黄芩甙铜配合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及化学药物领域， 特别是涉及一种黄芩甙铜配合物及其制备方法 。 背景技术

黄芩苷是一类重要的天然药物、 中药有效成分， 其生物活性极其广泛， 具有抑菌、 降血糖、 抗病毒、 抗炎、 利尿、 抗肿瘤、 抗氧化自由基、 抗变态反应和解痉等多种药理 作用。

Fe、 Cu 是人体中含量分别位居第一、 第二的必需微量元素。 体内有多种重要的酶 含 Cu， Cu对血红蛋白的形成起活化作用， 促进铁的吸收和利用， 在传递电子、 弹性蛋 白的合成、 结缔组织的代谢、 嘌呤代谢、 磷脂及神经组织形成方面有重要意义。

很多研究表明， 黄芩苷与适量金属离子通过化学结合螯合能增 加其生物效应， 根本 原因可能是： ①较原配体更易贡献电子与氧化自由基结合， 从而起到抗氧化作用； ②有 机配合物与很多以金属为活性中心的酶结构相 似， 能与此类酶结合而发挥作用； ③配合 物集合了配体与金属的协同作用而产生了 1+1〉2的药理活性。

许多药物化学工作者已对黄芩苷进行了大量的 结构修饰工作，得到了活性更高或化 学性质更有利于人体吸收的改性结构。

贾朝霞、 吴祺等 （参见 "无机化学学报， 1990， 6 ( 1 ) :106-108") 将黄芩苷溶于在 50%甲醇溶液中， 在氢氧化钠碱性条件下 （pH=7.4) 与氯化铜反应， 得到棕色针晶黄芩 苷合铜 （CuB)， 用 60%甲醇洗涤后干燥， 其结构如式 （I) 所示。

张素俊等 （参见"南京中医学院学报， 1991， 7 (4) :235-236") 将黄芩苷溶于无水 乙醇溶液中， 在碳酸钠碱性条件下， 加入醋酸铜反应， 回流得到棕红色粉末， 用热无水 乙醇洗涤后干燥， 其结构

II

从上述两个公开的文献可以看出， 同样是铜离子与黄芩苷反应， 得到的配合物的结 构是完全不同的， 这跟所用含铜离子的化合物及其用量有很大的 关系。 但上述两个反应 都是将黄芩苷溶于醇溶液中， 且在较弱碱性条件下将含铜离子的化合物与黄 芩苷反应， 但是， 在碱性条件下， 会产生大量的 Cu(OH) ₂ 沉淀， 该沉淀会与所得到的配合物一起沉 淀出来， 用醇洗涤是无法将其清除干净的， 因此说， 上述两个文献公开的方法得到的配 合物其实是一个混合物， 不能得到纯净物， 且配合物与氢氧化物沉淀确实很难分开， 因 此最终产物的纯化是很困难的。现有的有关黄 芩苷与其它金属形成的配合物报道， 在合 成纯化中也存在类似的困难和缺点。

因为黄芩苷中可与金属发生配位反应的活性基 团 （即配位点）较多， 能形成各种不 同结构的配合物， 结合黄芩苷的药理活性， 希望得到更多的不同药效或药效更高的黄芩 苷金属配合物。

发明内容

针对上述领域中的不足， 本发明提供新型结构的黄芩甙铜配合物， 体外实验表明， 具有较强的抑菌功能， 与现有公开的黄芩甙铜配合物相比， 其药用效果更好。

同时本发明还提供黄芩甙铜配合物的制备方法 ， 该方法简单， 且易控制， 最终产物 纯度高。

黄芩甙铜配合物， 其结构如式 （ΠΙ) 所示：

III

式 （m)所示黄芩甙铜配合物的制备方法， 其特征在于： 将黄芩苷、 硫酸铜或氯化 铜分别溶于非水溶液中， 两者按摩尔比为 2:1、 1 :1或 1 :2混合反应得棕黄色沉淀， 过滤， 用乙醇洗涤数遍， 烘干即可， 所述非水溶液为甲醇、 乙醇、 乙酸乙酯和石油醚的一种或 几种。

反应条件为： 反应温度为 30-80°C， 反应时间为 2-3小时。

黄芩甙铜配合物， 其

IV

式 （IV)所示黄芩甙铜配合物的制备方法， 其特征在于： 将黄芩苷、 醋酸铜分别溶 于非水溶液中， 两者按摩尔比为 2:1或 1 :1混合得棕红色沉淀， 过滤， 用乙醇洗涤数遍， 烘干即可， 所述非水溶液为甲醇、 乙醇、 乙酸乙酯和石油醚的一种或几种。

