Titre : Composés bifonctionnels ciblant le récepteur du mannose 6- phosphate cation-indépendant

Domaine technique

[0001] La présente invention relève du domaine de la chimie thérapeutique. Elle concerne plus particulièrement des composés bifonctionnels comprenant 1/ au moins un analogue du mannose 6-phosphate (M6P) ciblant le récepteur du mannose 6-phosphate cation- indépendant (RM6P-CI) et 2/ un anticorps ou un fragment d’anticorps permettant de lier un antigène cible spécifique ou une molécule cible. L’invention concerne également le procédé de préparation desdits composés bifonctionnels et leur utilisation médicale, de type thérapeutique ou diagnostique.

Technique antérieure

[0002] La plupart des molécules thérapeutiques ciblant des protéines associées à des maladies neutralisent la cible en question, bloquant ainsi la fonction physiopathologique de leur cible. Cependant, les molécules thérapeutiques ont souvent peu d’effets sur les niveaux d’expression ou de dégradation de la cible. De plus, il existe encore de nombreuses protéines qui ne sont pas encore pharmacologiquement ciblées et dont la dérégulation et l'accumulation provoquent un état pathologique.

[0003] Ces dernières années, la dégradation ciblée des protéines impliquées dans diverses maladies est apparue comme une stratégie clé pour obtenir une efficacité thérapeutique. Pour la dégradation ciblée des protéines par l'activation du protéasome, des médicaments induisant la dégradation sont utilisés, tels que les chimères ciblant la protéolyse. Cependant la conception de ces chimères est complexe et la perméabilité cellulaire est limitée. De plus, comme le système ubiquitine-protéasome est intracellulaire, l'utilisation desdites chimères ne peut pas être appliquée aux protéines extracellulaires.

[0004] Une voie physiologique de dégradation des protéines est représentée par la voie endo-lysosomale. Les lysosomes sont les principaux compartiments de dégradation des cellules eucaryotes. En plus du protéasome, les lysosomes peuvent également dégrader des molécules autres que les protéines, comme les glycosaminoglycanes, les oligosaccharides et les lipides. Des molécules capables d’adresser les protéines pathologiques au lysosome pour y être dégradées ont donc été développées.

[0005] Le récepteur du mannose 6-phosphate cation-indépendant (RM6P-CI), une glycoprotéine transmembranaire de 300 kDa, représente la principale voie de transport et de tri des enzymes lysosomales portant le signal mannose 6-phosphate (M6P) jusqu'aux lysosomes. Le RM6P-CI joue également un rôle de médiateur de l'endocytose des ligands extracellulaires contenant du M6P (Gary-Bobo et al., 2007). Les protéines contenant du M6P, qui diffèrent des enzymes lysosomales et sont internalisées par le transport dépendant du RM6P-CI, comprennent le granzyme B, une protéase impliquée dans l'apoptose induite par les cellules T cytotoxiques, le virus de l'herpès simplex (HSV) et même le facteur inhibiteur de la leucémie, une protéine multifonctionnelle qui joue un rôle important dans la formation des neurones, des plaquettes et des os. La condition pour que les protéines atteignent le lysosome est donc la présence de M6P. Cependant, le M6P peut être déphosphorylé à cause des phosphatases sériques, perdant ainsi sa capacité à se lier au RM6P-CI (El Cheikh K. et al., 2016). Des enzymes lysosomales ont ainsi été modifiées afin d'augmenter considérablement le nombre de résidus de M6P, bien que ces résidus soient toujours dégradés par les phosphatases (Zhu Y., et al., 2009).

[0006] Des analogues du M6P ont été synthétisés dans lesquels le phosphate est remplacé par d’autres groupes permettant la reconnaissance par le RM6P-CI, sans être dégradés par les phosphatases. Les analogues du M6P désignent un composé un peu différent du composé M6P naturel mais qui présente une capacité de liaison élevée au RM6P-CI. Les analogues du M6P se sont révélés efficaces en améliorant le potentiel thérapeutique d’une enzyme lysosomale produite dans un système d'expression baculovirus/cellules d'insecte dépourvue du signal M6P (El Cheikh K. et al., 2016) et même d'une enzyme lysosomale qui porte déjà le M6P (Basile I. et al., 2018).

[0007] Les documents EP 2 448 600 B1 et EP 3 350 192 B1 ont décrit des analogues du M6P, dénommés AMFA (« Analogues synthétiques du Mannose 6-phosphate Fonctionnalisés en position Anomère »), qui présentent plusieurs avantages pour la fonctionnalisation de glycoprotéines, en particulier pour la fonctionnalisation d’enzymes lysosomales. En effet les analogues du M6P décrits dans ces documents sont de petite taille, sont peu immunogènes et peuvent être facilement greffés sur l’enzyme lysosomale. Ces analogues sont de plus modulables, d’une part au niveau de la longueur et de la structure du bras espaceur et d’autre part au niveau du groupement réactif terminal du bras espaceur en fonction du type de liaison désirée. Dans ces documents, les analogues du M6P sont plus particulièrement utilisés pour internaliser des enzymes lysosomales dans le lysosome de la cellule, afin que lesdites enzymes puissent jouer leur rôle physiologique.

[0008] Le document PCT/US2019/067228 a décrit des molécules bifonctionnelles obtenues en greffant un polypeptide sur un anticorps, ledit polypeptide comprenant un nombre d’analogues du M6P allant de 20 à 90. L’addition de ce polypeptide sur l’anticorps s’est avérée efficace pour augmenter l’internalisation des antigènes dans les cellules en culture par l’intermédiaire des récepteurs du M6P. Le devenir des anticorps couplés au polypeptide après leur entrée cellulaire n’est pas analysé.

[0009] Le document PCT/IB2021/050922 décrit des composés bifonctionnels dans lesquels des analogues du M6P (M6Pa) ont été couplés à des ligands antagonistes spécifiques des facteurs PCSK9 et FHR3 afin de diminuer les concentrations extracellulaires de ces facteurs. L’internalisation cellulaire des antagonistes-M6Pa complexés aux facteurs ciblés est suivie d’une dégradation dans les lysosomes. Le couplage des analogues du M6Pa sur des anticorps n’est pas envisagé dans ce document et le devenir des antagonistes-M6Pa après leur entrée cellulaire n’est pas analysé.

[0010] Les Inventeurs ont maintenant mis au point de nouveaux composés bifonctionnels comprenant au moins un analogue du M6P lié de façon covalente à un anticorps.

Ces composés bifonctionnels présentent la propriété surprenante et inattendue de pouvoir être recyclés vers l’extérieur de la cellule après leur première entrée cellulaire par la voie des RM6P-CI. Cette propriété originale et inattendue permet d’envisager une réutilisation multiple du composé de l’invention par les cellules, notamment pour réduire/diminuer la concentration des antigènes extracellulaires solubles ou membranaires.

Résumé

[0011] Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un conjugué caractérisé en ce qu’il présente la formule générale (I) suivante

[Cheml] dans laquelle :

X est un groupement phosphonate -CH ₂ -P(O)(OZ) ₂ ou carboxylate -CH ₂ -C(O)(OZ) avec Z représentant indépendamment l’un de l’autre H (hydrogène), Na (sodium), Li (lithium), K (potassium) ou NH ₄ (ammonium); n est un entier allant de 0 à 2 ;

Li est un radical choisi dans le groupe comprenant *-O-N=**,

[Chem2]

[Chem3] avec * indiquant le point d’attachement de Li au groupe (O-CH ₂ -CH ₂ )n et ** indiquant le point d’attachement de Li à Yi ; ni est un entier allant de 1 à 20, et de préférence de 1 à 10,

Yi représente un anticorps Y ou un fragment d’anticorps Y comprenant au moins un domaine de liaison à l’antigène, ledit Yi formant liaison(s) covalente(s) avec Li.

[0012] Selon un deuxième aspect, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d’un conjugué de formule (I) tel que défini ci-dessus.

[0013] Selon un troisième aspect, la présente invention a pour objet un conjugué de formule (I) pour une utilisation médicale, de type diagnostique ou thérapeutique. Elle porte notamment sur un conjugué de formule (I) pour une utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique qui consiste à administrer un anticorps thérapeutique ou un fragment d’anticorps thérapeutique.

Brève description des dessins

[0014] D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels : Fig. 1

[0015] [Fig. 1 ] illustre le recyclage extracellulaire des conjugués de formule (I) de l’invention. L’analogue du M6P est représenté par le sigle AMFA. Le conjugué de formule (I) peut être nommé « AM FA- Anticorps ». L’anticorps est représenté par sa forme en Y, l’AMFA par une petite boule, et l’antigène par une forme de petit nuage.

Fig. 2

[0016] [Fig. 2] illustre le schéma de synthèse général des conjugués de formule (I) dans laquelle est égal à 1 , en fonction de la signification du groupe chimique réactif L de l’analogue du M6P de formule générale (II).

La figure 2 point 1/ illustre la réaction entre la fonction oxy-amine de l’analogue du M6P de formule (II) avec la fonction carbonyle (-CHO) de l’anticorps Y. L’anticorps Y est représenté par Yi’-CHO, Y représentant l’anticorps Y sans son groupe fonctionnel L’ égal à -CHO. L’analogue (II) est dénommé AMFA1 lorsque X est un groupement phosphonate et n est égal à 0 et AMFA2 lorsque X est un groupement carboxylate et n est égal à 0.

La figure 2 point 2/ illustre la réaction entre la fonction squarate de l’analogue du M6P de formule (II) avec la fonction amine (-NH ₂ ) de l’anticorps Y. L’anticorps Y est représenté par YI’-NH ₂ , Y représentant l’anticorps Y sans son groupe fonctionnel L’ égal à -NH ₂ . Les analogues (II) sont dénommés AMFA3 lorsque X est un groupement phosphonate et n est égal à 0, et AMFA4 lorsque X est un groupement carboxylate et n est égal à 0.

La figure 2 point 3/ illustre la réaction entre la fonction maléimide de l’analogue du M6P de formule (II) avec la fonction thiol (-SH) de l’anticorps Y. L’anticorps Y est représenté par Yi ’- SH, Yi ’ représentant l’anticorps Y sans son groupe fonctionnel L’ égal à -SH. Les analogues (II) sont dénommés AMFA5 lorsque X est un groupement phosphonate et n est égal à 0 et et AMFA6 lorsque X est un groupement carboxylate et n est égal à 0.

La figure 2 point 4/ illustre la réaction entre la fonction carbonylacrylique de l’analogue du M6P de formule (II) avec la fonction thiol de l’anticorps Y. Les analogues (II) sont dénommés AMFA7 lorsque X est un groupement phosphonate et n est égal à 0 et AMFA8 lorsque X est un groupement carboxylate et n est égal à 0.

Fig. 3

[0017] [Fig. 3] illustre le procédé de préparation de l’intermédiaire 3 : le 2,3,4-tri-O- triméthylsilyl-o-D-mannopyranoside de 2-bromoéthyle, qui servira comme précurseur pour la synthèse des AMFA de formule (II).

Fig. 4

[0018] [Fig. 4] illustre le procédé de préparation du composé AMFA1 répondant à la formule générale (II) à partir du composé 3. Fig. 5

[0019] [Fig. 5] illustre le procédé de préparation du composé AMFA2 répondant à la formule générale (II) à partir du composé 3.

Fig. 6

[0020] [Fig. 6] illustre le procédé de préparation des composés AMFA3 et AMFA5 répondant à la formule générale (II) à partir du composé 6.

