МИКРООРГАНИЗМЫ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ

МНОГОЛЕТНЕМЕРЗЛЫХ ПОРОД И ОБЛАДАЮЩИЕ

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ И ГЕРОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к штаммам микроорганизмов и может быть использовано для стимулирования деятельности иммунной системы и увеличения продолжительности жизни животных и человека.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В условиях, когда фундаментальные механизмы старения по- прежнему представляют собой актуальную проблему, изучение клеток, способных выживать в течение тысячелетий вполне может представлять интерес для геронтологии. Свидетельства жизнеспособности микроорганизмов в мерзлоте появились еще в девятнадцатом столетии. С.С. Абызов в 1979 году обнаружил во льду на Антарктической станции Восток бактерии, грибы, диатомеи и другие микроорганизмы (Абызов С.С, Бобин Н.Е., Кудряшов Б.Б., 1979. Микробиологические исследования ледника в Центральной Антарктиде. Известия АН СССР, серия Биология, 6, с. 828-836). Не отрицая вероятности развития микроорганизмов в мерзлых породах, отметим, что их рост, вероятно, затруднен. Даже в лабораторных условиях стареющие культуры, как известно, прекращают расти. Кристаллизация воды и остановка внешнего обмена веществ уменьшает способность к росту. Поэтому можно считать, что бактерии в многолетнемерзлых породах представляют собой ископаемые, реликтовые организмы. Их возраст подтверждается геологическими условия местонахождения (Баранова Ю.П., Ильинская И.А., Никитин В.П., Пнева Г.Н., Фрадкина А.Ф., Шварева Н.Я. Миоцен Мамонтовой горы. Труды ГИН СО АН СССР. Наука. Москва. 1976. 284 с), радиоуглеродными датировками (Katayama Т., Tanaka М., Moriizumi J., Nakamura Т., Brouchkov A., Douglas Т.А., Fukuda M., Tomita R, Asano K. Phylogenetic Analysis of Bacteria Preserved in a Permafrost Ice Wedge for 25,000 Years. Appl. Environ. Microbiol., Apr. 2007: 2360-2363), изучением оптических изомеров аминокислот (Brinton K.L.F., Tsapin A.I., Gilichinsky D., McDonald GD. Aspartic Acid Racemization and Age-Depth Relationships for Organic Carbon in Siberian Permafrost. Astrobiology, Volume 2, Number 1, 2002, p.77-82), косвенно, биоразнообразием встречаемых видов (Friedmann EI. 1994. Permafrost as microbial habitat. In Viable Microorganisms in Permafrost. Russian Academy of Sciences: Pushchino, Russia; 21-26).

Природа длительной жизнеспособности микроорганизмов в древней мерзлоте не имеет исчерпывающего объяснения. Способность реликтовых микроорганизмов сохранять жизнеспособность длительное время предполагает существование механизма, предотвращающего накопление повреждений. Мы считаем возможным использование этого механизма для лечения болезней и продления жизни животных и человека.

Настоящее изобретение относится к бактериям рода Bacillus, найденным в древних многолетнемерзлых породах Якутии.

Известен штамм бактерий Bacillus subtilis 1719, выделенный в естественных условиях и проявляющий широкий спектр антагонистической активности, низкую адгезивную активность и иммуномодулирующую активность (патент RU 2298032 С2, опубликовано 27.10.2007). Известен штамм бактерий Bacillus macroides Excel 00, выделенный из мицелия лекарственного гриба Agaricus Blazei Murill , проявляющий иммунную активность и способность препятствовать старению и болезням (заявка JP 2008-005702 А, опубликовано 17.01.2008).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Патентуемый штамм Bacillus sp., в отличие от известных, выделен из вечной мерзлоты, возраст которой составляет многие тысячи лет, и поэтому характеризуется исключительной жизнеспособностью и способностью выживать в течение длительного времени при низких температурах. В экспериментах с его культурой наблюдается увеличение мышечной силы, увеличение физической и умственной активности, иммуномодулирование и замедление старения.

Указанный технический результат достигается микроорганизмом - штаммом Bacillus sp., выделенным из многолетнемерзлых пород и обладающим иммуномодулирующей и геропротекторной активностью.