所述反应条件为： 反应温度为 30-80°C， 反应时间为 2-3小时。

上述黄芩甙铜配合物作为伺料添加剂的应用。

上述黄芩甙铜配合物在制备抗菌药物或抗肿瘤 药物中的应用。

所述抗菌药物指抗耐药菌药物， 所述耐药菌指耐药性猪源大肠杆菌； 耐药性鸡源沙 门氏菌； 耐药性金黄色葡萄球菌。

所述抗肿瘤药物， 指抗肺癌或抗肝癌的药物。

一种抗菌药物， 其特征在于， 其抗菌活性物质包括上述黄岑甙铜配合物。

所述抗菌药物， 还包括可与所述黄岑甙铜配合物配伍的中药， 西药或其它有益于 抗菌的无害化学成分。

所述药物， 其还包含药学上可接受的辅助成分。

所述药物， 其剂型为胶囊、 注射剂、 片剂、 颗粒剂、 口服液、 膏剂、 粉剂或悬浮剂。 一种抗肿瘤药物， 其特征在于， 其抗肿瘤活性物质包括上述黄岑甙铜配合物。 所述抗肿瘤药物， 还包括可与所述黄岑甙铜配合物配伍的中药， 西药或有益于抗 肿瘤的无害化学成分。

所述抗肿瘤药物， 其还包含药学上可接受的辅助成分。

所述抗肿瘤药物， 其剂型为胶囊、 注射剂、 片剂、 颗粒剂、 口服液、 膏剂、 粉剂或 悬浮剂。

本发明将实验分为两组：

( 1 ) 将黄芩苷、 硫酸铜或氯化铜分别溶于非水溶液中， 按不同摩尔比 （2:1、 1 :1、 1 :2) 的比例在一定温度条件下反应 2-3h， 得棕黄色沉淀， 过滤， 用乙醇洗涤数遍， 烘 干， 得棕黄色片状固体 A。 所述非水溶液为甲醇、 乙醇、 乙酸乙酯和石油醚的一种或几 种配合， 反应温度为 30-80°C。

(2)将黄芩苷、 醋酸铜分别溶于非水溶液中， 按不同摩尔比 （2:1、 1 :1 ) 的比例在 相同温度条件下反应 2-3h， 得到棕红色沉淀， 过滤， 用乙醇洗涤数遍， 烘干， 得棕红色 粉末状固体 B。 所述非水溶液为甲醇、 乙醇、 乙酸乙酯和石油醚的一种或几种配合， 反 应温度为 30-80°C。

上述实验证明， 不同摩尔比、 同种金属不同盐根与黄芩苷反应得到的可能是 相同结 构的化合物， 也可能是不同结构的化合物， 本发明将上述得到的产物分别用 UV、 Infra-red NMR、 LC-MS、 金属元素分析等进行结构表征， 推定上述第 （1 ) 组得到的 产物 A， 其结构式如 （III) 所示； 第 （2) 组得到的产物 B， 其结构式如 （IV) 所示。

本发明方法是将两种原料分别溶解后在原始的 pH值下反应， 避免了在碱性条件下 产生氢氧化铜的可能性， 因此本发明方法得到的产物纯度非常高， 省去了复杂的纯化步 骤。

本发明将上述部分产物（黄芩苷与金属铜反应 所得配合物 A与 B)还做了体外抑菌 试验， 表明具有较高的抑菌效果， 可作为伺料添加剂使用。

本发明还对得到的黄岑甙铜配合物进行了抗耐 药菌体外试验。试验结果表明， 其对 耐药大肠杆菌， 耐药沙门氏菌以及耐药金黄色葡萄球菌菌具有 较高的抗菌性。 可用于抗 耐药菌， 如作为活性成分制备抗耐药菌的药物。

本发明的体外研究发现， 两种黄岑甙铜配合物相比黄岑苷， 对肿瘤具有更好的抑制 作用， 特别是肺癌和肝癌细胞 _; 因此可作为抗肿瘤活性成分用于制备抗肿瘤的 药物。 具体实施方式

实施例 1:

1-1 合成配合物

本发明将实验分为两组：

(1) 将黄芩苷、 硫酸铜或氯化铜分别溶于非水溶液中， 按不同摩尔比 （2:1、 1:1、 1:2) 的比例在反应 2-3h， 得棕黄色沉淀， 过滤， 用乙醇洗涤数遍， 烘干， 得棕黄色片 状固体 A。 所述非水溶液为甲醇、 乙醇、 乙酸乙酯和石油醚的一种或几种配合， 反应温 度为 30-80°C。

(2)将黄芩苷、 醋酸铜分别溶于非水溶液中， 按不同摩尔比 （2:1、 1:1) 的比例反 应 2-3h。 两种不同摩尔比的反应所得产物均为棕红色沉 淀， 过滤， 用乙醇洗涤数遍， 烘 干， 得棕红色粉末状固体 B。 所述非水溶液为甲醇、 乙醇、 乙酸乙酯和石油醚的一种或 几种配合， 反应温度为 30-80°C。

