Штамм Bifidobacterium bifidum 8, используемый в качестве пробиотика

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии, фармацевтической и пищевой промышленности и представляет собой штамм бифидобактерий вида Bifidobacterium bifidum , который может быть использован в лекарственных средствах, функциональных и специализированных пищевых продуктах, в том числе, биологически активных добавках к пище.

Уровень техники.

Бифидобактерии являются основными представителями индигенной микрофлоры человека. Описаны следующие основные функции бифидобактерий в организме человека: бифидобактерии образуют основу микрофлоры, в результате высокой адгезивности к слизистой оболочке кишечника и определяют основные ниши сосуществования для других микроорганизмов, стабилизируют биопленку кишечника; укрепляют эпителиальный барьер кишечника, необходимы для созревания эпителиоцитов; белок клеток бифидобактерий содержит все незаменимые аминокислоты, включая триптофан (Терешкова Е.А. и др., 2020; Иванова Е.В., 2018).

Вид Bifidobacterium bifidum согласно современным исследованиям преобладает в кишечном микробиоценозе и необходим для нормального функционирования организма человека (Иванова Е.В., 2018; Turroni F. et al., 2019). Вид Bifidobacterium bifidum является доминирующим видом у лиц с нормальным составом микрофлоры и с начальными степенями дисбиоза 1 - 2 степени. При глубоких нарушениях в микросимбиоценозе (3 степень дисбиоза) выявляемость вида Bifidobacterium bifidum снижается (Иванова Е.В., 2018).

В литературе имеется много данных, свидетельствующих о том, что Bifidobacterium bifidum может взаимодействовать с человеком и с микроорганизмами микрофлоры кишечника с помощью различных механизмов, в частности, активировать иммунитет человека, адгезировать на слизистую оболочку кишечника и метаболизировать гликаны, такие как муцин (Turroni F. et al., 2019). Примечательно, что вид Bifidobacterium bifidum является единственным представителем среди всех признанных видов бифидобактерий, способным к росту посредством метаболизма муцина (Ruas-Madiedo Р. et al., 2008, Turroni F. et al., 2011). Причем метаболизм муцина, осуществляемый Bifidobacterium bifidum, может активировать выработку муцина, тем самым увеличивая глубину слоя слизи, обволакивающей слизистую оболочку, и, таким образом, усиливая функцию эпителиального барьера (Rokhsefat S. et al., 2016). Данные свойства позволяют отнести представителей данного вида бифидобактерий к пробиотическим микроорганизмам.

Штамм Bifidobacterium bifidum 1 и Bifidobacterium bifidum 791 в составе отечественных препаратов-пробиотиков применяется в широком масштабе во всех возрастных группах с 1972 года по настоящее время (Терешкова Е.А. и др., 2020).

В современной концепции функционального питания существенным весом обладают пребиотики и синбиотики. Согласно общепринятому в научной литературе определению, пребиотики - это пищевые ингредиенты, сочетающие следующие признаки: 1) устойчивые к желудочному соку, гидролизу пищеварительными ферментами человека, и не всасывающиеся в тонком кишечнике, 2) ферментируемые кишечной микрофлорой 3) избирательно стимулируют рост и/или активность одной или ограниченного числа групп бактерий микробиоты кишечника, которые положительно влияют на здоровье хозяина. Смесь синергетически взаимодействующих пробиотиков и пребиотиков, в которой они взаимно усиливают эффективность друг друга, называют синбиотиками (Gibson G.R., Roberfroid М.В., 1995). Также пребиотики часто связывают с так называемым бифидогенным эффектом (Roberfroid М. et al., 2010).

Известен штамм Bifidobacterium bifidum 792 (патент RU 2215028), который выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, активно размножающийся в питательной среде с накоплением производственной биомассы в короткие сроки культивирования с высокой концентрацией бифидобактерий. Обладает кислотообразующими и ингибирующими свойствами в отношении патогенной и гнилостной микрофлоры. Это позволяет получить кисломолочные, ферментированные и неферментированные пищевые продукты, закваски, гигиенические и косметические средства, биологически активные добавки и бактерийные препараты, обеспечивающие нормализацию микробиоценозов организма человека. Известны штаммы Bifidobacterium bifidum 79-32 (патент RU 2314340) и Bifidobacterium bifidum B-UH ВКПМ Ас-1875 (патент RU 2453592), выделенные из содержимого кишечника здорового ребенка грудного возраста, которые, кроме указанных выше свойств, заквашивают, либо сквашивают молоко.

Однако, для указанных штаммов не приведена информация об устойчивости к антибактериальным веществам, что осложняет возможность их применения в качестве активного компонента лекарственных препаратов в комплексной терапии ряда заболеваний. Также, для всех указанных штаммов видовая принадлежность не подтверждена современными молекулярно-генетическими методами, что для выделенных из природных источников микроорганизмов в настоящее время является обязательным (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume 5).

Известен штамм Bifidobacterium bifidum 791/БАГ (патент RU 2165454), полученный селекцией штамма Bifidobacterium bifidum 791. Штамм более устойчив к повреждающим факторам сред культивирования и агрессивных сред гастроинтестинального тракта человека, обеспечивает утилизацию более широкого спектра аминокислот, т. е. обладает более высокой жизнеспособностью и колонизирующими свойствами, что обеспечивает получение препаратов и продуктов на его основе с более длительными сроками хранения и более высокими лечебно-профилактическими свойствами. Однако, для указанного штамма также не приведена информация об устойчивости к антибактериальным веществам, что осложняет возможность его применения как активного компонента лекарственных препаратов в комплексной терапии ряда заболеваний.

Известен штамм Bifidobacterium bifidum OV-19 (патент RU 2375444), выделенный из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, который, кроме указанных выше свойств, устойчив к широкому спектру антибиотиков, а также сквашивает молоко с образованием ровного сгустка.

Недостатком всех указанных выше штаммов является то, что ни на уровне генотипа, ни на уровне фенотипа не определено отношение к муцину и желчным солям, что, как указывалось выше, является важными особенностями, влияющими на эффективность штамма, как пробиотика.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является штамм Bifidobacterium IATA-ES2 WO2010007198 А1, выделенный из фекалий здорового ребенка на грудном вскармливании и идентифицированный секвенированием 16S рРНК как представитель вида Bifidobacterium bifidum. Штамм предложено применять с целью улучшения защитных функций и снижения риска заболеваний. Показаны следующие механизмы его действия: 1) регуляция гликозилирования кишечника, благоприятствующую таковому у здоровых людей, 2) модуляция взаимодействия между эпителиальными клетками и микробиотой кишечника, способствующую адгезии полезных бифидобактерий, и 3) регуляцию иммунологического ответа. Однако, для указанного штамма не приведена информация об устойчивости к антибактериальным веществам.

Для всех указанных выше штаммов не приведена оценка способности ферментировать селективно стимулирующие рост бифидобактерий углеводные субстраты - пребиотики, что ограничивает возможность их применения в сии биотических функциональных и специализированных продуктах питания. Данная особенность, как указывалось выше, является основным критерием для разработки на основании штамма синбиотических продуктов. Изучение эффективности in vivo либо не проводилось, либо проводилось на животных моделях, т.е. полученные результаты не могут в полной мере быть перенесены на человека.

Раскрытие сущности изобретения.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов, с подтвержденной молекулярно-генетическими методами исследования принадлежностью к виду Bifidobacterium bifidum , охарактеризованного по показателям необходимым для включения в состав пробиотических лекарственных средств, функциональных и специализированных пищевых продуктов, в том числе, биологически активных добавок к пище.

При решении поставленной задачи достигаются следующие технические результаты: штамм является антагонистом патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, сбраживает молоко с образованием сгустка, отличается активным ростом и образованием органических кислот в средах, содержащих селективно стимулирующие рост бифидобактерий углеводные субстраты - пребиотики, что обусловливает усиление антагонизма против условно-патогенных микроорганизмов. Штамм устойчив к антимикробным веществам канамицину, гентамицину, амикацину. В результате полногеномного исследования показано, что штамм характеризуется наличием генов, кодирующих пептиды, которые отвечают за адгезию к муцину и слизистой кишечника, а также генов, кодирующих ферменты, осуществляющие гидролиз муцина. В результате полногеномного исследования показано, что штамм характеризуется наличием генов, отвечающих за гидролиз желчных солей, что указывает на устойчивость к желчи и участие в регулировании трансформации указанной группы веществ в цикле печень-кишечник-печень, способствуя пищеварению. Применение ферментированных продуктов и бактерийных препаратов на основе заявляемого штамма приводит к исчезновению клинических проявлений дисбактериоза (дисбиоза) кишечника, боли в желудке, улучшению функции иммунной системы, улучшению общего состояния, повышению работоспособности.