Fig. 7

[0021] [Fig. 7] illustre le procédé de préparation des composés AMFA4 et AMFA6 répondant à la formule générale (II) à partir du composé 1 .

Fig. 8

[0022] [Fig. 8] illustre le procédé de préparation des composés AMFA7 et AMFA8 répondant à la formule générale (II) à partir du composé 16 et 21 respectivement.

Fig. 9

[0023] [Fig. 9] présente les résultats obtenus par électrophorèse SDS-PAGE et Western blots (WB) pour les anticorps mAb1 , mAb2, mAb3 et mAb4, seuls ou associés avec AMFA1 (mAb1 -AMFA1 , mAb2-AMFA1 , mAb3-AMFA1 et mAb4-AMFA1 ). Les anticorps avant et après couplage avec l’AMFAI sont détectés soit par coloration des protéines par le bleu de Coomassie, soit par reconnaissance avec des anticorps anti-IgG humaines. Les AMFA1 couplés aux anticorps sont détectés par un sérum polyclonal de lapin anti-AMFA1 (représenté par « anti-AMFA » sur la figure). Le traitement de mAb1 -AMFA1 par l’endonucléase H (PNGase) est également décrit avec détection par un anticorps anti- AMFA.

Fig. 10

[0024] [Fig. 10] présente les courbes d'affinité respectivement de l’anticorps mAb1 ou du conjugué mAb1 -AMFA1 (A), de l’anticorps mAb2 ou du conjugué mAb2-AMFA1 (B), de l’anticorps mAb3 ou du conjugué mAb3-AMFA1 (C), et de l’anticorps mAb4 ou du conjugué mAb4-AMFA1 (D) pour leurs molécules cibles, à savoir les antigènes TNF-alpha humain (A et B), VEGF (C) et HER2 (D).

Fig. 11

[0025] [Fig. 11] (A) présente les données de l'analyse par cytométrie en flux de l'internalisation d’un anticorps IgG témoin non spécifique, de l’anticorps mAb1 et du conjugué mAb1 -AMFA1 avec un anticorps secondaire fluorescent anti-IgG humaine (Alexa647) dans des cellules de rhabdomyosarcome (graphe du haut), des cellules de type lymphocytes T (graphe du milieu) et des cellules de cancer du sein (graphe du bas). [Fig. 11] (B, C) présente l’entrée de l’anticorps mAb1 et du conjugué mAb1 -AMFA1 et de l’anticorps mAb4 et du conjugué mAb4-AMFA1 préalablement couplés à Alexa647 dans les lymphocytes T (B) et les cellules SKOV3 (C), respectivement.

“ p < 0,01 mAb1 -AMFA1 versus mAb1 (test de Student) à partir de 3 expériences.

* p < 0,05 mAb4-AMFA1 versus mAb4 (test de Student) à partir de 6 champs microscopiques.

Fig. 12

[0026] [Fig. 12] présente les données de l'essai de fluorescence cellulaire de cellules de cancer du sein (A) et de cellules de rhabdomyosarcome (B), traitées par :

- un anticorps IgG témoin non spécifique, l’anticorps mAb1 et le conjugué mAb1 -AMFA1 avec un anticorps secondaire fluorescent anti-IgG humaine (Alexa647) (cellules du cancer du sein) (A),

- l’anticorps mAb3 et le conjugué mAb3-AMFA1 avec un anticorps secondaire fluorescent anti-IgG humaine (Alexa647) (cellules de rhabdomyosarcome) (B).

Cet essai de fluorescence permet de définir l’internalisation cellulaire des anticorps seuls et du conjugué de l’invention.

** p < 0,01 mAb1 -AMFA1 versus mAb1 (test de Student).

Fig. 13

[0027] [Fig. 13] (A) présente l’internalisation de l’anticorps Ab ou du conjugué Ab-AMFA1 détectée par imagerie confocale sur des cellules de rhabdomyosarcome (à droite) et sur des cellules de cancer du sein (à gauche). Les noyaux sont marqués avec le colorant Hoechst 33342. Les marquages de Ab ou Ab-AMFA1 complexés à un anticorps secondaire fluorescent anti-IgG humaine (Alexa647) sont indiqués par des flèches. Les 2 photos du bas concernent le cas où un excès de M6P a été ajouté dans le milieu de culture pour saturer les sites de liaison du RM6P-CI des cellules. [Fig. 13] (B, C) présente l’internalisation de l’anticorps mAb1 et du conjugué mAb1 -AMFA1 dans les lymphocytes T Jurkat (B) et la réversion de cette internalisation par l’addition d’un excès d’AMFAI .

** p < 0,01 mAb1 -AMFA1 versus mAb1 (test de Student) n = 6.

Fig. 14

[0028] [Fig. 14] présente les données de l'analyse des échantillons de plasma de souris injectées avec les anticorps mAb1 ou mAb2 ainsi qu’avec les conjugués mAb1 -AMFA1 ou mAb2-AMFA1 correspondants. La concentration des anticorps dans le plasma est donnée en fonction du temps après injection. Le graphe du haut (A) concerne celui des souris traitées avec mAb1 ou mAb1 -AMFA1 et le graphe du bas (B) celui des souris traitées avec mAb2 ou mAb2-AMFA1 .

Fig. 15

[0029] [Fig. 15] montre la détection par Western blots des anticorps mAb1 et des conjugués mAb1 -AMFA1 présents dans le plasma de souris à 21 jours après injection intraveineuse (i.v.) de 4 mg/kg de mAb1 et de mAb1 -AMFA1. Un témoin des mAb1 -AMFA1 injectés est ajouté pour comparaison. Les anticorps sont détectés par reconnaissance avec des anticorps anti-IgG humaines et la présence des AMFA couplés aux anticorps est détectée par un sérum de lapin anti-AMFA1 (représenté par « anti-AMFA » sur la figure).

Fig. 16

[0030] [Fig. 16] (A) montre l’entrée cellulaire du TNF-alpha humain dans des lymphocytes T humains traités avec 5 ng/mL de TNF-alpha humain et 20 ng/mL de mAb1 ou mAb1 - AMFA1 , pendant 1 h, 5 h et 17 h.

Les lysats cellulaires ont été analysés par Western blot. Les concentrations intracellulaires de TNF-alpha humain sont quantifiées en fonction du temps (heures) après traitement.

** p<0,01 mAb1 -AMFA1 + TNF-alpha versus mAb1 + TNF-alpha (test de Student).

[Fig. 16] (B) montre les concentrations de TNF-alpha qui sont mesurées dans les milieux de culture des cellules indiquées en (A) et correspondant aux différents temps de traitement.

Fig. 17

[0031] [Fig. 17] montre la neutralisation par l’anticorps mAb1 ou le conjugué mAb1 -AMFA1 de l’effet anti-prolifératif du TNF-alpha humain sur des cellules de type fibroblastes murins traitées avec 5 ng/mL de TNF-alpha humain.

** p<0,01 mAb1 -AMFA1 versus mAb1 (test de Student).

Fig. 18

[0032] [Fig. 18] montre la réversion de l’effet mitogène du VEGF dans les cellules HUVEC traitées avec 50 ng/mL de VEGF humain et par différentes concentrations de mAb3 ou mAb3-AMFA1 pendant 72 h.

Fig. 19

[0033] [Fig. 19] (A) montre la dégradation de la protéine HER2 (ERBB2, Humain) par une méthode d’immunocytochimie des protéines (In Cell ELISA) dans les cellules de cancer du sein SK-BR-3 traitées avec 10 ou 100 nM de mAb4 ou mAb4-AMFA1 pendant 24 h. [Fig. 19] (B) montre la dégradation de HER2 dans les cellules de cancer du sein BT474 traitées avec 5 nM de mAb4 ou mAb4-AMFA1 pendant 5 h.

* p<0,01 mAb4-AMFA1 versus mAb4 (test de Student) (n = 2). Fig. 20

[0034] [Fig. 20] (A) montre la capacité de recyclage de l’anticorps mAb1 et du conjugué mAb1 -AMFA1 dans les cellules lymphocytes T Jurkat. Chaque anticorps/conjugué est incubé pendant 5 h avec les cellules puis le milieu de culture est remplacé par un milieu sans anticorps. La sortie cellulaire de l’anticorps ou du conjugué internalisé est mesurée à 1 h et 5 h (n = 2). [Fig. 20] (B) montre la sortie cellulaire des anticorps mAb1 et du conjugué mAb1 -AMFA1 à 10 min et 30 min après 30 min d’internalisation dans les lymphocytes T Jurkat (n = 4).

* p<0,05 mAb1 -AMFA1 versus mAb1 (test de Student).

Description détaillée

[0035] Les conjugués de formule (I)

[0036] Comme indiqué, la présente invention a pour objet un conjugué de formule (I) telle que ci-dessus définie. On entend par « conjugué » au sens de l’invention un composé comprenant deux parties liées entre elles par une liaison covalente.

La première partie du conjugué représente au moins un analogue du M6P tandis que la deuxième partie du conjugué représente un anticorps ou un fragment d’anticorps comprenant au moins un domaine de liaison à l’antigène.

Dans la formule (I) ci-dessus définie, l’analogue du M6P correspond à la formule délimitée par la grande parenthèse. L’entier indique le nombre d’analogue(s) du M6P lié(s) à l’anticorps ou au fragment d’anticorps. En effet, selon l’invention, analogue(s) du M6P peut (peuvent) être lié(s) de façon covalente à un anticorps ou un fragment d’anticorps comprenant au moins un domaine de liaison à l’antigène. Ces analogues du M6P sont liés à l’anticorps ou fragment d’anticorps par l’intermédiaire du radical Li.

Comme déjà indiqué, on entend par un analogue du M6P un composé qui diffère du M6P naturel mais qui présente une capacité de liaison élevée au RM6P-CI.

Dans toute la demande, M6P désigne le mannose 6-phosphate et RM6P-CI désigne le récepteur mannose 6-phosphate cation-indépendant.

Le conjugué de l’invention est un composé bifonctionnel en ce sens qu’il présente une double capacité de liaison, à savoir une capacité de liaison au RM6P-CI (par l’intermédiaire de l’analogue du M6P), et une capacité de liaison à un antigène cible spécifique ou à une molécule cible (par l’intermédiaire de l’anticorps ou du fragment d’anticorps).

L’antigène cible spécifique ou la molécule cible se réfère à une molécule membranaire ou extracellulaire d’intérêt thérapeutique ou de diagnostic, en particulier une molécule dont la surexpression induit un état pathologique ou est associée à une condition pathologique ou dont l’expression est impliquée dans un trouble pathologique. Les nouveaux composés bifonctionnels de l’invention permettent notamment de réduire/diminuer les concentrations de molécules cibles extracellulaires ou membranaires chez un individu, ladite diminution étant réalisée par endocytose cellulaire modulée par le RM6P-CI, de sorte que cette réduction/diminution de concentrations soit suffisante pour qu’il n’y ait plus d’état pathologique.

On entend par « molécules cibles extracellulaires ou membranaires » des molécules d’intérêt thérapeutique ou de diagnostic, en particulier des molécules dont la surexpression induit un état pathologique ou est associée à une condition pathologique ou dont l’expression est impliquée dans un trouble pathologique.

Les nouveaux composés bifonctionnels de l’invention permettent plus particulièrement de réduire/diminuer les concentrations d’un antigène extracellulaire soluble ou membranaire chez un individu, de sorte que l’individu ne présente plus d’état pathologique.

