BACTERIES UTILES DANS LA PREVENTION ET/OU LE TRAITEMENT DE PATHOLOGIES RESPIRATOIRES

[0001] Domaine technique

[0002] L'invention concerne trois souches bactériennes appartenant au genre Enterococcus, une composition les comprenant et son utilisation comme médicament, en particulier dans le traitement et/ou la prévention des maladies respiratoires.

[0003] Etat de l'art

[0004] Le corps humain possède plusieurs microbiotes tels que le microbiote intestinal, oral, cutané, vaginal et plus récemment un microbiote pulmonaire a été décrit. Ces microbiotes s'installent progressivement à partir de la naissance et orientent la maturation immunitaire. La colonisation par le microbiote digestif a un impact très important sur l'immunité et la santé. Dès lors, de nombreux travaux ont décrit les bactéries présentes dans les microbiotes humains et les ont utilisées pour leurs effets bénéfiques sur la santé, tels que les probiotiques.

[0005] Enterococcus faecalis (E. faecalis) fait partie des entérocoques retrouvés dans le tractus gastro-intestinal humain. Chez l'homme E. faecalis est sous-dominant dans le microbiote intestinal chez l'adulte sain et dominant chez l'enfant juste après la naissance. Il s'agit d'une bactérie ubiquiste de l'homme et des animaux, qui se retrouve dans l'intestin comme dans la cavité orale, mais aussi dans le microbiote pulmonaire. Toutefois, certaines souches de l'espèce sont à l'origine d'infections, notamment nosocomiales.

[0006] L'espèce E. faecalis a notamment été décrite pour ses propriétés immuno-modulatrices importantes pour l'être humain, en particulier dans la maturation des cellules épithéliales du colon, dans la protection contre les rechutes de bronchite chronique, dans la dermatite atopique, ou encore dans la susceptibilité à développer l'asthme. Une souche spécifique à déjà été décrite dans le brevet FR 1650656 pour ses effets bénéfiques dans le traitement et/ou la prévention des maladies respiratoires.

[0007] Les maladies respiratoires chroniques telles que l'asthme, la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO), la rhinite allergique, l'arthrite rhumatoïde, mais encore les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) touchent des millions de personnes dans le monde. Ces maladies chroniques ont un impact fort sur la qualité de vie des patients pour lesquels aucun traitement curatif n'est disponible et dont la prévalence augmente fortement dans les pays occidentaux. Dès lors ces pathologies constituent un problème médical, social et économique majeur dans le monde. L'objectif des traitements actuels est essentiellement symptomatique et visent à traiter ou éventuellement prévenir les crises survenant par période afin d'améliorer la qualité de vie des patients.

[0008] Les traitements actuels sont notamment basés sur des modulateurs de l'immunité à large spectre, tels que les corticostéroïdes. Ces derniers sont certes très efficaces en traitement ponctuel, mais peuvent entraîner des effets secondaires délétères lors d'une prise régulière. Par exemple, les corticoïdes inhalés peuvent causer un retard de croissance chez l'enfant, la suppression de l'axe hypothalamique pituitaire surrénalien et un risque accru d'ostéoporose. Plus récemment, certains médicaments ciblant des médiateurs clés de l'inflammation, tels que le Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-a), l'lnterleukine-1 (IL-1) ou l'lnterleukine-5 (IL-5) ont été développés. Toutefois, les pathologies inflammatoires ne répondent pas toutes au(x) même(s) inhibiteur(s) de cytokines. Enfin, certains patients sont encore réfractaires aux traitements existants, qu'il s'agisse de corticostéroïdes ou d'inhibiteurs spécifiques.

[0009] Il existe donc un besoin médical fort pour de nouvelles solutions thérapeutiques permettant soit de traiter et/ou de prévenir ses affections, telles que les pathologies respiratoires, soit de diminuer les doses de traitement anti-inflammatoire nécessaires et/ou d'augmenter leur efficacité.

[0010] Un objectif de la présente invention est donc d'apporter une solution alternative qui soit simple, plus efficace et économique pour prévenir et/ou traiter les maladies chroniques inflammatoires dont les maladies respiratoires, et permettant également de limiter les effets indésirables associés aux traitements actuels et ainsi faire reculer la prévalence de ces maladies.

[0011] Résumé de l'invention

[0012] Pour répondre à cet objectif, les inventeurs ont identifié, parmi la multitude de bactéries de l'espèce E. faecalis, trois nouvelles souches bactériennes d'E. faecalis déposées le 16 Juin 2021 auprès la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France sous le numéro CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 et CNCM 1-5701, particulièrement utiles pour réduire l'inflammation, en particulier dans la prévention et/ou le traitement des pathologies respiratoires.

[0013] En effet, les trois souches présentent un effet anti-inflammatoire in vitro sur des cellules humaines d'origine pulmonaire (BEAS-2B) mais également ex vivo sur des expiants de poumons de souris axéniques. Elles réduisent en particulier la libération de l'IL-18, l'IL-2, l'IL- 5, le TNF-a ou encore l'IL-6. Les autres souches d’E.faecalis testées ne présentent pas de telles propriétés. Les trois souches selon l'invention présentent également un effet antiinflammatoire in vivo, dans deux modèles précliniques d'asthme allergique. Elles permettent de réduire en particulier le recrutement d'éosinophiles et la libération de cytokines TH2 dans les poumons.

[0014] Enfin, la souche déposée sous le numéro CNCM 1-5699 présente également un effet protecteur de la fonction respiratoire dans le modèle d'asthme chez la souris adulte. Les trois souches selon l'invention présentent ainsi des propriétés tout à fait avantageuses et utiles dans le traitement et/ou la prévention de maladies respiratoires.

[0015] Ainsi, l'invention a pour objet trois souches de l'espèce d'E. faecalis déposées, respectivement, sous les numéros CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 et CNCM 1-5701.