Осуществление изобретения

Указанный технический результат достигнут получением нового штамма бактерий Bifidobacterium bifidum 8, который выделен из содержимого кишечника здорового человека, идентифицирован по 16S рРНК, и депонирован в Национальном биоресурсном центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика, коллекционный номер АС-2136.

Заявляемый штамм обладает следующими свойствами.

Полноразмерная последовательность гена, кодирующего 16S рибосомальную РНК, SEQ ID NO 1 на 100 % гомологична типовому штамму вида Bifidobacterium bifidum DSM 20456 (АТСС 29521).

Культурально-морфологические свойства.

Облигатный анаэроб, оптимальная температура роста 36 - 38 °С.

Грамположительные, неподвижные, неспорообразующие прямые или слегка изогнутые палочки с утолщением или бифуркацией на одном или обоих концах. Располагаются по одной, чаще по 2 или скоплениями. Характерной особенностью является расположение парных клеток под углом 90° друг к другу на поздних фазах роста.

При культивировании в среде Блаурокка в модификации Г. И. Гончаровой при температуре 37 - 38 °С в течение 36 - 48 часов образует колонии белого цвета в виде слаборасширяющихся конусов длиной до 10 мм. При культивировании на поверхности агаризованной (плотной) среды Bifidobacterium Broth фирмы Himedia в анаэробных условиях (bioMerieux GENbox anaer, температура 37 - 38 °С, продолжительность 72 часа) образует плоские сероватые колонии R-формы, диаметром до 5 мм.

Физиолого-биохимические свойства штамма

Штамм желатин не разжижает, каталазу не продуцирует, молоко сквашивает с образованием сгустка. Утилизирует глюкозу без образования газа, с образованием молочной и уксусной кислот, снижая pH среды до 3,8 - 4,2. Утилизирует сахарозу, лактозу, маннозу, целлобиозу. Не утилизирует: арабинозу, ксилозу, инулин (высокой степени очистки), салицин, сорбит.

Штамм устойчив к канамицину, гентамицину, амикацину. Штамм чувствителен к азитромицину, амоксицилину, кларитромицину, доксициклину, тетрациклину, цефтриаксону, ванкомицину, цефепиму, линкомицину, имипенему. В отношении, левофлоксацина, метронидазола, триметоприма, ципрофлоксацина, офлоксацина является промежуточным с учетом концентрации, минимально подавляющей рост (см. примеры). Штамм является активным антагонистом патогенных микроорганизмов. В присутствии пребиотиков фрутоолигосахаридов (ФОС), либо лактулозы в качестве единственного углевода в питательной среде отличается наибольшей степенью подавления микробных контаминантов пищи и возбудителей инфекционных заболеваний на примере тестовых штаммов Bacillus cereus и Staphylococcus aureus.

Установлена безвредность штамма на белых беспородных мышах массой 14-16 г. Суспензию лиофилизированного штамма вводили из расчета примерно 1x10 ⁹ КОЕ. В течение 5 суток все мыши остались живы и не потеряли в весе.

Штамм хранится в лиофлизированном виде в сахарозо-желатиновой среде высушивания не менее 5 лет в герметично укупоренных флаконах без потери указанных свойств.

Пример 1

Для подтверждения антагонистической активности штамма суспензию лиофилизата, восстановленного в физиологическом растворе, высевали на чашки Петри со средой МРС-5 штрихом по диаметру. Инкубировали культуру в анаэробных условиях (bioMerieux GENbox anaer) при 37 °С в течение 48 часов. После этого перпендикулярно зоне роста штамма, но не касаясь ее, высевали тестовые штаммы, используя для каждого отдельную чашку. Через 20 часов определяли зону отсутствия роста (табл. 1). Штамм Bifidobacterium bifidum 8 показал высокую антагонистическую активность в отношении тест-штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Таблица 1 - Антагонистическая активность штамма Bifidobacterium bifidum 8

Пример 2 Лиофилизированную культуру штамма Bifidobacterium bifidum 8 ресуспендировали в физиологическом растворе и инокулировали предварительно подвергнутую пастеризации 10% суспензию обрата молока из расчета примерно 2х 10 ⁶ КОЕ/мл. Инкубацию проводили при 37 °С в течение 48 часов. Результаты представлены в таблице 2. Штамм Bifidobacterium bifidum 8 сквашивает молоко с образованием сгустка.

Таблица 2 - Показатели сквашивания молока штаммом Bifidobacterium bifidum 8

Пример 3

Подтверждение активного роста штамма Bifidobacterium bifidum 8 и образованием органических кислот в средах, содержащих селективно стимулирующие рост бифидобактерий углеводные субстраты - пребиотики, а также их синергетического эффекта против условно-патогенных микроорганизмов проводили по описанному ранее методу (Karetkin В.А. et al., 2019). Представители вида В. cereus являются контаминатами пищевых продуктов и возбудителями кишечных инфекций. В качестве тестового использовали штамм В. cereus АТСС 9634. Ферментацию смешанной культуры бифидобактерий и тест- штамма проводили при температуре 37 °С в анаэробных условиях (2% углекислого газа, 98% азота) при постоянном перемешивании в жидкой среде, содержащей в качестве единственного углевода 1 % одного из известных коммерческих пребиотиков: фруктоолигосахариды (ФОС, Orafti ^® Р95, BENEO ORAFTI, Бельгия), изомальтулоза (Palatinose™, BENEO Palatinit GmbH, Германия), лактулоза сухая Лактусан (ООО Фелицата Холдинг, РФ) и D-раффиноза (ООО ДиаМ, РФ). В начальный момент эксперимента и после 9 ч роста оценивали численность обоих микроорганизмов высевом на селективные среды. Определение кислот проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе Agilent 1220 с рефрактометрическим детектором и колонкой Hi-Plex Н (4.6 х 250 мм). Заявляемый штамм Bifidobacterium bifidum 8 характеризуется активным ростом и наибольшим подавлением тест-штамм в синбиотической композиции с ФОС и лактулозой (Таблица 3).

Таблица 3 - Влияние коммерческих пребиотиков на активность штамма Bifidobacterium bifidum 8 против В. cereus АТСС 9634

Staphylococcus aureus считается одной из основных причин энтероколита и диареи у пациентов, прошедших курс лечения антибиотиками в госпитальных условиях (Lo T.S., Borchardt S.M., 2009). Исследования проводили по аналогичной методике. Заявляемый штамм Bifidobacterium bifidum 8 характеризуется активным ростом и наибольшим подавлением тест- штамм S. aureus АТСС 43300 в синбиотической композиции с ФОС и лактулозой (Таблица 4).

Таблица 4 - Влияние коммерческих пребиотиков на активность штамма Bifidobacterium bifidum 8 против S. aureus АТСС 43300

Пример 4 Определяли чувствительность заявляемого штамма к антимикробным веществам диско-диффузионным методом и методом серийных разведений в жидкой питательной среде по МУК 4.2.1890-04.

Суточную культуру штамма, полученную инкубированием в среде Блаурокка при температуре 37 °С, стандартизовали стерильным забуференным физиологическим раствором до OD560 = 2,1 и высевали по 0,1 мл полученной суспензии на чашки со средой Bifidobacterium Broth фирмы Himedia. На поверхность среды помещали диски с антибиотиками (см. табл. 5). Инкубацию проводили в анаэробных условиях (bioMerieux GENbox anaer) при температуре 37 °С в течение 3 суток, после чего определяли диаметр зоны угнетения роста (табл. 5).

