本发明属于药物有机化学领域， 涉及一类双环醇氨基酸衍生物及其制 双环醇， 化学名为 4, 4'-二甲氧基- 5, 6, 5', 6'-二次甲二氧基 -2-羟甲基 -2'- ¥氧羰基联 苯， 其结构式为 （Me表示甲基）：

双环醇为人工合成的一种多功能多靶点药物， 具有显著的保肝降酶活性。 对该药作 用机制进行多方面的研究表明， 双环醇的保肝降酶机制主要是通过清除自 ffi基， 从而维 持细胞的完整性， 使肝细胞核 DNA免受损伤及减少细胞凋亡的发生， 从而起到保肝作 用。 主要用于治疗各种肝损伤， 例如急性肝损伤。 经国家食品药品监督管理局批准， 双 环醇片 (商品名： 百赛诺)亍 2001年上市， 现已列入《国家基本医疗保险和工伤保险药品 目录》 乙类。

双环醇的一个重要物理化学性质是溶解性差， 口服生物利用率较低 （<9%) , 吸收 易受胃肠环境及以及食物等影响。 因此， 有必要对双环醇的分子结构进行优化， 以改善 其药物性质。巳有报道，通过对双环醇苯环上 的 2-羟 ¥基进行改造，来改善其分子特性。 发明内容 本发明的目的是提供一类水溶性好、 口服利用率高的双环醇氨基酸衍生物， 以及该 类双环醇氨基酸酯的制备方法及其应用。

发明人在双环醇苯环上的 2-羟甲基位点引入了各种氨基酸片段， 并且进行了大量的 研究和对比， 发现某些氨基酸片段结构可以有效改善分子水 溶性， 进而提高药物生物利 用度， 对提高药物活性意义重大， 从而完成了本发明创造。 本发明提供的双环醇氨基酸酯， 其结构式如下 _:

OMe

0、

0一

,。、 COOMe

、 0"

OMe 苴 Φ

本发明双环醇氨基酸酯还包括各种盐的形式例 如酸式盐， 包括盐酸盐、 硫酸盐、 富 马酸盐、 马来酸盐、 对¥苯磺酸盐等等。

本发明还提供了双环醇氨基酸衍生物的制备方 法- 当 R.是硒代蛋氨酸、 蛋氨酸、 亮氨酸、 色氨酸、 异亮氨酸、 苯丙氨酸、 氨酸、 脯 氨酸、 丙氨酸残基时， 包括以下步骤；

( ! ) 氨基保护的氨基酸与双环醇酯化反应， 得到保护的双环醇氨基酸酯；

(2 ) 保护的双环醇氨基酸酯经脱保护基反应， 即得双环醇氨基酸酯。

当 R是鸟氨酸、 赖氨酸残基时， 包括以下步骤；

( 1 ) 直链与侧链氨基均保护的赖氨酸、 鸟氨酸分别与双环醇酯化反应， 得到保护的双 环醇-赖氨酸酯和保护的双环醇-鸟氨酸酯；

(2 )保护的双环醇 -赖氨酸酯和保护的双环醇 -鸟氨酸酯分别经脱保护基反应， 即得双环 醇-赖氨酸酯和双环醇-鸟氨酸酯。

当 R为丝氨酸残基时， 包括以下步骤；

( 1 ) 羟基与氨基均保护的丝氨酸与双环醇酯化反应 ， 得保护的双环醇-丝氨酸酯；

(2) 保护的双环醇 -赖氨酸衍生物脱羟基保护基， 得氨基保护的双环醇 -丝氨酸酯。

(3 ) 氨基保护的双环醇-赖氨酸衍生物脱氨基保护� �， 即得双环醇-丝氨酸酯。

当 R为天冬氨酸残基时， 包括以下歩骤：

( I ) 氨基与侧链羧基均保护的天冬氨酸与双环醇酯 化反应， 得保护的双环醇-天冬氨酸 酯；

(2) 保护的双环醇-天冬氨酸衍生物经脱保护基反� �， 既得双环醇-天冬氨酸酯。

当 R是半胱氨酸残基时， 包括以下步骤：

(1) 巯基与氨基均保护的半腕氨酸与双环醇酯化反 应， 得保护的双环醇-半腕氨酸酯；

(2) 保护的双环醇 -半胱氨酸衍生物脱巯基保护基， 得氨基保护的双环醇-半胱氨酸酯。

(3) 氨基保护的双环醇 -半胱氨酸衍生物脱氨基保护基， 即得双环醇-半胱氨酸酯。

作为制备双环醇氨基酸衍生物方法的一种优选 方法， 当所用氨基酸为保护的硒代蛋 氨酸、 蛋氨酸、 亮氨酸、 色氨酸、 异亮氨酸、 苯 W氨酸、 甘氨酸、 脑氨酸、 丙氨酸、 鸟 氨酸、 赖氨酸、 丝氨酸 ^所用氨基保护基均为芴甲氧羰基 （Fmoc), 所用羟基保护基为 三苯甲基（Trt)。 当所用氨基酸为保护的天冬氨酸时， 所用羧基保护基为苄基（Bzl/Bn), 所用氨基保护基为苄氧羰基（Cbz)。 当所 ^氨基酸为保护的半胱氨酸所时， 所用巯基保 护基为三苯 Ψ基 （TVt)， 所用氨基保护基均为芴甲氧羰基 （Fm _0C )。

