MARCADORES PARA ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS. MEMORIA DESCRIPTIVA

La presente invención corresponde a compuestos derivados de benzimidazoles radio-marcados útiles como marcadores específicos para enfermedades neurodegenerativas.

DESCRIPCIÓN DE LO CONOCIDO

La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad de difícil tratamiento que requiere de un temprano diagnóstico para controlar o reducir sus efectos. La AD es una enfermedad de gran impacto en el sistema de salud pública y Ia más importante de las demencias, siendo en el mundo Ia cuarta causa de muerte después de los trastornos cardiovasculares. La prevalencia de Ia AD en el mundo es de un 12% en los mayores de 65 años. La mortalidad es de 100.000 personas por año y el costo para Ia economía norteamericana es de USD 170 millones anualmente (Wimo y Winblad, 2001).

La demencia, un síndrome cognitivo caracterizado por Ia disminución en las capacidades y funciones cognitivas, afecta a un porcentaje importante de esta población. Dentro de todas las demencias, Ia AD es Ia de mayor prevalencia e incidencia. Esta realidad significa un gran gasto para el estado, y se ha determinado que ha habido un incremento en Ia incidencia de AD debido al aumento en Ia esperanza de vida. Por otra parte, existe un grupo de patologías relacionadas, las taupatías que son enfermedades en las que Ia proteína tau, un componente esencial del citoesqueleto, que se agrega en el cerebro hasta formar estructuras llamadas ovillos neurofibrilares (NFTs) (Maccioni y Cambiazo, 1995; Maccioni y col., 2001), los NFTs están formados por agregaciones poliméricas de tau, una proteína que ha sido investigada en profundidad en el contexto de Ia AD, durante más de 30 años (Maccioni y col., 1986; 1995; 2001). Estas patologías hasta hoy no tienen cura, pero el encontrar un procedimiento diagnóstico para detectarlas tempranamente, permitiría aumentar substancialmente Ia sobrevida y Ia calidad de vida de los pacientes. Además, un procedimiento y tecnologías que permitan un certero diagnóstico de Ia AD permitirán estimular el desarrollo de terapias para lograr controlar Ia enfermedad.

El acelerado desarrollo de tecnologías de neuroimagen y de Ia radio- farmacia han posibilitado importantes aportes al entendimiento de procesos fisiopatológicos que ocurren en el cerebro humano. Sin embargo, en muchas enfermedades neurodegenerativas como Ia AD ₁ estas aproximaciones son aun muy inespecíficas, Io cual no permite realizar un diagnostico inequívoco.

Las publicaciones de Klunk y col. (2004); Verhoeff y col. (2004), Glodzik y col. (2005) y Mosconi y col., (2005,2007) han entregado luces sobre algunos marcadores de placas seniles, sin embargo pese a haber sido desarrollado ya hace varios años, su aplicación clínica no ha sido establecida o implementada. El desarrollo de radio-ligandos para obtener imágenes in vivo de placas de Aβ y de ovillos neurofibrilares (NFTs), ya sea mediante PET, SPECT u otras tecnologías, es en Ia actualidad, una importante y activa área de Ia Medicina Nuclear. El diseño y evaluación biológica de agentes para obtener imágenes de placas de Aβ, ya sea por PET o SPECT requiere conocer las relaciones estructura-función de estos radioligandos y varía desde grandes proteínas y péptidos tales como Aβ y anticuerpos monoclonales radioactivos hasta pequeñas moléculas derivados del rojo Congo, Chrisamina-G, tioflavina-T, y naranja de acridina. Estudios recientes han mostrado que con este tipo de tecnologías es posible obtener imágenes in vivo en humanos sugerentes tanto de placas seniles como de los NTFs, aunque esta correlación no ha sido establecida. Hasta el momento los radiotrazadores más útiles han sido moléculas relativamente pequeñas (<600 Da). El desarrollo de radioligandos para obtener imágenes in vivo de placas de Aβ-amiloide (PAB) y de NFTs, ya sea mediante PET o SPECT, ha sido una importante y activa área de Ia industria radiofarmacéutica (Mathis y col., 2005). El marcar anormalidades patológicas específicas, serán de gran utilidad en Ia diagnóstico precoz y en Ia identificación de los sujetos en riesgo de desarrollar una enfermedad determinada.

Hasta Ia fecha el único compuesto que se ha ensayado en humanos para detectar estructuras anómalas en el cerebro de pacientes con AD son el compuesto Pittsburg (PIB) y el FDDNP que marcan las placas seniles de amiloide. Sin embargo el amiloide no es un signo patognomónico para detectar el Alzheimer (Maccioni y col., 2001), y su marcación carece de valor diagnóstico patología específica. El PIB es un compuesto derivado de Ia tioflavina-T, se une a placas seniles en el cerebro, compuestas principalmente del péptido amiloide. El PIB ha sido usado sin éxito como herramienta de diagnóstico, para detectar Ia acumulación de placas seniles en el cerebro de pacientes con AD y otras demencias. Aunque el PIB es capaz de generar imágenes sugerentes de Ia disposición de las placas seniles visualizadas por medio de Ia emisión de positrones (tecnología PET) su uso en el diagnóstico de AD ha sido prácticamente nulo, debido a que las placas seniles no son patognomónicas de Ia enfermedad de Alzheimer, es decir hay individuos sanos con una carga importante de placas seniles en el cerebro y que no presentan deterioro cognitivo alguno. Por Io tanto, no se ha ensayado ningún compuesto que marque específicamente las lesiones de los NFTs formados por agregados de tau, por Io que las moléculas de Ia presente invención son los únicos productos realmente capaces de marcar específicamente estas estructuras.