上述实验的合成产率如下： 摩尔比 2:1 1:1 1:2 黄芩苷： 氯化铜 46.37% 60.22% 46.13% 黄芩苷： 硫酸铜 46.73% 61.80% 45.78% 黄芩苷： 醋酸铜 55.73% 74.62%

1-2 结构表征

1-2-1 黄芩甙铜配合物的紫外表征

1-2-1-1 稀碱溶液溶解的紫外结果

将配合物溶于 2%的 NaOH中， 测定最大吸收波长， 结果见表 1。

表 1 黄芩苷与配合物在碱溶液中的紫外吸收

1-2-1-2 DMSO溶解的紫外结果

将配合物溶于 DMSO中， 测定最大吸收波长， 结果见表 2。

表 2 黄芩苷与配合物在 DMSO溶液中的紫外吸收

最大吸收波长

DMSO

黄芩苷 280 nm 316 nm

黄芩甙铜 （所有产物） 292 nm —

最大吸收波长变化 红移 12 nm —

从表 1、 表 2可知， 产物在碱液中与在 DMSO中的紫外吸收略有不同， 在 DMSO 中测定由于消除了作为溶剂空白的 DMSO在 200nm附近的末端吸收，所以 DMSO中黄 芩苷和各产物在 200nm附近的吸收消失，在两种不同溶剂中黄芩� ��及各产物在其他主要 吸收峰的波长略有不同（DMSO中各物质最大吸� �波长值略大于在碱液中各物质的最大 吸收波长值）。

在碱液中测定的黄芩苷及各物质最大吸收波长 ， 黄芩苷在 214nm、 275nm及 317nm 有三处最大吸收， 所有产物均只有两处紫外吸收， 在 317nm处吸收消失。

在 DMSO中测定的黄芩苷及各物质最大吸收波长， 黄芩苷在 280nm及 316nm有两 处最大吸收， 所有产物均只有一处紫外吸收为 292nm， 而 316nm处紫外吸收消失。

可见相对于黄芩苷的两处主要吸收峰 （在碱中为 275nm及 317nm、 在 DMSO中为 280nm及 316nm)， 配合物的紫外吸收峰发生明显变化， 一处吸收峰消失， 一处吸收峰 发生红移。表明黄芩苷确与金属离子发生了反 应。 紫外吸收产生红移的原因是由于形成 配合物后使整个分子中电子的离域程度增大且 金属离子具有一定的吸电子能力，共轭环 体系的电子云向平面中心的金属移动， 使电子跃迁所需的激发能减小， 所以吸收峰发生 红移。

1-2-2 黄芩苷金属配合物的红外表征

黄芩苷、 产物 A (黄芩苷： 硫酸铜或氯化铜 =2: 1、 1 : 1或 1 :2)、 产物 B (黄芩苷： 醋 酸铜 =2: 1或 1 : 1 ) 的红外结果分析如下：

C=0的吸收峰 （伸縮） 在 1850— 1600 cm- ¹ 之间。 在黄芩苷的红外图谱中， 黄芩苷 4位 C=0的吸收峰 （伸縮振动峰） 为 1661.05 cm- 黄芩苷糖苷上羧酸的羰基吸收峰为 1726.71cm" ¹ , 而在两个配合物的红外图谱中， 这两个 C=0吸收峰变宽合并成一个峰， 分别红移至 1624.260^、 1621.90cm" ¹ 1619.20cm— ¹ 、 1625.84cm" ¹ 1620.91cm" ¹ 1623.67cm" ¹ ,导致吸收峰红移的原因是氧的孤对电子与金� �离子的空轨道形成配位键及 金属离子使电子离域而导致碳氧双键的电子云 密度降低， 使力常数变小， 从而导致红移 现象。 由此说明， 黄芩苷与金属离子的结合部位可能是 4位的羰基或 （和）糖苷上羧基 的羰基。

醇、 酚的游离 0_H 键吸收峰在 3650_3580cm- ¹ 之间， 缔合 0_H 键吸收峰在 3400— 3200cm ¹ 之间， 而羧酸的游离 0— H键 3540— 3350cm- ¹ 之间。黄芩苷 5位羟基与 4位羰基可发生分子内氢键缔合， 则峰位于 3400— 3200cm- ¹ 之间， 黄芩苷中羧酸上的羟 基位游离 0— H键， 则峰位于 3540— 3350cm- ¹ 之间。 由于这些 0— H吸收峰很宽， 且还 有其他位置上的许多羟基，致使这些 0— H吸收峰在 3600— 3200cm- ¹ 之间形成一个大的 宽峰， 难以分辨各 0— H所对应的位置。 黄芩苷红外图谱中， 这些 0— H键形成的大宽 峰在 3398.45cm- ¹ 处有吸收峰。 而在配合物的红外图谱中， 黄芩苷形成配合物后， 该峰 从 3398.45cm- ¹ 分别位移至 3412.63cm- 3399.95cm ¹ , 即吸收峰发生了蓝移， 说明分子 内氢键遭到破坏， 由此可见 5位羟基或糖苷上羧基的羟基与金属离子发生� �配位。