Штамм Bacillus sp. задепонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУШ осНИИГенетика 30.01.2009, регистрационный номер ВКПМ: В-10130.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Для получения микроорганизмов из мерзлых пород были отобраны образцы из естественных обнажений. Они расположены на левом берегу Алдана, в 325 километрах вверх по течению от его впадения в Лену, на Мамонтовой горе. Образцы были отобраны в 0.9-1 м глубже слоя сезонного оттаивания. Обнажение разрушается рекой (более метра в год), так что отложения, из которых отбирались образцы, находились, очевидно, в многолетнемерзлом состоянии. При этом происходит ежегодное весенние смывание обрушений, предотвращающее завалы и смешения пород. Последние представляют собой тонкозернистые пески и алевролиты; их возраст соответствует среднему миоцену (Баранова Ю.П., Ильинская И.А., Никитин В.П., Пнева Г.Н., Фрадкина А.Ф., Шварева Н.Я. Миоцен Мамонтовой горы. Труды ГИН СО АН СССР. Наука. Москва. 1976. 284 с). Похолодание началось здесь в конце плиоцена, около 3 - 3.5 миллионов лет тому назад. Температура в январе для того времени была оценена от -12 до -32°С, а в июле от +12 до +16°С. Отложения, по-видимому, не оттаивали в плейстоцене из-за холодного климата Якутии. Таким образом, возраст мерзлоты на Мамонтовой горе, вероятно, может достигать 3.5 миллионов лет. Кроме того, были отобраны образцы из повторно-жильных льдов ледяного комплекса в Якутии и на Аляске: в тоннеле Фокс и на золотом руднике вблизи Фербенкса, а также из стенок подземелья Института Мерзлотоведения им. П.И.Мельникова в Якутске.

1.1. Отбор образцов

Пробы отбирались с использованием стерилизованных спиртом и обожженных в пламени металлические инструменты (буры, пинцеты, скальпели). Для того, чтобы провести поверхностную стерилизацию образцов, проба весом около 50 г помещалась в стакан с 96% раствором этанола на одну минуту, и затем в пламя горелки на примерно 2 сек и, наконец, в стерильную пробирку. Отобранные породы хранились при температуре -5°С, что было близко к естественным условиям. Транспортировка проб осуществлялась в термоконтейнерах с хладагентами в мерзлом состоянии.

1.2. Рост на искусственных средах

Образцы различного разведения в стерильных условиях добавлялись в чашки Петри, содержащие среды YPD, MRS и NA (см инструкцию Manual of environmental microbiology. 1997. Ed. Hurst C.J. FSM Press. Washington DC. 894 p.). Образцы добавлялись также в жидкий мясо-пептонный бульон в анаэробных и аэробных условиях.

1.3. Получение и секвенирование ДНК

Рибосомальная ДНК микробной культуры извлекалась с помощью Fast DNA kit for soil (BIO 101 Inc., Vista, CA), где применяется метод, основанный на разрушении клетки стеклянными шариками. Нуклеиновые кислоты осаждались из раствора с использованием раствора, состоящего из 0.1 части 3 М ацетата натрия (рН 5.2) и 2.5 частей этанола, инкубировались на льду, а затем центрифугировались в течение 30 минут на скорости 12,000 об./мин. Осажденные нуклеиновые кислоты растворялись затем в дистиллированной воде (свободной от RN-аз и DN-аз), и хранились при -20°С. Фрагменты 16S rRNA были амплифицированы ПНР, проводимой с бактериальными праймерами (27F; 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', 1492R;

5 ' -TG ACTG ACTGAGG YTACCTTGTTACGACTT-3 ' ) . ПЦР проводилась в объеме 20-μ1 с помощью GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) следующим образом: 4 мин при 94°С, затем 30 циклов по 1 мин при 94°С, 1 мин при 50°С, и 1.5 мин при 72°С, затем 7 мин при 72°С. ПЦР ампликоны подвергались электрофорезу и очищению с помощью Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Madison, USA). Очищенные ампликоны были клонированы с использованием pCR2.1 вектора, культуры Е. coli, а также ТА cloning kit (Invitrogen) в соответствии с рекомендациями производителя. Из суточной культуры ДНК плазмид, содержащая 16S rDNA, получена с помощью Mini prep spin kit (Quiagen, Crawley, UK). Очищенные ДНК плазмид секвенировали на ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer с помощью Big Dye Terminator cycle-sequencing kit (Applied Biosystems). Амплицицированные продукты 27F-1492R были секвенированы в обоих направлениях с праймерами 27F, 357F (5'- CTACGGGAGGCAGCAG -3'), 520R (5'-ACCGCGGGGTGCTGGC- 3'), 920F (5 '- AAACTC AAAGGAATTGACGG-3 '), 1080R (5'- CCCAACATCTCACGAC-3') и 1492R как описано Mori et al. (1997). Длина последовательности составила 1488 bp. Полученная последовательность сравнивалась с другими, используя BLAST (Altschul et al., 1997). Филогенетическое дерево строилось по методу Saitou и Nei (1987), используя CLUSTAL W software package (Thompson et al., 1994). Нуклеотидная последовательность 16S rRNA была депонирована в DDBJ/EMBL/GeneBank под номером АВ 178889, идентификационный номер 20040510203204.24251.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ВЫДЕЛЕНИЯ, ИЗУЧЕНИЯ РОСТА И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