Таблица 5 - Исследования чувствительности штамма Bifidobacterium bifidum 8 к антимикробным веществам диско-диффузионным методом

Для метода серийных разведений использовали жидкую питательную среду MRS с цистеином и аскорбиновой кислотой и антимикробные вещества (см. табл. 6) для биохимических исследований. Лекарственные препараты на основе данных веществ наиболее часто применяются в современной терапии. Для каждого вещества готовили серию последовательных двукратных разведений в стерильной среде от 512 до 0,125 мкг/мл. Инокулировали 10 % суточной культурой штамма, предварительно стандартизованной по OD560 = 1,5. Через 10 часов инкубирования при температуре 37 °С в анаэробных условиях (2% углекислого газа, 98% азота) и при постоянном перемешивании измеряли мутность суспензии, кривые зависимости данной величины от концентрации антимикробного вещества носили сигмоидальный характер. Из зависимостей определяли минимальную подавляющую концентрацию (МПК) и минимальную концентрация антимикробного вещества, при которой начинается наблюдаемое подавление роста (табл. 6). Определение данной величины связано со следующими соображениями. Для достижения лечебного действия необходимо попадание в кишечник человека или животного определенного количества живых клеток бифидобактерий, что может быть обеспечено только при минимальном воздействии антибактериальных веществ. Поэтому устойчивость определяли с учетом указанной величины, а не только с учетом МПК, как это принято для патогенных микроорганизмов, когда выживание доже небольшого количества клеток может привести к заболеванию.

Таблица 6 - Исследование чувствительности штамма к антимикробным веществам методом серийных разведений в жидкой питательной среде

Штамм устойчив (У) к канамицину, гентамицину, амикацину. Чувствителен (Ч) к амоксицилину, цефтриаксону, цефепиму, имипенему, тетрациклину, доксициклину, азитромицину, кларитромицину, линкомицину, ванкомицину. В отношении офлоксацина, ципрофлоксацина, левофлоксацина, метронидазола, нифуроксазида, триметоприма является промежуточным (П) с учетом минимальной концентрации начала наблюдаемого подавления роста.

Результаты полногеномного исследования показали отсутствие генов с маркерами устойчивости к тетрациклину tet(W) (SEQ ID NO: 2) и trp-tet(W) (SEQ ID NO: 3), что также подтверждено фенотипически.

Пример 5

Молекулярно-биологические признаки штамма определяли на основании полногеномного исследования.

Анализ полученного генома показал, что штамм Bifidobacterium bifidum 8 не содержит плазмид.

Анализ полученного генома показал наличие генов, кодирующих пептиды клеточной стенки, отвечающие за специфическую адгезию. Коллаген связывающий протеин участвует в адгезии к эпителию. Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 4) с пептидом фимбринального пили Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: BBA48285.1) составляет 99 %.

Протеин, кодируемый геном ОррА, отвечает за связывание с клетками эпителия кишечника Сасо-2 (Guglielmetti S. ety al., 2008). Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 5) с олигопептид связывающим протеином ОррА Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: KLN80891.1) составляет 100 %.

Образование трансальдолазы значительно увеличивает степень связывания клеток бактерий - представителей кишечной микробиоты с муцином (Gonzalez-Rodriguez I. et al., 2012). Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 6) с трансальдолазой Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: WP 003813255.1) составляет 100 %.

Эндо альфа-^ацетилгалактозаминидаза участвует в гидролитическом разложении муцина (отщеплении от пептидной цепи углеводных остатков). Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 7) с эндо альфа-^ацетилгалактозаминидазой Bifidobacterium bifidum АТСС 29521 (NCBI GenBank SEQ ID NO: BAQ97477.1) составляет 99 %.

Одним из основных механизмов, обуславливающих устойчивость бактерий кишечника к солям желчи, секретируемым печенью, является их расщепление ферментами (Ruiz L. et al., 2013). Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 8) с гидролазой солей желчи Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: AAR39435.1) составляет 99 %. Фосфопируват гидролаза также участвует в расщеплении желчных солей. Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 9) с фосфопируват гидролазой Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: WP 003812660.1) составляет 100 %.

Пример 6.

Использование штамма Bifidobacterium bifidum 8 в лекарственных средствах. На основе штамма Bifidobacterium bifidum 8 получали лиофилизированную биомассу бифидобактерий. Из чистой культуры путем проведения 2-3 пассажей получали маточную культуру (инокулят) в среде Блаурокка по одному из известных способов. Инкубирование проводили при 37 °С. Далее проводили культивирование с поддержанием pH в интервале 5,5 - 7,0. Полученную культуру, содержащую не менее 2х 10 ⁹ КОЕ/мл, отделяли от среды культивирования с применением центрифугирования, сепарирования, либо других способов, применяемых для суспензий бактериальных клеток. К полученному концентрату добавляли сахарозо-желатиновую среду высушивания, замораживали во флаконах или на поддонах для сушки из пищевой легированной стали до температуры не выше минус 40 - 45 °С и подвергали лиофильному высушиванию. Остаточная влажность составляла не более 5 %. Полученную лиофилизированную биомассу, содержащую не менее 5 ^c 10 ¹⁰ КОЕ/г, используют в качестве активного компонента лекарственных средств, стандартизуя наполнителем из расчета разовой дозы (5- 10) ^c 10 ⁸ КОЕ.

Пример 7.

Использование штамма Bifidobacterium bifidum 8 в функциональных и специализированных пищевых продуктах, в том числе, биологически активных добавках к пище. Полученную аналогично описанному в примере 6 методу лиофилизированную биомассу применяют в качестве основного ингредиента пробиотических биологически активных добавок к пище в различных товарных формах (порошки, капсулы и т.п.) из расчета 1x10 ⁸ - П10 ⁹ КОЕ в разовой дозе. Лиофилизированную биомассу бифидобактерий штамма Bifidobacterium bifidum 8 вносят в жидкие ферментированные продукты для заквашивания и сквашивания, либо для обогащения в ферментированные или не ферментированные продукты из расчета 10 ⁶ - 10 ⁷ КОЕ в 1 г готового продукта. Благодаря этому получаемые продукты могут быть отнесены к функциональным продуктам питания.

Пример 8. Полученную, как описано в примере 6, суспензию клеток штамма Bifidobacterium bifidum 8 в среде высушивания дозировали в пенициллиновые флаконы из расчета разовой дозы (5-10)х10 ⁸ КОЕ и лиофилизировали. Применение лиофилизированной биомассы в указанной разовой дозе 4 раза в день внутрь курсами от 8 до 32 дней у добровольцев мужчин и женщин в возрасте 45 лет, 61 год, 66 лет, 72 года, 93 года приводило к исчезновению выраженных болей в желудке, развившихся на фоне обострения хронического гастрита (без приема лекарственных препаратов); исчезновению проявлений дисбактериоза (дисбиоза) кишечника (метеоризм, боли в животе, нерегулярный стул, разжиженный стул, задержка стула); быстрому купированию симптомов ОРВИ (в течение 1 - 3 дней), особенно при приеме в ранние сроки заболевания; исчезновению лабиального герпеса; улучшению общего состояния, повышению физической, умственной активности, работоспособности, улучшению эмоционального состояния (исчезновение пониженного настроения, раздражительности, эмоциональной лабильности).

Пример 9.

Женщина, 57 лет. Многократные курсы химиотерапии в связи с раком яичников. На этом фоне выраженный дисбактериоз (дисбиоз) кишечника, боли в животе, прием любых продуктов сопровождается метеоризмом, диарейный синдром с водянистым стулом. Употребляла кефир, обогащенный бифидобактерими штамма Bifidobacterium bifidum 8 в количестве 10 ⁶ КОЕ в 1 мл в течение 4 дней, первые два дня по 300 мл в день, последующее дни по 200 мл в день. Общий объем кефира 1 литр. Диарея полностью исчезла на второй день приема кефира, на четвертый день стул приобрел оформленную консистенцию, исчезли боли в животе, значительно уменьшился метеоризм, улучшилось общее состояние.

Библиография:

1. Терешкова Е.А., Кареткин Б. А., Дорошенко Е.О., Ланских А.Г. Сорбированные пробиотики. Механизм действия. - М.: ТД ДеЛи, 2020 - 36 с.

2. Иванова Е.В. Роль бифидофлоры в ассоциативном симбиозе кишечной миробиоты человека. Дисс. д.м.н. Оренбург. 2018:295.