保护的氨基酸的对应结构为 -

N- -异亮氨酸

N- -苯 W氨酸

N-芴甲氧羰基- 氨酸

N-芴甲氧羰基-脯氨酸



本发明还优化了制备双环醇氨基酸衍生物的反 应条件；

当 R是硒代蛋氨酸、 蛋氨酸、 亮氨酸、 色氨酸、 异亮氨酸、 苯丙氨酸、 甘氨酸、 脯 氨酸、 W氨酸、 鸟氨酸、 赖氨酸残基时， 所对应的

步骤 （1) 中， 酯化反应温度为 540C; 反应时间为 2-10h _; 酯化反应体系中还包括 二 ^氨基吡啶（DMAP)和 1- (3-二 φ基氨基丙基) -3-乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC'HCi); 双环醇与保护的氨基酸的摩尔比为 1: (l~L2)o

步骤（2) 中， 脱保护基反应温度为 反应 B寸间为 0.5-2h; 所述脱保护基反应 体系为哌啶和二氯甲烷 （DCM) 的混合物。

当 R为丝氨酸残基 -, 所对应

步骤 （1) 中， 酯化反应温度为 540C; 反应时间为 2-10h _; 酯化反应体系中还包括 二 ^氨基吡啶（DMAP)和 1- (3-二 ¥基氨基 W基)- 3-乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC'HCl); 双环醇与保护的氨基酸的摩尔比为 1: (1-L2),

歩骤（2) 中， 脱保护基反应温度为 5- 40Ό; 反应^间为 0.5- 2h; 所述脱保护基反应 体系为三.氟乙酸和二氯甲垸（DCM)的混合物，� ��应体系中还包括捕获剂三异 W基硅垸。

步骤（3) 中， 脱保护基反应温度为 5-40Ό; 反应^间为 0,5-2h; 所述脱保护基反应 体系为哌啶和二氯甲垸 （DCM) 的混合物。

当 R是天冬氨酸残基时， 所对应

步骤 (1) 中， ―酯化反应温度为 5-4CTC; 反应时间为 2- 10h; 酯化反应体系中还包括 二甲氨基吡啶（DMAP)和 1- (3-二¥基氨基丙基) -3-乙基碳化二亚胺盐酸盐（ED HC1); 双环醇与保护的氨基酸的摩尔比为 1: (1—1.2)。

步骤 （2) 中， 脱保护基反应温度为 5- 40"C; 反应时间为 2-6h; 所述脱保护基反应 体系为钯碳 （Pd/C); 所用溶剂为甲醇。

当 R半胱氨酸残基时， 所对应

步骤 (1) 中， ―酯化反应温度为 5-4CTC; 反应时间为 2- 10h; 酯化反应体系中还包括 二¥氨基吡啶（DMAP)和 1- (3-二甲基氨基丙基)- 3-乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDOHCl); 双环醇与保护的氨基酸的摩尔比为 1: (1—1.2)。 步骤（2 ) 中， 脱保护基反应温度为 5-401：; 反应时间为 0.5-2h; 所述脱保护基反应 体系为三氟乙酸和二氯 φ烷（DCM )的混合物，反应体系中还包括捕获剂 异丙基硅烷。

步骤（3 ) 中， 脱保护基反应温度为 5- 40'C : 反应^ "间为 0.5- 2h _; 所述脱保护基反应 体系为哌啶和二氯甲烷 （DCM) 的混合物。

本发明提供的双环醇氨基酸酯的制备方法操作 简便、 成本低、 收率高。

本发明还提供一种药物组合物， 含有一种或多种上述双环醇氨基酸酯。 本发明双环 醇氨基酸酯或其盐，可以与一种或多种药用辅 料，制成各种液体或固体别型，例如片别、 粉针剂、 悬浮剂、 颗粒齐 il等。 给药途径包括肠道或非肠道给药， 例如口服、 注射等， 优 选口服。

本发明还涉及到上述双环醇氨基酸酯在制备治 疗肝损伤药物中的应用。 药理实验表 明， 本发明提供的双环醇氨基酸衍生物， 能显著减轻 D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性 肝损伤程度。 而 , 该类双环醇氨基酸酯容易成盐， 水溶性好 ·， 很容易制成片剂、 注射 剂等各种剂型， 口服利用率高。 注射剂对治疗急性肝损伤具有特别重要的意义 。 具体实施方式

根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。 然而， 本领域的技术人员容易理解， 实 施例所描述的具体的物料配比、 工艺条件及其结果仅用于说明本发明， 而不应当也不会 限制权利要求书中所详细描述的本发明。 实施例 1 双环醇 西代蛋氨酸酯的制备