В мерзлых миоценовых отложениях на Мамонтовой горе было обнаружена культивируемая бактерия, способная к аэробному и анаэробному росту в средах YPD, MRS и NA; оптимальная температура роста определена в +37°С. Микроорганизм является психротолерантным, т.к. способен к метаболической активности при -5°C. Бацилла представляет собой сравнительно большую ((1- 1.5) х (3-6) микрон) палочку, которая в культуре соединяется в цепи, и способна образовывать споры круглой формы. Она слабоподвижна, грамположительна, непатогенна. Микроорганизм принадлежит роду Bacillus и является новым видом. Наибольшее видовое подобие выделенной бациллы отмечено с В. cereus и В. macroides., гомология с 16S rRNA которых составляет 99 и 97% соответственно .

Выживание и рост бацилл при низких температурах наблюдались ранее; известно, например, что Bacillus anthracis легко переносит замораживание (Luyet B.J., Gehenio P.M. 1940. Life and death at low temperatures. Biodynamica: Normany, Missouri; 99 p., a также Baross J.A., Morita R.Y. Life at Low Temperatures: Ecological Aspects. In Microbial Life in Extreme Environments, Kushner DJ (ed.). Academic Press: London 1978; 9 - 71). Однако оптимальная температура роста найденной бациллы довольно высока. Несмотря на то, что она оказалась способной на искусственной среде расти и ниже нуля, видимых колоний на мерзлых образцах при этом не наблюдалось. Насколько активна ее жизнь в мерзлоте, неясно; это относится и к микроорганизмам, выделенным из льдов Центральной Якутии и Аляски (Katayama Т., Tanaka М., Moriizumi J., Nakamura Т., Brouchkov A., Douglas Т.А., Fukuda M., Tomita R, Asano K. Phylogenetic Analysis of Bacteria Preserved in a Permafrost Ice Wedge for 25,000 Years. Appl. Environ. Microbiol., Apr. 2007: 2360-2363).

Штамм Bacillus sp. ВКПМ B-10130 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические особенности штамма: Морфологические: прямые палочки с закругленными концами, слабоподвижные 1-1 ,2 х 3-10 мкм, по 1-2, цепочки до 7. Образует эндоспоры овальной формы, расположенные центрально и терминально, не превышающие размер вегететивных клеток. Грамположительные.

Культуральные: Оптимальные условия (температура + 30- 37°С, аэробные условия): однако способен расти и при температурах от +5°С и до 43 °С и в широком разбросе значений рН.

На плотных агаризованных питательных средах образуют полиморфные, непрозрачные, блестящие, слегка шероховатые, мягкие колонии слабо желтоватого оттенка, с волнистым краем.

Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПА, МПБ).

Для культивирования Bacillus sp. ВКПМ В- 10130 применяют среду следующего состава, г/л: пептон 10, дрожжевой экстракт 5; вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 37°С и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста.

Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при -70°С или в лиофильно-высушенном состоянии.

Физиологические признаки.

Не обладает гемолитической активностью, не подавляет рост типовых штаммов Bacillus cereus, Escherichia coli, Candida albicans, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, каталазоположителен, растет при концентрации NaCI до 5%, но не на 10% , устойчив к рифампицину, оксациллину, полимиксину, цефтазидиму, цефепиму; чуствителен к стрептомицину, бензилпенициллину, канамицину, гентамицину, амикоцину, эритромицину, меропенему, ампициллину, тетрациклину, левомицитину при 37°С, а при 10°С даже минимальная концентрация антибиотиков препятствует росту бактерии.