[0016] Les souches déposées sous les numéros CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 et CNCM 1-5701 possèdent un chromosome, respectivement, de 2843733 pb (paire de base), de 2937166 pb et de 2982831 pb. La taille du chromosome des souches selon l'invention est donc inférieure à celui de la souche décrite dans le brevet FR 1650656 déposée sous le numéro CNCM 1-4969 dont la taille est de 3056663 pb.

[0017] L'invention vise aussi le surnageant de culture obtenu à partir d'au moins une des souches bactériennes choisie parmi les souches CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 et CNCM 1-5701. Selon une variante, le surnageant peut-être obtenu à partir d'un mélange des souches CNCM 1-5699 et/ou CNCM 1-5700 et/ou CNCM 1-5701.

[0018] Selon un autre objet, l'invention vise également une composition comprenant (i) au moins une souche bactérienne selon l'invention et/ou (ii) le surnageant de culture selon l'invention et (iii) au moins un excipient acceptable. Ledit excipient acceptable étant préférentiellement un excipient pharmaceutiquement acceptable lorsqu'il s'agit d'un produit destiné à être utilisé comme médicament pour un usage humain ou un usage vétérinaire. La composition est alors une composition pharmaceutique comprenant une souche choisie parmi les souches CNCM 1-5699, CNCM 1-5700, CNCM 1-5701 et leur mélange et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.

[0019] Enfin, l'invention est particulièrement adaptée pour utiliser ladite souche bactérienne, ledit surnageant ou ladite composition selon l'invention comme médicament. En effet, la présente invention est particulièrement adaptée dans la prévention et/ou le traitement des maladies inflammatoires, en particulier des maladies respiratoires, plus particulièrement chroniques telles que l'allergie, l'asthme, la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO), ou la rhinite allergique. D'autres pathologies inflammatoires chroniques sont également d'intérêts telles que l'arthrite rhumatoïde ou les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin ( M ICI ), l'inflammation excessive secondaire provoquée par une primoinfection, par exemple bactérienne mais également virale telle que la grippe, la bronchiolite du nourrisson, ou les SRAS.

[0020] Selon une variante, les souches selon l'invention sont également utiles pour prévenir et/ou traiter les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, plus préférentiellement la maladie de Crohn, ou la colite ulcéreuse.

[0021] D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l'invention, des exemples et des figures qui vont suivre.

[0022] Brève description des Figures

[0023] La Figure 1 représente les propriétés anti-inflammatoires des souches selon l'invention en particulier la réduction d'IL-8 induite par le TNF-a dans les cellules BEAS-2B.

[0024] La Figure 2 représente les propriétés anti-inflammatoires ex-vivo des souches selon l'invention en particulier la réduction de plusieurs cytokines responsables de l'inflammation dans des expiants de poumons de souris axéniques.

[0025] La Figure 3 représente la Heat map (ou Carte de Chaleur en Français) des souches selon l'invention sur la production de cytokines par les expiants de poumon.

[0026] La Figure 4 représente le protocole du modèle préclinique d'asthme allergique induit par HDM selon l'Exemple 3 chez le souriceau (Panel A) et chez la souris adulte (Panel B).

[0027] La Figure 5 représente l'effet protecteur de la souche déposée sous le numéro CNCM I- 5699 contre une baisse d'oxygénation du sang dans un modèle d'asthme induit par HDM chez la souris adulte.

[0028] La Figure 6 représente l'effet protecteur de la souche déposée sous le numéro CNCM I- 5699 contre l'augmentation de la résistance pulmonaire dans un modèle d'asthme induit par HDM chez la souris adulte.

[0029] Description détaillée de l'invention

[0030] Définition

[0031] Par « bactérie » au sens de l'invention, on entend un microorganisme unicellulaire capable de se reproduire par division cellulaire. Les bactéries sont classées par famille, genre, espèce. Chaque espèce bactérienne comprend une diversité de souches bactériennes. Les souches bactériennes selon l'invention appartiennent à la famille Enterococcaceae, au genre Enterococcus et à l'espèce faecalis.

[0032] Par « souche bactérienne » ou « souche » au sens de l'invention, on entend donc une souche bactérienne spécifique mais également toutes les bactéries issues de la souche ou obtenues à partir de la souche ou correspondant à la souche bactérienne et ayant les mêmes fonctions métaboliques, par exemple, au moins une bactérie prélevée d'une colonie issue de la souche. Par « bactérie(s) selon l'invention », au sens de l'invention, on entend donc également une souche bactérienne selon l'invention, en particulier, les souches déposées sous les numéros CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 et CNCM 1-5701 ainsi que leurs souches dérivées.

[0033] Par « souche dérivée » au sens de l'invention, on entend une souche bactérienne ayant une forte similarité avec au moins l'une des souches bactériennes déposées sous le numéro CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 ou CNCM 1-5701. Préférentiellement, la séquence nucléotidique chromosomique de la souche dérivée comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 99,9% d'identité d'ANI, plus préférentiellement au moins 99,91%, au moins 99,92%, au moins 99,93%, au moins 99,94%, au moins 99,95%, au moins 99,96%, au moins 99,97%, au moins 99,98%, au moins 99,99% d'identité d'ANI avec la séquence nucléotidique chromosomique d'au moins une des souches CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 ou CNCM 1-5701.

[0034] Par « ANI », on entend au sens de l'invention le pourcentage d'identité moyen des nucléotides calculé à partir de la comparaison deux-à-deux de toutes les séquences chromosomiques des deux souches bactériennes. Selon les connaissances générales bien connues de l'Homme du métier, à partir de ladite souche d'intérêt déposée, par exemple auprès de la CNCM, l'ADN génomique peut être extrait à partir d'une culture bactérienne pure issue de ladite souche d'intérêt, suivi du séquençage de l'ADN selon différentes méthodes bien connues, par exemple Sanger, Roche 454, Illumina, Oxford Nanopore puis le génome séquencé est assemblé par bio-informatique et les séquences obtenues sont analysées. Enfin, les séquences des chromosomes d'intérêt sont comparées deux à deux pour calculer l'ANI.