( I ) 酯化反应

称取 503mg N-芴甲氧羰基-硒代蛋氨酸 (1.2mmol) 溶于 15 mL无水二氯甲烷 (DCM) 中,冰浴冷却， 加入 13mg 4二甲氨基吡啶 ( DMAP ) ( O.lmmol) 和 230 mg 1- (3-二甲基 氨基丙基)— 3-乙基碳化二亚胺盐酸 ¾ ( EDOHC1) ( 1.2mnioI),搅拌 0 min,加入 390 mg 双环醇 （Immol), 反应 3 h。 反应液依次用饱和碳酸氢钠溶液、 饱和氯化钠溶液洗涤， 干燥， 得固体。

将步骤（1 )所得固体溶于 10 1111_, 20%哌啶/0(〕^[混合体系中，室温反应 30 mill, TLC 检测反应完全。 反应液依次用稀醋酸溶液， 饱和氯化钠溶液洗涤， 干燥， 硅胶柱梯度洗 脱， 流动相为 DCM: _: MeOH===,50:I , 旋干得 450mg白色泡状固体， 即为双环醇-硒代蛋氨 酸酯。

MS(ESI+)OT Z:570.0[M+H] ⁺ 。 两步总产率 79.2%。 实施例 2

本实施例的制备方法与实施例 1基本相同， 不同之处仅在亍： 所选用的保护的氨基 酸分别为 N-芴甲氧羰基-蛋氨酸， N-芴甲氧羰基-亮氨酸， N-芴甲氧羰基-色氨酸， N-芴 甲氧羰基 -异亮氨酸， N-芴 Ψ氧羰基苯丙氨酸， Ν-芴 ¥氧羰基 -甘氨酸， Ν-芴 Ψ氧羰基- 脯氨酸， Ν-芴 ^氧羰基 -丙氨酸， 侧链氨基为芴 ¥氧羰基保护的 氧羰基 -赖氨酸， 侧链氨基为芴甲氧羰基保护的 Ν-芴甲氧羰基鸟氨酸， 分别制得双环醇—蛋氨酸酯、 双环 醇 亮氨酸酯、 双环醇 -色氨酸酯、 双环醇-异亮氨酸酯、 双环醇苯丙氨酸酯、 双环醇- 氨酸酯、 双环醇 -誧氨酸酯、 双环醇 -丙氨酸酯、 双环醇 -赖氨酸酯、 双环醇 -鸟氨酸酯。 实施例 3 双环醇 -丝氨酸酯的制备

( 1 ) 酯化反应

称取 l„25g羟基为三苯 ¥基保护的 N-芴甲氧羰基-丝氨酸 (2.2mmol) 溶于 30 mL无 水二氯 ^烷 (DCM)中,冰浴冷却，加入 24mg 4-二 ¥氨基 Ρ比啶（ DMAP) (0.2mmoi)和 460 mg 1- (3-二¥基氨基 W基)- 3-乙基碳化二亚胺盐酸盐 （EDC'HCl) ( 2.4mmol), 搅拌 0 min， 加入 780 ffig双环醇 （2mffioi)， 反应 2 h。 反应液依次用饱和碳酸氢钠溶液、 饱和 氯化钠溶液洗涤， 干燥， 旋千得 1.79g白色泡状固体。

将步骤（1)所得白色泡状固体溶于 50mL (体积比： 二氯甲烷 /三异丙基硅烷 /三氟 乙酸 =94/1/5) 溶液， 反应 1.5h， TLC检测反应完全， 反应液依次用饱和碳酸氢钠溶液、 饱和氯化钠溶液浼涤， 千燥， 过滤， 浓缩， 硅胶柱梯度洗脱， 流动相为 PE: ΕΑ=1:ΐ,

将步骤 (2,2)所得 1,19g白色固体溶于 10111[ 20%哌啶/〕(〕1^混合体系中， 室温反 应 30mi TLC检测反应完全。反应液依次用稀醋酸溶液， 饱和氯化钠溶液洗涤，千燥， 浓缩， 硅胶柱梯度洗脱， 流动相为 DCM: MeOH=50:l, 旋干得 480mg白色泡状固体， 即为双环醇-丝氨酸酯。

MS(ESI+)m/z:578.2[M+H 三歩总产率 50.5% 实施例 4 双环醇 -天冬氨酸酯的制备

(!) 酯化反应

称取 430mg支链羧基为苄基保护的 N-苄氧羰基-丝氨酸 (l,2mmoi) 溶亍 25 mL 无水二氯甲烷 (DCM)中,冰浴冷却， 加入 13mg4-二 氨基吡啶 （DMAP) (O.lmmol) 和 230 mg 1- (3-二甲基氨基丙基)- 3乙基碳化二亚胺盐酸盐 （EDC'HCi) ( 1.2mmol), 搅拌 10 min, 加入 390 mg双环醇 （Immol), 反应 2 h。 反应液依次用饱和碳酸氢铀溶液、 饱 和氯化钠溶液洗涤， 干燥， 硅胶柱梯度洗脱， 流动相为 PE; EA=1:2, 旋干得 630mg白 色泡状固体。