[0037] Dans la formule générale (I) du conjugué de l’invention, Yi a été défini comme représentant un anticorps Y ou un fragment d’anticorps Y comprenant au moins un domaine de liaison à l’antigène. Dans ce qui suit, par souci de simplification, on entend par anticorps Y aussi bien l’anticorps Y entier qu’un fragment d’anticorps Y comprenant au moins un domaine de liaison à l’antigène ou qu’une molécule dérivée d’anticorps comprenant au moins l’un desdits domaines de liaison à l’antigène.

L’anticorps Y désigne l’anticorps libre ce qui signifie qu’il ne forme pas de liaison avec l’analogue du M6P.

L’anticorps Yi désigne l’anticorps Y lorsque ce dernier est lié de façon covalente à l’analogue du M6P par l’intermédiaire du radical Li.

L’anticorps Y libre peut être représenté par Yi’-L’, avec L’ représentant un groupe fonctionnel ou une fonction réactive porté(e) par l’anticorps Y. Autrement dit, Y représente l’anticorps Y sans son groupe fonctionnel L’.

C’est le groupe fonctionnel L’ de l’anticorps Y qui va réagir avec un groupe fonctionnel ou une fonction réactive porté(e) par l’analogue du M6P afin de former une liaison covalente entre l’anticorps Y et l’analogue du M6P et obtenir ainsi le conjugué de formule (I) de l’invention.

Dans la présente demande, on peut employer indifféremment les termes « groupe fonctionnel », « fonction réactive » ou « groupe chimique réactif ». Chacun de ces termes désigne un groupe porté par l’anticorps (ou porté par l’analogue du M6P) capable d’entrer en réaction avec un groupe porté par l’analogue du M6P (ou porté par l’anticorps).

L’anticorps est n’importe quel type d’anticorps, de n’importe quel isotype, issu de n’importe quelles espèces. Il s’agit notamment d’un anticorps thérapeutique ou de diagnostic ciblant une molécule d’intérêt thérapeutique ou diagnostic, tel qu’un anticorps anti-TNFo, anti- VEGF, anti-HER2 et anti-GFP. L’anticorps est notamment un anticorps à chaînes lourde et légère, un anticorps à chaîne unique, un anticorps dimérique ou multimérique, bispécifique ou multi-spécifique. L’anticorps est notamment une immunoglobuline de type IgG, notamment de sous-type lgG1 , lgG2, lgG3 ou lgG4, de type IgE, IgD, IgA ou IgM. L’anticorps englobe les anticorps monoclonaux, les anticorps humanisés ou entièrement humains et les anticorps chimériques provenant de différentes espèces (humain, souris, rat, lapin, chèvre, camélidés, poule, etc.), notamment des anticorps chimériques humains- souris. Les fragments d’anticorps incluent notamment les fragments Fab, Fab’, F(ab’) ₂ , Fv, scFv, Fabc ou Fab comprenant une portion de la région Fc et les fragments d’anticorps à chaîne unique dérivés d’immunoglobulines de camélidé ou de requin (anticorps simple domaine V _H H (nanocorps) et V-NAR). Les molécules dérivées d’anticorps incluent les protéines de fusion comprenant un domaine de liaison d’un anticorps à la molécule cible, notamment sous forme de protéine de fusion Fc ; les anticorps ou protéines de fusion ayant plusieurs domaines de liaison correspondant à plusieurs molécules cibles, c’est-à-dire des anticorps ou protéines de fusion polyspécifiques. L’anticorps peut être en outre modifié pour lui conférer une propriété particulière en plus de sa reconnaissance de la molécule cible notamment par la conjugaison de l’anticorps à une molécule active sur le plan thérapeutique telle qu’une molécule cytotoxique ou un inhibiteur de la croissance cellulaire, à un inhibiteur de protéase, à un élément permettant d’augmenter la demi-vie de l’anticorps dans le sang du patient, ou à une molécule d’imagerie permettant la détection de l’anticorps et/ou de la molécule cible chez le patient par les diverses techniques utilisables en clinique (radiologie, radiographie, scintigraphie, IRM, endoscopie, scanner, etc.).

[0038] Dans le conjugué de formule (I) telle que ci-dessus définie, Yi peut plus particulièrement être représenté par le groupement L ₂ -Y’I dans lequel Y’i représente l’anticorps Y lié à Li par l’intermédiaire du radical L ₂ avec L ₂ choisi dans le groupe comprenant =CH- , -NH- et -S-, ledit Yi pouvant ainsi être représenté par : =CH-Y’i , -NH-Y’i et -S-Y’i.

Le radical L ₂ est plus particulièrement issu de la transformation du groupe fonctionnel L’ porté par l’anticorps lorsque ce dernier forme une liaison covalente avec l’analogue du M6P.

[0039] Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, le conjugué de formule (I) est caractérisé en ce que est un entier égal à 1 , et en ce que ledit conjugué est choisi dans le groupe comprenant :

[Chem5] avec X, n et Y’i tels que définis ci-dessus.

[0040] Selon encore un autre mode de réalisation avantageux, le conjugué de l’invention est caractérisé en ce que Yi représente un anticorps Y thérapeutique ou de diagnostic.

[0041] Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le conjugué de l’invention est plus particulièrement caractérisé en ce que Yi représente un anticorps Y choisi dans le groupe comprenant les anticorps monoclonaux, les anticorps chimériques, les anticorps humains ou humanisés, les anticorps à chaînes lourde et légère, les anticorps à chaîne unique, les anticorps bispécifiques ou multi-spécifiques et les nanocorps.

[0042] Selon encore un mode de réalisation particulièrement avantageux, le conjugué de l’invention est plus particulièrement caractérisé en ce que Yi représente un anticorps Y qui est une immunoglobuline de type IgG, en particulier de sous-type IgG 1 , lgG2, lgG3 ou lgG4, ou une immunoglobuline de type IgE, IgD, IgA ou IgM.

[0043] Selon encore un autre mode de réalisation de l’invention, le conjugué de formule (I) tel que ci-dessus défini peut également être caractérisé en ce qu’il présente une affinité IC ₅ o vis-à-vis du RM6P-CI allant de 10 ^-4 M à 10 ^-9 M, et de préférence allant de 10 ^-5 M à 10 ^-8 M. Cette affinité peut par exemple être mesurée par une méthode de compétition envers un autre ligand du RM6P-CI tel que le pentamannose 6-phosphate (selon Basile I. et al., 2018).

[0044] Les conjugués de l’invention sont très intéressants en ce qu’ils permettent une internalisation cellulaire d’une molécule cible comme par exemple un antigène par la voie endo-lysosomale, cette internalisation étant avantageusement suivie de la libération extracellulaire des conjugués de l’invention, ce qui permet ainsi la réalisation d’un nouveau cycle de capture de la molécule cible par le conjugué de l’invention.

Le recyclage extracellulaire des conjugués de l’invention est illustré à la figure 1. Le conjugué AMFA-Anticorps de l’invention, lié à un Antigène pénètre dans l’endosome de la cellule via le RM6P-CI pour y déposer l’antigène. L’antigène est ensuite dirigé vers le lysosome tandis que le conjugué AMFA-Anticorps de façon inattendu ressort de la cellule. Le conjugué ainsi ressorti de la cellule pourra resservir à fixer un nouvel antigène extracellulaire ou membranaire.

Cette capacité de recyclage était inattendue car les exemples antérieurs de la littérature utilisant des analogues du M6P pour internaliser des enzymes lysosomales (voir par exemple le document EP 2 448 600 B1 ) indiquaient la présence de ces composés bifonctionnels (comprenant des analogues du M6P liés à des enzymes) dans la voie endo- lysosomale sans recyclage extracellulaire.

De même, dans le document PCT/US2019/067228 les molécules bifonctionnelles associées aux antigènes sont présentées dans les lysosomes. Ce document ne donne pas d’information sur un possible recyclage extracellulaire des molécules bifonctionnelles.

Ainsi, dans toutes ces études les composés bifonctionnels étaient décrits pour être présents et/ou dégradés dans les lysosomes avec leur cible spécifique. Dans la présente invention, de façon inattendue, avec les conjugués de formule (I), seule la molécule cible est dégradée dans les lysosomes tandis que les conjugués sont avantageusement recyclés dans l’espace extracellulaire. [0045] Le conjugué de formule (I) est encore caractérisé en ce qu’il présente au moins une des propriétés suivantes :

- il est capable de pénétrer dans l’endosome de la cellule via sa liaison avec le RM6P-CI pour y emmener un antigène extracellulaire soluble ou membranaire ;

- il est capable de ressortir de l’endosome de la cellule après y avoir déposé l’antigène extracellulaire soluble ou membranaire ;

- il permet la dégradation dans le lysosome des antigènes extracellulaires solubles ou membranaires reconnus par Yi après leur internalisation cellulaire ;

- il est recyclé dans le milieu extracellulaire après son internalisation cellulaire ;

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le conjugué de l’invention présente chacune des propriétés ci-dessus définies.

[0046] L’originalité des conjugués de l’invention provient notamment du fait qu’ils ne détruisent pas la capacité naturelle qu’a l’anticorps à pouvoir ressortir de la cellule quand il en a besoin. En effet, le couplage d’analogues du M6P avec l’anticorps est effectué de manière à ne pas créer d’encombrement au niveau des fonctions réactives de l’anticorps, comme par exemple au niveau de la partie de l’anticorps interagissant avec des récepteurs spécifiques des anticorps, comme par exemple le FcRn néonatal. Ceci a pour effet de ne pas modifier les capacités de recyclage extracellulaire de l’anticorps lorsqu’il est lié de façon covalente aux analogues du M6P décrits dans la présente demande.

[0047] Procédé de préparation des conjugués de formule (I)

[0048] Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d’un conjugué de formule (I) tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que l’on fait réagir :

- un anticorps Y ou un fragment d’anticorps Y comprenant au moins un domaine de liaison à l’antigène avec

- ni composé(s) répondant à la formule générale (II)

[Chem9]

(II), dans laquelle X, n et sont tels que définis ci-dessus,

L est un groupe chimique réactif choisi dans le groupe comprenant -O-NH ₂ ,

[Chem 10] ledit groupe L du composé (II) formant liaison(s) covalente(s) avec groupe(s) fonctionnel(s) porté(s) par ledit anticorps Y ou fragment d’anticorps Y.

[0049] Le composé de formule (II) est un analogue du M6P. C’est le groupe chimique réactif L porté par l’analogue du M6P de formule (II) qui va réagir avec le groupe fonctionnel L’ de l’anticorps Y afin de former une liaison covalente entre l’anticorps Y et l’analogue du M6P et obtenir ainsi le conjugué de formule (I) de l’invention. Le radical L ₂ précédemment mentionné est plus particulièrement issu de la transformation du groupe fonctionnel L’ porté par l’anticorps lorsque ce dernier forme une liaison covalente avec l’analogue du M6P.

Les composés de formule (II) sont particulièrement intéressants de par la simplicité de leur bras espaceur. On entend par « bras espaceur » la partie située après l’oxygène porté par le carbone anomérique de la structure cyclique de l’analogue du M6P et qui comprend le groupe chimique réactif L, à savoir la partie (CH ₂ )2(O-CH ₂ -CH ₂ )n-L.