Hasta hoy se han utilizado sin resultados positivos, diferentes tipos de técnicas de neuroimagen como una aproximación al diagnostico y evaluación de Ia evolución en el tiempo de Ia AD y taupatías (Mathis y col, 2005; Rusinek y col., 2003; Stoub y col., 2005; Rosen y col., 2005; Godbolt y col., 2006). Estas técnicas incluyen: Tomografía Axial Computarizada, resonancia magnética nuclear (NMR), tanto estructural (sNMR) como funcional NMR (fNMR), tomografía computarizada de emisión de fotones (SPECT) y también Ia tomografía de emisión de positrones (PET). Esta última proporciona información relacionada con el metabolismo cerebral de Ia glucosa. Todas estas técnicas de neuroimagen, tienen Ia ventaja de no ser técnicas invasivas por Io que se pueden aplicar en repetidas ocasiones y a distintos intervalos de tiempo, para evaluar e identificar anomalías cerebrales antes que el paciente debute con el cuadro clínico (Rusinek y col., 2003). En resumen, los procedimientos estándares de diagnóstico mediante neuroimágenes no son específicos para Ia AD, ya que virtualmente todos los esfuerzos para lograr una tecnología de neuroimágenes para AD se han dirigido a los depósitos del amiloide, incluyendo el "Pittsburgh compound" (PIB) y el 2-(1-{6-[(2-[F-18]fluoroethyl)(methyl)amino]-2- naphthyljethylidene) malononitrile (FDDNP) (Klunk y col., 2004; Mosconi y col., 2007; Small y col., 2007); que reconocen tanto al amiloide como a los NFTs Io que no permite una visualización selectiva. De acuerdo a estos estudios no queda claro que lesiones se pretende visualizar (por ejemplo placas 'difusas' vs. 'completas', etc.). Se sabe que el primer compuesto no visualiza los NFTs, y el último puede visualizar diferentes tipos de lesiones, además de los NFTs, por Io que no sirve como herramienta diagnóstica (Mathis et al., 2005; Furomoto, 2007). Por otro lado, las solicitudes de patentes PCT/US96/05918; PCT/US98/07889; PCT/J P01/02204 y PCT/J P01/02205 describen compuestos incapaces de identificar selectivamente NTF's.

El desarrollo de radio-marcadores patología-específicos para las enfermedades neurodegenerativas es esencial no sólo para el diagnóstico sino también para monitorear nuevas terapias de Ia AD. Cabe hacer notar que el diagnóstico confirmatorio de AD solamente se puede hacer mediante neuropatología, tras el análisis "postmortem" de tejido cerebral. Sin embargo existe Ia posibilidad de obtener imágenes de los ovillos neurofibrilares (NFTs), principal signo histológico- molecular de Ia AD y de las taupatías, y se dispondría así de una poderosa herramientas para un diagnóstico neuro-patológico de certeza en vida y un método para evaluar Ia evolución del proceso fisiopatológico de Ia AD (Lavados y cois., 2005; Fernández y cois., 2008; Kuljis, 2008). Existen algunas aproximaciones a esta necesidad pero no se ha desarrollado hasta ahora una herramienta de diagnostico del todo satisfactoria y especifica, manteniéndose aun sin resolver el problema del diagnóstico temprano de Ia AD (US2006018825; WO02069965; Okamura, 2004 y 2005). Por ejemplo, Okamura ha descrito un conjunto de compuestos derivados de benzimidazoles con el objeto de detectar agregados del péptido amiloide Aβ, sin profundizar en los estudios sobre el uso de estos benzimidazoles como radiotrazadores en el diagnóstico PET mediante detección de los ovillos neurofibrilares. No obstante ninguno de los compuestos analizados por el grupo de Okamura han sido usados en Ia práctica clínica ni han tenido éxito para su uso en imagenología PET, y sus estudios preclínicos podrían tardar mucho en validar su posible uso, por Io que están lejos de poder ser considerados como potenciales radiotrazadores para el reconocimiento de los NFTs mediante Tomografía de Emisión de Positrones (PET). En este contexto, nuestro invento está dirigido a compuestos que se unen a agregados de tau con alta especificidad y que servirían como radiotrazadores patología-específicos con el objeto de diagnosticar tempranamente Ia enfermedad de Alzheimer.

La posibilidad de obtener imágenes de los ovillos neurofibrilares de Ia AD, o de cualquier otra proteína patognomónica daría a Ia medicina Ia oportunidad, sin precedentes, de un diagnóstico de certeza que hoy día sólo se puede lograr mediante estudios neuropatológicos post-mortem. Además, entregaría Ia posibilidad de un diagnóstico precoz, un método para Ia evolución del proceso patológico y un modelo par evaluar intervenciones terapéuticas específicas. Por Io tanto, se requiere de un diagnóstico de neuroimágenes, específico para una determinada lesión. Por esta razón, los compuestos benzimidazolicos (BZs) son capaces de unirse a Ia tau agregada en Ia forma patológica presente en Ia AD, son los radiotrazadores más promisorios para desarrollar Ia tecnología de neuroimágenes PET. Más interesante aún, Ia invención entrega benzimidazoles conocidos y clínicamente probados que se unen a tau agregada. Los grandes beneficios de Ia presente invención son: 1) Diagnóstico patológico específico. 2) Diagnóstico temprano y posibilidad de un diagnóstico presintomático de Ia AD. 3) Comprender Ia evolución natural de Ia enfermedad y su fisiopatología. 4) Capacidad de medir directamente los efectos de terapias específicas que se desarrollen en el futuro. Lo anterior se debe a que Ia presente invención permite el obtener imágenes con moléculas de ¹⁸ F-benzimidazoles, demostrándose así su afinidad diferencial con tau de los ovillos neurofibrilares (NFT) y no con Ia tau normal o monomérica, ni tampoco con agregados del péptido Aβ, Io que hace que nuestra tecnología sea altamente específica y confiable para el certero diagnóstico de Ia AD. Los benzimidazoles de Ia presente invención tienen Ia ventaja de que son drogas utilizadas en medicina para otros propósitos y no producen efectos secundarios serios en los pacientes. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Electromicrografía de los filamentos de tau humana agregada in Vitro y PHFs aislados desde pacientes con AD. A y B muestran filamentos de tau humana (441 a. a.) inducidos por heparina 200 μM. (20.000X). C y D muestran PHFs aislados desde pacientes con AD: Barra 80 nm. Las flechas indican las torsiones de los filamentos helicoidales. En los filamentos inducidos por heparina predomina Ia presencia de filamentos rectos por sobre los helicoidales, donde se verificó que los filamentos inducidos por heparina son más largos que los obtenidos desde cerebros humanos y con menor número de torsiones, es decir, Ia mayoría de los filamentos inducidos in Vitro son rectos y no helicoidales. La heterogeneidad estructural de los filamentos de tau ha sido descrita ya por varios autores. (Skravana y col., 2006; Csokova y col., 2003). Considerando estas diferencias estructurales en los filamentos de tau formados in Vitro e in vivo, se estudiaron separadamente los parámetros de interacción de diferentes con filamentos inducidos por heparina y aislados desde pacientes con AD. Adicionalmente, se conoce que los sitios expuestos en ambas conformaciones -filamentos de tau humana agregada in Vitro y PHFs aislados desde pacientes con AD- donde se unen moléculas como las descritas en Ia presente invención, son los mismos. No obstante, aun no es posible de elucidar con claridad el mecanismo por el cual PHFs se conforma, Io cual llevaría a una mejor comprensión de las similitudes entre ambas estructuras.