[0035] Par « surnageant » au sens de l'invention, on entend, le surnageant de culture de la souche bactérienne selon l'invention comprenant éventuellement des composés cellulaires de ladite souche et/ou débris cellulaires de ladite souche, et/ou des métabolites et/ou des molécules sécrétées par ladite souche.

[0036] Par « Homme » au sens de l'invention, on entend un patient humain. Ledit patient humain peut appartenir à n'importe quelle classe d'âge, c'est-à-dire le patient peut être un nourrisson, un bébé, un enfant, un adolescent ou un adulte. Il est connu que les enfants, les bébés, les nourrissons et les personnes âgées sont plus sensibles aux maladies respiratoires, notamment l'asthme. Préférentiellement, l'invention s'adresse aux patients humains résistants et/ou réfractaires aux traitements par corticostéroïdes.

[0037] Par « patient résistant et/ou réfractaire aux traitements par corticostéroïdes », on entend au sens de l'invention un patient à qui l'on administre un traitement à base de corticostéroïdes, qui ne répond pas à ce traitement, c'est-à-dire que l'on n'observe pas chez le patient une inversion de la progression de l'inflammation ou une inversion ou régression de la progression de la maladie.

[0038] Par « prévention » au sens de l'invention, on entend la réduction à un degré moindre du risque ou de la probabilité d'occurrence d'un phénomène donné, c'est-à-dire, dans le contexte de la présente invention de l'inflammation, préférentiellement des maladies respiratoires, par exemple l'asthme.

[0039] Par « traitement » au sens de l'invention, on entend une diminution de la progression de la maladie, une stabilisation, une inversion ou régression, voire une interruption ou inhibition de la progression de l'inflammation, préférentiellement des maladies respiratoires, par exemple l'asthme. Dans le contexte de l'invention, ces termes s'appliquent également sur un ou plusieurs symptômes desdites maladies de la présente invention.

[0040] Par « maladie respiratoire » au sens de l'invention, on entend ici les maladies de l'appareil respiratoire ou provoquant des troubles de la respiration.

[0041] Par « excipient acceptable » au sens de l'invention on entend tout composé permettant de faciliter la mise en forme de la composition et ne modifiant pas la nature de l'activité biologique du principe actif. Un excipient acceptable peut être un solvant, tampon, solution saline, plastifiant, lubrifiant, milieu de dispersion, agents retardant l'absorption, agent d'écoulement, agent isotonique. Préférentiellement, il s'agit d'excipient pharmaceutiquement acceptable qui sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité, parmi les excipients habituels et connus de l'homme du métier et apte à un usage humain et/ou vétérinaire. L'excipient sera ainsi choisi en fonction de la voie d'administration, par exemple approprié pour une administration orale, nasale, intraveineuse, intramusculaire, topique etc.

[0042] Souche bactérienne ou surnageant selon l'invention

[0043] La présente invention a donc pour objet une souche bactérienne d'E. faecalis choisie parmi les souches déposées sous les numéros CNCM 1-5699, CNCM 1-5700, CNCM 1-5701 et leur mélange.

[0044] Les inventeurs ont découvert et caractérisé ces souches bactériennes d'E. faecalis à partir de donneurs humains, ou de fromages et ont démontré, dans des modèles in vitro, des effets anti-inflammatoires, en particulier la réduction de la production d'IL-8 induite par une molécule pro-inflammatoire, le TNF-a.

[0045] Les propriétés anti-inflammatoires des souches selon l'invention ont également été caractérisées sur un modèle d'explants de poumons qui est plus proche de la physiologie pulmonaire que les lignées cellulaires existantes. Les différentes souches ont ainsi été co- incubées avec des expiants de poumons de souris axéniques en culture ex vivo et présentent également un effet anti-inflammatoire, en particulier elles réduisent la libération de l'IL-18, l'IL-2, l'IL-5, le TNF-a ou encore l'IL-6.

[0046] Ces premiers résultats, en particulier sur les expiants de poumons de souris axéniques confirment l'intérêt clinique des souches selon l'invention comme médicament en particulier dans la prévention et/ou le traitement des maladies respiratoires.

[0047] Ainsi, l'invention se rapporte au moins à une souche bactérienne d'E. faecalis choisie parmi les souches déposées sous les numéros CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 et CNCM 1-5701.

[0048] La séquence du gène de l'ARN 16S de la souche CNCM 1-5699, de la souche CNCM I- 5701 et de la souche CNCM 1-5700 sont identiques et de SEQ ID NO:1.

[0049] L'ARN ribosomique 16S (ARNr 16S) est l'ARN ribosomique constituant la petite sous- unité des ribosomes des procaryotes. Les gènes codant de cet ARN sont appelés ADNr 16S (16S rDNA en anglais). La séquence ADNr 16S est très utilisée en phylogénie du fait de sa structure très conservée qui permet de reconstruire l'histoire évolutive des organismes et en particulier des procaryotes et bactéries.

[0050] Or, la séquence d'ADNr 16S ne permet pas toujours de différencier deux souches d'une même espèce ayant pour autant des propriétés différentes, par exemple des propriétés antiinflammatoires, telles qu'un profil cytokinique différent. Il en résulte une efficacité différente pour chaque souche. Par conséquent, l'Homme du métier étant donné ses connaissances générales est en mesure de caractériser une souche bactérienne selon d'autres paramètres tels que le calcul de distance phylogénétique basé sur la séquence nucléotidique du chromosome (ANI) ou de sa taille.

[0051] Ainsi, les souches CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 et CNCM 1-5701 possèdent des chromosomes dont les tailles respectives sont de 2843733 pb, 2937166 pb et 2982831 pb. La taille du chromosome des souches selon l'invention est donc inférieure à celui de la souche décrite dans FR 1650656 déposée sous le numéro CNCM 1-4969 dont la taille est de 3056663 pb.

[0052] De plus, la distance phylogénétique basé sur la séquence du chromosome (ANI) a également été calculée. Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-après.