En effet, la simplicité de la structure du bras espaceur participe aux avantages présentés par les conjugués de formule (I) de l’invention. Cette simplicité du bras espaceur permet notamment de synthétiser aisément les composés de formule (II) puis de réaliser un couplage particulièrement intéressant et efficace avec un anticorps. La synthèse des conjugués de formule (I) est ainsi efficace et aisée à mettre en œuvre.

[0050] Dans ce qui suit, par souci de simplification, les groupes L de l’analogue du M6P tels que ci-dessus définis sont respectivement dénommés, par ordre d’apparition, « oxy- amine », « squarate », « maléimide » et « groupe comprenant une fonction carbonylacrylique ».

[0051] Les exemples spécifiques d’analogues du M6P de formule (II) sont plus particulièrement représentés par le sigle « AMFA » dans la présente demande. [0052] Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de l’invention le composé (II) est choisi dans le groupe comprenant :

[Chem 13]

AMFA1 ,

[Chem 14] AMFA2,

[Chem 15]

AMFA3,

[Chem16]

AMFA4,

[Chem 17]

AMFA5,

[Chem 18]

AMFA6,

[Chem 19]

AMFA7,

[Chem20]

AMFA8.

[0053] Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de l’invention, l’utilisation des AMFA1 à AMFA8 ci-dessus décrits permet d’effectuer un couplage particulièrement intéressant et efficace avec un anticorps tel que ci-dessus décrit. De plus, comme déjà indiqué, les composés de formule (II), et plus particulièrement les AMFA1 à AMFA8 ci- dessus décrits, sont simples au niveau de leur structure chimique, notamment de par la simplicité de leur bras espaceur. Ces composés sont aisés à synthétiser puis aisés à coupler avec l’anticorps.

[0054] Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, le groupe L du composé AMFA va se lier au niveau d’une fonction carbonyle préalablement générée sur une chaîne/partie oligosaccharidique de la partie glycosidique de l’anticorps.

La partie glycosidique de l’anticorps susmentionnée est plus particulièrement celle située au niveau de la région Fc de l’anticorps.

A titre d’exemple de groupe L du composé AMFA, on pourra citer le groupe oxy-amine.

[0055] Selon un autre mode de réalisation de l’invention, le groupe L du composé AMFA va se lier au niveau d’un résidu acide aminé approprié de la chaîne/partie peptidique de l’anticorps.

A titre d’exemple d’un résidu acide aminé approprié on pourra citer un groupe amine provenant d’une lysine ou encore un groupe thiol provenant d’une cystéine.

A titre d’exemple de groupe L du composé AMFA, on pourra citer un groupe squarate, un groupe maléimide ou un groupe carbonylacrylique.

[0056] Les termes « chaîne » ou « partie » utilisés pour parler d’une chaîne oligosaccharidique ou d’une partie oligosaccharidique de l’anticorps, ou pour parler de la chaîne peptidique ou de la partie peptidique de l’anticorps peuvent être employés indifféremment dans la présente demande.

[0057] La figure 2 illustre le schéma de synthèse général des conjugués de l’invention en fonction des définitions respectives du groupe chimique réactif L de l’analogue du M6P de formule générale (II).

Comme indiqué et montré sur la figure 2, point 1/, la fonction carbonyle (-CHO) de l’anticorps Y réagit avec la fonction oxy-amine du composé AMFA de formule (II). Ce mode de couplage intervient plus particulièrement au niveau d’une chaîne oligosaccharidique de la partie glycosidique située sur la partie Fc de l’anticorps.

Ce mode de couplage est particulièrement avantageux en ce sens qu’il ne crée pas d’encombrement au niveau des autres fonctions réactives de l’anticorps (comme par exemple les régions interagissant avec les récepteurs de l’anticorps), ce qui permet avantageusement à l’anticorps de préserver ses propriétés naturelles de recyclage vers l’extérieur de la cellule et ainsi aux conjugués de l’invention de pouvoir être recyclés à l’extérieur de la cellule.

Concernant le mode de couplage du composé AMFA de formule (II) comprenant le groupe squarate (voir figure 2 point 2/), ce dernier intervient au niveau d’un résidu lysine de la partie peptidique de l’anticorps, à savoir plus particulièrement au niveau de la fonction amine. Concernant le mode de couplage du composé AMFA de formule (II) avec un groupe maléimide (voir figure 2 point 3/), ce dernier intervient au niveau d’un résidu cystéine de la partie peptidique de l’anticorps, à savoir plus particulièrement au niveau de la fonction thiol. Concernant le mode de couplage du composé AMFA de formule (II) comprenant une fonction carbonylacrylique (voir figure 2 point 4/), ce dernier intervient au niveau d’un résidu cystéine de la partie peptidique de l’anticorps, à savoir plus particulièrement au niveau de la fonction thiol.

Ces modes de couplage sont particulièrement avantageux car ils ne créent pas ou créent peu d’encombrement au niveau des autres fonctions réactives de l’anticorps (comme par exemple les récepteurs FcRn de l’anticorps), ce qui permet avantageusement à l’anticorps de préserver ses propriétés naturelles et ainsi aux conjugués de l’invention de pouvoir être recyclés à l’extérieur de la cellule.

[0058] Utilisation des conjugués (I) dans une méthode de traitement thérapeutique ou de diagnostic

[0059] Les nouveaux composés bifonctionnels permettent de réduire/diminuer les concentrations d’antigènes extracellulaires solubles ou membranaires, chez un individu, ladite réduction/diminution étant réalisée par endocytose cellulaire modulée par le RM6P- Cl. Cette propriété les rend ainsi particulièrement intéressants pour une utilisation de type thérapeutique.

[0060] Selon un autre aspect de l’invention, il est proposé une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu’elle comprend :

- un conjugué tel que défini ci-dessus,

- au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.

Le conjugué de l’invention de formule (I) est présent en une quantité thérapeutiquement efficace dans la composition de l’invention.

Par "quantité thérapeutiquement efficace", on entend un dosage suffisant pour produire un résultat souhaité, par exemple, une quantité suffisante pour obtenir des résultats thérapeutiques (y compris préventifs) bénéfiques ou souhaités, tels qu'une réduction du taux d’un élément dont l’expression ou la surexpression extracellulaire ou membranaire est responsable d’une pathologie ou est impliquée dans une condition pathologique. Une quantité efficace peut nécessiter une ou plusieurs administrations.

[0061] Selon encore un autre aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant :

- une quantité thérapeutiquement efficace du conjugué de formule (I),

- au moins un autre agent thérapeutiquement actif,

- éventuellement au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.

[0062] La présente invention concerne également un conjugué de formule (I) tel que défini ci-dessus ou une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, pour une utilisation médicale, de type diagnostique ou thérapeutique.

[0063] A cet égard, l’invention a plus particulièrement pour objet un conjugué de formule (I) tel que défini ci-dessus ou une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, pour une utilisation comme médicament.

[0064] L’invention a encore pour objet un conjugué de formule (I) tel que défini ci-dessus ou une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, pour une utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique qui consiste à administrer un anticorps thérapeutique ou un fragment d’anticorps thérapeutique.

Comme déjà indiqué, la capacité de recyclage extracellulaire confère aux conjugués de l’invention des propriétés particulièrement avantageuses dans le cadre de leur utilisation pour traiter des pathologies dont le traitement consiste à administrer un anticorps thérapeutique ou un fragment d’anticorps thérapeutique.

En effet, l’administration d’un conjugué de formule (I) permet d’utiliser une dose moindre d’anticorps thérapeutique que si l’anticorps thérapeutique était utilisé seul (sans être lié de façon covalente à un analogue du M6P). En effet, l’anticorps thérapeutique, lorsqu’il est lié à un analogue du M6P, présente une efficacité thérapeutique améliorée par rapport à l’anticorps utilisé seul. Ainsi, à doses égales d’anticorps, l’anticorps lié à l’analogue du M6P est plus efficace que lorsqu’il est utilisé seul.

Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, l’utilisation d’un conjugué de formule (I) permet de diminuer les doses d’anticorps habituellement utilisées dans une méthode de traitement thérapeutique impliquant l’administration d’anticorps, et ainsi de diminuer les effets secondaires liés au traitement par les anticorps.

[0065] A titre d’exemples de pathologies impliquant l’administration d’anticorps on pourra citer celles choisies dans le groupe comprenant le cancer, les maladies inflammatoires, les maladies auto-immunes, les maladies du sang, les maladies ophtalmologiques, les infections virales, les maladies allergiques et les maladies rares.

[0066] Les anticorps plus particulièrement testés dans l’invention en couplage avec les AMFA sont notamment les anticorps anti-TNF-alpha, anti-VEGF et anti-HER2.

Les anticorps anti-TNF-alpha sont notamment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques des intestins, la maladie de Crohn, la rectocolite hémorragique et les maladies auto-immunes qui touchent les articulations telles que la polyarthrite rhumatoïde, la spondyloarthrite axiale / spondylarthrite ankylosante ainsi que le rhumatisme psoriasique et le psoriasis.

L’anticorps anti-VEGF est notamment utilisé en clinique pour traiter la néovascularisation et la croissance tumorale de nombreux types de cancers ainsi que les désordres vasculaires oculaires comprenant la dégénérescence maculaire néovasculaire liée à l'âge. Quant à l’anticorps anti-HER2, il est notamment utilisé pour le traitement de certains cancers, en particulier les cancers du sein surexprimant le récepteur HER2.

[0067] L’invention a encore pour objet un conjugué de formule (I) tel que défini ci-dessus ou une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, pour une utilisation dans une méthode de diagnostic.

Ainsi, un conjugué de formule (I) lié de façon covalente à une molécule d’imagerie par l’intermédiaire de l’anticorps Yi peut permettre de localiser des lésions pathologiques telles que des tumeurs ou métastases, ou d’autres zones pathologiques à traiter.

A titre d’exemples de méthode de diagnostic, on pourra notamment citer le diagnostic de maladies ou d’affections associées à une augmentation de l’expression du RM6P-CI.

[0068] Le conjugué de l’invention ou la composition pharmaceutique peuvent être formulés sous différentes formulations pharmaceutiques (forme solide, semi-solide, liquide ou gazeuse), telles que des comprimés, des capsules, des poudres, des granules, des pommades, des solutions, des injections, des inhalations et des aérosols.

La formulation pharmaceutique peut se présenter sous une forme liquide, une forme lyophilisée ou une forme liquide reconstituée à partir d'une forme lyophilisée, où la préparation lyophilisée doit être reconstituée avec une solution stérile avant l'administration. Les conjugués de l’invention peuvent être formulées en préparations pour injection sous cutanée, intraveineuse ou intra-vitréenne en les dissolvant, en les mettant en suspension ou en les émulsionnant dans un solvant.

[0069] Selon un mode de réalisation avantageux, l’invention a pour objet le conjugué de formule (I) ou la composition pharmaceutique pour une utilisation telle que ci-dessus définie, caractérisée en ce que le conjugué ou la composition pharmaceutique est sous une forme adaptée pour une administration par voie parentérale, intraveineuse ou sous-cutanée.

Exemples

[0070] La synthèse des conjugués (I) de l’invention et l’étude de leur effets biologiques est décrite en détails dans les exemples ci-dessous qui font référence aux figures 3 à 20. Les analogues du M6P de formule générale (II) synthétisés dans les exemples ci-dessous sont respectivement nommés AMFA1 , AMFA2, AMFA3, AMFA4, AMFA5, AMFA6, AMFA7 et AMFA8.