Figura 2. Gráficas de Scatchard. Las gráficas de Scatchard muestran los estudios de saturación realizados para evaluar Ia afinidad de 3H-Astemizol por agregados de Aβ (A), filamentos de tau humana recombinante (B) y PHFs de pacientes con AD (C). Se aprecia en estos casos que las moléculas de Ia presente invención se unen con mayor afinidad a tau que a péptido Aβ, en donde es significativamente mayor Ia afinidad a PHFs comparada con Aβ.

Figura 3 muestra un gráfico sobre estudios de inhibición realizados con lansoprazol sobre filamentos de Tau aislados de pacientes con enfermedad de

Alzheimer para N=3±SD, mediante el desplazamiento de astemizol marcado. Se puede apreciar en Ia Tabla 2, Ia Ki (nM) calculada para lansoprazol frente a estructuras de proteína Tau.

Figura 4. Análisis farmacocinético comparativo de Ia concentración de Astemizol en sangre intracardíaca (A) y tejido cerebral (B) a distintos tiempos 0, 30, 90 y 180 min. Además se muestra Ia relación cerebro/sangre (C) que se registra a los tiempos de medición. La tabla muestra que astemizol llega eficientemente al tejido cerebral, registrando a los 28 minutos (Tmax) una concentración máxima en sangre, mientras que a los 55 minutos Io obtiene en cerebro. Además se aprecia que Ia vida media en plasma es menor que en cerebro, entregando una permanencia en encéfalo de al menos 3 horas. Lo anterior hace de esta molécula un excelente agente para emplear como radiotrazador cerebral. Los ensayos fueron realizados en ratones albinos de Ia cepa C2, de peso promedio 30 gr., machos, los cuales fueron inyectados vía endovenosa. La dosis fue de 16 mg/Kg. Luego de Ia inyección los ratones fueron sacrificados a distintos tiempos y se obtuvo sangre intracardíaca y se extrajo el tejido cerebral para análisis de Ia concentración del agente por cromatografía líquida de alta resolución acoplada a detección UV (HPLC/UV).

Figura 5. Análisis farmacocinético comparativo de Ia concentración de Lansoprazol en sangre intracardíaca (A) y tejido cerebral (B) a distintos tiempos 0, 30, 90 y 180 min. Además se muestra Ia relación cerebro/sangre (C) que se registra a los tiempos de medición. La tabla muestra que lansoprazol llega eficientemente al tejido cerebral, registrando a los 30 minutos (Tmax) una concentración máxima en sangre, mientras que a los 37 minutos Io obtiene en cerebro. Además se aprecia que Ia vida media en plasma es menor que en cerebro. Lo anterior hace de esta molécula un agente compatible con el uso como radiotrazador cerebral. Los ensayos fueron realizados en ratones albinos de Ia cepa C2, de peso promedio 30 gr., machos, los cuales fueron inyectados vía endovenosa. La dosis fue de 8 mg/Kg. Luego de Ia inyección los ratones fueron sacrificados a distintos tiempos y se obtuvo sangre intracardíaca y se extrajo el tejido cerebral para análisis de Ia concentración del agente por cromatografía líquida de alta resolución acoplada a detección UV (HPLC/UV). Figura 6. Análisis farmacocinético comparativo de los niveles de 18F-

Lansoprazol a 30 y 60 min. en sangre intracardíaca (A) y en cerebro (B), N=3. En Ia tabla se describe Ia relación cerebro sangre a diferentes tiempos. Lo anterior muestra que el agente tendrá una mayor permanencia en cerebro que en sangre. Figura 7. Muestra gráficos de afinidad de 3H-Astemizol respecto de una proteína tau agregada (A) y de Aβ (B), se aprecia como 3H-Astemizol se une con mayor afinidad a formas agregadas de proteína tau que a Aβ a bajas concentraciones. Figura 8. Muestra secciones finas de hipocampo (20 μm) analizadas por inmunohistoquímica con anticuerpos anti tau fosforilada (PHF-1) demuestra Ia presencia de abundantes lesiones tipo neuríticas (A) y ovillos neurofibrilares (B) en un paciente con diagnostico clínico de AD (PHF1).

Figura 9. Muestra secciones finas de hipocampo (20 μm) analizadas por ¡nmunohistoquímica con anticuerpos anti péptido Aβ (6E10) demuestra Ia presencia de abundantes placas seniles (A, B, C) en un paciente con diagnostico clínico de AD (PHF1).