(2) 应

将步骤（ 1 )所得 630mg固体溶于 7 mL 四氢呋喃和 30niL甲醇，加入 10% Pd/C 150mg 氢气保护， 室温反应 5h, TLC检测反应完全。 过滤， 千燥， 硅胶柱梯度洗脱， 流动相 为 PE: EA==4:1, 旋干得 200mg白色泡状固体， 即为双环醇-天冬氨酸酯。

MS(ESI+)m/z:505.9[M+H]+ _o 两步总产率 39.6%。 实施例 5 双环醇 -半胱氨酸酯的制备

(1) 酯化反应

称取 l,76g巯基为三:苯 ^基保护的 Ν-芴甲氧羰基-半胱氨酸氨酸 (3mmol) 溶于 30 mL无水二氯甲垸 (DCM)中,冰浴冷却，加入 30mg4-二甲氨基吡 ®(:DMAP) (0.25mmol) 和 624mg 1- (3-二 φ基氨基丙基) -3-乙基碳化二亚胺盆酸盐（EDC。HCi) ( 3,25nimol), 搅 拌 lO mi 加入 976mg双环醇 （2.5mmol), 反应 21ι。反应液依次用饱和碳酸氢钠溶液、 饱和氯化钠溶液洗涤， 千燥， 旋千得 2.48g白色泡状固体。

(2) 脱保护基反应

(2,1) 脱氨基保护基

将歩骤（2.1)所得 2.48g白色固体溶于 1()!«1_ 20%哌啶/1)(：^混合体系中， 室温反 应 30 min, TLC检测反应完全。反应液依次用稀醋酸溶液， 饱和氯化铀溶液洗涤，千燥， 浓缩， 硅胶柱梯度洗脱， 流动相为 DCM: MeOH=50:l, 旋千得 1.74g 白色泡状固体， 即为双环醇-丝氨酸酯。

(2.2) 脱巯基保护基

将歩骤 （2.1) 所得白色泡状固体溶于 30mL (体积比： 二氯甲烷 /三异丙基硅垸 /三 氟乙酸 ==94/1/5)溶液，反应 1.5h, TLC检测反应完全，反应液依次用饱和碳酸氢钠 溶液， 饱和氯化钠溶液洗涤， 千燥， 过滤， 浓缩， 硅胶柱梯度洗脱， 流动相为 PE: EA=1:1, 旋干得 560m 淡绿色固体， 即为双环醇半胱氨酸酯。

ES1-MS: m/'z ：三歩总产率 48.3%。 实施例 1、 2、 3、 4、 5所得双环醇氨基酸酯具体实验及质谱核磁数� �如下- 双环醇硒代蛋氨酸酯： 0.45g白色泡状固体， 收率 79,2%。

jH-NMR(500MHz, CDC1 ₃ ) δ: 7.35- 7.36(d， IH, ArH), 6,66- 6,67(d, IH, ArH), 5.97-6,08(m, 2H， OCH ₂ 0)， 5.90- 5.92(m, 2H， OCH ₂ 0), 4.79- 4.96(m, 2H， ArCH ₂ 0), 3.94- 3.96(m, 3H, OCH ₃ ), 3,91-3,93(ni, 3H, OCH ₃ ), 3,65-3,70(ni, 3H, COOCH ₃ )， 3.58(s, 1H, CH), — 1.93-— 1.95(m， 2H, CH ₂ )， — 1.89(m, 2H, CH ₂ )， 1.25(s, 3H, C¾)。

ESI- MS: m/z [； M+H] ⁺ =570.0。

双环醇蛋氨酸酯： 0.42g白色泡状固体， 收率 81.3%。

jH-NMR(500MHz, CDC1 ₃ ) δ: 7.33- 7.40(d， 1H, ArH), 6,66- 6,69(d, 1H, ArH), 5.97-6,07(m, 2H， OCH ₂ 0)， 5.90- 5.92(m, 2H， OCH ₂ 0), 4.74- 4.96(m, 2H， ArCH ₂ 0), 3.95- 4.02(m, 3H, OCH3), 3,91- 3,94(m, 3H, OCH ₃ )， 3,65- 3,70(m, 3H, COOCH ₃ ), 3.57(s, 1H, CH), 3.153.51(m, 2H, CH ₂ ), 2.32- 2.65(m, 2H, CH ₂ ), 1.99- 2.05(m， 3H, SCH ₃ )。

ESI- MS： m/z [M+H] ⁺ -522.1 , [M+Na]+=544.1。

双环醇亮氨酸酯： 0,40g白色泡状固体， 收率 79.4%。

jH-NMR(500MHz, CDC1 ₃ ) δ: 7.35- 7.36(d， 1H, ArH), 6,65- 6,67(d, 1H, ArH), 5.97-6,04(m, 2H, OCH ₂ 0), 5.90- 5.92(m, 2H, ()(::¾()), 4.76- 4.94(m, 2H, ArCH ₂ 0), 3.93- 3.96(m, 3H, OCH3), 3,90- 3,92(m, 3H, OCH ₃ ), 3,64- 3,67(m, 3H, COOCH ₃ ), 3.55(s, 1H, CH), 1.51 1.56(m, 1H， CH), 1.22 1.25(m, 2H， CH ₂ ), 0.840.86(m, 3H， CH ₃ ), 0.830.84(m, 3H, CH ₃ ).