Certains de ces AMFA ont été couplés avec des anticorps dénommés mAb1 , mAb2, mAb3, mAb4 et Ab (voir ci-après).

[0071 ] Exemple 1 : Synthèse des AMFA1 à AMFA8 de formule générale (II)

[0072] Préparation de l’intermédiaire 3 : le 2,3,4-tri-O-triméthylsilyl-a-D-mannoDyranoside de 2-bromoéthyle

Le procédé de préparation de l’intermédiaire 3 qui servira comme précurseur pour la synthèse des AMFA est illustré à la figure 3, dont les conditions et réactifs des étapes (i) à (iii) sont les suivants : (i) 2-bromoéthanol, triéthylamine, CH2CI2, 3,5 h, 80°C ; (ii) TMSCI, Et ₃ N, CH2CI2, 20 h, TA ; (iii) K ₂ CO ₃ , MeOH, 15 min, 0°C.

Le composé de départ est le D-mannose sur lequel est introduit le 2-bromoéthanol en position anomère à l’aide de résine Amberlite IR120 préalablement réactivée pour former le composé 1 . Le composé 1 a été persilylé avec du chlorure de triméthylsilyle en présence de triéthylamine pour former l’intermédiaire 2. La position 6 de l’intermédiaire 2 a été déprotégée sélectivement par du carbonate de potassium en quantité catalytique dans le méthanol pour conduire au composé 3 avec un rendement de 60% sur deux étapes (voir figure 3).

[0073] Préparation du composé AMFA1

Le procédé de préparation du composé AMFA1 à partir du composé 3 est illustré à la figure 4, dont les conditions et réactifs des étapes (i) à (vi) sont les suivants : (i) periodinane de Dess-Martin à 0,3 M, CH2CI2, TA, 1 h; (ii) méthylènediphosphonate de tétraéthyle, NaH, THF, 1 h, TA ; (iii) Pd/C, Et ₃ SiH, MeOH, 2 h, TA. (iv) /V-hydroxyphtalimide, NaH, DMF, 22 h, 60°C; (v) TMSCI, Et ₃ N, CH2CI2, 15,5 h, TA; (vi)-a) TMSCI, Nal, CH ₃ CN, 50 min, 35°C ; (vi)-b) N2H4.H2O, MeOH, 15,5 h, TA. L’alcool 3, obtenu tel que décrit précédemment, est oxydé en aldéhyde à l’aide du périodinane de Dess-Martin pour former le composé 4. Cet intermédiaire clé va permettre l’accès aux différents AMFA de formule (II).

Pour synthétiser le composé AMFA1 , l’aldéhyde 4 est mis en réaction avec le méthylènediphosphonate de tétraéthyle, préalablement déprotoné par de l’hydrure de sodium, pour former le composé 5 avec un rendement de 76% sur deux étapes. Lors d’une étape d’hydrogénation catalytique, en présence de palladium sur charbon et pour laquelle l’hydrogène est généré in situ par ajout progressif de triéthylsilane, la double liaison est réduite et les groupements triméthylsilyles sont hydrolysés. On obtient ainsi le composé 6, sans purification, avec un rendement quantitatif. L’atome de brome est ensuite substitué par du /V-hydroxyphthalimide pour former l’intermédiaire 7 avec un rendement de 61 %. Les fonctions alcools sont ensuite protégées par du chlorure de triméthylsilyle pour conduire au composé 8 avec un rendement quantitatif. L’intermédiaire 8 ainsi obtenu, sans purification est ensuite mis en réaction avec du chlorure de triméthylsilyle et de l’iodure de sodium pour former le phosphonate bis(triméthylsilylé) par une réaction de type Rabinowitz. Cet intermédiaire est ensuite converti en acide phosphonique par action de l’hydrazine monohydratée dans le méthanol qui va aussi déplacer les groupements triméthylsilyles présents sur les alcools secondaires du sucre et réagir avec le phtalimide afin de démasquer la fonction amine. On obtient ainsi, en une seule étape, le composé AMFA1 déprotégé sur la partie phosphonate, sur les alcools du sucre et portant la fonction aminooxy en position anomère avec un rendement de 85% sur deux étapes (figure 4).

[0074] Préparation du composé AMFA2

Le procédé de préparation du composé AMFA2 à partir du composé 3 est illustré à la figure 5, dont les conditions et réactifs des étapes (i) à (iv) sont les suivants : (i)-a) periodinane de Dess-Martin à 0,3 M, CH ₂ CI ₂ , TA, 1 h ; (i)-b) Phosphonoacetate de triéthyle, NaH, THF, 20 min, TA, 73% (2 étapes); (ii)-a) Pd/C, Et ₃ SiH, MeOH, 2 h, TA ; (ii)-b) NaOH 1 N, THF/H ₂ O, 2 h, TA ; (iii) /V-hydroxyphtalimide, NaH, DMF, 20 h, 60°C; (iv) N ₂ H4.H ₂ O, MeOH, 15,5 h, TA.

Le composé AMFA2 est synthétisé en suivant les voies de synthèse décrites dans la figure 5. L'une des principales étapes de la synthèse de ce ligand saccharidique a été l'introduction de la fonction carboxylate sur la chaîne latérale des fragments de mannose. De la même manière que les synthèses précédentes, cette fonctionnalisation est réalisée par une oxydation de Dess-Martin de l'intermédiaire 3 en position 6 suivie d'une réaction de Horner-Wadsworth-Emmons utilisant l'anion phosphonacétate de triéthyle. De cette façon, le carboxylate insaturé 10 est obtenu. Après les étapes de réduction de la double liaison et hydrolyse de groupements protecteurs triméthylsilyles sur les fonctions hydroxyles, la foonction carboxylate a été saponifié pour donner l’intermédiaire 11. Le brome est ensuite substitué par l’hydroxyphthalimide pour donner l’intermédiaire 12. Le demasquage de la fonction amine par hydrazinolyse conduit au composé AMFA2 entièrement déprotégé (figure 5).

[0075] Préparation des composés AMFA3 et AMFA5

Le procédé de préparation des composés AMFA3 et AMFA5 à partir du composé 6 est illustré à la figure 6, dont les conditions et réactifs des étapes (i) à (v) sont les suivants : (i) periodinane de Dess-Martin à 0,3 M, CH ₂ CI ₂ , TA, 1 h; (ii) méthylènediphosphonate de tétraéthyle, NaH, THF, 1 h, TA ; (iii) Pd/C, EtsSiH, MeOH, 2 h, TA. (iv) phtalimide de potassium, DMF, 22 h, 60°C; (v) TMSCI, Et ₃ N, CH ₂ CI ₂ , 15,5 h, TA; (vi)-a) TMSCI, Nal, CHsCN, 50 min, 35°C ; (vi)-b) N ₂ H4.H ₂ O, MeOH, 15,5 h, TA ; (vii) Diéthyle squarate, Et ₃ N, EtOH/H ₂ O, 30 min ; (viii) /V-(méthoxycarbonyl)maléimide, Solution saturée NaHCOs, 30 min, 0°C.

Pour synthétiser les composés AMFA3 et AMFA5, l’atome de brome du composé 6 est substitué par du phtalimide de potassium pour former l’intermédiaire 14 avec un rendement de 74%. Les fonctions alcools sont ensuite protégées par du chlorure de triméthylsilyle pour conduire au composé 15 avec un rendement quantitatif. L’intermédiaire 15 ainsi obtenu, sans purification est ensuite mis en réaction avec du chlorure de triméthylsilyle et de l’iodure de sodium pour former le phosphonate bis(triméthylsilylé) par une réaction de type Rabinowitz. Cet intermédiaire est ensuite converti en acide phosphonique par action de l’hydrazine monohydratée dans le méthanol qui va aussi déplacer les groupements triméthylsilyles présents sur les alcools secondaires du sucre et réagir avec le phtalimide afin de démasquer la fonction amine. On obtient ainsi, en une seule étape, le composé 16 déprotégé sur la partie phosphonate, sur les alcools des deux sucres et portant la fonction amine en position anomère avec un rendement de 65% sur deux étapes. Le composé 16 est ensuite mis en réaction soit avec le squarate de diéthyle pour former le produit AMFA3 avec un rendement de 50% ou soit avec le /V-(méthoxycarbonyl)maléimide pour former le composé AMFA5 avec un rendement de 80% (figure 6).

[0076] Préparation des composés AMFA4 et AMFA6

Le procédé de préparation des composés AMFA4 et AMFA6 à partir du composé 1 est illustré à la figure 7, dont les conditions et réactifs des étapes (i) à (v) sont les suivants : (i) NaN ₃ , DMF, 20 h, TA ; TMSCI, Et ₃ N, CH ₂ CI ₂ , 20 h, TA; K ₂ CO ₃ cat, MeOH, 50 min, 0°C, 38% (3 étapes) ; (ii)-a) périodinane de Dess-Martin, CH ₂ CI ₂ , 3 h, TA, (ii)-b) Phosphonoacetate de triéthyle, NaH, THF, 2 h, TA, 73% (2 étapes) ; (iii)-a) HCl 0,5 N, THF, 30 min, TA, (iii)-b) NaOH 0,1 N, 30 min, TA, 99%, (iii)-c) H ₂ , Pd/C, EtOH/H ₂ O, 1.5 h, TA, 99% ; (iv) squarate de diéthyle, EtOH/H ₂ O, 40 min, TA, 34% ; (v) /V-(méthoxycarbonyl)maléimide, Solution saturée NaHCOs, 30 min, 0°C.

Les composés AMFA4 et AMFA6 sont synthétisés en suivant les voies de synthèse décrites dans la figure 7. L'une des principales étapes de la synthèse de ces ligands saccharidiques a été l'introduction de la fonction carboxylate sur la chaîne latérale des fragments de mannose. Cette fonctionnalisation est réalisée par une oxydation de Dess-Martin de l'alcool 19 en position 6 suivie d'une réaction de Horner-Wadsworth-Emmons utilisant l'anion phosphonacétate de triéthyle. De cette façon, le carboxylate insaturé 20 est obtenu. Une autre étape critique a été la fonctionnalisation des fragments d'aglycone avec le squarate de diéthyle ou le maléimide. Cette réaction a été réalisée sur le composé 21 entièrement déprotégé pour fournir AMFA4 et AMFA6 respectivement (figure 7).

[0077] Préparation des composés AMFA7 et AMFA8

Le procédé de préparation du composé AMFA7 à partir du composé 16, et celui du composé AMFA8 à partir du composé 21 sont respectivement illustrés à la figure 8.

Les conditions et réactifs de l’étape (i) sont les suivantes : (i) acide 3-benzoylacrylique, N- méthylmorpholine, chloroformiate d’isobutyle, DMF, 1 h, -10°C à TA.

Pour préparer les composés AMFA7 et AMFA8, on suit les mêmes modes opératoires utilisés lors de la préparation des composés AMFA3 et AMFA4, excepté pour la dernière étape. En effet, la dernière étape consiste en la réaction entre les amines des intermédiaires respectifs 16 et 21 et l’acide 3-benzoylacrylique activé par le chloroformiate d’isobutyle en présence de /V-méthylmorpholine (figure 8).