Figura 10. Muestra un ensayo realizado en cerebros post mortem de pacientes con diagnóstico clínico de Enfermedad de Alzheimer de acuerdo a los criterios NINCDS-ADRDA por al menos 3 meses (Dubois y col., 2007), donde se emplearon los compuesto marcados, conforme a Ia presente invención, para Ia identificación selectiva y específica de agregados filamentosos de proteína tau comparado con estructuras amiloides. El mareaje con Ia droga mostró una co- localización de Ia marca de las drogas benzimidazólicas con los agregados de Ia proteína tau en las estructuras patológicas del tipo ovillos neurofibrilares. En las imágenes A y C, se muestra tinción fluorescente de Lansoprazol en agregados de proteína Tau (cabezas de flechas); Imagen G muestra co-localización de anticuerpos específicos para Tau (PHF-1) y tinción con Lanzoprazol, ambos mareajes por separado se muestran en las imágenes E y F respectivamente. Con flechas se indica los agregados de tau marcados. Sin embargo las drogas marcadas NO mostraron co- marcación con las placas seniles formadas por el componente amiloideo (imágenes B y D, muestra tinción con Tioflavina que marca placas seniles (flechas) y agregados Tau (puntas de flechas)). Como control negativo, las imágenes controles sin Ia droga marcada no mostraron reactividad. Estas evidencias confirman que los productos de Ia presente invención son útiles para el diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas, tau patologías, de preferencia enfermedad de Alzheimer. Figura 11 muestra una representación del procedimiento para efectuar los ensayos de identificación con los compuestos de Ia presente invención, en cerebros postmorten de pacientes con diagnóstico clínico de Enfermedad de Alzheimer. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con derivados de benzimidazoles útiles para Ia detección de depósitos proteicos de tau como método diagnóstico para enfermedades neurodegenerativas, tau patologías, de preferencia enfermedad de Alzheimer. A Ia vez, Ia invención incluye formulaciones que comprenden estas moléculas, los kit, productos y dispositivos que los contengan. En particular, Ia invención entrega los medios necesarios para el diagnóstico temprano, en estadios iniciales, del desarrollo de enfermedades neurodegenerativas, tau patologías, de preferencia patologías del tipo Enfermedad de Alzheimer.

La invención entrega un producto que es un excelente trazador para Ia ejecución de diagnóstico mediante estudios de neuroimagen del daño cerebral, como por ejemplo Tomografía de Emisión de Positrones (PET), que caracteriza a enfermedades como el Alzheimer y otras, como aquellas enfermedades que también exhiben alteraciones en Ia proteína tau pudiesen ser más fácilmente diagnosticables mediante el procedimiento de Ia presente invención. La invención comprende compuestos derivados de benzimidazoles de fórmula I de acuerdo a Ia siguiente estructura:

En donde: X es un heteroátomo seleccionado entre N, S, O, P, SO, SO ₂ y SO ₃ ; de preferencia se selecciona entre N, S y SO ₃ , y preferentemente N y SO ₃ ; n puede ser O ó 1 ; R1 es un grupo seleccionado entre:

y v. / R2 es un grupo seleccionado entre H y

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención comprende compuestos derivados de benzimidazoles (BZs) de acuerdo a Ia fórmula I, de preferencia BZs sustituidos en posición 2, más referentemente Astemizol y/o Lansoprazol,

Astemizol Lansoprazol,

los cuales pueden encontrarse marcados radiactivamente con elementos que emitan rayos gamma como es el caso de "mTc, ¹¹¹ In, ⁶⁷ Ga, ²⁰¹ TI, ¹²³ I y ¹³³ Xe; y/o marcados con elementos que emitan positrones como es el caso de ¹¹ C, ¹³ N, ¹⁵ O y ¹⁸ F, y/o con ³ H; de preferencia los compuestos son marcados con ³ H y ¹⁸ F y/o elementos que emitan fluorescencia, de preferencia y sin ánimos de restringir el alcance de Ia invención, dichos fluoróforos conocido pueden ser seleccionados entre FAM, DYXL, Hex, Tet, Joe, Rox, Tamra, Yac, Max, Edans, Cy5, LC670, Fluoresceína, Coumarina, Eosina, rodamina, Bodipy, Alexa, Cascada azul, amarillo Yakima, amarillo Lucifer y rojo texas. Estas son moléculas pequeñas que tienen Ia propiedad de unirse específicamente y con gran afinidad a los ovillos neurofibrilares, y e consecuencia entregan Ia posibilidad de detectar estas estructuras mediante estudios de neuroimágenes, como es el caso de PET. Esta propiedad de los BZs permite el desarrollo de estrategias de neuroimágenes específicas para visualizar las lesiones más características de Ia enfermedad de Alzheimer, esencial no sólo para mejorar el diagnóstico de patologías, sino también para desarrollar nuevos tratamientos mediante ensayos que permitan Ia identificación de nuevos principios activos para enfermedades neurodegenerativas.

Conforme a Ia presente invención, se ha encontrado que derivados de benzimidazol de fórmula I ₁ de preferencia astemizol y/o lansoprazol radioactivos, son compuestos capaces de unirse a formas agregadas de Ia proteína tau con muy alta afinidad, Io cual es de gran importancia farmacológica ya que reviste a Ia invención con un enorme potencial como radiotrazadores para neuroimágenes, en el diagnóstico de Ia enfermedad de Alzheimer (AD).

En efecto, como se aprecia en Ia figura 2, Ia interacción de proteína ligando es inmensamente ventajosa para astemizol, ya que se aprecia una mayor afinidad de este agente cuando se liga a sistemas proteicos de Tau comparado con amiloide. Algo equivalente se aprecia para lansoprazol, en Ia figura 3 se muestra que a bajas concentraciones lansoprazol desplaza a astemizol en filamentos de proteína Tau de enfermos de Alzheimer. Lo anterior, queda de manifiesto en Ia tabla 1 donde se muestran valores de Bmax/Kd para Ia interacción de astemizol con Aβ y Tau. A través de este valor se aprecia que astemizol registra una afinidad diferencial para dichos blancos, ya que por PHF es alta (3,316) en relación a Ia afinidad que muestra por fibras de Aβ (0,057). En efecto, Ia afinidad de astemizol por PHF es alrededor de 60 veces mayor que para Aβ, significativamente mayor a Io descrito para compuestos equivalentes divulgados con anterioridad. Si se consideran los antecedentes del estado del arte, por ejemplo US2006/0018825 describe algunos benzoxazoles, benzotiazoles y benciimidazoles -estructuralmente diferentes a los empleados en Ia presente invención- sin identificar cuantitativamente Ia afinidad del agente por Aβ o tau. Por otro lado, Okamura y col., 2005, describe un benciimidazol -estructuralmente diferentes a los empleados en Ia presente invención- identificado como BP 126, el cual se muestra sólo dos veces más afín por fibras de tau que por Aβ (valores de EC ₅₀ en Tabla 1 de Ia referencia: EC ₅₀ por Tau= 583 nM; EC ₅₀ por Aβ= 1280 nM).