由此可见， 黄芩苷的 5位羟基、 4位羰基或 （和） 糖苷上羧基的羰基、 羟基与铜离 子发生了配位。

由紫外和红外结果可知， 产物相对原料（黄芩苷） 的紫外和红外吸收均发生了显著 变化， 说明黄芩苷与铜离子发生了配合反应， 配位点为 4位羰基、 5位羟基或糖苷上羧 基的羰基、 羟基。

由于紫外与红外数据仅能鉴定出黄芩苷已与金 属离子发生了配合反应且初步确定 了可能发生配合反应的配位点，但不同原料不 同比例得到的不同产物发生配位的确切位 置则还需以下方法进一步鉴定。

1-2-3 黄芩甙铜的 1H NMR表征

黄芩苷 1H NMR (DMSO) 数据如下：

δ 12.545 (s, 1H, 5-OH), 8.664 (s, 1H, 6-OH), 8.070 (d,2H, 2'，6'-H)， 7.571-7.534 (m， 3H, 3'，4'，5'-H)， 7.004 (s, 1H， 8-H), 7.000 (s, 1H,3-H), 5.289-5.499 (m， 3H, 2",3",4"-OH), 5.240 (d, 1H, Γ-Η), 4.060 (d， 1H, 5"-H), 3.330-3.450 (m， 3H, 2",3",4"-H).

黄芩甙铜 （A) 1H NMR (DMSO) 结果及分析如下：

黄芩甙铜配合物由于铜离子顺磁性的影响， 峰形变宽， 信号也变弱， 但相对黄芩苷 各位移处， 配合物均有相应峰出现， 唯有 12.6左右的峰（即 5-OH峰）消失， 可见 5-OH 由于与铜离子发生配位其 H原子被取代。

由于铜离子顺磁性影响，产物氢谱的峰形及信 号难以十分准确的判断具体的结构信 息， 故只做了一种产物 （黄芩苷： 氯化铜 =1 :1 ) 的氢谱， 但可以确定的是， 峰形变宽、 信号变弱是作为抗磁性的二价铜离子对化合物 核磁图谱影响的重要特征， 导致黄芩苷的 氢谱信息发生了根本性的变化， 说明铜离子已成功络合上去， 且黄芩甙铜 （黄芩苷： 氯 化铜 =1 :1 ) 由于 12.6左右的峰（即黄芩苷 5— OH峰）消失， 可以初步确定该结构是以 5 位羟基与铜离子发生配位。

1-2-4. 铜含量测定

黄芩苷与不同摩尔比的不同铜盐配合物的铜离 子含量见表 3.

表 3 黄芩苷与铜离子反应所测得铜离子含量结果

黄芩苷： 氯化铜 10.49% 10.78% 10.91% 黄芩苷： 硫酸铜 10.31% 10.56% 10.76% 黄芩苷： 醋酸铜 10.55% 11.36%

由测得的各配合物中所含铜离子的含量初步确 定，黄芩苷与氯化铜或硫酸铜在三种 比例下 （2:1、 1 :1、 1 :2) 以及黄芩苷与醋酸铜在 2:1或 1 :1 的比例下的产物均为一分子 黄芩苷络合一分子铜离子。

1-2-5 物理性质

黄芩苷与硫酸铜或氯化铜在不同摩尔比 （2:1、 1 :1、 1 :2) 所得产物性状完全一致， 均为棕黄色整片状固体， 且均溶于 DMSO、 DMF， 难溶于甲醇、 乙醇、 水、 乙酸乙酯 等有机溶剂， 均溶于 NaHC0 ₃ 、 Na ₂ C0 ₃ 溶液和稀 NaOH溶液。

黄芩苷与醋酸铜在摩尔比 2:1、 1 :1两组组实验得到产物性状一致， 均为棕色粉末状 固体， 且均溶于 DMSO、 DMF，溶于稀 NaOH溶液， 但不溶于 NaHC0 ₃ 和 Na ₂ C0 ₃ 溶液。

黄芩苷与硫酸铝或氯化铝在摩尔比 2:1时得到红褐色不规则状固体， 1 :1或 1 :2摩尔 比得到橙红色不规则状固体， 二者均溶于 DMSO、 DMF， 难溶于甲醇、 乙醇、 水、 乙 酸乙酯等有机溶剂， 均溶于 NaHC0 ₃ 、 Na ₂ C0 ₃ 溶液和稀 NaOH溶液。