[0053] [Tableau 1]

[0054] L'invention se rapporte également aux souches dérivées d'au moins l'une des souches bactériennes déposées sous les numéros CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 ou CNCM 1-5701 qui permettent de maintenir ou d'améliorer les capacités décrites des souches selon l'invention. Lesdites souches dérivées peuvent être produites naturellement ou intentionnellement, par des méthodes de mutagénèse connues dans l'état de la technique. A titre d'exemple les méthodes de mutagénèse pouvant être mises en œuvre dans le cadre de la présente invention sont la croissance du micro-organisme original en présence d'agents mutagènes ou producteurs de stress, ou par le génie génétique visant à modifier des gènes spécifiques ou non telle que la mutagénèse dirigée ou la mutagénèse aléatoire.

[0055] Préférentiellement, ladite souche dérivée comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 99,9% d'identité d'ANI (« Average Nucleotide Identity », Identité Nucléotidique Moyenne en français) avec la séquence nucléotidique chromosomique d'une des souches bactériennes déposées sous les numéros CNCM 1-5699 ou CNCM 1-5700 ou CNCM 1-5701. Plus préférentiellement, la souche dérivée comprend une séquence nucléotidique d'au moins 99,91%, au moins 99,92%, au moins 99,93%, au moins 99,94%, au moins 99,95%, au moins 99,96%, au moins 99,97%, au moins 99,98%, au moins 99,99% d'identité d'ANI avec la séquence nucléotidique chromosomique d'au moins une des souches CNCM 1-5699, ou CNCM 1-5700 ou CNCM 1-5701.

[0056] Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention concerne la souche d'E. faecalis déposée sous le numéro CNCM 1-5699.

[0057] Les souches selon l'invention peuvent être produite par culture, par exemple, dans un milieu de croissance connu de l'homme du métier (par exemple, un milieu BHI : « Brain-Heart Infusion ») de 8 heures à 3 jours, à une température de 30-37°C, avec ou sans ajustement du pH. Le bouillon de fermentation contenant les cellules bactériennes est recueilli. Le bouillon peut être utilisé tel quel, concentré ou lyophilisé. Avantageusement, les bactéries seront recueillies, par exemple par centrifugation puis remises en suspension dans un tampon approprié, par exemple du PBS (« phosphate buffered saline »). La concentration bactérienne peut être établie en utilisant un cytomètre de flux ou un autre procédé équivalent. La souche selon l'invention est particulièrement avantageuse en ce qu'elle entraine une diminution de l'inflammation. Ainsi, la bactérie de l'invention permet d'atténuer les effets des maladies inflammatoires, notamment respiratoires.

[0058] Un autre objet de l'invention se rapporte au surnageant de culture obtenu depuis l'une des souches bactériennes selon l'invention, mais également une souche dérivée de celles-ci. Préférentiellement, le surnageant de culture comprend au moins un des constituants choisis parmi un composé cellulaire bactérien, un débris cellulaire bactérien, un métabolite et/ou une(des)molécule(s) sécrété(s) par la souche et/ou la souche dérivée, ou leur mélange.

[0059] Ainsi, les composés cellulaires et/ou débris cellulaires peuvent être des composants de la paroi, des acides nucléiques, des composants membranaires, des protéines, lipides etc. Les métabolites ou molécules sécrété(s) peuvent être toute molécule produite ou modifiée par la bactérie en raison de son activité métabolique au cours de sa croissance, de son utilisation dans des procédés technologiques (par exemple, mais sans s'y limiter, des procédés de production d'aliments ou de médicaments). A titre d'exemple, les métabolites ou molécules peuvent être des protéines, acides aminées, enzymes, lipides, acides nucléiques etc. Par « métabolite et/ou une(des)molécule(s) sécrété(s) par la souche et/ou la souche dérivée », on entend une molécule produite et exportée ou libérée à l'extérieur de la bactérie par la bactérie. Ainsi l'invention se rapporte également au surnageant de culture obtenu depuis l'une des souches bactériennes selon l'invention ou leur mélange.

[0060] Composition

[0061] La ou les souches selon l'invention ou souche(s) dérivée(s) et/ou le surnageant de culture précédemment décrit et les bactéries issues desdites souches, sont avantageusement administrées dans une composition.

[0062] Ainsi, l'invention concerne une composition comprenant : (i) au moins une souche bactérienne selon l'invention et/ou (ii) un surnageant selon l'invention et (iii) au moins un excipient acceptable. [0063] La composition peut également comprendre un milieu physiologiquement acceptable, c'est-à-dire un milieu qui est compatible avec l'organisme de l'individu auquel ladite composition doit être administrée. Il peut s'agir, par exemple, d'un solvant non toxique tel que l'eau, de tampon, solutions salines. En particulier, ledit milieu est compatible avec une administration orale.

[0064] Ainsi, de façon préférentielle, la composition comprend au moins une souche bactérienne choisie parmi l'une des souches déposées sous le numéro CNCM 1-5699, le numéro CNCM 1-5700, le numéro CNCM 1-5701 et leur mélange ; et/ou le surnageant de culture obtenu depuis lesdites souches et au moins un excipient acceptable et/ou un milieu physiologiquement acceptable.

[0065] Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la composition comprend la souche déposée sous le numéro CNCM 1-5699.

[0066] Selon une variante, la composition comprend la souche déposée sous le numéro CNCM 1-5699 et la souche déposée sous le numéro CNCM 1-5700 et la souche déposée sous le numéro CNCM 1-5701.

[0067] La souche bactérienne selon l'invention peut être présente sous toute forme produisant les effets escomptés et l'efficacité décrite dans la présente demande. En particulier, la souche peut être sous forme vivante (cultivable ou non), morte, semi-vivante, atténuée ou inactivée. La forme morte, semi-vivante, atténuée ou inactivée induit les mêmes effets que la souche vivante et possède donc elle aussi des propriétés anti-inflammatoires, permettant notamment la prévention et/ou le traitement des maladies respiratoires.

[0068] Ces formes peuvent être obtenues par différentes techniques bien connues de l'homme du métier. On citera par exemple les techniques suivantes : irradiation, inactivation thermique ou lyophilisation, en particulier par la chaleur, l'exposition à un pH approprié, aux UV, aux rayons gamma, aux rayons X ou à la mise sous haute pression.