3. Turroni F., Duranti S., Milani C., Lugli G.A., van Sinderen D., Ventura M. Bifidobacterium bifidum: A Key Member of the Early Human Gut Microbiota. //Microorganisms. 2019, 9; 7(11).

4. Ruas-Madiedo P., Gueimonde M., Femandez-Garcia M., de los Reyes-Gavilan C.G., Margolles A. Mucin degradation by Bifidobacterium strains isolated from the human intestinal microbiota. //Appl. Environ. Microbiol. 2008, 74, 1936-1940. Turroni F., Milani C., van Sinderen, D., Ventura, M. Genetic strategies for mucin metabolism in Bifidobacterium bifidum PRL2010: An example of possible human-microbe co-evolution. Gut Microbes 2011, 2, 183-189. Rokhsefat S., Lin A.F., Comelli E.M. Mucin-Microbiota Interaction During Postnatal Maturation of the Intestinal Ecosystem: Clinical Implications. Dig. Dis. Sci. 2016, 61, 1473- 1486. Gibson G.R., Roberfroid M.B. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics // The Journal of Nutrition. 1995, Vol. 125, p. 1401— 1412 Roberfroid M., Gibson G.R., Hoyles L., et al. Prebiotic effects: metabolic and health benefits. //Br J Nutr. 2010, Vol. 104, S. 2, S1-S63 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume 5: The Actinobacteria Editors: Whitman, W., Goodfellow, M., Kampfer, P., Busse, H.-J., Trujillo, M., Ludwig, W., Suzuki, K.-L, Parte, A. (Eds.) 2012 Karetkin B. A., Guseva E. V., Evdokimova S. A. et al. A quantitative model of Bacillus cereus ATCC 9634 growth inhibition by bifidobacteria for synbiotic effect evaluation // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2019. Vol. 35. P. 89 Lo T.S., Borchardt S.M. Antibiotic-associated diarrhea due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus // Diagnostic microbiology and infectious disease. 2009. Vol.63 (4), P. 388-389 Guglielmetti S., Tamagnini L, Mora D., Minuzzo M., Scarafoni A., Arioli S., Heilman J., Karp M., Parini C. Implication of an outer surface lipoprotein in adhesion of Bifidobacterium bifidum to Caco-2 cells. Applied and environmental microbiology, 2008, 74(15), 4695-4702 Gonzalez-Rodriguez I., Sanchez B., Ruiz L., Turroni F., Ventura M., Ruas-Madiedo P., Gueimonde M., Margolles A. Role of extracellular transaldolase from Bifidobacterium bifidum in mucin adhesion and aggregation. Applied and environmental microbiology, 2012, 78(ll), 3992-3998. Ruiz L., Margolles A., Sanchez B. Bile resistance mechanisms in Lactobacillus and Bifidobacterium. //Frontiers in microbiology, 2013, 4, 396 Перечень последовательностей <160> 9

<210> 1

<211 > 1534

<212> DNA

<213 > Bifidobacterium bifidum

<400> 1 ttttttgtgg agggttcgat tctggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg 60 caagtcgaac gggatccatc aagcttgctt ggtggtgaga gtggcgaacg ggtgagtaat 120 gcgtgaccga cctgccccat gctccggaat agctcctgga aacgggtggt aatgccggat 180 gttccacatg atcgcatgtg attgtgggaa agattctatc ggcgtgggat ggggtcgcgt 240 cctatcagct tgttggtgag gtaacggctc accaaggctt cgacgggtag ccggcctgag 300 agggcgaccg gccacattgg gactgagata cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg 360 gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga tgcagcgacg ccgcgtgagg gatggaggcc 420 ttcgggttgt aaacctcttt tgtttgggag caagccttcg ggtgagtgta cctttcgaat 480 aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg tagggcgcaa gcgttatccg 540 gatttattgg gcgtaaaggg ctcgtaggcg gctcgtcgcg tccggtgtga aagtccatcg 600 cttaacggtg gatctgcgcc gggtacgggc gggctggagt gcggtagggg agactggaat 660 tcccggtgta acggtggaat gtgtagatat cgggaagaac accgatggcg aaggcaggtc 720 tctgggccgt cactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc 780 tggtagtcca cgccgtaaac ggtggacgct ggatgtgggg cacgttccac gtgttccgtg 840 tcggagctaa cgcgttaagc gtcccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct aaaactcaaa 900 gaaattgacg ggggcccgca caagcggcgg agcatgcgga ttaattcgat gcaacgcgaa 960 gaaccttacc tgggcttgac atgttcccga cgacgccaga gatggcgttt cccttcgggg 1020 cgggttcaca ggtggtgcat ggtcgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1080 ccgcaacgag cgcaaccctc gccccgtgtt gccagcacgt tatggtggga actcacgggg 1140 gaccgccggg gttaactcgg aggaaggtgg ggatgacgtc agatcatcat gccccttacg 1200 tccagggctt cacgcatgct acaatggccg gtacagcggg atgcgacatg gcgacatgga 1260 gcggatccct gaaaaccggt ctcagttcgg atcggagcct gcaacccggc tccgtgaagg 1320 cggagtcgct agtaatcgcg gatcagcaac gccgcggtga atgcgttccc gggccttgta 1380 cacaccgccc gtcaagtcat gaaagtgggc agcacccgaa gccggtggcc taaccccttg 1440 tgggatggag ccgtctaagg tgaggctcgt gattgggact aagtcgtaac aaggtagccg 1500 taccggaagg tgcggctgga tcacctcctt tcta 1534 <210> 2 <211> 23 <212> DNA

<213 > Artificial Sequence <400> 2 tggaattctt gcccatgtag acg 23

<210> 3 <211> 22 <212> DNA

<213 > Artificial Sequence <400> 3 attcagcgac gaactggcac ag 22

<210> 4 <211> 534 <212> PRT

<213 > Bifidobacterium bifidum <400> 4

Met Lys Phe Lys Lys Leu Phe Ala Gly Val Ala Ala Ala Ala Thr Leu 1 5 10 15

Leu Ala Gly Met Ala Phe Gly Thr Gly Ala Ala Asn Ala Ala Glu Thr 20 2 5 30

Thr Val Asp Thr Ala Ala Thr Val Thr Phe Lys Ala Ser Lys Glu Lys

35 40 45

Gin Leu Thr Ser Ala Gin Leu Ser Ala Tyr Lys lie Ala Asp Tyr Val

50 55 60

Asn Tyr Gly Thr Ala Lys Thr Pro Val Tyr Gly Val Lys Thr Ala Ala 65 70 75 80

Gly Ala Asn Arg Thr Lys Leu Ala Ala Ala Leu Thr Ala Ala Gly Phe

85 90 95

Gin Asn Val Pro lie Asp Gly Thr Thr Asp Leu Met Ala Trp Ala Met

100 105 110

Asn Gin Lys Thr Thr Thr Asp Thr Asp Gly Thr Val Thr Gin Val Gin

115 120 1 25 Phe Asp Gin Ser Glu Thr Arg Pro Trp Asn Asn Pro Ser Val Thr Arg

130 135 140

Lys Phe Ala Asp Ala Leu Gin Ala Gly Asn Pro Phe Thr Ala Thr Ala

145 150 155 160

Asp Pro Phe Val Leu Asn Lys Ala Thr Gly Asn Asp Thr Asp Gly Trp

165 170 175

Thr Ala Thr Asn Lys Thr Ala Leu Thr Ala Gly Val Tyr Leu Phe Leu

180 185 190

Asp Gly Asn Ala Ser Thr Asp Thr Leu Thr Gin Ala Val Pro Met lie

195 200 205

Val Ser Thr Gly Ser Val Asp Ala Glu Gly Val Leu Ser Leu Gly Asp

210 215 220

Ser Thr Ala Glu Val Asp Met Lys Ser Thr Val Ser Gly Thr Gin Thr

225 230 235 240

Lys Ser Thr Thr Ser Lys Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Pro Phe

