 而受到限制和阻碍。 虽然开发了几 种小动物感染模型： 树駒 (Xie,et al.(1998)Virology 244:513-520 , Zhao , et al.(2002)J.Clin.Invest. 109:221 - 232 ) , 狨猴 /絹毛猴（Fdnstone， et al.(1982)J.Infect.Dis.l44:588-598;Karayiannis , et al.(1983)J,Med.Virol.ll:251-256;Watanabe, et al.(1987)J. Med.Virol.22: 143-156),和 其他灵长类动物 (Abe, et al.(1993)J. Med.PrimatoL22:433-434), 然而丙型肝炎病毒 仅能在黑猩猩上成功感染。 最近， 肝异种植入的方法已经成为构建丙型肝炎病毒 感染的小鼠模型的一种公认的方法 ( netman & Mercer(2005 年）. Hapatology 41:703-706; Kneteman &Toso(2009)Methods Mol.Biol. 510:383-399; Grompe, et al.(1999)Semin.Liv.Dis.l9:7-14) ₍ ,这种方法将人原代肝细胞移植到具 内源性肝细 胞致死缺陷的免疫缺陷小鼠肝脏上。 随着小鼠内源性肝细胞死亡， 移植的人原代 肝细胞可以重新填充小鼠肝脏， 导致小鼠形成嵌合肝脏， 允许 HCV感染。

因此， 为证明化合物 (1-1 Z)的体内活性， 实验使用三重突变体 (包括 Fag-/- / RAG2-/- /I12rg-/-小鼠）的小鼠进行实验， 这种小鼠被证明能够接受肝异种植入 (Azuma,et al(2007)Nat. Immunol Biotechnol. :25 :903-910;Schultz,et al.(2007)Nat.Rev,Imm nol.7:118 - 130)„ 当然，也可以使用免疫缺陷 (SCID)/尿激酶 型纤溶酶原激活剂 (uPA)同时缺陷的小鼠。 人原代肝细胞移植小鼠， 按常规方法 (Azuma,et al(2007)Nat. Immunol Biotechnol. :25 :903-910; Bissig ,et al.Proc.Natl.Sci.Acad.USA 104:20507-20511), 移植后监测 2个月， 通过测量 ^ k 清白蛋白水平来评估移植效杲。 使用这些模型， 可以评估药物对小鼠的丙型肝炎 病毒感染的预防或对已经感染丙肝病毒的抑制 效果。

为证明预防作用， 小鼠在感染丙肝病毒前， 给予下列 2种给药方式： 1) 小 鼠在被感染前一天口服 10mg/kg/天化合物 (1-1 Z), 2)小鼠在被感染前口服 lmg/kg/ 天， 3mg/kg/天的化合物 (1-1 Z)7天。 小鼠被注射任何 HCV基因型 HCV阳性的人 血清， 同时定量检测血清 HCV RNA含量 (每天和 /或每周）， 以评估药物在降低扩 增 HCV R A水平方面的效果。 实验结果表明，与未给药的动物相比，化合物 (1-1 Z)降低了感染 HCV动物体内的 HCV增殖水平， 提示化合物 (1-1 Z)对人类是一种 有效的 HCV治疗药物。 因此， 可以预期，化合物 (1-1 Z)可以 效抑制丙型肝炎病 毒感染。

为证明治疗作用， 小鼠感染 HCV阳性的人血清 (任何 HCV基因型）。 对血清 HCV R A进行定期监测， 确认成功感染， 建立稳定的体内慢性感染模型。 慢性 丙型肝炎病毒感染的小鼠分别进行以下平行给 药处理 (1)1型干扰素 (例如，皮下注 射派罗欣 30μ _β /]<¾, 每周两次)， （2)口服化合物 (1-1 Ζ) (单用）， 剂量为 10mg kg/天 (3)1型干扰 (例如， 派罗欣 (3(^g/kg,每周两次)和化合物 (1-1 Z)(10mg/kg/天)联合 用药。 在治疗期间， 每周对血清 HCV RNA进行定量检测， 评估各组给药方案对 稳态 HCV RNA水平減少的疗效。 实验结果表明， 化合物 (1-1 Z)单独或与 IFN联 用均可降低体内 HCV水平， 提示化合物 (1-1 Z)能够有效治疗感染 HCV的患者。 因此， 可以预期， 与 I型干扰素或化合物 (1-1 Z)单独治疗相比， I型干扰素和化合 物 (1-1 Z)联合给药将协同增强 HCV感染的清除。

实施例 4: 化合物 (Ί-1 Z)的体内活性

为了进一步检测化合物 (I-1Z)对 HCV的体内侵入抑制效果，本发明在已培育 完善的丙肝易感模型品系-树駒 (Tupaia belangeri, Li et al.201i)上对化合物 (I-IZ) 进行了药效学研究。

预防实验： 实验树齣 15只 ,每组 5只，分别为未给药组， lm/kg组， I- 1Z 5m/kg组。 在 HCV感染前， 未给药组口服生理盐水， 给药組每天给药 1次 (给药 方式为口服给药）， 持续给药 2周， 两周后对树齣进行感染。 感染后第二周至第 六周抽血测定 HCV R A。实验结果表明，与未给药的动物相比，在� � 4周时， I-1Z lm/kg组， 5只树駒体内 HCV RNA的含量低于检测限， I-1Z 5m/kg組仅有一只 树齣体内 HCV RNA的含量检测到浓度极低的 HCV RNA,说明化合物 (I-1Z)能有 效预防 HCV对树齣的感染 (图 5); 第二周至第六周血液 HCV RNA的检测显示， I-1Z lm/kg组， I-lZ 5m/kg组的体内阳性感染检出频次显著性低于未� ��药组 (图 6), 未给药组阳性感染共检出 12次， I-1Z lm/kg组阳性感染检出 3次， I-lZ 5m/kg组 阳性感染检出 2 次。 I- 1Z预防实验结杲提示化合物 (I-1Z)对人类是一种有效的 HCV感染预防药物。

同时给药实验： 实验树齣 10只， 每组 5只， 在 HCV感染时同时给药， 未给 药组每天口服生理盐水， 给药组每天给药 1 次 (给药方式为口服给药）， I-1Z 3mg/kg, 持续给药 2周。 在 HCV感染前一天， 感染后连续 4周每周抽血， 在第 4周时， 与未给药的动物相比， 60%树齣体内 HCV RNA的含量低于检测限， 表 明化合物 (I-1Z)能有效预防或治疖 HCV对树齣的感染 (图 7),结果提示化合物 (I-1Z) 在感染同时给药同样能有效抑制 HCV感染。