ESI MS； m/z [M+H] ⁺ =504.1 , [M+Na] ⁺ =526, 1。

双环醇色氨酸酯： 0.41g白色固体， 收率 71.2%。

⁵ H-NMR(300MHz, CDC1 ₃ )6: 7.51- 7.74(d， J===7.86Hz, H, H), 7.36-7.37(d, J==3,54Hz, 1H, ArH), 7.30-7.3 l(m, 1H, ArH), 7.14 7.19(m, 2H， ArH), 7.04-7.10(ni, 1H， ArH), 6.906.94(dd, J ₃ =2,16Hz, J ₂ =9.37Hz， ArH), 6.60(ώ J-2.22Hz, 1H， ArH), 5.96- 6.02(m, 2H, OCH ₂ 0), 5.92(m, 2H, OCH ₂ 0), 4.84- 4.99(m, 2H, ArC¾0), 4,08-4, 15(m, 2H, NH ₂ ), 3,93- 3,95(d, J=4.17Hz, 3H, OCH ₃ ), 3.86- 3.88(d, J=3.84Hz, 3H， OCH ₃ ), 3.69(m, 1H, CH), 3.65-3.66(d, J===3,42Hz, 3H, COOC )， 3,II-3,20(m, 1H, CH ₂ )， 2.91- 3.00(m, 1H, CH ₂ )。

ESI- MS; m/z； M+H] ⁺ =577。2。

双环醇异亮氨酸酯： 0.35g白色黏状物， 收率 69.6%。

NMR(500MHz, CDC1 ₃ ) δ: 7.36- 7.37(d, 1H, ArH), 6,65- 6,68(d， 1H, ArH), 5.99~6,04(m, 2H， OCH ₂ 0)， 5.90- 5.93(m, 2H， OCH ₂ 0), 4.85- 4.97(m, 2H， ArCH ₂ 0), 3.94- 3.96(m, 3H, OCH3), 3.90- 3.93(m， 3H, OCH ₃ ), 3.63-3.67(m, 3H, COOCH ₃ ) _? 3,45(m, 1H, CH), 3,19- 3,31(m， IH, CH), 1.53(br, 2H, C¾), 1.25(s, 3H, C¾)， 0.83- 0.88(m, 3H, C¾)。

双环醇赖氨酸酯： 0.45g白色泡状固体， 收率 86.8%。

-i- NMR(3()()MHz, CDCi ₃ ) δ: 7.31- 7.39(m, IH, ArH), 6.62-6.71 (m, IH, ArH), 5.99-6.17(m, 2H' OCH ₂ 0), 5.89- 5.94(m， 2H, OC¾0), 4,82- 5,16(m, 2H, ArH and N¾), 3.94- 3。97(m, 3H, OCH ₃ ), 3.87-3.93(m, 3H， OCH ₃ ), 3.50-3.73(m, 3H, COOCH ₃ ), 2.93(br, IH, CH), 1.61- 1.96(m， 3H, CH ₂ )， 1.26- 1.40(m, 4H， C¾)， 0.86- 0.90(m, IH, C¾)。 ESI- MS; mlz [M+H]"=519.2, [M+Na] ⁺ =541.2。

双环醇丝氨酸酯： 0.48g白色泡状固体， 收率 50.5%。

NMR(500MHz, CDCI3) δ: 7.35(d, — IH, ArH), 6.68(s, — IH, ArH), 6.01-6.05(m, 2H, OCH ₂ 0), 5.92(s, 2H, OCH ₂ 0), 4.914.98(m, 2H, ArCH ₂ 0), 3,97(m, 3H, OCH ₃ ), 3.93- 3.94(m, 3H, OCH3), 3.66-3.70(m, 4H, C00C1¾ and CH ), 3.56- 3.6()(m, IH, CE ₂ ), 3.44-35(m, IH, C¾)。

ESI- MS: m/z [； M+H] ⁺ =578.2。

双环醇天冬氨酸酯： 0.2g白色固体， 收率 39.6%。

jH-NMR(300MHz, CDC1 ₃ ) δ: 7.30- 7.31(m, IH, ArH), 6.66(s, IH, ArH), 5.88~6.05(m, 4H， OCH ₂ 0), 4.91- 4.94(m， 2H, ArCH ₂ )， 4,08-4, 13(m, 2H, N¾)， 3,86- 3,97(m， 9H, OCH3 andCOOCH ₃ ), 3,62(s, IH, CH), 2.46- 2.68(ra， 2H， （〕¾)。