245 250 255

Glu Leu Gly Tyr Thr lie Pro Asn Pro Val Pro Thr Asp Phe Thr Leu

260 265 270

Gin Phe Lys Asp Val Pro Ser Lys Gly Leu Thr Val Asn Phe Ala Ser

275 280 285

Leu Thr Val Lys Ala Gly Asp Lys Val Leu Thr Asp Thr Asp Tyr Thr

290 295 300

Val Glu Asn Asn Leu Thr Asp Asn Lys Gly Asp Gly Thr Asn Thr Phe

305 310 315 320

Val Val Lys He Thr Asp Pro Ala Lys Tyr Ala Gly Lys Gin He Thr

325 330 335

He Thr Tyr Asn Ala Thr Val Asn Asp Glu Ala Glu Thr Val Glu Gly

340 345 350

Gin Asp Tyr His Ala Val Thr Asn Lys Leu Val Gly Asn Asp Gly Thr

355 360 365

Pro He Pro Gly Thr Glu Thr Leu Thr Lys He Phe Gly Phe Lys Phe

370 375 380

Thr Lys Val Asn Ala Gin Gly Glu Ala Val Glu Gly Ala Lys Phe Thr

385 390 395 400 Leu Ser Val Ala Lys Asp Gin Asn Gly Val Leu Pro Asn Ser Asp Lys

405 410 415

Tyr Pro Leu Glu Val Thr Ser Gly Ala Asn Gly Val Val Lys Phe Asp 420 425 430

Gly Leu Lys Ala Gly Ser Tyr Thr Val Thr Glu Thr Ala Val Ala Asp 435 440 445

Gly Tyr Gin Asp Phe Lys Ala Ser Phe Thr Val Ala lie Asp Glu Asn 450 455 460

Gly Lys Val Thr Phe Ala Gly Thr Asp Ser Trp Gly Leu Ala Pro Lys 465 470 475 480

Gly Ser Ala Asp Asp Tyr Lys Val Thr Asn Val Lys Ser Val Phe Glu

485 490 495

Leu Pro Lys Thr Gly Ala Ala Gly lie Ala Leu Phe Val Val He Ala 500 505 510

Ala Leu Leu Gly Gly Ala Ala Ala Thr Val Tyr Ala Lys Ser Arg Arg 515 520 525

Thr Ser Arg Ala Leu Arg 53 0

<210> 5 <211> 596 <212> PRT

<213 > Bifidobacterium bifidum <400> 5

Met Gin Ser Met Ser Phe Ala Ser Thr Ala Arg Lys Val Thr Ala Phe

1 5 10 15

Ala Ala Ala Ala Ala Thr Leu Leu Ala Leu Gly Ala Cys Gly Asn Ser

20 25 30

Asn Asn Gly Ser Ala Gly Asn Asn Gly Ala Lys Ser Thr Ser Glu Pro

35 40 45

Gin Glu Gly Val Pro Thr Asn Tyr Thr Gly Ser Phe Pro Met Pro Asp 50 5 5 60

Pro Gly Lys Ala Tyr Asn Asn Pro Lys Asp Arg Gly Glu Leu Lys Gin 65 70 75 80 Gly Gly Thr Leu Thr Leu Pro lie Thr Glu lie Gly Pro Asn Trp Asn

85 90 95

Ala He Asp Val Asn Gly Asn Thr Val Tyr Met Ser Gly Leu Trp Arg

100 105 110

Phe Tyr Met Pro Cys He Trp Glu Tyr Pro Ala Asp Gly Ser Leu Glu

115 12 0 125

Asn He Lys Pro Asn Thr Asn Tyr Val Thr Lys Val Glu Gin Thr Ser

130 135 140

Asp Ser Pro Glu Thr Val Val Phe Thr He Asn Asp Lys Ala Ser Trp

145 150 155 160

Asn Asp Gly Thr Pro He Thr Trp Lys Asp Phe Glu Ser Thr Trp Lys

165 170 175

Val Gin Ser Gly Lys Ser Asp Lys Phe Thr Pro Ala Leu Thr Thr Gly

180 185 190

Tyr Asp Gin He Lys Ser Val Thr Lys Gly Asp Thr Asp Lys Gin Ala

195 200 205

Val Val Thr Phe Glu Lys Asp Phe Tyr Pro Tyr Gin Ser Leu Phe Asn

210 215 220

Leu Leu Tyr Pro Ser Glu Ala Leu Thr Gly Asp Asp Thr Lys Asp Gly

225 230 235 240

Asp Thr Phe Ser Lys Gly Trp Ser Asn Asp Ser His Ser Asp Lys Trp

245 250 255

Gly Ala Gly Pro Phe Val Val Ser Lys Ser Ser Asp Ser Glu Val Thr

260 265 270

Phe Thr Pro Asn Pro Lys Trp Trp Gly Asp Lys Pro Leu Leu Asp Lys

275 280 285

Val Val Leu Lys Gin Met Glu Pro Ser Ala Ala Met Asn Ala Phe Lys

290 295 300

Asn Gly Glu He Asp Ala Val Gly Ala Ser Asp Ala Glu Ser Met Thr

305 310 315 320

Ser Ala Lys Thr Val Lys Asp Ala Tyr Leu Arg Arg Ser Tyr Asp Ser

325 330 335

Gly Val Tyr Thr Leu Thr He Asn Thr Lys Asn He Pro Leu Glu Val

340 34 5 3 50 Arg Lys Ala Phe Val Gin Gly Val Asp Arg Ser Gin Leu Gin Lys lie 355 360 365

Asp Phe Gin Gly lie Glu Trp Thr Glu Lys Thr Pro Gly Ser Leu He 370 375 380

Leu Pro Gin Phe Gin Asp Gly Tyr Glu Asp Asn Met Pro Ala Glu Ser 385 390 395 400

Lys Tyr Ser Thr Ala Asn Ala Thr Lys Thr Leu Glu Asp Ala Gly Tyr

405 410 415

Lys Lys Asn Ser Asp Gly Tyr Tyr Glu Lys Gly Gly Lys Val Ala Ala 420 425 430

He Thr Tyr Thr Thr Phe Ser Asp Ser Ala Ser Thr Lys Ala Lys Ala 435 440 445

Thr Ala He Gin Lys Met Ala Lys Thr Val Gly He Lys Val Ser He 450 455 460

Asp He Lys Ala Ser Asn Thr Phe Ser Asp Thr Val Ser Ser Gly Asn 465 470 475 480

Trp Asp Met He Gly Leu Gly Trp Ser Ala Ser Asp Pro Phe Gly Tyr

485 490 495

Ala Ser Ser Ala Tyr Gin Leu Tyr Gly Ser Lys Ser Glu Ser Asn Phe 500 505 510

Ser Phe Thr Gly Thr Asp Glu He Asp Lys Glu Leu Glu Ser He Pro 515 520 525

Gly He Lys Asp Ser Thr Lys Ala He Ala Gin Phe Asn Lys Ala Glu 530 535 540

Lys Glu Ala Gin Lys Leu Tyr Ala Gin He Pro Phe Glu Asn Gly Gin 545 550 555 560

He Thr Val Ala Val Lys Lys Gly Leu Ala Asn Tyr Gly Pro Ala Gly

565 570 575

Tyr Ser Ser Gly Ala Arg Val Met Val Thr Val His Pro Glu Asn Leu 580 585 590

Gly Trp Glu Lys 595

<210> 6 <211 > 367 <212> PRT

< 213 > Bifidobacterium bifidum <400> 6

Met Thr Glu Ala Thr Gin Arg Thr Ser Asp Asn Gly Val Ser lie Trp

1 5 10 15

Leu Asp Asp Leu Ser Arg Thr Arg lie Glu Ser Gly Ser Leu Gin Glu 20 25 30

Leu He Lys Asp Lys Asn Val Val Gly Val Thr Thr Asn Pro Ser He 35 40 45

Phe Gin Lys Ala Leu Ser Gin Val Gly Pro Tyr Asp Ala Gin Leu Lys 50 55 60

Glu Leu Gly Lys Val Asp Val Glu Thr Ala Val Arg Glu Leu Thr Thr 65 70 75 80

Thr Asp Val Arg Asn Ala Thr Asp He Phe Arg Glu He Ala Glu Ala

85 90 95

Thr Asp Phe Val Asp Gly Arg Val Ser He Glu Val Asp Pro Arg Leu

100 105 110

Ala His Asp Thr Glu Asn Thr Glu Lys Gin Ala Val Glu Leu Trp Glu

115 120 125

Lys Val Asn Arg Pro Asn Ala Met He Lys He Pro Ala Thr Leu Glu

130 135 140

Gly Leu Pro Ala He Thr Ala Thr Leu Ala Lys Gly He Ser Val Asn 145 150 155 160

Val Thr Leu He Phe Ser Leu Glu Arg Tyr Glu Gin Val He Asp Ala

165 170 175

Tyr He Glu Gly He Ala Gin Ala Ala Ala Asn Gly His Asp Leu Lys

180 185 190

His He Gly Ser Val Ala Ser Phe Phe Val Ser Arg Val Asp Thr Ala 195 200 205

Val Asp Lys Leu Leu Glu Ala Asn Gly Ser Asp Glu Ala Lys Ala Leu

210 215 220

Glu Gly Lys Ala Ala Val Ala Asn Ala Arg Leu Ala Tyr Glu Leu Phe

225 230 235 240

Glu Lys Lys Phe Ala Ala Asp Pro Arg Trp Ala Asp Leu Ala Ala Lys

245 250 255 Gly Ala Lys Val Gin Arg Pro Leu Trp Ala Ser Thr Gly Thr Lys Asn 260 265 270