Las constantes de afinidad de los compuestos de Ia presente invención se encuentran en el rango de nM (nanomolar) Io que indica su gran afinidad por esta variante patológica de Ia proteína tau. Esto posibilita su uso como marcador específico de agregados cerebrales de tau y, por Io tanto, es un excelente trazador para estudio por neuroimagen, por ejemplo por Tomografía de Emisión de Positrones (PET), y para estudios de neuroimágen del daño cerebral que caracteriza a enfermedades como el

Alzheimer y otras taupatías, en las cuales Ia proteína tau forma agregados en el cerebro, y otros órganos y tejidos.

Por otra parte, Ia presente invención entrega evidencias respecto de Ia farmacocinética de las drogas, indicando que las moléculas de astemizol y/o lansoprazol acceden al cerebro de manera eficiente y permanecen por al menos 3 horas, Io que posibilita Ia generación de imágenes cerebrales por estudio por neuroimágen, por ejemplo por Tomografía de Emisión de Positrones (PET).

En efecto, conforme a Ia presente invención, los agentes propuestos tienen una mejor residencia en cerebro y encéfalo que en sangre. Como se muestra en las figuras 4 a 6, astemizol y lansoprazol muestran una increíble eficiencia para llegar y mantenerse en el tejido cerebral, mientras que Ia presencia en sangre disminuye más rápida y notoriamente. Estas cualidades hacen de los compuestos propuestos en Ia presente invención un excelente candidato con enorme potencial como radiotrazadores para neuroimágenes de enfermedades neurodegenerativas, tau dependientes, para Io cual es de gran importancia farmacológica ya que Ia invención entrega moléculas que son excelentes candidatos para el diagnóstico de Ia enfermedad de Alzheimer (AD).

Lo anterior se debe a que Ia presente invención facilita Ia posibilidad de marcar una lesión específica y patognomónica de Ia AD, con Io cual se permitiría diagnosticar AD y taupatías, con diagnóstico diferencial debido a que:

- Las moléculas de bencimidazoles de Ia invención se unen selectivamente a agregados de proteína tau mucho más que a los agregados del péptido Aβ (Figura 2 y Tablas 1 y 2). - Estas moléculas permiten detectar Ia presencia de formas agregadas de Ia proteína tau, Io que no es posible con PIB ni con otros compuestos que se usen actualmente en medicina nuclear humana.

- Estas moléculas presentan ventajas con respecto a otras moléculas que se usan para producir imágenes del cerebro como Ia glucosa, debido a su alta afinidad por agregados de Ia proteína tau. El compuesto radio-trazador más usado para imagenología por emisión de positrones es Ia Fluordeoxiglucosa, sin embargo, su unión al tejido cerebral es muy inespecífica porque se concentra mayormente en todas las células con alta tasa metabólica y no en los agregados macromoleculares de Ia proteína tau como Io hace astemizol y lansoprazol. Además en Ia AD hay una caída en Ia captación de F-deoxyglucosa en las neuronas corticales. - Las evidencias in vivo en ratones indican que Ia concentración de las moléculas de Ia presente invención marcadas con ¹⁸ F en el cerebro es alta y se mantiene en el cerebro por a Io menos 3 horas Io que permite su utilización como radiotrazador cerebral (Figuras 4 y 5). - Adicionalmente, astemizol y lansoprazol son compuestos médica y clínicamente probados y autorizados, con abundante evidencia clínica en aplicaciones diferentes a las aquí propuestas. Además, a partir de dichas evidencias no se podría haber derivado Io que en esta invención se propone y demuestra con las experiencias in vivo e in Vitro ejecutadas y aquí incorporadas como parte de Ia invención. En efecto, Astemizol es una droga antihistamínica y el Lanzoprazol se usa en clínica como inhibidor de Ia bomba de protones, por Io que drogas aceptadas para su uso médico y nuestro invento se relaciona con una nueva aplicación nunca antes descrita para dichos compuestos.

Conforme a Ia presente invención las técnicas donde se pueden emplear las moléculas descritas pueden ser: Tomografía Axial Computarizada (CAT) ₁ resonancia magnética nuclear (NMR), tanto estructural (sNMR) como funcional NMR (fNMR), tomografía computarizada de emisión de fotón único (SPECT) y Ia tomografía de emisión de positrones (PET).

De esta forma Ia invención proporciona una herramienta farmacológicamente segura, médicamente probada, con una elevada afinidad y selectividad por estructuras proteicas de proteína Tau, en desmedro de Aβ, Io cual permite establecer una aplicación, método o uso de dichos agentes para Ia identificación y diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas, tau patologías, de preferencia enfermedad de Alzheimer. Lo que permite no solamente el diagnóstico de Ia enfermedad manifestada, sino que una determinación precoz de Ia misma considerando el hecho que Tau esta directamente relacionada con el desarrollo y deterioro de dichas patologías, especialmente AD. Estas evidencias permitirían hacer un diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas en etapas iniciales asintomáticas de Ia patología, favoreciendo de esta forma que se puedan aplicar a dichos pacientes tratamientos preventivos y curativos de manera anticipada, favoreciendo y elevando así las expectativas de mejora y control sobre Ia enfermedad, impartiendo una mejora sustancias en Ia calidad de vida de los paciente, Io cual es impensado hasta ahora con métodos actuales de diagnóstico postmorten o cuando Ia enfermada ya esta declarada, clínicamente confirmada y en estados avanzados. Ejemplo 1. Evaluación de Ia afinidad específica de benzimidazoles por agregados de proteína tau.

Con el fin de evaluar Ia afinidad específica de los benzimidazoles por agregados de proteína tau, se determinaron parámetros de afinidad (constantes de disociación (Kd) y de máxima unión (Bmax)) de ³ H-Astemizol por agregados de tau, además se evaluó las constantes de inhibición (Ki) por agregados de Ia proteína tau en ensayos de desplazamiento de H ³ -Astemizol. La determinación de las constantes Kd y

Bmax es un paso previo y necesario para determinar las constantes Ki. Es decir, se necesita tener un valor de Kd obtenido de un radioligando conocido para llegar a obtener los valores de Ki por ensayos de inhibición y utilizando Ia ecuación de Cheng

Prusoff.