黄芩苷与硫酸铁或氯化铁在摩尔比 2:1时得到黑色块状固体， 1 :1或 1 :2摩尔比得到 黑绿色块状固体， 二者均溶于 DMSO、 DMF， 难溶于甲醇、 乙醇、 水、 乙酸乙酯等有 机溶剂， 均溶于 NaHC0 ₃ 、 Na ₂ C0 ₃ 溶液和稀 NaOH溶液。

1-2-6 配位点的进一步鉴定

根据《天然药物化学》 （人民卫生出版社， 吴立军）， 已确定黄酮类化合物各羟基酸 性大小排列及在各不同强度的碱液中的溶解性 ，各基团酸性排列如下：羧酸基（-COOH) 〉7，4'-二 OH〉7-OH或 4'-OH〉一般酚 OH〉5-OH〉3-OH， 含羧基或同时存在 7位和 4' 羟基则可溶于 NaHC0 ₃ ，只含 Ί位或 4'羟基可溶于 Na ₂ C0 ₃ ，其他位羟基则不溶于 NaHC0 ₃ 及 Na ₂ C0 ₃ ， 只能溶于不同浓度的 NaOH中。

黄芩苷与硫酸铜、 氯化铜在不同摩尔比 （2: 1、 1 : 1、 1 :2) 所得产物性状完全一致， 均为棕黄色整片状固体， 且 Cu ²⁺ 含量也一致。 从红外的鉴定结果看， 由于铜离子吸电子 的作用， 致使羧酸上的羰基及 4位羰基吸收均发生红移而重叠为宽峰， 而各羟基的红外 吸收由于均在 3600-3200 cm ¹ 间呈一个大宽峰， 故单纯以红外图谱难以判断铜离子的配 位位点。 该反应所得所得产物均溶于 NaHC0 ₃ ， 说明羧基是存在的， 而根据金属离子含 量测定结果，产物中，黄芩苷与 Cu ²⁺ 的配位比为 1 : 1，可见一分子黄芩苷配合一分子 Cu ²⁺ ， 由于黄芩苷可发生的配位的基团为两处： 羧基上的羰基与羟基、 4位羰基与 5位羟基， 所以该反应为一分子黄芩苷以 4位羰基和 5位羟基与一分子 Cu ²⁺ 发生配位。

黄芩苷与醋酸铜在摩尔比 2: 1、 1 : 1两组组实验得到产物性状一致， 均为棕红色粉末 状固体， 且 Cu ²⁺ 含量也一致。 红外结果也显示了配合物相对黄芩苷发生了根 本变化， 变 化部位也是羰基及羟基，但同上述结果一样也 由于各同类基团吸收峰重叠而使得单纯以 红外图谱难以判断具体的配位点。 该反应所得产物溶于 NaOH, 但不溶于 NaHC0 ₃ 和 Na ₂ C0 ₃ 溶液， 说明环上的 -OH存在， 而糖苷的 -COOH的氢已不存在。 而根据金属离子 含量测定结果， 产物中， 黄芩苷与 Cu ²⁺ 的配位比为 1 : 1， 可见一分子黄芩苷配合一分子 Cu ²⁺ , 由于黄芩苷可发生的配位的基团为两个： 羧基、 4位羰基与 5位羟基， 由红外羰 基吸收发生变化以及糖苷的 -COOH 的氢已不存在可知， 是一分子黄芩苷以羧基上的羰 基和羟基与一分子 Cu ²⁺ 发生配位。

1-2-7 黄芩甙铜配合物的 LC-MS表征

将黄芩甙铜配合物 A、黄芩甙铜配合物 B做质谱分析， 质谱图中所得分子离子峰分 别为：

配合物 分子离子峰 黄芩甙铜 A (黄芩苷与硫酸铜或氯化铜在不同配比下所得� �物） 590

黄芩甙铜 B (黄芩苷与醋酸铜 2: 1或 1 : 1配比下所得产物） 568

综上所述， 推测所得各物质结构如下：

1、 黄芩苷与不同比例氯化铜或硫酸铜反应得到结 构推测如下： （该结构相对分子质 量为 589， 铜所占比例为 10.70% )