Ala Ala Tyr Ser Asp Cys Lys Tyr Val Asp Glu Leu Val Ala Lys His 275 280 285 lie Val Asn Thr Met Pro Glu Lys Thr Leu Asn Ala Leu Ala Asp His 290 295 300

Gly Asn Gly Ala Pro Ser lie Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Ser His Ala 305 310 315 320

Val He Asp Lys Leu Ala Glu Leu Gly He Asn Leu Lys Asp Val Thr

325 330 335

Asp Lys Leu Glu Ala Asp Gly Val Ala Ala Phe He Lys Ser Trp Asp 340 345 350

Ser Val Leu Ala Asp Val Gin Ser Gly He Asp Arg Val Asn Ala 355 360 365

<210> 7 <211 > 1931 <212> PRT

< 213 > Bifidobacterium bifidum <400> 7

Met Arg Lys Arg Val Val Ser Val Ala Leu Ala Val Ala Leu Ala Val 1 5 10 15

Ala Pro Leu Gly Val Gly Ser Thr Ala Ser Ala Ala Pro Leu Ser Ala

20 25 30

Ser Asp Leu Gin Thr Leu Ala Leu Arg Ser Ala Ala Ser Ser Asn Asp 35 40 45

Ala Asn Ala Asn Asp Val Ala Thr Val Ala Asp Asp Ala Ala Val Asn

50 55 60

Gly Trp Thr He Asp Arg Asn Thr Ala Lys Gly Gly Glu He Leu Ala 65 70 75 80

Ala Gly Thr Gly Asp Tyr Ala Gly Trp Thr His Phe Lys Ser Thr Ser

85 90 95

Ala Asn Gly Asn Ala Thr Ser Ser Ser Gly Tyr Pro Ala Val Ala He

100 105 110 Ser Gly Lys Thr lie Asp Leu Thr Arg Ala Gly Glu Phe Ser lie Lys 115 120 125

Val Lys Ser Pro Gin Ala Gly Ser Ala Asn Arg Phe Gly Phe Tyr Leu 130 135 140

Gly Tyr Lys Asp Pro Gly Asn Ala Leu Phe Leu Gly Tyr Asp Lys Gly

145 150 155 160

Gly Trp Phe Trp Gin Lys Tyr Val Asp Gly Asn Gly Asp Trp Tyr Asn

165 170 175

Gly Thr Arg Val Ala Ala Pro Ala Ala Asn Ala Glu He Thr Val Asn 180 185 190

Val Ser Trp Thr Ala Ala Lys Val Ala Thr Leu Thr He Asp Gly Gin 195 200 205

Lys Ala Phe Asp Val Asp Tyr Ser Ser Met Thr Ala Leu Thr Asn Lys 210 215 220

Leu Ala Met Lys Ala Gly Ser Tyr Ser Gly Thr Ser Glu Val Thr Asp 225 230 235 240

Val Tyr Phe Lys Asn Phe Thr Val Gly Glu Val Ala Lys His Asn Val

245 250 255

Thr Gly Lys Val Val Asp Ala Ser Gly Ala Ala He Ala Gly Ala Glu 260 265 270

Val Val Thr Gly Lys Asn Ser Ala Thr Thr Ala Ala Asp Gly Thr Phe 275 280 285

Thr Leu Thr Gly Leu Ala Ala Gly Asp Tyr Thr Leu Thr Val Ser Ala

290 295 300

Glu Gly Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Val Thr Val Ala Asp Gly Asn

305 310 315 320

Ala Ser Val Gly Asn He Thr Leu Asn Lys Ser Ala Glu Val Ala Thr

325 330 335

Glu Thr Leu Ser Thr Ala Ala Met Asp Val Arg Val Lys Lys Asn Phe 340 345 350

Pro Ser Val Tyr Asp Tyr Thr Met Lys Lys Phe Gly Gly Lys He Met 355 360 365

Tyr Gly Gin Pro Lys Asp Val Arg Val He Thr He Asn Gly Thr Asp 370 375 380 Val Thr Leu Lys Asp Ser Asp Val Thr Phe Lys Lys Val Ser Ala Thr