ESI- MS; m/z [M+H] ⁺ =505。9。

双环醇苯丙氨酸酯： 0.31g白色固体， 收率 73.0%。 ESI MS: m/z〖M+H] ⁺ =538.2。

双环醇甘氨酸酯： 0,27g白色固体， 收率 67 %。 ESI- MS: m/z [Μ+Η] ⁺ =448.2 双环醇脯鍾酯: 0.29g白色固体， 收率 59.3%。 ESI-MS: m/z [M+H] ⁺ =488.2 双环醇丙氨酸酯： 0.27g淡黄色固体， 收率 67.2%。 ES】-MS: ιη/'ζ [M+H] ⁺ === 62.2 双环醇鸟氨酸酯： 0.43g淡黄色固体， 收率 65.8%。 ESI- MS: m/z [M+H] ⁺ =504.2 双环醇半腕氨酸酯： 0.56g淡绿色固体， 收率 48„3%。 ESI-MS: m/z [M+H] ⁺ =494.1。 实施例 6 双环醇氨基酸酯的水溶性

以蒸馏水为溶剂， 采用超声 2h或加热后放至室温， 使溶液达到饱和状态。分别测定 25Ό和 37Ό下双环醇及其衍生物的饱和溶解度， 结果如下- 25 °C时双环醇的溶解度约为 28 g/mL , 双环醇氨基酸酯衍生物的溶解度范围为 2-30mg/mL;

37°C if 双环醇的溶解度约为 56 g/mL， 双环醇氨基酸酯衍生物的溶解度范围为 5- 52mg/mL。

通常认为， 当药物的水溶性^！！^/！^ .， 其水溶性可能成为药物吸收的限速步骤。 实验结果表明， 双环醇氨基酸酯衍生物的水溶性明显优亍双环 醇， 有利于药物吸收。 实施例 7 双环醇氨基酸酯对大鼠 D-氨基半乳糖胺肝损伤模型的影响

1. 实验材料

1.1动物

SPF级 SD大鼠， 体重 180g〜220g, 雌雄各半， 由南京军区总医院比较医学中心提 供。

实施例 1、 2、 3 , 4、 5提供的双环醇氨基酸酯供试样品较多， 动物实验分两批进行； 第一批： 隨机分为 9 ， 每组 10只， 即 (1)空白对照组， （2)模型对照组， （3)双环醇 组， （4)双环醇蛋氨酸酯组， （5)双环醇亮氨酸酯组， （6)双环醇异亮氨酸酯组， （7) 双环醇 fi西代蛋氨酸酯组， （8)双环醇丝氨酸酯组， (9) 双环醇缬氨酸酯组。

第二批： 随机分为 12组， 每组 10只， 即 (1)空白对照组， （2)模型对照组， （3)双环 醇组， （4)双环醇苯丙氨酸酯组， （5) 双环醇 t'氨酸酯组， （6) 双环醇誧氨酸酯组， （7)双 环醇丙氨酸酯组， （8)双环醇色氨酸酯组， （9)双环醇赖氨酸酯组， （10) 双环醇半胱氨酸 酯组， （11)双环醇天冬氨酸酯组， (12)双环醇鸟氨酸酯组。

1.2 药物

实施例 1、 2、 3、 4、 5的双环醇氨基酸酯， 双环醇。

1.3 药物配制、 别量及分组

第一批实验分九组， 包括：

(1) 空白对照组；

(2) 模型对照组；

(3) 双环醇组： 给药双环醇， 剂量为 6.75 mg kg (按照临床人日服用量 75mg按体表 面积折算成大鼠给药剂量）；

(4) 双环醇蛋氨酸酯组： 给药双环醇代蛋氨酸酯， 剂量为 6.75 mg/kg _;

(5) 双环醇亮氨酸酯组； 给药双环醇亮氨酸酯， 齐 ij量为 6,75 mg/kg。 (6) 双环醇异亮氨酸酯组： 给药双环醇异亮氨酸酯， 剂量为 6.75 ffig/kg。

(7) 双环醇硒代蛋氨酸酯组： 给药双环醇硒代蛋氨酸酯， 剂量为 6.75 nig/k¾。

(8) 双环醇丝氨酸酯组： 给药双环醇丝氨酸酯， 剂量为 6.75 mg/kg。

9) 双环醇缬氨酸酯组： 给药双环醇缬氨酸酯， 剂量为 6.75 ffig/kg。

(1) 空白对照组；

(2) 模型对照组；

(3) 双环醇组： 给药双环醇， 剂量为 6.75 mg kg (按照临床人日服用量 75mg按体表 面积折算成大鼠给药剂量）；

(4) 双环醇苯 R氨酸酯组： 给药双环醇苯丙氨酸酯， 剂量为 6.75 mg/kg。

(5) 双环醇 It氨酸酯组； 给药双环醇甘氨酸酯， 齐 ij量为 6,75 mg/kg。

(6) 双环醇脯氨酸酯组； 给药双环醇脯氨酸酯， 剂量为 6.75 mg/kg。

(7) 双环醇丙氨酸酯组： 给药双环醇丙氨酸酯， 剂量为 6.75 mg/kg;