[0069] Par « semi-vivante » on entend une bactérie à faible activité physiologique dont la capacité à proliférer est réduite, temporairement ou définitivement. Le terme « inactivé » désigne une bactérie qui n'est plus capable, temporairement ou définitivement, de proliférer. Le terme « morte » désigne une bactérie qui n'est plus capable, définitivement, de proliférer. Les bactéries mortes ou inactivées peuvent avoir les membranes cellulaires intactes ou rompues. Ainsi le terme « inactivé » désigne également les extraits et lysats de bactéries obtenues. [0070] Il est particulièrement avantageux d'utiliser de telles formes dans les compositions pharmaceutiques de l'invention.

[0071] La composition selon l'invention peut comprendre en outre au moins un composé additionnel. Le composé additionnel peut être un ingrédient, une molécule, un principe actif, un microorganisme, une bactérie ou un mélange de bactéries. Préférentiellement, le composé additionnel est un agent anti-inflammatoire, plus préférentiellement un corticostéroïde, encore plus préférentiellement le budésonide. Selon une variante, le composé additionnel peut-être un probiotique et/ou un prébiotique.

[0072] La composition selon l'invention se présente sous toute forme acceptable pour être administrée à un patient, préférentiellement un patient humain ou animal (non-humain). Ainsi, la composition selon l'invention vise également les usages vétérinaires.

[0073] De façon préféré, la composition selon l'invention se présente sous forme solide, liquide ou lyophilisée.

[0074] Lorsque la composition se présente sous forme liquide, elle peut notamment comprendre des souches bactériennes selon l'invention et/ou de la souche dérivée et/ou un milieu de culture physiologiquement acceptable pour lesdites bactéries qui permet de les conserver, comme par exemple le milieu BHI, ou un milieu équivalent ne contenant pas de produit dérivé d'origine animale.

[0075] Lorsque la composition selon l'invention se présente sous forme solide, les souches bactériennes selon l'invention et/ou de la souche dérivée peuvent être présentes sous forme lyophilisée, et peuvent comprendre également des excipients tels que par exemple la cellulose microcristalline, le lactose, le saccharose, le fructose, le lévulose, les amidons, le stachyose, le raffinose, l'amylum, le lactate de calcium, le sulfate de magnésium, le citrate de sodium, le calcium stearate, la polyvinylpyrrolidone, la maltodextrine, les galactooligosaccharides, les fructooligosaccharides, les pectines, les béta-glucanes, les lactoglobulines, les isomaltooligosaccharides, les polydextroses, le mannitol, le sorbitol, le glycérol, le dioxide de silice, le stéarate de magnésium, la cystéine, le mannose, le galactose, le glucose anhydre, le monoydrate de glucose et/ou leurs mélange.

[0076] L'homme du métier saura choisir au mieux les voies et modes d'administration de la composition selon l'invention, ainsi que les posologies et formes galéniques optimales, selon les critères généralement pris en compte dans la fabrication d'un médicament ou l'établissement d'un traitement pharmaceutique ou vétérinaire. De préférence, la composition selon l'invention est sous une forme adaptée à une administration par voie orale, nasale, parentérale, rectale, sublinguale, oculaire, auriculaire, intramusculaire, intraveineuse, inhalée ou cutanée, plus préférentiellement par voie nasale ou inhalée à l'aide d'un appareil de nébulisation.

[0077] La composition peut se présenter sous toute forme adaptée. Ainsi, la composition selon l'invention peut se présenter sous une forme choisie parmi une poudre, poudre à nébuliser, poudre microencapsulée, poudre microencapsulée à nébuliser, gélule, capsule, comprimé, pastille, granulés, solution, solution à nébuliser, émulsion, émulsion à nébuliser, suspension, suspension à nébuliser, ampoule, suppositoire, inhalateur et un sirop, plus préférentiellement sous une forme d'inhalateur tel qu'un appareil de nébulisation.

[0078] La composition selon l'invention peut éventuellement se présenter sous une forme gastro-résistante, par exemple un comprimé enrobé contenant des bactéries microencapsulées.

[0079] De façon particulièrement préférée, la composition comprend au moins 10 ³ unités formant des colonies (UFC) de bactéries par dose quotidienne de composition à administrer, préférentiellement de 10 ⁴ à 10 ⁹ UFC, plus préférentiellement de 10 ⁵ à 10 ⁷ UFC.

[0080] Préférentiellement cela correspond à une dose quotidienne de bactéries à administrer, quel que soit le poids de la personne ou de l'animal. Ainsi et de façon préférée, cette dose est administrée en une seule fois. La composition utile comprend alors au moins 10 ³ , préférentiellement de 10 ⁴ à 10 ⁹ UFC, encore plus préférentiellement de 10 ⁵ à 10 ⁷ UFC de bactéries par dose quotidienne à administrer.

[0081] Lesdites bactéries sont un mélange de bactéries correspondant ou issu d'une des souches selon l'invention, y compris les souches dérivées.

[0082] Le terme CFU (Colony Forming Unit) ou UFC (Unité Formant Colonie) est une unité permettant de dénombrer le nombre de bactéries capables de donner naissance à une colonie lors de la propagation, c'est-à-dire des bactéries viables. Il faut comprendre que des bactéries non viables peuvent également être présentes dans les compositions et qu'en général, elles ne devraient pas avoir d'effet négatif sur les propriétés des bactéries vivantes de la composition.

[0083] Préférentiellement, la dose quotidienne est mesurée par gramme ou millilitre de la composition selon l'invention finale.

[0084] Selon un autre objet préféré, lorsque la composition selon l'invention comprend un mélange de bactéries vivantes ou non, ledit mélange comprenant au moins des bactéries vivantes, la composition comprend préférentiellement au moins 1% de bactéries vivantes (en nombre), plus préférentiellement au moins 10% de bactéries vivantes (en nombre), encore plus préférentiellement au moins 50% de bactéries vivantes (en nombre).