385 390 395 400

Glu Ala Gin Tyr Thr Leu Asn Val Lys Ser Gly Asn Lys lie Asn Ala

405 410 415

Val Val Thr Val Gin lie Lys Val Val Asp Asn Thr Leu Lys Leu Asn

420 425 430

Val Thr Lys He Val Asn Lys Ala Asp Asp Ala Lys Thr Glu Ala Glu

435 440 445

Glu Asn Pro Val Gin Thr He Ala Phe Pro Asn Gin Ser Leu He Ser

450 455 460

Val Arg Ser Gly Gin Asp Gly Ala Gin Phe Thr Gly Ala Arg Met Ser

465 470 475 480

Ser Asp Thr Ala Arg Pro Gly Asp Thr Asn Phe Gly He Thr Ala Asp

485 490 495

Thr Thr Val Gly Asn Ala Asn Asp Tyr Thr Tyr Gly Phe Val Ser Gly

500 505 510

Asn Gly Leu Ser Ala Gly Leu Trp Ser Asn Ser Glu His Asp Gly Thr

515 520 525

Thr Val Gly Asn Thr Val Ala Gly Gly Ala Arg Asn Thr Arg Val Leu

530 535 540

Thr Ser Thr Gin Lys Val Gly Lys Ala Thr Ser Phe Gly Leu Gly Thr

545 550 555 560

Ala Pro Trp Tyr Tyr His Arg Val Val Thr Asp Thr Lys Lys Arg Thr

565 570 575

Tyr Thr Val Glu Glu Thr Asp Met Pro Lys Met Ala Val Ala He Ala

580 585 590

Gly Asp Glu Asn Glu Asp Gly Thr Val Asn Trp Glu Asp Gly Ala He

595 600 605

Ala Tyr Arg Asp He Met Asn Asn Pro Tyr Lys Ser Glu Glu Val Pro

610 615 620

Glu Leu Val Ala Trp Arg He Ala Met Asn Phe Gly Ser Gin Ala Gin

625 630 635 640

Asn Pro Phe Leu Thr Thr Leu Asp Asn Val Lys Lys Val Ala Leu Asn

645 650 655 Thr Asp Gly Leu Gly Gin Ser Val Leu Leu Lys Gly Tyr Gly Asn Glu

660 665 670

Gly His Asp Ser Gly His Pro Asp Tyr Gly Asp lie Asn Thr Arg Ala

675 680 685

Gly Gly Ala Ala Asp Met Asn Thr Leu Met Glu Lys Gly Thr Glu Tyr

690 695 700

Gly Ala Arg Phe Gly Val His Val Asn Ala Ser Glu Met Tyr Pro Glu

705 710 715 720

Ala Lys Ala Phe Ser Glu Asp Met Val Arg Arg Asn Ser Ser Gly Gly

725 730 735

Leu Ser Tyr Gly Trp Asn Trp Leu Asp Gin Gly lie Gly He Asp Gly

740 745 750

He Tyr Asp Leu Ala Ser Gly Met Arg Lys Ser Arg Phe Ala Asp Leu

755 760 765

Lys Ser Lys Val Gly Asp Asn Met Asp Phe He Tyr Leu Asp Val Trp

770 775 780

Gly Asn Asn Thr Ser Gly Ala Glu Asp Ser Trp Glu Thr Arg Lys Met

785 790 795 800

Ser Gin Met He Asn Gin Asn Gly Trp Arg Met Thr Thr Glu Trp Gly

805 810 815

Ala Gly Asn Glu Tyr Asp Ala Thr Phe Gin His Trp Ala Ala Asp Leu

820 825 830

Thr Tyr Gly Gly Ser Gly Met Lys Gly Glu Asn Ser Gin Val Met Arg

835 840 845

Phe Leu Arg Asn His Gin Lys Asp Ser Trp Val Gly Asp Tyr Pro Ser

850 855 860

Tyr Gly Gin Ala Ala Asn Ala Pro Leu Leu Gly Gly Tyr Ser Met Lys

865 870 875 880

Asp Phe Glu Gly Trp Gin Gly Arg Asn Asp Tyr Ala Ala Tyr He Arg

885 890 895

Asn Leu Tyr Thr His Asp Val Ser Thr Lys Phe He Gin His Phe Lys

900 905 910

Val Val Arg Trp Val Asn Ser Pro Leu Asp Ala Thr Ser Val Lys Asp

915 92 0 9 25 Ala Ser Val Asn Asn Gly Asn Glu Gin lie Thr Leu Lys Asp Asp His

930 935 940

Gly Asn Val Val Val Leu Ser Arg Gly Ser Asn Asp Thr Asn Asn Gly

945 950 955 960

Ala Tyr Arg Asn Arg Thr lie Thr Leu Asn Gly He Thr Val Ala Ser

965 970 975

Gly Ala Val Ser Pro Gly Asn Ser Asn Thr Val Lys Gly Thr Glu Ser

980 985 990

Tyr Leu Leu Pro Trp Leu Trp Asp Val Asn Thr Gly Lys Leu Val Lys

995 1000 1005

Ser Ser Asp Glu Lys Leu Tyr His Trp Asn Thr Gin Gly Gly Thr Thr

1010 1015 1020

Glu Trp Thr Leu Pro Lys Asp Trp Gin Asn Leu Ala Ser Val Lys Val

1025 1030 1035 1040

Tyr Gin Leu Thr Asp Gin Gly Lys Thr Asn Glu Lys Thr Val Ala Val

1045 1050 1055

Ser Gly Gly Lys He Ser Leu Thr Ala Glu Ala Glu Thr Pro Tyr Val

1060 1065 1070

Val Thr Lys Gly Ser Glu Lys Gin He Ser Val Lys Trp Ser Glu Gly

1075 1080 1085

Met His Val Val Asp Ala Gly Phe Asn Gly Gly Gin Asn Thr Leu Lys

1090 1095 1100

Asp Asn Trp Ala Val Ser Gly Thr Gly Lys Ala Glu Val Glu Gly Thr

1105 1110 1115 1120

Asn Asn Ala Met Leu Arg Leu Thr Gly Asp Val Lys Val Ser Gin Lys

1125 1130 1135

Leu Thr Asp Leu Thr Ala Gly Lys Arg Tyr Ala He Tyr Val Gly Val

1140 1145 1150

Asp Asn Arg Thr Asn Ser Pro Ala Lys He Thr Val Thr Asn Gly Thr

1155 1160 1165

Lys Val Leu Ala Thr Asn Glu Thr Gly Lys Ser He Ala Lys Asn Tyr

1170 1175 1180

He Lys Ala Tyr Gly His Asn Thr Tyr Ser Asn Thr Glu Gly Gly Ser

1185 1190 119 5 1200 Ser Туг Phe Gin Asn Met Tyr Val Trp Phe Val Ala Pro Glu Ser Gly 1205 1210 1215

Asp Val Lys Val Thr Leu Ser His Ser Gly Ala Cys Asp Asn Thr Asp 1220 1225 1230

His Val Tyr Phe Asp Asp Val Arg Val Leu Glu Asn Gly Tyr Lys Gly 1235 1240 1245

Leu Thr Leu Asn Ala Asp Gly Thr Leu Lys Thr Leu Thr Asn Asp Phe 1250 1255 1260

Glu Asp Asn Ala Gin Gly lie Trp Pro Phe Val Val Ser Gly Ser Glu 1265 1270 1275 1280

Gly Val Glu Asp Asn Arg lie His Leu Ser Glu Leu His Ala Pro Phe 1285 1290 1295

Thr Gin Ala Gly Trp Asp Val Lys Lys Met Asp Asp Val Leu Asp Gly 1300 1305 1310

Lys Trp Ser Val Lys Ala Asn Gly Leu He Gin Lys Gly Thr Leu He 1315 1320 1325

Tyr Gin Thr He Pro Gin Asn Val Lys Leu Glu Pro Gly Glu Thr Tyr 1330 1335 1340

Lys Val Ser Phe Lys Tyr Gin Ser Gly Ser Asp Asp He Tyr Ala He 1345 1350 1355 1360

Ala Thr Gly Asp Gly Glu Tyr Asn Ala Ser Thr Val Lys Leu Thr Asn 1365 1370 1375

Leu Lys Lys Ala Leu Gly Glu Asp Gly Thr Ala Glu Phe Glu He Thr 1380 1385 1390

Gly Ser He Thr Gly Asp Ser Trp Phe Gly He Tyr Ser Thr Ser Thr 1395 1400 1405

Ala Pro Asp Leu Gin Asn Thr Ser Asp Ser Ala Ala Ala Phe Gly Gly 1410 1415 1420

Tyr Lys Asp Phe Val Leu Asp Asp Leu Lys Val Glu His Val Ala Ser 1425 1430 1435 1440

Ala Glu Arg Thr Lys Ala Asp Ala Glu Ala Lys Leu Lys Glu Val Lys 1445 1450 1455

Asp Thr Tyr Asn Gly Lys Ser Gly Asp Tyr Ser Ala Glu Val Trp Thr 1460 1465 1470 Thr Туг Val Asn Thr Val Ala Glu lie Glu Ala Leu lie Ala Lys Asp

1475 1480 1485

Lys Pro Asp Tyr Thr Thr Ala Tyr Asn Lys Ala Val Ala Leu Ala Glu

1490 1495 1500

Tyr Met Lys Asn Ala Pro Gly Asp Asp Ser Asn Asp Ala Tyr Asp Val

1505 1510 1515 1520

Ala Thr Asp Ala Tyr Thr Val Glu Ala Gly Ser Gin Gin Ala Leu Ser

1525 1530 1535

Gly Gly Asn Glu Gly Pro Ala Ser Leu Ala Gin Asp Gly Asn Ala Gly

1540 1545 1550

Thr His Trp His Thr Ser Trp Ser Ala Asn Ala Val Ser Ala Gly Thr

1555 1560 1565

Ala Trp Tyr Gin Phe Asn Leu Asn Glu Pro Thr Thr He Asp Gly Leu

1570 1575 1580

Arg Tyr Met Ala Arg Ser Gly Ser Ala Asn Ala Asn Gly Lys He Lys

1585 1590 1595 1600

Lys Tyr Lys He Thr Leu Thr Leu Ser Asp Gly Thr Thr Lys Asp Val

1605 1610 1615

Val Thr Asn Gly Thr Phe Thr Thr Thr Ser Gly Val Trp Gin Lys Val

1620 1625 1630

Lys Phe Asp Ala Val Lys Asn Val Thr Lys Val Arg He Thr Ala Leu

1635 1640 1645

Glu Thr Ala Gly Gin Ser Ala Gly Glu Val Asn Thr Tyr Ala Ser Ala

1650 1655 1660

Ala Glu Leu Arg Val Thr Thr Val Arg Asp Val Pro Ser Thr Glu Val

1665 1670 1675 1680

Lys Val Asn Lys Cys Asp Leu Gin Asn Leu Tyr Asp Asp Ala Ser Ala

1685 1690 1695

Leu Thr Glu Ala Thr Tyr Thr Ala Asp Thr Trp Lys Val Leu Val Ala

1700 1705 1710

Lys Arg Asp Ala Ala Lys Lys Val Leu Asp Asp Glu Asn Ala Thr Ala

1715 1720 1725

Tyr Asp Val Ala Leu Ala Tyr Gin Asn Leu Lys Asp Ala He Ala Ala

1730 1735 1740 Leu Glu Glu Arg Val Asp Thr Ser Lys Leu Ala Gly Leu Val Ala Asp 1745 1750 1755 1760