Биохимические признаки штамма приведены в таб. 1.

Таблица 1.

Показатели Характеристика

Окраска по Граму +

Пигментация -

Форма Э

Расположение ц

Спора:

Раздутость

- спорангия

Подвижность +

Рост в анаэробных условиях +

Катал азная активность +

Оксидазная активность +сл

Тест Фогес-Проскауэра -

Использование цитрата -

Редукция нитратов +газ

Казеина -

Гидролиз Желатины +

Крахмала -

Образование Глюкозы - кислоты из: Маннита -

Арабинозы -

Ксилозы -

Лактозы -

Маннозы +

Сорбита -

+2°С -

Рост при

+8°С +

температуре:

+43°С +

6,5% NaCl +СЛ

10% NaCl -

15% NaCl - рН 4 - рН 5 +СЛ

Реакция на

рН 5,5 +

среду

рН 8,5 +

рН 9 +

рН 10 +

рН 10,5 +

рН 11 +СЛ

Аммиака -

Образование на

Индола - МПБ:

H ₂ S +

Фиксация N ₂ +

Э - эллипсовидная спора; Ц - центральное расположение споры, - - отрицательная реакция; + - положительная реакция; +сл - слабоположительная реакция. 3. ТЕСТИРОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ Bacillus sp. НА ВЫСШИХ ОРГАНИЗМАХ

ПЕРЕЧЕНЬ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 показано влияние культуры Bacillus sp. на продолжительность жизни Drosophila melanogaster

На фиг. 2 - влияние культуры Bacillus sp. при парентеральном введении 5000 клеток на продолжительность жизни лабораторных мышей 17-ти месячного возраста.

На фиг. 3 - уровни IFN-γ через 6 дней (А) и TNF-α через 90 минут (В) в сыворотке крови мышей после интраперитонеальной инъекции Bacillus sp.

ПРИМЕРЫ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

3.1. Тестирование на мушках Drosophila melanogaster

Для эксперимента отбирались особи Drosophila melanogaster одного возраста (1 сутки). Их помещали в пробирки с питательной средой (5-7 мл) по 5 пар. Объем выборки для каждого варианта составил 100 мух. Отбор особей для эксперимента проводили путем эфиризации, погибших и выживших мух учитывали каждые третьи сутки. Эксперимент проводили с суточной культурой Bacillus sp. МЗ, выращенной на мясопептонном бульоне. В опытную пробирку вносили культуру в объёме 20 мкл. Эксперимент включал контрольный вариант, в котором мух содержали на среде с добавлением дрожжей; и опытный вариант, когда первые 5 суток мух содержали на среде с добавлением дрожжей, затем 1 сутки на среде с бациллой (чередование весь период наблюдения). Для определения плодовитости отбирались виргинные мухи в день вылета. Самок и самцов помещали отдельно и выдерживали 5 суток по достижении ими максимальной плодовитости. Затем помещали попарно в пробирки со съемными крышками. Дно крышек заливали агар-агаром кондитерским с добавлением сахара. Учет плодовитости проводили ежесуточно на протяжении 6 дней. Учитывали количество отложенных яиц, а через сутки определяли количество неразвившихся яиц.

При добавлении на поверхность питательной среды 75 мкл штамма Bacillus sp. в физрастворе (1млрд. кл/мл) наблюдалось снижение плодовитости по отношению к контролю в 5 раз. Средняя плодовитость самки составила в контроле 58,1±8,61 шт., в опытном варианте эта величина 10,2±3,44 шт. При добавлении бактериальной культуры после выдерживания мушек на дрожжях, несмотря на гибель мушек в опыте и контроле после 50 дней, отмечалось превышение доли выживших мух с 24-х по 42-е сутки эксперимента по сравнению с контролем (фиг. 1).