[0085] Les bactéries vivantes sont un mélange de bactéries correspondant à l'une des souches selon l'invention, y compris les souches dérivées.

[0086] Dans le cas de la mise en œuvre d'un surnageant de l'une quelconque des souches bactériennes susmentionnées, la composition selon l'invention l'incluant peut notamment en comprendre une teneur comprise entre 0,1 et 99 % en poids, notamment de 5 à 95 % en poids, en particulier de 10 à 90 % en poids et plus particulièrement de 15 à 85 % en poids, par rapport au poids total de la composition.

[0087] Ainsi, une composition selon l'invention peut comprendre une teneur comprise entre 0,1 et 99 % en poids, notamment de 5 à 95 %, en particulier de 10 à 90 % en poids, plus particulièrement de 15 à 85 % en poids, de surnageant par rapport au poids total de la composition.

[0088] Lorsque la composition est destinée à un usage thérapeutique, la composition comprend au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable, la composition selon l'invention est alors une composition pharmaceutique.

[0089] Par « excipient pharmaceutiquement acceptable », on entend ici un excipient dont l'administration à un individu ne s'accompagne pas d'effets délétères significatifs. Les excipients pharmaceutiquement acceptables sont bien connus de l'homme du métier.

[0090] Ainsi, l'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant le ou les ingrédients inclus dans la composition selon l'invention et selon l'un des quelconques modes de réalisation décrits précédemment. Ladite composition pharmaceutique est un médicament.

[0091] Selon un autre aspect, la composition selon l'invention peut se présenter sous la forme d'un produit alimentaire, d'une boisson, d'un nutraceutique, d'un additif alimentaire, d'un complément alimentaire ou d'un produit laitier.

[0092] Lorsque, la composition selon l'invention est comprise dans un complément alimentaire pour une administration par la voie orale, celle-ci peut être sous forme de capsules, de gélules, de capsules molles, de comprimés, de comprimés dragéifiés, de pilules, de pâtes, de pastilles, de gommes, de solutions ou émulsions buvables, de sirop ou de gel. [0093] Un complément alimentaire selon la présente invention peut comprendre en outre un édulcorant, un stabilisant, un antioxydant, un additif, un agent aromatisant et/ou un colorant. La formulation de celui-ci est effectuée au moyen des procédés usuels pour produire des comprimés dragéifiés, des gélules, des gels, des hydrogels pour libération contrôlée, des émulsions, des comprimés ou des capsules.

[0094] Une composition selon la présente invention peut également être sous la forme d'une composition nutritionnelle. Une telle composition nutritionnelle selon la présente invention peut être sous la forme d'un yaourt, un aliment fermenté, une barre de céréales, des céréales pour le petit-déjeuner, un dessert, un aliment congelé, un aliment réfrigéré, un aliment surgelé, une soupe, un aliment pour animaux de compagnie, une suspension liquide, une poudre, un comprimé, une gomme ou un bonbon.

[0095] Une composition nutritionnelle selon la présente invention peut comprendre en outre au moins un ingrédient choisi parmi : des antioxydants, des huiles de poisson, huiles végétales, DHA, EPA, des vitamines, des minéraux, des phytonutriments, une protéine, un lipide, des probiotiques, des prébiotiques, des postbiotiques et des combinaisons de ceux-ci.

[0096] Utilisation

[0097] La composition selon l'invention est utile comme médicament pour un usage dans la santé humaine ou vétérinaire.

[0098] Préférentiellement, la composition selon l'invention est destinée à prévenir et/ ou traiter l'inflammation et ainsi être utilisée dans le traitement et/ou la prévention des maladies inflammatoires, plus préférentiellement des maladies respiratoires et/ou des maladies inflammatoires de l'intestin et/ou l'arthrite rhumatoïde et/ou des maladies inflammatoires associées à une infection virale ou bactérienne.

[0099] On peut ainsi citer à titre d'exemple l'asthme (léger, modéré ou sévère), par exemple, bronchique, allergique, intrinsèque, extrinsèque, induit par l'exercice, d'origine médicamenteuse (y compris l'aspirine et aux anti-inflammatoires non stéroïdiens - AINS) et l'asthme induit par la poussière, l'asthme résistant aux stéroïdes, la bronchite, y compris la bronchite infectieuse et à éosinophiles, d'une maladie pulmonaire obstructive chronique (COPD), comme la BPCO (broncho-pneumopathie chronique obstructive), la fibrose cystique, la fibrose pulmonaire, y compris cryptogénique alvéolite fibrosante, la fibrose pulmonaire idiopathique, pneumonies interstitielles idiopathiques, la fibrose compliquant une thérapie antinéoplasique et chronique l'infection, y compris la tuberculose et l'aspergillose et d'autres infections fongiques; complications de la transplantation pulmonaire; vascularite et troubles thrombotiques du système vasculaire pulmonaire et hypertension artérielle pulmonaire (y compris l'hypertension artérielle pulmonaire); activité antitussive comprenant le traitement de la toux chronique associée à des affections inflammatoires et sécrétoires des voies respiratoires et la toux iatrogène; rhinite aiguë et chronique, y compris la rhinite médicamenteuse, et la rhinite vasomotrice; per annuelle et saisonnière rhinite allergique y compris la rhinite nerveuse (rhume des foins); polypose nasale; infection aiguë virale, y compris le rhume, et l'infection due au virus respiratoire syncytial (VRS), la grippe, les bronchopathies pulmonaires, les infections aux coronavirus (SRAS notamment) et l'adénovirus, un œdème pulmonaire, embolie pulmonaire, pneumonie, sarcoïdose pulmonaire, la silicose, poumon de fermier et les maladies apparentées; pneumopathie d'hypersensibilité, insuffisance respiratoire, syndrome de détresse respiratoire aiguë, l'emphysème, la bronchite chronique, la tuberculose et le cancer du poumon.

[0100] La composition selon l'invention vise également les pathologies respiratoires ayant des « dérégulations immunitaires » communes avec celles observées dans l'asthme comme l'induction de certaines cytokines (IL-6, TSLP, IL-8, IL-5, IL-13, IL-17) et des dérégulations mucosales (hyper production de mucus).