Dichos experimentos se realizaron utilizando proteína tau extraída de pacientes con AD y agregados del péptido Aβ^ ₂ sintéticos obtenidos a partir de soluciones del monómero obtenido de pacientes con AD. 1.1. Obtención de los agregados de proteína tau y péptido Aβ.

La obtención de las diferentes proteínas fue realizada de Ia siguiente manera: a) Filamentos helicoidales de tau (PHF) fueron aislados de acuerdo a Io descrito por Vinzent y Davies (1992). Brevemente, se construyeron columnas de inmuno-afinidad en base a Proteína-A acoplada al anticuerpo específico MC-1 específico para filamentos helicoidales pareados de tau. La eficiencia de acoplamiento de el anticuerpo en Ia fase estacionaria de Ia columna fue >90%. El soporte inmuno- adsorbente fue depositado en columnas y lavado con TBS (3 veces). Luego Ia columna fue mantenida a 4 ⁰ C. EL sobrenadante (27.000 x g) de homogeneizados de cerebro se cargo en esta columna a un flujo de 25mL/hora. La unión inespecífica se minimizó mediante lavados sucesivos con 30 veces el volumen de Ia columna de tampón TBS. Las fracciones enriquecidas en PHFs fueron dializadas y almacenadas a -7O ⁰ C hasta su utilización. b) Agregados del péptido amiloide: los agregados de péptido sintético Aβ se obtuvieron mediante incubación del péptido en tampón PBS1X por 7 días. Los agregados se monitorearon mediante microscopía electrónica de transmisión y geles de poliacrilamida.

1.2. Determinación de parámetros de interacción de ³ H-Astemizol por agregados de proteína tau y péptido Ap ₁ ^ ₂ Para evaluar Ia afinidad de ³ H-Astemizol por los agregados de ambas proteínas, se estudiaron los siguientes parámetros de interacción proteína-ligando: constantes de disociación (Kd) y de máxima unión (Bmax). La Kd, constante de disociación, es un parámetro inversamente proporcional a Ia afinidad de los compuestos. Bmax es Ia unión máxima, e indica Ia máxima cantidad de Ia droga que se une a una determinada cantidad de agregado de tau o péptido Aβ. Dichos experimentos fueron realizados siguiendo el siguiente protocolo METODOLOGÍA DE LOS ESTUDIOS DE AFINIDAD: Para verificar Ia afinidad de astemizol (AST) y lansoprazol (LNS) por agregados de tau, se realizaron ensayos de saturación con AST-tritiado. Brevemente se incubaron polímeros de tau (40 Dg mL de PHF alzheimer y 0,01 mg/mL de filamentos in Vitro) en presencia de concentraciones crecientes de AST-tritiado (0-2,5-5,0-7,5-10,5-12,5 nM). Luego Ia mezcla fue filtrada en frío (4 ⁰ C) en filtros Watman GF/B. Filtro fue secado a temperatura ambiente y posteriormente se midió Ia radiactividad retenida en los filtro en contador de Centelleo TRICARB-2100 TR en presencia de 2 mL de liquido de centelleo.

Estudios de Inhibición: Se estudió Ia interacción de Lanzoprazol con filamentos de tau (PHFs y filamentos inducidos por heparina) mediante el desplazamiento de Astemizol tritiado. Esto se realizó mediante Ia incubación de 40 ug/mL de PHF alzheimer y 0,01 mg/mL de filamentos in Vitro con una serie de diluciones crecientes de LNS (0,09 hasta 0,000003 mM). Luego Ia mezcla fue filtrada en frío (4 ⁰ C) en filtros Watman GF/B. El filtro GF/B fue secado a temperatura ambiente y posteriormente se midió Ia radiactividad retenida en el filtro usando un contador de Centelleo TRICARB- 2100 TR en presencia de 2 mL de líquido de centelleo.

En Ia Figura 2 se muestran las imágenes obtenidas mediante microscopía electrónica del experimento realizado y las gráficas de Scatchard que dan cuenta del análisis de Ia información. En Ia Tabla 1 se muestra un análisis comparativo de los datos de saturación. Estos resultados indican que el ³ H-Astemizol se une con mayor afinidad a los agregados de proteína tau que a los agregados de péptido Aβ _1-42 , dado que Ia relación Kd/Bmax para Ia unión a agregados de proteína tau humana (PHFs) fue cerca de 60 veces superior que para los agregados del péptido Ap _1-42 Ello apoya el uso de los compuestos de Ia invención como radiotrazadores patología específica, a diferencia del "PIB compound" que se unen al Aβ más que a los PHFs de tau. Si bien en Ia presente invención los valores de Bmax/Kd no son significativamente elevados, como se esperaría en condiciones óptimas con relación Bmax/Kd cercana a 10, los compuestos descritos aquí tienen un elevado potencial como radiotrazador cerebral. Lo anterior se ve reforzado ante Ia evidencia que en el caso de las patologías exploradas en Ia presente invención, se encuentran blancos moleculares muy abundantes en el parénquima cerebral, como son los NFTs en los pacientes con AD (Mathis y cois, 2004, Okamura y cois, 2005, Klunk y cois., 2005), por Io cual los valores de afinidad expuestos son suficientes para una aplicación diagnostica y preventiva exitosa.

Tabla 1. Parámetros de interacción entre ³ H-Astemizol y agregados de proteína tau y péptido Ap _1-42 .

1.3. Evaluación de afinidad de benzimidazoles por agregados de proteína tau humana.

Se evaluó Ia afinidad de Lansoprazol por agregados de proteína tau humana mediante ensayos de desplazamiento de ³ H-Astemizol. Estos ensayos fueron realizados según el protocolo descrito más arriba.

En Ia Tabla 2 se muestran los resultados de los estudios de inhibición y Ia constante Ki obtenida para cada molécula, obtenida a través de Ia ecuación de Cheng-Prusoff (Okamura y col., 2004, 2005).

Tabla 2. Constantes de inhibición (Ki) obtenidas en ensayo de desplazamiento de ³ H- Astemizol en agregados de proteína tau humana.