3.2.Тестирование на лабораторных мышах

Подготовка бактериальной культуры проводилась аналогично методике тестирования на дрозофилах; использовалась суточная культура Bacillus sp., однако перед введением проводили ее замораживание и оттаивание. Эксперименты проводились на мышах Fl СВА/В1аск-6, в среднем по 15 особей в каждой группе. В первой серии экспериментов изучалось влияние доз культуры на параметры иммунной системы молодых животных (возраст 3-4 месяца). В контроле использовали две группы животных, одна из которых была интактной, а второй группе вводили физиологический раствор. Бактериальную культуру Bacillus sp. вводили животным однократно внутрибрюшинно 5 000; 50 000; 500 000; 5 000 000 и 50 000 000 микробных тел (м.т.) на животное. Во второй серии экспериментов оценивалось влияние бактериальной культуры на физиологические и поведенческие реакции «пожилых» мышей (возраст 17 месяцев), при этом культуру вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 5000 м.т. Контрольная группа была представлена животными того же возраста. Эвтаназия животных проводилась методом дислокации шейных позвонков. По стандартным методикам оценивались морфофизиологическая активность тимуса и селезенки по индексу органа (отношение веса органа к весу тела, %), активность факторов неспецифической иммунорезистентности по уровню фагоцитарной (ФП, %) и метаболической (НСТ-тест, %) активности селезеночных макрофагов, клеточного иммунитета в реакции ГЗТ in vivo, активность гуморального иммунитета по числу антителообразующих клеток (АОК) в 1 миллионе ядросодержащих клеток в селезенке, мышечная сила животных в тесте поднятия груза, поведенческие реакции в тесте «Открытое поле», а также продолжительность жизни.

Оказалось, что Bacillus sp. в дозе 5 000 микробных тел способствует увеличению индексов тимуса и селезенки. Культура бацилл в малой дозе (5000 м.т.) стимулируют, а в средних дозах (500000 и 5000000 м.т.) - подавляют фагоцитарную активность селезеночных макрофагов. Культура бацилл Bacillus sp. почти во всех дозах повышает активность гуморального иммунитета, а доза в 5000 м.т. способствует увеличению функциональной активности и клеточного и гуморального иммунитета.

В этой связи для исследований влияния культуры на продолжительность жизни была выбрана доза в 5 000 м.т. Минимальный срок жизни мышей из контрольной группы составил 589 дней, а максимальный - 833 дня. Минимальный срок жизни мышей из опытной группы составил 836 дней, а максимальные - 897 (фиг. 2). Вес тела у животных опытной группы был выше, чем у животных контрольной группы через 2 месяца после введения культуры. Мышечная сила у опытных животных увеличилась (около 60%) относительно сверстников из контрольной группы. О повышении у животных способности к ориентации в пространстве и исследовательской активности свидетельствовало более частое посещение ими внутренних секторов открытого поля, увеличение числа вертикальных стоек и посещения норок. По-видимому, бактериальная культура при парентеральном введении стимулирует иммунную систему и улучшает эмоциональную устойчивость лабораторных животных. Увеличение продолжительности жизни мышей свидельствует о возможном присутствии в культуре Bacillus sp. геропротекторов.

Кроме того, штамм исследован в качестве иммуномодулирующих биокорректоров, способных запускать врожденный иммунный ответ на животных моделях. Активация иммунитета была исследована в экспериментах по изменению метаболической активности макрофагов, уровней интерферона- гамма (IFN-γ), фактора некроза опухолей (TNF-α) и неспецифического цитотоксического действия Т-лимфоцитов под действием клеток Bacillus sp., введенных мышам линии С57В1/6. Установлено, что внутрибрюшинные инъекции штамма в диапазоне доз 5 000 - 5 000 000 м. т. на животное приводят к дозозависимой активации метаболизма интраперитонеальных макрофагов, оцениваемой по уровню химически активных промежуточных соединений аэробного метаболизма (ROIs) более чем в 2 раза. Однократные внутрибрюшинные инъекции в дозе 5 000 м.т. приводят к увеличению уровней IFN-γ в 2,6 раза, а также способствуют значительному снижению TNF-α (фиг. 3). Цитотоксическое действие Т-лимфоцитов, полученных из селезенки животных после инъекций Bacillus sp., было исследовано in vitro против клеток лимфосаркомы мыши RLS. Установлено, что достоверная активация неспецифического клона Т-лимфоцитов происходит при дозе 5 ООО ООО м.т., при этом цитотоксическое действие таких Т-лимфоцитов против клеток лимфосаркомы было в 1,8 раз выше, чем их действие без активации штаммом. Таким образом, усиление метаболизма макрофагов, повышение уровня интерферона-гамма, снижение фактора некроза опухолей и активация цитотоксического действия Т-лимфоцитов под действием Bacillus sp. свидетельствует об активации врожденного иммунитета у лабораторных животных и о ярко выраженных иммуномодулирующих свойствах штамма Bacillus sp.