[0101] En particulier, les utilisations et les compositions de la présente invention englobent la prévention et le traitement des maladies respiratoires chroniques, par exemple l'asthme, la BPCO et la rhinite. Encore plus particulièrement, les utilisations et les compositions de la présente invention portent sur la prévention et le traitement de l'asthme.

[0102] Les inventeurs ont démontré que les souches selon l'invention sont particulièrement efficaces pour prévenir l'asthme lorsqu'elles sont administrées avant l'apparition de l'ensemble de symptômes de la maladie. Ainsi, l'utilisation de la souche de l'invention et la composition la comprenant pourront notamment être utilisées efficacement pour prévenir l'apparition de l'asthme chez des patients connus pour leur prédisposition pour cette pathologie (par exemple, des patients ayant une prédisposition familiale au développement de l'asthme).

[0103] Etant donné les voies inflammatoires communes, la composition selon l'invention est également utile dans une maladie choisie parmi la maladie de Crohn, la colite ulcéreuse, la recto-colite ulcéro-hémorragique, la diverticulite, l'cesophagite, la gastrite, la pancréatite, l'ulcère gastro-duodénal et le syndrome du côlon irritable.

[0104] Enfin, la composition selon l'invention est particulièrement d'intérêt lorsque l'Homme ou l'animal est résistant et/ou réfractaire aux corticostéroïdes.

[0105] L'invention est à présent illustrée par des exemples non limitatifs de compositions selon l'invention et par des résultats.

[0106] Exemples

[0107] Exemple 1 - Effet anti-inflammatoire des souches selon l'invention.

[0108] Des cellules BEAS-2B ont été co-incubées avec du TNF-a (lpg/ml) seul ou avec des bactéries E. faecalis selon l'invention (CNCM 1-5699, CNCM 1-5700, CNCM 1-5701) ou hors invention (CNCM 1-4969, E. faecalis 1 ou E. faecalis 2) MOI 250:1. Après 6h d'incubation, la concentration d'IL-8 a été mesurée dans le surnageant. Les niveaux d'IL-8 sont exprimés en pourcentage du taux d'IL-8 induit par une stimulation de TNF-a de 6h. Les résultats correspondent à la médiane de 5 expériences, au moins n= 3-6 réplicats techniques par condition. * p<0.05 comparé avec le contrôle TNF-a.

[0109] Les inventeurs ont observé que les trois souches d'E. faecalis selon l'invention (CNCM 1-5699, CNCM 1-5700, CNCM 1-5701) présentent un effet « anti-IL-8 » fort, respectivement de 93%, 75% et 70% comparativement à la souche CNCM 1-4969 et à deux autres souches d'E. faecalis. La souche CNCM 1-4969 présente certes un effet, mais plus faible que les trois souches selon l'invention. Ainsi, les souches E. faecalis selon l'invention présentent des propriétés antiinflammatoires utiles (Figure 1).

[0110] Exemple 2 - Effet anti-inflammatoire ex-vivo des souches selon l'invention.

[0111] Les inventeurs ont poursuivi leurs travaux en comparant les 3 souches selon l'invention avec 5 autres souches d'E. faecalis (CNCM 1-4969, E. faecalis 1, E. faecalis 2, E. faecalis 3, E. faecalis 4).

[0112] Les expiants de poumons, ou PCLS (« Precision Cut Lung Slices »), sont des coupes en culture de 200-250pm, de poumons provenant de souris axéniques. Les expiants sont co- incubés ou non avec 50 UFC (unités formant des colonies) de bactéries : souches d'E. faecalis. Après 24h, les surnageants de culture sont prélevés et la quantité de cytokines mesurée par Luminex. Les résultats représentent le pourcentage de cytokine mesuré, comparé à la condition du milieu seul. Les données sont regroupées de 4 expériences, au moins n = 6 réplicats biologiques par condition. * p<0.05 comparé avec le contrôle milieu.

[0113] Les inventeurs ont ainsi caractérisé les effets anti-inflammatoires sur un modèle d'explants de poumons qui est plus proche de la physiologie pulmonaire en comparaison des lignées cellulaires. Les différentes souches d'E. faecalis ont été co-incubées avec des expiants de poumons de souris axéniques en culture ex vivo. Ces expiants ont une production basale de différentes cytokines, laquelle peut être modifiée par la présence d'éléments immunomodulateurs.

[0114] Les inventeurs ont mis en évidence que les 3 souches d'E. faecalis selon l'invention possèdent un effet anti-inflammatoire sur des expiants de poumons de souris. Elles réduisent en particulier la libération de l'IL-18, l'IL-2, l'IL-5, le TNF-a ou encore l'IL-6 (Figures 2 et 3). La souche CNCM 1-4969 présente un effet significativement plus faible que les trois souches selon l'invention et les 4 autres souches testées (E. faecalis 1, E. faecalis 2, E. faecalis 3, E. faecalis 4) ont des effets neutres ou pro-inflammatoires (Figure 3).

[0115] Exemple 3 - Etude sur des modèles précliniques d'asthme induit par HDM

[0116] Le protocole du modèle préclinique d'asthme allergique induit par HDM chez le souriceau est représenté dans la Figure 4, panel A.

[0117] Des souriceaux ont été sensibilisés par une administration intranasale d'HDM (House Dust Mite - acarien de poussière) (lpg) à J0 (Sensibilisation) puis à lOpg de J7 à Jll (Challenges). Les souches selon l'invention ont été administrées par voie intranasale à 10 ⁶ UFC tous les 2 jours de J-2 à J10 (Figure 4 Panel A). A J12, les inventeurs ont analysé le suivi de croissance, procédé à un lavage bronchoalvéolaire (LBA) et analysé les cellules et les cytokines du tissu pulmonaire.

[0118] Le protocole du modèle préclinique d'asthme allergique induit par HDM chez la souris adulte est présenté dans la Figure 4, panel B.