Ala Glu Lys Leu Lys Glu Ser Ala Tyr Thr Lys Asp Ser Trp Ala Ala 1765 1770 1775

Phe Lys Lys Ala Leu Asp Ala Ala Lys Ala Val Leu Asn Asn Ala Asn 1780 1785 1790

Ala Thr Lys Ala Asp Val Asp Ala Ala Tyr Asn Ala Leu Asn Ala Ala 1795 1800 1805

Met Lys Ala Leu Lys Pro Ala Ser Ser Lys Pro Thr Pro Asn Pro Glu 1810 1815 1820

Thr Thr Asp Lys Ser Lys Leu Gin Ala Thr lie Asp Gin Ala Lys Ala 1825 1830 1835 1840

Leu Asp Leu Ser Gly Tyr Thr Lys Lys Ser Val Gin Ala Val Arg Asp 1845 1850 1855

Ala Leu Ala Lys Ala Gin Ser Val Leu Ala Asp Asp Asn Ala Thr Gin 1860 1865 1870

Ala Asp lie Asp Ala Ala Gin Lys Ala Leu Ala Asp Ala He Ala Ala 1875 1880 1885

Leu Glu Lys Ala Asp Ala Asn Gly Asn Ala He Ser Lys Thr Gly Ala 189 0 189 5 1900

Asn Val Ala Val He Gly Met Ala Gly Met Met Leu Val Ala Ala Ala 1905 1910 1915 1920

Gly Ala Val Phe He Ala Arg Lys Arg Ala Glu

1925 1930

<210> 8 <211 > 316 <212> PRT

< 213 > Bifidobacterium bifidum <400> 8

Met Cys Thr Gly Val Arg Phe Ser Asp Asp Glu Gly Asn Met Tyr Phe 1 5 10 15

Gly Arg Asn Leu Asp Trp Ser Phe Ser Tyr Gly Glu Thr He Leu Val

20 25 30

Thr Pro Arg Gly Tyr Gin Tyr Asp Tyr Val Tyr Gly Ala Glu Gly Lys 35 4 0 45

Ser Glu Pro Asn Ala Val lie Gly Val Gly Val Val Met Val Asp Arg

50 55 60

Pro Met Tyr Phe Asp Cys Ala Asn Glu His Gly Leu Ala lie Ala Gly

65 70 75 80

Leu Asn Phe Pro Gly Tyr Ala Ser Phe Ala His Glu Pro Val Glu Gly

85 90 95

Thr Glu Asn Val Ala Thr Phe Glu Phe Pro Leu Trp Val Ala Arg Asn

100 105 110

Phe Asp Ser Val Asp Glu Val Glu Glu Ala Leu Lys Asn Val Thr Leu

115 120 125

Val Ser Gin Val Val Pro Gly Gin Gin Glu Ser Leu Leu His Trp Phe

130 135 140

He Gly Asp Gly Thr Arg Ser He Val Val Glu Gin Met Ala Asp Gly

145 150 155 160

Met His Val His His Asp Asp Val Asp Val Leu Thr Asn Gin Pro Thr

165 170 175

Phe Asp Phe His Met Glu Asn Leu Arg Asn Tyr Met Cys Val Ser Asn

180 185 190

Glu Met Ala Glu Pro Thr Thr Trp Gly Lys Ala Glu Leu Ser Ala Trp

195 200 205

Gly Ala Gly Val Ser Met His Gly He Pro Gly Asp Val Ser Ser Pro

210 215 220

Ser Arg Phe Val Arg Val Ala Tyr Thr Asn Thr His Tyr Pro Gin Gin

225 230 235 240

Asn Asn Glu Ala Ala Asn Val Ser Arg Leu Phe His Thr Leu Val Ser

245 250 255

Val Gin Met Val Asp Gly Met Ser Lys Met Gly Asn Gly Gin Phe Glu

260 265 270

Arg Thr Leu Phe Thr Ser Gly Tyr Ser Gly Lys Thr Asn Thr Tyr Tyr

275 280 285

Met Asn Thr Tyr Glu Asp Pro Ala He Arg Ser Phe Ala Met Ser Asp

290 295 300

Phe Asp Met Asp Ser Ser Glu Leu He Thr Ala Asp

305 310 315 <210> 9 <211 > 432 <212> PRT

< 213 > Bifidobacterium bifidum

< 400 > 9

Met Ala Ala lie Glu Ser Val Tyr Ala Arg Gin lie Leu Asp Ser Arg

1 5 10 15

Gly Asn Pro Thr Val Glu Val He Leu Asp Thr Glu Asp Gly Ala Glu 20 25 30

Gly Arg Gly Leu Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Glu Ala Glu Ala 35 40 45

Trp Glu Arg Arg Asp Gly Asp Lys Ser Val Tyr Gly Gly Lys Gly Val 50 5 5 60

Leu Asn Ala Val Lys Ala Val Asn Glu Val He Ala Pro Lys Val He 65 70 75 80

Gly Met Asp Ala Thr Asp Gin Arg Ala Leu Asp Asp Leu Met He Glu

85 90 95

Leu Asp Gly Thr Pro Asn Lys Gly Lys Leu Gly Ala Asn Ala He Leu

100 105 110

Gly Val Ser Leu Ala Ala Leu Tyr Ala Ser Ala Glu Ser Ala Glu Leu

115 120 125

Pro Leu Tyr Arg Tyr He Gly Gly Thr Asn Gly His He Leu Pro Val

130 135 140

Pro Asn Met Asn He Met Asn Gly Gly Ala His Ala Asp Phe Ala Thr 145 150 155 160

Asp He Gin Glu Tyr Met He Ser Pro Tyr Gly Phe Asp Thr Tyr Ser

165 170 175

Glu Ala Leu Arg Ala Gly Val Glu Val Tyr His Thr Leu Lys Asn Val

180 185 190

Leu Lys Lys Glu Gly Leu Asn Thr Gly Leu Gly Asp Glu Gly Gly Phe 195 200 205

Ala Pro Lys Met Lys Ser Asn Glu Asp Ser Leu Lys Tyr He Met Asp

210 215 220

Ala He Ser Ala Ala Gly Tyr Glu Pro Gly Lys Gin He Gly He Cys

22 5 2 30 235 24 0 Leu Asp Val Ala Ser Ser Glu Phe Tyr Asn Lys Glu Thr Gly Lys Tyr

245 250 255

Arg Phe Asp Gly Glu Glu Arg Asp Ser Ala Tyr Met Leu Asp Tyr Tyr

260 265 270

Glu Asn Leu lie Asn Glu Tyr Pro lie Val Ser He Glu Asp Pro Phe

275 280 285

Asn Glu Glu Gly Trp Glu Asp Trp Ala Glu He Thr Arg Arg Leu Gly

290 295 300

Asp Arg Leu Gin Phe Val Gly Asp Asp Leu Leu Val Thr Asn Pro Ala

305 310 315 320

Arg Leu Arg Lys Ala He Asp Met Gly Ala Ala Asn Ser Leu Leu Val

325 330 335

Lys Leu Asn Gin He Gly Ser Val Thr Glu Thr Leu Asp Ala He Glu

340 345 350

Leu Ala Thr Glu Asn Gly Tyr Thr Ser Met Val Ser His Arg Ser Gly

355 360 365

Glu Thr Pro Asp Thr Thr He Ser Asp Leu Ala Val Ala Lys Asn Thr

370 375 380

Arg Gin He Lys Thr Gly Ala Pro Ala Arg Gly Glu Arg Val Ala Lys

385 390 395 400

Tyr Asn Arg Leu Leu Glu He Glu Glu Glu Leu Gly Ser Thr Ala Gin

405 410 415

Tyr Ala Gly Tyr Ser Ala Phe Lys Ala Cys Lys Lys Tyr He Ala Lys 420 425 4 30