[0078] Exemple 2 : Synthèse des conjugués de formule générale (I)

[0079] L'ingénierie des AMFA a été validée sur cinq anticorps différents qui ont été couplés aux AMFA de formule (II) :

- deux anticorps dirigés contre le facteur de nécrose tumorale alpha (T umor Necrosis Factor, TNF-alpha), appelés infliximab et adalimumab, et dénommés respectivement dans la demande mAb1 et mAb2 ;

- un anticorps dirigé contre le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF), appelé bevacizumab, dénommé mAb3 ;

- un anticorps dirigé contre le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (Epithelial Growth Factor Receptor, HER2), appelé trastuzumab, dénommé mAb4 ; et

- un anticorps dirigé contre la protéine fluorescente verte (Green Fluorescent Protein, GFP), dénommé Ab.

[0080] Le greffage des AMFA, pour ces exemples non limitatifs, peut être réalisé au niveau :

- de la chaîne oligosaccharidique de la partie glycosidique de l'anticorps recombinant (voir les points 1/ à 5/ ci-après) avec l’AMFAI , ou

- de la fonction amine des résidus lysine de la partie peptidique de l'anticorps recombinant (voir point 6/ ci-après) avec l'AMFA4.

[0081 ] 1/ Greffage de l’AMFAI sur les chaînes oligosaccharidiques de la partie qlycosidique d'un anticorps chimérique anti-TNF-alpha

Le couplage de l’AMFAI a été testé sur un anticorps monoclonal chimérique souris-humain commercial dirigé contre le TNF-alpha humain, l'infliximab, défini comme mAb1 .

Un conjugué de formule (I) est formé qui peut indifféremment être représenté dans la demande par « mAb1 -AMFA1 » ou « AMFA1 -mAb1 ». Ce conjugué comprend une partie (mAb1 ) qui se lie à une cible spécifique (comme un antigène extracellulaire ou membranaire) et une partie (AMFA1 ) qui se lie au RM6P-CI.

L'anticorps mAb1 a été choisi comme modèle dans la présente demande car il présente des chaînes oligosaccharidiques sur les régions constantes qui sont très similaires à celles produites chez l'homme.

Le couplage entre l'AMFAI et l'anticorps mAb1 est effectué selon le protocole décrit ci- dessous.

Dans une première étape, l'anticorps mAb1 est oxydé. Plus particulièrement, l'anticorps mAb1 et une solution de méta-périodate de sodium 1 mM (NalO4) sont mis à réagir dans un tampon phosphate 25,5 mM pH 6,25 pendant 30 min à 4°C dans l'obscurité. Du glycérol (20 pL/mL) est ajouté et incubé pendant 10 min à 4°C pour arrêter la réaction. Les composés de faible poids moléculaire sont éliminés à l'aide d'une colonne de dessalage PD-10 pré-remplie de résine Sephadex G-25.

Dans une deuxième étape, l'AMFAI est ajouté à la solution d’anticorps oxydé obtenu précédemment et le mélange est laissé à réagir sous agitation pendant 2 h à 37°C. Enfin, les échantillons sont dialysés pendant une nuit contre un tampon phosphate.

La première étape du protocole ci-dessus conduit à l'oxydation des chaînes oligosaccharidiques de l’anticorps mAb1 et génère des groupes aldéhydes qui interagissent de manière covalente avec les groupes oxy-amines de l’AMFAI pour former une liaison oxime. De plus, seules les chaînes oligosaccharidiques de l’anticorps mAb1 sont remodelées. En effet, la partie peptidique de l’anticorps mAb1 n’est pas affectée par les conditions utilisées pour le greffage de l’AMFAI .

[0082] 2/ Greffage de l’AMFAI sur les chaînes oligosaccharidiques de la partie qlycosidique d'un anticorps anti-TNF-alpha humanisé

L’anticorps anti-TNF-alpha, l’adalimumab, défini comme mAb2, a été testé et soumis à la même procédure que celle décrite dans le point 1/ ci-dessus afin de greffer l'AMFAI sur les chaînes oligosaccharidiques de la partie glycosidique de l’anticorps mAb2. Un conjugué de formule (I) est formé, qui peut indifféremment être représenté dans la demande par « mAb2-AMFA1 » ou « AMFA1 -mAb2 ». Ce conjugué comprend une partie (mAb2) qui se lie à une cible spécifique (comme un antigène extracellulaire ou membranaire) et une partie (AMFA1 ) qui se lie au RM6P-CI.

[0083] 3/ Greffage de l’AMFAI sur les chaînes oligosaccharidiques de la partie qlycosidique d'un anticorps anti-VEGF humanisé

L’anticorps anti-VEGF, le bevacizumab, défini comme mAb3, a été testé et soumis à la même procédure que celle décrite dans le point 1/ ci-dessus afin de greffer l’AMFAI sur les chaînes oligosaccharidiques de l’anticorps mAb3.

Un conjugué de formule (I) est formé, qui peut indifféremment être représenté dans la demande par « mAb3-AMFA1 » ou « AMFA1 -mAb3 ». Ce conjugué comprend une partie (mAb3) qui se lie à une cible spécifique (comme un antigène extracellulaire ou membranaire) et une partie (AMFA1 ) qui se lie au RM6P-CI.

[0084] 4/ Greffage de l’AMFAI sur les chaînes oligosaccharidiques de la partie qlycosidique d'un anticorps anti-HER2 humanisé

L’anticorps anti-HER2, le trastuzumab, défini comme mAb4, a été testé et soumis à la même procédure que celle décrite dans le point 1/ ci-dessus afin de greffer l’AMFAI sur les chaînes oligosaccharidiques de l’anticorps mAb4.

Un conjugué de formule (I) est formé, qui peut indifféremment être représenté dans la demande par « mAb4-AMFA1 » ou « AMFA1 -mAb4 ». Ce conjugué comprend une partie (mAb4) qui se lie à une cible spécifique (comme un antigène extracellulaire ou membranaire) et une partie (AMFA1 ) qui se lie au RM6P-CI.

[0085] 5/ Greffage de l’AMFAI sur les chaînes oligosaccharidiques de la partie qlycosidique d'un anticorps anti-GFP

L’anticorps anti-GFP, défini comme Ab, a été testé et soumis à la même procédure que celle décrite dans le point 1/ ci-dessus afin de greffer l’AMFAI sur les chaînes oligosaccharidiques de l’anticorps Ab.

Un conjugué de formule (I) est formé, qui peut indifféremment être représenté par « Ab- AMFA1 » ou « AMFA1 -Ab ». Ce conjugué comprend une partie (Ab) qui se lie à une cible spécifique (comme un antigène extracellulaire ou membranaire) et une partie (AMFA1 ) qui se lie au RM6P-CI.

[0086] 6/ Greffage de TAMFA4 sur la fonction amine de résidus lysine de la partie peptidique d'un anticorps anti-VEGF humanisé

Le couplage entre TAMFA4 et l'anticorps mAb3 (bevacizumab) est effectué au niveau de la chaîne peptidique du mAb3, en particulier au niveau des résidus lysine selon le protocole décrit ci-dessous.

La solution d'anticorps mAb3 et TAMFA4 sont mis à réagir dans une solution tampon phosphate pendant 24 h à 37 °C sous agitation légère. Les échantillons sont dialysés pendant une nuit contre un tampon phosphate.

Un conjugué de formule (I) est formé, qui peut indifféremment être représenté par « mAb3- AMFA4 » ou « AMFA4-mAb3 ». Ce conjugué comprend une partie (mAb3) qui se lie à une cible spécifique (comme un antigène extracellulaire ou membranaire) et une partie (AMFA4) qui se lie au RM6P-CI.

[0087] Exemple 3 : Etude des conjugués (I) et de leurs propriétés biologiques

[0088] 1/ Etude du nombre d’AMFAI ou d’AMFA4 liés à une molécule d’anticorps mAb1 , mAb2, mAb3 ou mAb4

Les conjugués AMFA1 -mAb1 , AMFA1 -mAb2, AMFA1 -mAb3, AMFA1 -mAb4 et AMFA4- mAb3 ont été analysés par spectrométrie de masse MALDI-TOF en utilisant un spectromètre de masse RapifleX (Bruker) en mode linéaire, afin de quantifier le nombre d’AMFAI liés à une molécule d’anticorps, selon la méthode adaptée et décrite dans Zhou, Q et al. 2013.

Les poids moléculaires de chaque anticorps mAb1 , mAb2, mAb3 et mAb4 ont été mesurés avant et après le couplage avec l’AMFAI ou TAMFA4. Les échantillons et les standards ont été dilués à 1 : 5 dans de l'acide formique à 0,1 % dans de l’eau, puis dilués à 1 : 1 dans de l'acide sinapique saturé dans 50 % d'acétonitrile / 0,1 % de TFA. Un pL (microlitre) de ce mélange a été appliqué sur une cible. Les échantillons, les références correspondantes et le contrôle d'étalonnage BSA ont été analysés en double. Un étalonnage en deux points a été réalisé avec les ions [M+H] ⁺ et les ions dimères de BSA.

Le nombre d’AMFAI ou d’AMFA4 greffés aux anticorps mAb1 , mAb2, mAb3 ou mAb4 pour obtenir les conjugués de l’invention a été calculé sur la base de la différence des poids moléculaires entre le conjugué « AMFA-Anticorps » et son « Anticorps » témoin correspondant, puis en divisant la différence par le poids moléculaire de chaque AMFA.

[0089] Le tableau 1 ci-après présente les données de l'analyse MALDI-TOF de différents lots de conjugués AMFA1 -mAb1 , AMFA1 -mAb2, AMFA1 -mAb3 et AMFA1 -mAb4 tels qu’obtenus à l’exemple 2 (points 1/ à 4/).

[0090] [Tableau 1]

[0091] Le tableau 2 ci-après présente les données de l'analyse MALDI-TOF de différents lots de conjugués AMFA4-mAb3 tels qu’obtenus à l’exemple 2 (point 6/).

[0092] [Tableau 2]

[0093] Remarques et conclusion

L'augmentation des masses moléculaires après le greffage de l’AMFAI ou de l’AMFA4 est une indication du nombre d'AMFA couplés par anticorps. La reproductibilité de la réaction de greffage est indiquée par le faible écart-type du nombre d'AMFA greffés entre les différents essais.

Les données des tableaux 1 et 2 démontrent que l’AMFAI et TAMFA4 peuvent être facilement greffés sur l'anticorps mAb1 , mAb2, mAb3 ou mAb4, avec des standards de reproductibilité élevés, et que le nombre d'AMFAI ou d’AMFA4 greffés sur chaque anticorps est maîtrisé en modulant les conditions de réaction. Des concentrations plus faibles de l'agent oxydant, le métapériodate de sodium, permettent un taux de greffage plus faible de l’AMFAI .

Le greffage des AMFA de l’invention est reproductible et facilement maîtrisable selon les conditions de réaction.

[0094] 2/ Etude des modifications structurelles associées au greffage de l’AMFAI sur les anticorps mAb1 , mAb2, mAb3 ou mAb4

Les anticorps mAb1 , mAb2, mAb3 et mAb4 seuls ou conjugués à l’AMFAI (mAb1 -AMFA1 , mAb2-AMFA1 , mAb3-AMFA1 et mAb4-AMFA1 (les conjugués mAb-AMFA)) ont été analysés sur SDS-PAGE non dénaturant et dénaturant. La coloration au bleu de Coomassie a révélé une seule bande (sous conditions non-dénaturantes) ou deux bandes (sous conditions dénaturantes) de même poids moléculaire pour tous les anticorps avant et après couplage avec les AMFA1. La liaison de l’AMFAI avec l’anticorps n'a induit ni de dégradation visible ni de déplacement significatif du poids moléculaire des chaînes lourdes ou légères de l’anticorps en raison du faible nombre d'analogues greffés.