III

质谱分析： 分子离子峰位显示为 590， 由于为 （分子 +H ⁺ ) 模式， 所以实际分子量 为 589， 与上述结构分子量完全符合。 在对分子离子进行轰击时， 由于电离的缘故， 所 以显示为 588。 碎片离子峰 570的强度最大， 588-570=18显然为分子离子峰失去一份子 水所致（该水分子应为金属铜上的配位水， 所以首先失去）。 碎片峰 475的强度也较大， 根据 588-18-63-32=475， 可能是由于分子离子峰失去一分子配位水 （18 )、 一分子配位 甲醇（32)以及一分子铜离子（63 )。碎片峰 361.9的峰强度仅次于 570的峰强度， 361.9 =588-18-176-32, 可见， 此为分子离子峰的另一种裂解方式， 即分子离子失去一分子配 位水（18)、一分子配位甲醇（32)以及一分子糖 苷（176)。碎片峰 330.8=588-18-176-32-31， 可见此种裂解方式除了失去一分子配位水 （18 )、 一分子配位甲醇 （32) 以及一分子糖 苷 （176) 夕卜， 还继续失去一分子结合在铜离子上的 -OCH ₃ 基团。 由此可知， 该结构由 一分子黄芩苷配合一分子铜离子， 另外有一分子水及两分子甲醇分别与铜离子配 位。

2、 黄芩苷与醋酸铜 （ 2: 1 、 1 : 1 ) 反应得到结构推测如下： （该结构相对分子质 量为 567， 铜所占比例为 11.11% )

IV

质谱分析： 分子离子峰为 568， 由于为 （分子 +H ⁺ ) 模式， 所以实际分子量为 567， 与上述结构分子量完全符合。 实施例 2 药效实验 体外抑菌试验， 抑菌实验结果见表 4。

表 4 抑菌实验结果 （MIC值）

黄芩苷 2.5mginl 2.5mg ^/ ml 黄芩苷： 氯化铜或硫酸铜 * 0.5mginl 0.25mginl 黄芩苷： 醋酸铜 （2:1或 1 :1 ) O^mginl O mginl 氯化铜 2 mginl 1 mginl

硫酸铜 2 mginl 1 mginl

醋酸铜 2 mginl 1 mginl

* 由于黄芩苷与氯化铜、 硫酸铜在三种比例下 （2:1、 1 :1、 1 :2) 所得产物为相同产 物， 抗菌效果也相同， 故只列一处数据。

**由于黄芩苷与醋酸铜在 2:1、 1 :1比例下所得产物为相同产物， 抗菌效果也相同， 故只列一处数据。

结果： 由抑菌结果可知， 各配合物的抑菌效果较黄芩苷均显著增强， 其中黄芩苷与 硫酸铜 （或氯化铜） 得到的配合物对金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌的 MIC分别为黄芩苷 的 1/5、 1/10， 黄芩苷与醋酸铜 （2:1 或 1:1 ) 得到的配合物对金黄色葡萄球菌、 大肠杆 菌的 MIC分别为黄芩苷的 1/10、 1/5。

蔡传英公开的专利 （公开号： CN 1462619A) 发明了一种黄芩苷锌 （结构为一分子 黄芩苷以羧基位配合一分子锌离子）药物制剂 ， 具有良好的抗菌效果， 对金黄色葡萄球 菌的 MIC为 0.63 mg½l， 对大肠杆菌的 MIC为 5.0 mg½l; 王玉天等公开的专利 （公开 号： CN 1634952A) 发明了一种黄芩苷锌配合物 （结构为两分子黄芩苷以羧基位、 4位 羰基及 5位羟基配合三分子锌离子）， 对金黄色葡萄球菌的 MIC为 lmg½l， 对大肠杆菌 的 MIC 为〉 lmg½l。 而本专利中发明的两种黄芩甙铜配合物对金黄 色葡萄球菌的抑制 效果为上述专利所发明黄芩苷配合物的 1.26-4倍，对大肠杆菌的抑制效果为上述专利所 发明黄芩苷配合物的 2-20倍， 所以本专利所发明的两种黄芩甙铜配合物显示 出更强的 抑菌活性。 实施例 3. 本发明的产品对不同耐药细菌的抑菌试验

以 6种化合物对耐药大肠杆菌、沙门氏菌和金黄� �葡萄球菌的最小抑菌浓度 ( MIC )。 1 材料与试剂

1.1 化合物

1#-黄芩甙 （黄酮提取物）、 2# -黄芩甙铜配合物 A、 3# -黄芩甙铜配合物 B、 4# -黄芩甙铜 混合物 （1 : 1 )、 5# -硫酸铜、 6# -黄芩甙锌 （以实施例 1的方法制得并验证， 其结构同黄 芩甙铜配合物 A)