(8) 双环醇色氨酸酯组： 给药双环醇色氨酸酯， 剂量为 6.75 mg/kg。

(9) 双环醇赖氨酸酯组： 给药双环醇赖氨酸酯， 剂量为 6.75 ffig/kg。

(10) 双环醇半胱氨酸酯组： 给药双环醇半胱氨酸酯， 剂量为 6.75 mg/kg。

(11)双环醇天冬氨酸酯组； 给药双环醇天冬氨酸酯， 剂量为 6.75 mgZkg。

(12) 双环醇鸟氨酸酯组： 给药双环醇鸟氨酸酯， 别量为 6.75 mg/kg。

空白对照组， 模型组给予等容积溶媒， 上述各组药物使用时用 DMSO溶解， 调节 浓度至 6.75 mg/ml,用含 10% β环糊精的 PBS 1:10稀释后灌胃。给药体积为 l.O mL/100 g

L4 试剂

D-氨基半乳糖胺， 南京博源医药科技有限公司。

B-cyclodextrin, 中国医药集团上海化学试剂公司。

W氨酸氨基转移鷗 （AUT) IFCC法检测试剂盒， 四川迈克科技有限责任公司。

天冬氨酸氨基转移酶 （AST) IFCC法检测试剂盒， 四川迈克科技有限责任公司。

1 .5 仪器

DK-8D型恒温水浴槽， 上海精宏实验设备有限公司；

Sartorius电子大平， 德国 Sartorius公— e'J ;

OLYMPUS AU2700全自动生化分析仪。 2 实验方法

2.1 实验歩骤

建模： 除空白对照组外， 其余各组大鼠于第七次给药后 24小 ^"腹腔注射 D-氨基半 乳糖胺 600 mg/kg, 注射体积为 1.0 mL/100 g体重； 空白组注射等量生理 &水。

给药： 各组大鼠每天灌胃分别按剂量给药一次， 连续给药七天。

检测； 大鼠腹腔注射 D-氨基半乳糖胺 24小^后， 称体重， 眼眶采愈并分离愈清， 测定 AUi'和 AST。 颈椎脱臼处死大鼠后， 进行尸检， 取肝、 脾、 胸腺， 称量并计算脏 器系数 （脏器重量 /体重 χΐοο%), 并对肝脏组织进行病理组织学检查。

2.2 病理学检查

实验结束后剖取肝脏， 经 10%福尔马林溶液固定， 常规取材， 脱水， 石蜡包埋， 制 片 （4μη 厚）， HE染色， 在光学显微镜下阅片， 检査有无下列病变： （1 )有无肝细胞脂

(2 )有无肝细胞索断裂； （3 )有无肝细胞坏死， 嗜酸性小体形成； （4) 肝窦有无扩张、 充血； （5 )肝小叶内有无炎细胞浸润； （6) 门管区有无炎症或纤维组织增生。 根据病变 由轻到重的程度标记为 0.5分 （轻微）， 1分 （轻度）， 2分 （中度）， 3分 （重度）， 0分

(基本正常）， 累加所有分数， 并计算出每组每例动物的均分 （ ±SD), 结果进行两个 样本比较的秩和检验。

23 数据处理

对所有数据使用 Microsoft Excel软件进行数据处理， 对病理学 i 分采用秩和检测， 并统 分析结果。

3 实验结果

3.1 受试双环醇氨基酸酯对 D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤血清生� ��指标的影 响

从表 1-1和表 1-2可以看出， D-氨基半乳糖胺造模组大鼠血清 AL 和 AST显著升 高 （P<0.01 ), 表明: D-氨基半乳糖胺可造成大鼠急性肝损伤。 不同受试药物给药后 AL 和 AST数据见表 1-1和表 1-2。 表 1-1 第一批不同药物对 D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤血清生� ��指标的影响 ( ±sd, n= 10)

¾| 漏（mg/kg) 血清生化指标 ALT(U/L) AST(U/L) 空白对照组 ― 58, 3士 13,0 272.7±55.2 模型组 ― 4350, 1士 1941.1 ^ΔΔ 6032,4士 1944.2 ^ΔΔ 双环醇组 6,75 2246,8士 1458, 2 3921 ,2±2433.8* 双环醇蛋氨酸酯组 6.75 2357,8士 1746.3* 4229,6士 1842.5* 双环醇亮氨酸酯组 6,75 2162.7±2047.0* 3005. ±2349.4" 双环醇异亮氨酸酯组 6,75 1985.5±1003.0** 3855.2.士 1910.7* 双环醇硒代蛋氨酸酯组 6.75 2981.6±1771 .5 3586,6±2339.0* 双环醇 έ氨酸酯组 6.75 3256.8士 2386.1 4393.9士 2177.8 双环醇缬氨酸酯组 6,75 2784,3士 1629.0 4542,2士 2082.8 与模型组比较， <0.05, * <0.01； 与空白对照组比较， POOL

表 1-2 第二批不同药物对 D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤血清生� ��指标的影响 ( X士 sd， n= 10 )