L'immunoréactivité des conjugués mAb-AMFA envers un second anticorps anti-IgG humaine commercial est inchangée sur le Western blot par rapport aux mAb. L'hybridation avec un anticorps de lapin anti-AMFA1 (représenté par « anti-AMFA » sur la figure 9) a confirmé la présence de l’AMFAI sur la chaîne lourde des anticorps liés à AMFA1 (selon les protocoles décrits dans Basile I. et al., 2018). Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 9.

Les analyses par Western blot des différents anticorps démontrent d'un côté que l'oxydation n'altère pas la structure générale de l'anticorps et de l'autre que le couplage de l’AMFAI est effectif sur les chaînes lourdes de chaque anticorps mAb1 , mAb2, mAb3 ou mAb4 et efficace comme le prouve la détection des AMFA1 par l'anticorps de lapin anti-AMFA1 . En conclusion, le greffage des AMFA1 aux anticorps mAb1 , mAb2, mAb3 ou mAb4 ne modifie pas l’intégrité de l’anticorps. De plus la détection des AMFA1 sur les chaînes lourdes des anticorps mAb1 , mAb2, mAb3 et mAb4 est en accord avec le greffage uniquement sur les chaînes oligosaccharidiques portées par les chaînes lourdes. Le fait que le traitement par la PNGase hydrolysant les chaînes N-glycosylées permette de détacher les AMFA1 du mAb1 -AMFA1 indique la spécificité du greffage sur les chaînes oligosaccharidiques.

[0095] 3/ Etude de la capacité des conjugués mAb1 -AMFA1 et mAb2-AMFA1 à se lier au RM6P-CI

Les essais d’affinité des conjugués de l’invention mAb1 -AMFA1 et mAb2-AMFA1 pour le RM6P-CI ont été réalisés en utilisant du RM6P-CI biotinylé (Basile et al, 2018).

On entend par affinité des conjugués mAb1 -AMFA1 et mAb2-AMFA1 pour le RM6P-CI la capacité des conjugués mAb1 -AMFA1 et mAb2-AMFA1 à se lier au RM6P-CI.

Brièvement, le RM6P-CI, purifié sur une colonne d'affinité phosphomannane-sepharose, a été biotinylé par de la biotine /V-hydroxysuccinimide. La liaison du RM6P-CI biotinylé (RM6P-CI-b) au pentamannose 6-phosphate (PMP) préalablement adsorbé sur une plaque de microtitration a été empêchée par la compétition de concentrations croissantes des conjugués mAb1 -AMFA1 ou mAb2-AMFA1. Le RM6P-CI-b lié au PMP adsorbé a ensuite été déterminé en utilisant la streptavidine couplée à de la peroxydase et son substrat, le dichlorhydrate d'o-phénylènediamine (OPD), par des mesures de densité optique. La valeur 100% correspond à la concentration de RM6P-CI-b liée au PMP adsorbé en absence de compétiteur.

Le tableau 3 ci-après présente les données des essais de liaison du M6P naturel au RM6P- Cl-b et des conjugués mAb1 -AMFA1 et mAb2-AMFA1 au RM6P-CI-b. Les conjugués étudiés comprennent une partie (mAb1 ou mAb2) qui cible une molécule cible (antigène) et une partie (AMFA1 ) qui cible le RM6P-CI-b. L'affinité (exprimée comme la concentration nécessaire pour une inhibition de la liaison de 50%, IC50) a été déterminée par un essai compétitif avec le ligand pentamannose 6-phosphate.

[0096] [Tableau 3]

[0097] Remarques et conclusion

Alors que la capacité de liaison de l’anticorps seul mAb1 ou mAb2 au RM6P-CI est proche de zéro (inférieure à 10 % de liaison à une gamme de concentrations de 5.10 ⁸ - 2.10 ⁶ M), le tableau 3 montre que le conjugué mAb1 -AMFA1 ou mAb2-AMFA1 de l'invention a une affinité de liaison plus élevée pour le RM6P-CI que celle du M6P naturel pour le RM6P-CI. Les conjugués de l’invention acquièrent ainsi la capacité de se lier au RM6P-CI. Plus particulièrement, le greffage de l’AMFAI , respectivement sur mAb1 et mAb2, permet aux conjugués de l’invention mAb1 -AMFA1 et mAb2-AMFA1 de gagner en affinité pour le RM6P- Cl.

[0098] 4/ Etude de l’impact du greffage de l’AMFAI sur l’affinité de liaison des anticorps mAb1 à mAb4 à la molécule cible, à savoir l’antigène correspondant (TNF-alpha humain, VEGF ou HER2).

L'affinité des anticorps mAb1 , mAb2, mAb3, mAb4 seuls, et des conjugués mAb1 -AMFA1 , mAb2-AMFA1 , mAb3-AMFA1 et mAb4-AMFA1 pour les antigènes cibles (TNF-alpha humain VEGF ou HER2) a été évaluée en utilisant un test ELISA pour déterminer la liaison à l’antigène.

On entend par « affinité » de l’anticorps ou du conjugué pour l’antigène la capacité de liaison dudit anticorps ou dudit conjugué pour ledit antigène.

En bref, l’antigène (TNF-alpha humain commercial, VEGF ou HER2) a été adsorbé sur une plaque de micropuits et incubé avec respectivement l’anticorps (mAb1 , mAb2, mAb3, mAb4) ou le conjugué correspondant (mAb1 -AMFA1 , mAb2-AMFA1 , mAb3-AMFA1 et mAb4-AMFA1 ).

Le taux d’anticorps ou de conjugués liés à la cible d'intérêt est déterminé par un anticorps anti-IgG humain couplé à la peroxydase de raifort et au substrat OPD en utilisant des mesures de densité optique. II ressort de la figure 10 que le greffage de l’AMFAI sur les anticorps mAb1 , mAb2, mAb3 ou mAb4 n’affecte pas leur affinité pour leur antigène cible (le TNF-alpha humain VEGF ou HER2). Les conjugués de l’invention présentent une affinité pour leur antigène comparable à celle des anticorps seuls.

[0099] 5/ Etude de la stabilité du conjugué mAb1 -AMFA1 de l’invention

Des conjugués mAb1 -AMFA1 provenant de différents lots ont été incubées dans un tampon acétate (pH 5) ou un tampon phosphate (pH 7) pendant une durée allant jusqu'à 12 jours. Les conjugués ont ensuite été analysées par MALDI-TOF pour déterminer si l'AMFAI était toujours lié à l'anticorps mAb1. Le nombre d’AMFAI greffés sur l’anticorps mAb1 a été déterminé au jour 0 et au jour 12 à pH 5 et 7. Les résultats obtenus sont illustrés dans le tableau 4 ci-après.

[0100] [Tableau 4]

[0101 ] Remarques et conclusion

Le tableau 4 montre que le nombre d’AMFAI greffés sur l'anticorps mAb1 est stable aux deux différents pH même après 12 jours. Les conjugués AMFA1 -mAb1 sont donc stables dans le temps et à différents pH.

[0102] 6/ Etude de l’internalisation cellulaire des conjugués mAb1 -AMFA1 , mAb3-AMFA1 et Ab-AMFA1

L'internalisation cellulaire des anticorps et des conjugués de l’invention a été observée dans des cellules de rhabdomyosarcome, des cellules de type lymphocytes T et des cellules de cancer du sein. Les données ont été obtenues par cytométrie en flux et par des essais de fluorescence cellulaire totale. Des cellules de rhabdomyosarcome, des cellules de type lymphocytes T et des cellules de cancer du sein ont été traitées pendant 24 h ou 48 h avec un complexe comprenant mAb1 -AMFA1 et un anticorps secondaire fluorescent anti-IgG humaine Alexa647 (figures 11 (A) et 12 (A)).

Avant l’incubation avec les cellules, l’anticorps mAb1 , le conjugué mAb1 -AMFA1 ainsi qu’une IgG humaine témoin non-spécifique ont été préalablement incubés avec l’anticorps secondaire fluorescent anti-IgG humaine Alexa647. La fluorescence présente dans les cellules a ensuite été analysée par cytométrie en flux (figure 11 (A)). Les données de la figure 1 1 (A) montrent une fluorescence significativement plus élevée (7,9 fois, 1 1 ,3 fois et 1 1 ,8 fois plus élevée par rapport au témoin) dans les cellules traitées avec mAb1 -AMFA1. La figure 1 1 (B, C) présente l’entrée de mAb1 et mAb1 -AMFA1 , et de mAb4 et mAb4-AMFA1 préalablement couplés à Alexa647 dans les lymphocytes T et les cellules de cancer ovarien SKOV3, respectivement. La figure 1 1 démontre que l’AMFAI améliore l'absorption cellulaire du conjugué mAb1 -AMFA par rapport au mAb1 seul. Le greffage de l’AMFAI à l’anticorps mAb1 augmente significativement l’internalisation cellulaire des anticorps.

Ces résultats ont été confirmés par les expériences d'internalisation du mAb1 , du mAb1 - AMFA1 ainsi que du mAb3 et du mAb3-AMFA1 , réalisées par un test de fluorescence cellulaire totale (figure 12). Les cellules de rhabdomyosarcome et de cancer du sein ont été traitées pendant 24 h dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment. La figure 12 montre qu'une fluorescence plus élevée est observée dans les cellules traitées avec le mAb1 -AMFA1 versus mAb1 (cellules du cancer du sein) et le mAb3-AMFA1 versus mAb3 (cellules de rhabdomyosarcome). Le greffage de l’AMFAI à l’anticorps mAb1 ou mAb3 augmente significativement l’internalisation cellulaire des anticorps.

Ces résultats ont été confirmés par microscopie confocale sur cellules vivantes de rhabdomyosarcome et de cancer du sein (figure 13 (A)). Les cellules ont été pré-incubés avec 200 nM de l’anticorps Ab ou du conjugué Ab-AMFA1 (voir exemple 2, point 5/) et 400 nM de protéine fluorescente verte, pendant 24 h.

Une fluorescence plus élevée a été observée avec Ab-AMFA1 versus Ab seul dans les deux types de cellules (vésicules cellulaires fluorescentes signalées par des flèches sur la figure 13). L’ajout d’un excès de M6P (10 mM) dans le milieu cellulaire pour saturer les sites de liaison du RM6P-CI a montré que l'internalisation de Ab-AMFA1 dans les cellules est considérablement réduite dans les deux types de cellules. Cette expérience démontre que la majorité de l'internalisation du Ab-AMFA1 a été réalisée par l’intermédiaire du RM6P-CI. Dans une autre expérience, mAb1 et mAb1 -AMFA1 ont été couplés au fluorophore Alexa467 pour mesurer leur internalisation dans les cellules Jurkat (lymphocytes T). L’augmentation de l’internalisation de mAb1 -AMFA1 par rapport à mAb1 , et la réversion de l’entrée des mAb-AMFA1 par l’addition d’un excès de 30 mM AMFA1 sont décrites et quantifiées dans la figure 13 (B, C). Plus largement, ces résultats démontrent que le greffage des AMFA sur des anticorps induit une augmentation de l'internalisation cellulaire par la voie de transport médiée par le RM6P-CI.