1.2 受试菌株

猪源大肠杆菌 CVCC1498 ( C83543 ), 1980年分离于广西某农场腹泻仔猪粪便， 血 清型为 0141 :K+。 耐四环素、 青霉素、 磺胺类等药物。 猪源大肠杆菌 CVCC1515 ( C83646 P1038 ),从腹泻仔猪消化道分离，血清型 0149， 多重耐药 （耐氨苄西林、 磺胺异噁唑、 复方新诺明、 四环素、 多西环素、 头孢噻呋等药 物）。 鸡源沙门氏菌 CVCC 533 ( C79-13 ): 早期分离于北京西郊马连洼某鸡场， 从病鸡心 血中分离， 血清型为 9,121,123。 对四环素、 青霉素、 磺胺类耐药。 记载于： 马卫明等， 猪小肠抗菌肽的抗菌作用研究， 《中国兽医杂志》 2005年第一期。 鸡源沙门氏菌 CVCC1793 CSal.5， 15616y ): 鸡消化道中分离， 强致病性， 耐大观霉 素、 多粘菌素等。 猪源金黄色葡萄球菌 546 ( C56023 ) 1989年从北京海淀某猪场死猪关节液中分离， 耐氨苄西林和环丙沙星等。 记载于： 扶亚祥等， 杠板归化学成分分析及抗菌效果研究， 《动物医学进展》， 2008, 29 ( 9)： 45〜49. 金黄色葡萄球菌 CVCC 2086 (ATCC, 6538)： 致化脓性疾患， 多重耐药（耐青霉素、 氨苄西林、 氨苄西林 /克拉维酸、 克林霉素、 红霉素、 磺胺异噁唑、 复方新诺明、 头孢噻 呋、 头孢西丁、 氧氟沙星等）。 以上耐药菌株均购于中国兽医微生物菌种保藏 中心 （CVCC ) ， 其编号见 CVCC的 兽医微生物菌种共享数据库， 其网址：

http:〃222.35.47.100:8018/cvcc/cvcc search/search fet.isp,可保证自申请日起 20年内向公 众发放用于验证试验。

1.3 仪器和试剂

C0 ₂ 培养箱； 天平（感量 O.OOOlg); 96孔板； 移液器（20(^L和 ΙΟΟΟμυ; 浊度仪； 无菌滤器 （ρ=0.22μηι); MIC细菌稀释液 （生理盐水）； M-H肉汤； NaHC0 ₃ 溶液。 2 方法

2.1 各种化合物溶液的配置

2.1.1 NaHC0 ₃ 溶液

准确称取 NaHC0 ₃ 0.03g，溶解于无菌去离子水中，定溶至 100ml,即为 0.03% NaHCO ₃ 溶液。

2.1.2 化合物贮存液 分别称取化合物 40mg， 溶解于 10 ml 上述 NaHC0 ₃ 溶液中， 使终浓度为 4mg/ml

( _1# 和 4#微溶， 用超声至全溶解）， 5号化合物直接溶解于 10ml无菌去离子水中。

2.2 菌株的复苏 将大肠杆菌 1498 (2010.3.16冻干）、 沙门氏菌 533 (2005.4.6冻干) 和金黄色葡萄 球菌 546(2002.1.16冻干)用生理盐水复原后接种于营养� ��脂平板，大肠杆菌 CVCC1515、 沙门氏菌 CVCC1793和金黄色葡萄球菌 CVCC 2086的甘油冻存液直接接种于营养琼脂 平板， 置于 37°C培养箱 20h。 培养后挑取单个菌落接种营养琼脂平板传一代 。

2.3 MIC的测定

2.3.1 化合物的稀释 分别取 6种化合物和 4%NaHC0 ₃ 溶液 0.3ml加至 96孔板（8*12)的第一列孔中（每 种化合物对应一排孔， 共占 7排孔， 最后一排孔作为生长对照和空白对照用）， 后面 7 列孔中各加入 0.15ml M-H肉汤。从第一列孔移取 0.15ml化合物溶液加入第二列孔， 做 倍比稀释， 吹打混匀后移取第二列孔 0.15ml溶液加入至第三列孔， 以此类推， 直至第 8 列孔稀释完毕， 移取 0.15ml溶液弃去。 最终每孔化合物浓度如下表 5:

2.3.2 抑菌试验 挑取营养琼脂平板上生长的不同受试菌株的单 菌落 2-3个，溶解于 MIC细菌稀释液 (生理盐水） 中， 调整细菌悬液浊度至 0.5麦氏单位。 移取该细菌悬液 0.3ml加入至 30ml M-H肉汤中， 作 100倍稀释， 再将该细菌稀释 液加入到含不同浓度化合物的 96孔板中， 每孔 0.15ml。 最后一排的 8个孔中分两部分 (前 4孔和后 4孔）分别加入 M-H肉汤和细菌稀释液 0.15ml作为空白对照和生长对照。 然后将 96孔板放入 37°C培养箱。

2.3.3 20h后读取抑菌试验结果

3 结果

3.1 抑菌试验结果 （MIC值） 综合两次平行试验， 抑菌试验结果 （MIC) 如下表 6:

3.2 对氨苄西林抑菌试验结果 （MIC值）

选择受试耐药菌株猪源金黄色葡萄球菌： 综合两次平行试验结果， 将抑菌试验结果 (MIC值 mg/ml)

注： 抗菌药 +2号指的是在稀释好的细菌中每 10ml加入 0.1ml的 黄岑甙铜化合物 B， 混 匀后再加入系列稀释好的抗菌药中， 测定 MIC。

3.3 结果分析 不同的试验产品对不同细菌的 MIC有所不同， 2#和 3#化合物对大肠杆菌抑菌效果 最强， MIC为 1 mg/ml， 其次是 4#和 5#化合物， MIC为 2 mg/ml, 1#和 6#为>2 mg/ml。 化合物对沙门氏菌的抑菌效果相差不大， 2#、 3#、 4#和6#稍强为 0.5 mg/ml， 1#和 5# 为 1 mg/ml和 2 mg/ml。化合物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果强� ��大肠杆菌和沙门氏菌， 2#和 3#化合物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最强， MIC为 0.125-0.25 mg/ml， 4#和 6# 化合物的 MIC为 0.25-0.5 mg/ml, 1#和 5#化合物的 MIC为 1 mg/ml。 NaHC0 ₃ 稀释液对 3种细菌的 MIC均 >2， 表明 NaHC0 ₃ 稀释液不影响抑菌效果。

本试验选择的菌株均存在不同程度的耐药状况 。而受试产品的抑菌作用未发现因细 菌耐药程度不同而产生的抑菌效果的差异， 同一种产品对不同耐药菌株的抑菌作用基本 一致。 如表 7， 本发明的化合物还能降低金黄色葡萄球菌对氨 苄西林的耐药性。 4 结论

4.1 六种试验产品对三种受试菌的抑制作用是有差 异的， 总体来说，对金黄色葡萄球菌 的抑制作用最强， 沙门氏菌次之， 对大肠杆菌的抑制作用最弱。

4.2 黄芩甙铜配合物的抑菌效果最佳，优于黄芩甙 铜混合物和硫酸铜， 明显大于黄芩甙 和黄芩甙锌。对大肠杆菌的 MIC为 lmg/ml， 是黄芩甙混合物和硫酸铜的 1/2， 是黄芩甙 和黄芩甙锌的 1/2以下。 对金黄色葡萄球菌 MIC为 0.125-0.25mg/ml， 是黄芩甙铜混合 物和黄芩甙锌的 1/2， 是黄芩苷和硫酸铜的 1/4以下。 黄芩甙铜 1和黄芩甙铜 2对不同 细菌的 MIC无差异。

4.3 本试验产品其抑菌效果不受细菌耐药程度的影 响。 实施例 4. 本发明的黄岑甙铜的抗肿瘤作用

分别取对数生长期的肺癌 A549细胞和肝癌 HepG2细胞，用含体积百分浓度为 10% 的胎牛血清的 RPMI-1640培养基稀释至菌液浓度为 l x l0 ⁴ /mL， 接种于 96孔板， 每孔 ΙΟΟμΙ^, 置培养箱中于温度为 37°C、 C0 ₂ 体积分数为 5%的条件下培养 24小时， 弃去培 养基， 加入新鲜培养基 ΙΟΟμΙ^, 再加入不同浓度 （20、 40、 80、 160、 320μΜ) 的黄芩 苷或黄岑甙铜溶液， 每孔 ΙΟΟμ 每个浓度设 5个复孔， 并设溶剂对照组， 继续于相同 条件下培养 48小时， 再每孔加入 ΜΤΤ培养 4小时， 弃去上清液， 加入 DMSO振荡， 用酶标仪于 490nm处测定吸光度，取 5个复孔的平均值，计算每种化合物对不同肿� �细 胞的半数有效抑制浓度 （IC _5Q )。 结果见表 6。

表 6 黄芩苷及其金属配合物的抗肿瘤活性

由表 6可知，实施例 1制得的 2种黄岑甙铜对肺癌 A549细胞和肝癌 HepG2细胞的 抑制活性较黄芩苷均显著增强。 目前尚无文献报道黄芩苷金属配合物的抗肿瘤 作用。

基于以上实验结果， 实施例 1制得的 2种黄岑甙铜可用于制备抗菌药物和抗肿瘤药 物。 实施例 5 黄岑素金属配合物的制备及用途

分别以实施例 1制备得到的黄岑甙铜为起始原料，经如下工� �制备得到黄岑素铜配 合物：

黄岑甙铜溶于 10%盐酸中，发生水解反应，水解产物采用柱层 析法分离得到黄岑素 铜。

工艺流程如下：

黄芩苷

经实施例 3、 4的功能实验验证， 在急性毒性及药理实验中与实施例 1制备得到黄 岑甙铜没有区别。