[0119] Des souris adultes ont également été sensibilisées par une administration intranasale d'HDM (House Dust Mite - acarien de poussière) (25 pg) à J0 et J7 (Sensibilisation) puis à lOpg de J14 à J16 (Challenges). Les souches selon l'invention ont été administrées par voie intranasale à 10 ⁶ UFC tous les 2 jours de J-2 à J16. Dans un des groupes contrôle, du budésonide a été administré par voie intranasale (3mg/kg) de J14 à J16 (Figure 4 Panel B). A J17, les inventeurs ont analysé le suivi de croissance, procédé à un lavage bronchoalvéolaire des cellules et analysé les cytokines retrouvées dans le lavage et dans le tissu pulmonaire.

[0120] Les résultats sont représentés dans le Tableau 2 ci-après.

[0121] [Tableau 2] en souligné : p<0.05

[0122] Les cellules immunes retrouvées dans le LBA, les cytokines TH2 présentes dans les poumons et le LBA, ainsi que l'histopathologie sont des marqueurs du développement de l'asthme communs aux modèles souris d'asthme et aux patients humains. Les données du Tableau 2 proviennent d'une expérience avec 8 et 10 animaux par groupe, chez les souriceaux et chez les adultes, respectivement. Elles indiquent les effets protecteurs (valeurs positives) ou aggravants (valeurs négatives) de l'administration des souches d'E. faecalis selon l'invention (CNCM 1-5699, CNCM 1-5700, CNCM 1-5701) et hors invention (CNCM 1-4969) en comparaison avec les groupes d'animaux traités uniquement à l'HDM. Dans le protocole utilisé chez les souris adultes, les effets ont été comparés à ceux du budésonide, un co rti co stéroïde de référence en clinique. Dans le protocole chez les souriceaux, cette comparaison n'a pas été faite.

[0123] Les inventeurs ont ainsi montré que l'administration par voie intranasale des souches d'E. faecalis selon l'invention possèdent un effet anti-inflammatoire amélioré par rapport à la souche CNCM 1-4969 dans 2 modèles précliniques d'asthme chez la souris nouveau-né et adulte. Elles réduisent le recrutement de cellules retrouvées dans le LBA, ainsi que la libération de cytokines pro-inflammatoires dans les poumons, notamment l'IL-5, l'IL-4, l'IL-13 et l'IFN-y. [0124] Exemple 4 - Effet de la souche CNCM 1-5699 sur les fonctions respiratoires de souris adultes dans un modèle préclinique d'asthme induit par HDM

[0125] Des souris adultes ont été sensibilisées par une administration intranasale d'HDM (25pg) à J0 et J7 puis à 10pg de J14 à J16 (Figure 4 Panel B). La souche CNCM 1-5699 a été administrée par voie intranasale à 10 ⁶ UFC tous les 2 jours de J-2 à J16. Du budésonide a été administré par voie intranasale (3mg/kg) de J14 à J16. La fonction pulmonaire a été mesurée tous les deux jours à l'aide d'un oxymètre de pouls à J-2 avant le premier traitement, puis tous les 2 jours jusqu'à la fin de l'expérience. La mesure permet d'obtenir le niveau de saturation en oxygène du sang, qui peut être affectée en cas d'altération de la fonction respiratoire, notamment lors du développement de l'asthme. A J17, les inventeurs ont procédé à une mesure de la résistance dynamique pulmonaire. Un test similaire est utilisé chez l'homme pour diagnostiquer l'hyperréactivité bronchique (HRB), qui est notamment observée dans l'asthme, et qui se traduit par une augmentation de la résistance pulmonaire. Le principe général de ce test de provocation bronchique consiste en l'administration par voie inhalée de doses croissantes de méthacholine, une substance induisant de façon indirecte la contraction du muscle lisse bronchique, avec pour conséquences des modifications du calibre des voies aériennes, une augmentation de leur résistance et une diminution du débit gazeux au travers de celle-ci. Les souris ont été anesthésiées et intubées. Des concentrations croissantes de méthacholine en aérosol ont été administrées. La résistance a été enregistrée avec un pléthysmographe.

[0126] Les résultats sont représentés dans les figures 5 et 6.

[0127] L'asthme allergique a été induit chez des souris C57BL/6J naïves par des administrations intranasales d'HDM (Figure 4 Panel B). La souche CNCM 1-5699 a été administrée tous les deux jours par voie intranasale à raison de 1.10 ⁶ UFC/souris de J-2 à J16. L'oxymétrie de pouls a été mesurée tous les deux jours de J-2 à J16. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de 10 souris par groupe. Après évaluation statistique des différences entre les groupes expérimentaux, les valeurs p inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives : + p<0,05, groupe PBS comparé au groupe HDM ; *p<0,05 groupe HDM comparé aux groupes traités (Figure 5).

[0128] L'asthme allergique a été induit chez des souris C57BL/6J naïves par des administrations intranasales d'HDM (Figure 4 Panel B). La souche CNCM 1-5699 a été administrée tous les deux jours par voie intranasale à raison de 1.10 ⁶ UFC/souris de J-2 à J16. Les souris ont été euthanasiées à J17, 24 heures après la dernière provocation, et la résistance des voies respiratoires a été mesurée avec soustraction de la ligne de base du PBS. Les données sont représentées en tant que moyenne ± SEM de 10 souris par groupe. Après évaluation statistique des différences entre les groupes expérimentaux, les valeurs p inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives : + p<0,05, groupe PBS comparé au groupe HDM ; *p<0,05 groupe HDM comparé aux groupes traités (Figure 6).

[0129] Les inventeurs ont ainsi montré que l'administration par voie intranasale de la souche d'E. faecalis CNCM 1-5699 selon l'invention possède un effet protecteur de la fonction respiratoire dans un modèle préclinique d'asthme chez la souris. Ils ont observé une meilleure oxygénation du sang (Figure 5) et une meilleure contractibilité du poumon (Figure 6) en présence de la souche CNCM 1-5699, dans un modèle préclinique d'asthme induit par l'HDM.