Se puede apreciar que lansoprazol presenta una Ki significativamente mayor a Ia registrada para otros compuestos en el arte... Lansoprazol se une con mayor afinidad (Ki 2,7 nM) que BF 168 (Ki 6,4 nM) a agregados de Ia proteína tau. Sin perjuicio de Io anterior, cualquier valor en el rango de nM es potencialmente útil como potencial radio-marcador de un agregado macromolecular o receptor que esta presente en el parénquima cerebral.

Para complementar las evidencias anteriores se realizaron estudios de Docking con el programa Autodock®, dirigidos a ensayos bio-informáticos para astemizol. Estos confirman que Ia presente invención registra favorables valores respecto de Ia energía de unión de este ligando a tau, respaldando Ia alta afinidad que se aprecia en las otras evidencias que se reportan en Ia invención aquí descrita. La tabla 3 muestra valores predictivos para 10 configuraciones preferenciales de interacción PHF-Tau con astemizol modelados por el programa Autodock®, entregando además comparación con las energías de unión de ligandos para algunos fármacos con alta afinidad por los receptores de glutamato mGlu4 y mGlu7 obtenidas con el mismo programa (Yanamala y col., 2008). Aquí se resumen los datos obtenidos del análisis bio-informático de Docking para astemizol y el fragmento resistente a pronasa PHF-Tau-387DHGAE391 del cual se conoce perfectamente su estructura cristalina y debido a que se encuentra expuesto en los en los filamentos pareados de Ia proteína Tau como describe Novak y col., 1989. Debido a las cualidades estructurales de Tau no se ha logrado una cristalización de Ia proteína total. Los datos indican que astemizol registra una alta afinidad por el fragmento 387DHGAE391 de Tau, mientras que metronidazol presenta valores menos favorables. Menores valores de energías de unión con más favorables.

Tabla 4 Sitio de interacción entre Astemizol y PHF-tau: Análisis bioinformático {AutoDock Energies)

Ejemplo 2. Evaluación in Vitro de Ia capacidad de los benzimidazoles de atravesar Ia barrera hematoencefálica Esta evaluación fue realizada para el compuesto analizado en el ejemplo 1.3. Los parámetros analizados fueron: permeabilidad específica (Pe), este es un indicador de Ia capacidad de los compuestos de atravesar Ia barrera hematoencefálica (BHE) por difusión pasiva y Coeficiente de partición (LogP), que corresponde al coeficiente de partición del compuesto entre Octanol y tampón fosfato pH 7,4 y es un elemento predictivo de Ia penetración del compuesto en Ia BHE. La determinación de los valores de Pe se realizó de acuerdo a Io descrito por Adveef y Tsinman, 2006.

El ensayo de Permeabilidad en Membranas Paralelas (PAMPA) se basa en Ia capacidad de los compuestos en difundir desde un compartimiento a través de un filtro de membrana de Polifluoruro de Vinilideno (PVDF) recubierto con una solución de fosfatidilcolina 20% hacia un segundo compartimiento aceptor, el cual es analizado. De Ia misma forma se realiza una comparación con las sustancias controles, las cuales fueron Tiopental 40ug/mL. como control positivo y Bromuro de Clidinio 800ug/mL. como control negativo. La cuantificación se realizó por espectrofotometría, utilizando cubetas de 1mm de longitud y 300 uL de capacidad. - ULJ¿Λ/ I J I U U U H

18 La obtención de los valores de LogP fue realizada siguiendo el protocolo descrito por Cheng y cois., 2006 para otros potenciales radiotrazadores de imagenología cerebral

Brevemente, el coeficiente de partición (log P _0/w ) se determina en solución tampón pH 7,4 se ajusta con hidróxido de sodio 0,1 M. La fase orgánica utilizada es octanol Ia cual se satura con Ia solución tampón pH 7,4. Se preparó una solución de Ia droga 1 mg/mL en metanol. A partir de estas soluciones se realizaron las diluciones para un rango de concentración de 0,02 y 0,4 mg/mL. Luego se tomo una alícuota entre 0,5 μl a .1000 μl de cada una de las soluciones stock preparada anteriormente en diferentes matraces volumétricos de 25 mL, y se completó a volumen con tampón pH 7,4. Luego se miden 25 mL de octanol, se agregan en tres embudos de decantación, y se Ie adicionó cada embudo de decantación las soluciones preparadas anteriormente, se mezclan ambas fases, agitando fuertemente por dos minutos. Se permite Ia separación completa de las fases, dejándolas reposar durante 48 horas. Una vez alcanzado el equilibrio, se separan ambas fases. La fase acuosa se procede a centrifugar por 3 min. Para asegurarnos Ia completa separación de las fases. Todo este proceso se realiza a temperatura de 25 ⁰ C. La cuantificación se realiza en un espectrofotómetro UVA/. En Ia tabla 4 se indica los valores obtenidos para los coeficientes Pe y LogP para los bencimidazoles analizados de acuerdo a Ia presente invención.

Tabla 4: Coeficiente de permeabilidad específica (Pe) y coeficiente de partición (LogP) obtenido para los benzimidazoles en estudio.

LogP SNC significa coeficiente de Partición en relación a su potencial liposoluble que permite atravesar Ia BHE. Los resultados obtenidos indican que Astemizol y Lansoprazol son los compuestos con mejor perfil de liposolubilidad para ser considerados como potenciales trazadores de acción cerebral, ya que atraviesan eficientemente membranas fosfolipídicas. Esto no cambia las propiedades fisicoquímicas de Ia molécula.

Ejemplo 3. Evaluación de Ia farmacocinética de Astemizol y Lansoprazol in vivo en modelos animales.

Los compuestos Lansoprazol y Astemizol fueron analizados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) asociadas a detección por UV en las condiciones cromatográficas adaptadas del método descrito por Kanazawa y col., 2002. En las Figuras 4 y 5 se muestran los resultados de experimentos farmacocinéticos de los compuestos Lansoprazol y Astemizol. En estos resultados se evidencia que Astemizol (Fig. 4) llega eficientemente al tejido cerebral (C), el tiempo para Ia máxima concentración (tmax) es 28 min. en sangre y es 55 min en cerebro, Io que es compatible con su potencial como radiotrazador PET debido a que el período de semi-desintegración del Fluor 18 es de 120 min. También se observa que Ia vida media de Astemizol en el plasma es inferior a Ia del cerebro. Esto da cuenta de una permanencia en el encéfalo de por Io menos tres horas, siendo compatible con su uso como radio trazador cerebral (Ono y col., 2006, Mathis y col., 2004, 2005).