血清生化指标

组别 齐 [！量 (mg/kg)

ALT(U/L) AST(U/L) 空白对照组 ― 35,5士 8.6 187,9土 40.2 模型组 162.7±85.5 ^ΔΔ 504.1±191.1 ^ΔΔ 双环醇组 6.75 74.6±58,4* 238.5±91 .2** 双环醇苯丙氨酸酯组 6.75 156,9士167.5 448 J土 254.0 双环醇 氨酸酯组 6.75 82,0±72.4* 267.2±67.0** 双环醇脯氨酸酯组 6.75 149,0±88.0 396.7±〗〗9,6 双环醇丙氨酸酯组 6.75 166.8士 212,0 381.7±310.8 双环醇色氨酸酯组 6.75 252,2±403.8 465, 5土 443.1 双环醇赖氨酸酯组 6.75 133,0士 103.6 452。4±269.5 双环醇半胱氨酸酯组 6.75 45.3±：! 8,广 256,5土 96.9** 双环醇天冬氨酸酯组 6.75 142.6士 144,0 360.7±155.7 双环醇鸟氨酸酯组 6.75 132,6±109.4 455, 8土 217.8

与模型组比较， <0.05, * <0.01； 与空白对照组比较， ^ΔΔ Ρ<0,01。 32 双环醇氨基酸酯对 D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤病理组� ��学检查的影响 受试双环醇氨基酸酯对 D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝脏损伤的组� ��病理组织 学研究表明， 两批实验中 D-氨基半乳糖胺引起的大鼠肝损伤模型主要表� ��为 （1) 肝细 胞明显脂变； （2) 出现较多的嗜酸性小体； （3)肝小叶内有多灶性炎细胞浸润， 肝窦淤 血。 不同受试药物应用后均能减轻肝脏损伤程度， 其中双环醇亮氨酸酯， 双环醇异亮 氨酸酯， 双环醇蛋氨酸酯， 双环醇 t'氨酸酯， 双环醇半胱氨酸酯的效果尤为显著， 其减 轻效果较阳性药双环醇组明显， 与模型组相比具有统计学显著性差异 （见表 2-1,2-2)。 表 2-1第一批不同药物对大鼠 [)-氨基半乳糖胺肝损伤影响的病变评分结果 （ ±SD) 组 另 t] 动物数 (只） 病变评分

正常组 10 0,10±0.21** 模型组 10 5.70+0.92

阳性药双环醇组 10 4.35±1.40* 双环醇蛋氨酸酯组 10 4.2.5±1,32 ^#

双环醇亮氨酸酯组 10 3,5士 1.65" 双环醇异亮氨酸酯组 10 3.75士]— ,27** 双环醇硒代蛋氨酸酯组 10 4.35±2.12 双环醇 氨酸酯 10 5.20±2.39 双环醇缬氨酸酯组 10 5,35 ±2,26

注： 各组与模型组比较 * Ρ < 0.05 , **Ρ < 0,0 表 2-2第二批不同药物对大鼠 D-氨基半乳糖胺肝损伤影响的病变评分结果 （ ±S:D)

组 另 u 动物数 (只） 病变评分

正常组 10 0,05土 0,16**

模型组 10 3, 70土 1.53 双环醇组 10 2.40±1.07* 双环醇苯丙氨酸酯组 10 3.05+2.63

双环醇甘氨酸酯组 10 1.55±1.77**

双环醇脯氨酸酯组 10 2.20±2.02

双环醇丙氨酸酯组 10 3.45+2,73

双环醇色氨酸酯组 10 3.95±3,20

双环醇赖氨酸酯组 10 2.80±2.07

双环醇半胱酸酯组 10 1 ,40土 0,74**

双环醇天冬氨酸酯组 10 4.00±2.59

双环醇鸟氨酸酯组 10 3.00±1 ,96

注： 各组与模型组比较 * P < 0.05 , < 0.01

4 结论

本发明的双环醇氨基酸酯受试药物对 D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤引起 的 ALT和 AST升高均有明显的降低作用，均能不同程度地 减轻肝脏损伤程度， 其中双 环醇亮氨酸酯、双环醇异亮氨酸酯、双环醇甘 氨酸酯、双环醇半胱酸酯的效果尤为显著， 其减轻效果较 ffl性药双环醇组明显， 与模型组相比具有统计学显著性差异。

血清生化指标 A T、 AST以及病变评分从不同侧面反应了肝脏损伤程 度，它们之间 可能存在着一定程度的不一致性。双环醇色氨 酸酯和双环醇天冬氨酸酯病变评分指标较 模型组加重了肝脏损伤程度， 但在一定程度上较模型组降低了 ALT和 AST指标。

综上所述， 本发明的双环醇氨基酸酯的水溶性较双环醇明 显改善， 对 D-氨基半乳 糖胺诱导的大鼠急性肝损伤引起的丙氨酸氨基 转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶升高均 有明显的降低作用， 均能不同程度地减轻肝脏损伤程度， 可以作为治疗肝损伤的药物应 用。