En Ia Figura 5 se muestra que Lansoprazol llega eficientemente al tejido cerebral (C), el tiempo para Ia máxima concentración (tmax) es 30 min en Ia sangre y 37 min en el cerebro, Io que es compatible con su potencial uso como radiotrazador PET debido a que el período de semidesintegración del Fluor 18 es de 120 min. Por otro lado, se observa que Ia vida media del Lansoprazol en el plasma es inferior a Ia del cerebro, posiblemente debido a Ia gran capacidad metabólica del hígado y las enzimas circulantes en el plasma a diferencia de Io que ocurre en el tejido cerebral que es un compartimiento farmacocinético altamente lipídico que elimina las drogas más lentamente.

Los antecedentes expuestos claramente favorecen y evidencian que los compuestos expuestos conforme a Ia invención son útiles en aplicaciones diagnósticas preventivas -en etapas tempranas de alguna patología neurodegenerativa- o diagnóstico confirmatorio en etapas avanzadas, sin requerir una confirmación post- morten tal como ocurre en Ia actualidad. Considerando Ia abúndate evidencia clínica de estas moléculas para otras patologías, el uso propuesto en este caso resulta sorprendente y altamente ventajoso respecto de las evidencias mostrada para moléculas estructuralmente equivalentes en el estado del arte. Adicionalmente se realizaron experimentos de bio-distribución del compuesto Lansoprazol marcado radiactivamente ( ¹⁸ F-Lansoprazol). En Ia figura 6 se muestran los resultados del ensayo de bio-distribución cerebro/sangre, en Ia figura se puede apreciar que el ¹⁸ F-Lansoprazol llega al cerebro en un 0,3% a los 30 minutos y disminuye a 0,14% a los 60 minutos. Las relaciones de bio-distribución cerebro/sangre en ambos tiempos fueron de 0,23 y 1,27 respectivamente, Io que da cuenta de una permanencia mayor del fármaco en el cerebro que en Ia sangre. Estos resultados son concordantes con Io que se observa al analizar Ia farmacocinética del Lansoprazol sin mareaje radiactivo. Ejemplo 4. Evaluación de Ia fijación de los benzimidazoles a los Ovillos Neurofibrilares (ONFs) en secciones finas de cerebros humanos de enfermos de Alzheimer.

La presente invención muestra en estudios preliminares que Astemizol y Lanzoprazol se unen a estructuras de ONFs en cerebros postmortem de pacientes con AD, mediante estudios autoradiográficos y de fluorescencia. Conforme a Io anterior, y con el objeto de evaluar el uso de Ia presente invención en pacientes, se verificó Ia presencia de ONFs y placas seniles en secciones de corteza cerebral de pacientes con diagnóstico clínico de Enfermedad de Alzheimer. Dicha evaluación se realizó mediante inmunohistoquímica con anticuerpos específicos para placas seniles, anticuerpo 6E10 reactivo contra residuos 6-13 de péptido Aβ, y con anticuerpo PHF1 específico contra tau. Los resultados se muestran en las figuras 8 y 9.

El objetivo que se busca con estos ensayos es mostrar las pruebas de co-localización de dichos anticuerpos con Ia aplicación de moléculas marcadas con radioactividad o fluorescencia de Ia presente invención. Así graficar Ia aplicación diagnóstica que registra Ia invención aquí propuesta.

En resumen, cerebros postmorten de pacientes con diagnóstico clínicamente probado de Alzheimer son fijados en formalina 10%, se efectúan cortes con sección entre 5 a 200 μm, de preferencia de 20 μm. Estos cortes son incubados con los benzimidazoles marcados conforme a Ia presente invención y posteriormente son incubados con los anticuerpos específicos 6E10 y PHF1 , para determinar Ia co- localización de Ia marca en estructuras de proteína Tau de las secciones de cerebro evaluadas.

Como se muestra en Ia Figura 10, en pacientes tratados conforme al proceso anteriormente descrito, se aprecia que benzimidazoles marcan de forma eficiente y selectiva los sectores positivos para tau en vez de los sectores positivos para Aβ, de acuerdo a Io que muestran los estudios con los anticuerpos anteriormente mencionados. Con ello queda plenamente identificado que Ia presente invención respalda aplicaciones de dichos benzimidazoles como agentes diagnósticos de enfermedades neurodegenerativos y taupatologías como Ia enfermedad de Alzheimer. En Ia ejecución de las pruebas anteriormente mencionadas se han utilizado dos tecnologías diferentes de co-localización de astemizol o lanzoprazol marcados para identificar las estructuras patológicas de los ovillos neurofibrilares en cerebros postmortem de pacientes Alzheimer: 1) Marcación con benzimidazoles tritiados, siguiendo el protocolo descrito en detalle en Ia Figura 11. 2) Marcación fluorescente con benzimidazoles. Para efectos prácticos como parte de los ejemplos, se analiza Ia co-localización de Ia tau marcada con anticuerpos conjugados a un fluoroforo, con Ia localización de Ia droga marcada fluorescentemente. En estos ensayos se verifica Ia co-localización de las drogas con las estructuras agregadas de Tau en regiones del hipocampo, corteza entorrina y núcleos de Meynert de los cerebros postmortem con Ia enfermedad de Alzheimer analizados. Por otra parte, en los controles de cortes de cerebros sanos de sujetos de Ia misma edad que los cerebros Alzheimer analizados, Ia droga marcada no se fije a ningún tipo de estructuras ni a otras estructuras no relacionadas (agregados de amiloide o placas por ejemplo), puesto que éstos no evidencias lesiones del tipo de los ovillos neurofibrilares formados por Ia tau patológica. Con esta evidencia demostramos Ia especificidad de los benzimidazoles de Ia presente invención para su utilización como segundo uso en el desarrollo de un método diagnóstico con tecnología PET para Ia determinación temprana y asintomática de Ia enfermedad de Alzheimer.

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