[0103] 7/ Etude du profil pharmacocinétique des conjugués mAb1 -AMFA1 et mAb2-AMFA1 de l’invention L'effet du greffage de l’AMFAI sur les anticorps mAb1 et mAb2 ciblant le TNF-alpha a été étudié en comparant le profil pharmacocinétique de mAb1 ou mAb2 avec celui des conjugués mAb1 -AMFA1 ou mAb2-AMFA1 correspondants.

Les anticorps mAb1 ou mAb2 ainsi que les conjugués mAb1 -AMFA1 ou mAb2-AMFA1 correspondants ont été administrés à des souris mâles C57BL/6J âgées de 10 semaines en une seule injection intraveineuse en bolus de 4 mg/kg diluée dans une solution saline physiologique. Les souris ont été pesées avant l'injection et tout au long de l'expérience pour surveiller leur état de santé. Des échantillons de sang prélevés à 4 heures et 1 , 2, 3, 7, 10, 14, 17 et 21 jours après l'injection ont été recueillis dans des tubes contenant de l'héparine et centrifugés à 3000 g pendant 15 min et le plasma a été conservé à - 20 °C jusqu'à la mesure. Les souris ont été sacrifiées 21 jours après l’injection. Aucun événement clinique indésirable n'a été observé dans les quatre groupes de traitement.

Les concentrations plasmatiques de mAb1 , mAb2, mAb1 -AMFA1 et mAb2-AMFA1 ont été mesurées à l'aide de techniques ELISA. Brièvement, le TNF-alpha humain recombinant a été adsorbé sur une plaque de micropuits Maxisorp et a été reconnu par le mAb1 , mAb2, mAb1 -AMFA1 ou mAb2-AMFA1 présents dans les échantillons de plasma. L'anticorps thérapeutique a été détecté par un anticorps anti-IgG humaine conjugué à la HRP et spécifique du fragment Fc, qui a permis ensuite une quantification par un dosage colorimétrique avec le substrat OPD et une lecture de l'absorbance à 450 nm.

Les résultats obtenus sont montrés à la figure 14. Les profils pharmacocinétiques de mAb1 comparé à mAb1 -AMFA1 (A) et de mAb2 comparé à mAb2-AMFA1 (B) détectés dans les échantillons de plasma des animaux traités, exprimés en pourcentage par rapport aux valeurs à 4 h, sont similaires. Aucune différence significative de demi-vie des anticorps n'est observée avec le greffage de l’AMFAI sur mAb1 ou mAb2. Le greffage de l’AMFAI sur les anticorps ne modifie donc pas leur stabilité plasmatique.

En conclusion, le greffage de l’AMFAI sur les anticorps mAb1 et mAb2 ciblant l’antigène TNF-alpha ne modifie pas le profil pharmacocinétique des anticorps.

[0104] 8/ Etude de la stabilité in vivo du conjugué mAb1 -AMFA1 de l’invention

La stabilité in vivo de la liaison de l’AMFAI à l'anticorps thérapeutique mAb1 a été évaluée en analysant la présence de l’AMFAI dans les échantillons de plasma collectés à 21 jours de souris traitées avec mAb1 -AMFA1 ou mAb1 comme décrit dans le point 7/ ci-dessus.

Les mAb1 ou mAb1 -AMFA1 ont d'abord été isolés des échantillons de plasma en se liant pendant 24 h à un anticorps anti-IgG humaine spécifique du fragment Fc préalablement adsorbé sur une plaque à micropuits. Comme contrôle de charge, 50 ng de mAb1 -AMFA1 dilué dans du tampon phosphate ont également été incubés. Après lavage, les anticorps liés ont été analysés par Western blot pour la présence de l’AMFAI à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-AMFA1 (représenté par « anti-AMFA » sur la figure 15) et avec un anticorps anti- IgG humaine pour contrôler la quantité de mAb1 ou mAb1 -AMFA1 présente à 21 jours. La figure 15 fournit la preuve que l'AMFAI est toujours conjugué à l'anticorps thérapeutique mAb1 à 21 jours. La figure 15 montre que mAb1 et mAb1 -AMFA1 sont tous deux détectés dans le plasma de souris traitées après 21 jours à une quantité similaire à celle du témoin de 50 ng de mAb1 -AMFA1 , comme le confirme l'hybridation avec l'anti-IgG.

La majorité des AMFA1 sont encore liés au mAb1 , l'intensité du signal de la bande étant comparable à celle du mAb1 -AMFA1 utilisé comme témoin.

[0105] 9/ Etude de la capacité du conjugué mAb1 -AMFA1 à augmenter l’internalisation cellulaire du TNF-alpha humain

Il est montré dans cette étude que l’antigène TNF-alpha humain, après avoir été internalisé dans les cellules avec le conjugué mAb1 -AMFA1 , est dégradé au cours du temps. La dégradation du TNF-alpha humain a été étudiée dans des cellules humaines de type lymphocytes T. Les cellules ont été traitées avec 5 ng/mL de TNF-alpha humain et 20 ng/mL de mAb1 ou mAb1 -AMFA1 , pendant 1 h, 5 h et 17 h. Les lysats cellulaires ont été analysés par Western blot pour la détection du TNF-alpha humain intracellulaire. Pour le conjugué mAb1 -AMFA1 , les données montrent une augmentation du niveau de TNF-alpha humain jusqu'à 17 h (figure 16 (A)). En revanche, seule une légère augmentation intracellulaire du TNF-alpha humain est remarquée avec l’anticorps mAb1 . Les données démontrent que le TNF-alpha humain est mieux internalisé grâce au mAb1 -AMFA1 par rapport à l’anticorps mAb1 . Les quantités de TNF-alpha mesurées par Western Blot dans le milieu de culture au cours du traitement par mAb1 -AMFA1 et mAb montrent que mAb1 -AMFA1 provoque une baisse plus importante du TNF-alpha (figure 16 (B)). Cette forte diminution dans le milieu extérieur est corrélée à l’augmentation de l’entrée cellulaire du TNF-alpha.

[0106] 10/ Etude de la capacité du conjugué mAb1 -AMFA1 à permettre la diminution de l’effet biologigue du TNF-alpha humain

Il est montré dans cette étude que le conjugué mAb1 -AMFA1 permet, en plus d’une meilleure internalisation dans la cellule, une diminution de l’effet biologique supérieure à celle observée avec l’anticorps seul.

Des cellules de type fibroblastes murins L929 ont été traitées avec 5 ng/mL de TNF-alpha humain et des doses croissantes de mAb1 ou mAb1 -AMFA1 .

Etant donné que le TNF-alpha humain induit une cytotoxicité dans les cellules L929, le taux de cellules vivantes après 48 h de traitement avec mAb1 ou mAb1 -AMFA1 a été analysé par la méthode MTT.

La figure 17 montre l’effet neutralisant sur la toxicité du TNF-alpha humain du mAb1 ou mAb1 -AMFA1 . Le mAb1 -AMFA1 permet de neutraliser la toxicité du TNF-alpha humain à des doses beaucoup plus faibles (4 à 5 fois) que le mAb1 .

En conclusion, les conjugués mAb1 -AMFA1 induisent une neutralisation dose-dépendante de l’inhibition de la croissance cellulaire induite par le TNF-alpha humain plus efficace que celle de l’anticorps mAb1 seul.

[0107] 11/ Etude de la capacité du mAb3-AMFA1 de l’invention à permettre une diminution de l’effet du VEGF humain sur la croissance des cellules HUVEC

Il est montré dans cette étude que le conjugué mAb3-AMFA1 permet, en plus d’une meilleure internalisation dans la cellule, une diminution de l’effet biologique supérieure à celle observée avec l’anticorps mAb3 seul.

Des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine HUVEC ont été traitées avec 50 ng/mL de VEGF humain et des doses croissantes de mAb3 ou mAb3-AMFA1 . Etant donné que le VEGF humain induit une prolifération des cellules HUVEC, le taux de cellules vivantes à 72 h sur les cellules traitées avec mAb3 ou mAb3-AMFA1 a été analysé par la méthode MTT.

La figure 18 montre que l’inhibition de l’effet mitogène du VEGF dans les cellules HUVEC est plus importante avec le conjugué mAb3-AMFA1 par rapport à l’anticorps seul. A faibles doses, le conjugué mAb3-AMFA1 est deux fois plus efficace que l’anticorps mAb3 seul. Le conjugué mAb3-AMFA1 est efficace à des doses beaucoup plus faibles (10 fois) que le mAb3.

[0108] 12/ Etude de la capacité des conjugués AMFA1 -mAb4 à permettre une diminution de la quantité de HER2

Des cellules de cancer du sein SK-BR-3 ont été traitées avec 10 ou 100 nM de mAb4 ou mAb4-AMFA1 pendant 24 h. Puis les cellules ont été fixées et la quantité de la protéine cible a été mesurée par une méthode colorimétrique basée sur un ELISA indirect.

La protéine HER2 est reconnue par un anticorps spécifique, dont la partie Fc sera à son tour reconnue par un anticorps secondaire couplé à la peroxidase (HRP). L’enzyme peroxidase catalysera la réaction colorimétrique après addition du substrat.

La figure 19 (A) montre la diminution de la protéine HER2 après traitement avec le mAb4- AMFA1 par comparaison à mAb4 seul sur les cellules SK-BR3. Les doses croissantes de mAb4-AMFA1 permettent une diminution plus importante de la concentration de HER2 cellulaire par rapport aux mêmes doses de mAb4.

Des cellules de cancer du sein BT474 ont été traitées par 5 nM mAb4 ou mAb4-AMFA1 pendant 5 h. La quantité totale de HER2 est quantifiée par Western blot. Après 5 h de traitement avec mAb4-AMFA1 , la quantité de HER2 est fortement diminuée alors que le traitement par mAb4 n’est pas efficace (figure 19 (B)). [0109] 13/ Recyclage extracellulaire des conjugués AMFA1 -mAb1 après leur internalisation dans les lymphocytes T

Le recyclage extracellulaire de l’anticorps mAb1 et du conjugué mAb1 -AMFA1 internalisés a été mis en évidence par des expériences d’entrée cellulaire des anticorps pendant 5 h dans les cellules lymphocytes T immortalisées (Jurkat) suivie d’un changement du milieu par un milieu dépourvu d’anticorps et d’une période de 1 et 5 h de relargage dans le milieu de culture des anticorps préalablement internalisés (figure 20 (A)). Dans une autre expérience les cellules sont traitées pendant 30 min avec les anticorps et après changement de milieu, le relargage des anticorps internalisés est mesuré après 10 et 30 min (figure 20 (B)). Les concentrations de mAb1 et mAb1 -AMFA1 ont été mesurées à l'aide de la technique ELISA comme décrit dans le point 7/ ci-dessus.

La figure 20 montre que le recyclage extracellulaire des conjugués mAb1 -AMFA1 est comparable à celui des mAb1 seuls. Ces résultats indiquent que le mAb1 -AMFA1 est normalement recyclé hors de la cellule après sa forte internalisation cellulaire médiée par le RM6P-CI.

[0110] La présente divulgation ne se limite pas aux exemples décrits ci-avant, seulement à titre d’exemple, mais elle englobe toutes les variantes que pourra envisager l’homme de l’art dans le cadre de la protection recherchée.

Liste des documents cités

Documents brevets

[0111] À toute fin utile, les documents brevets suivants sont cités :

- patcitl : EP 2 448 600 B1 ;

- patcit2 : EP 3 350 192 B1 ;

- patcit3 : .PCT/US2019/067228 ;

- patcit4 : PCT/IB2021/050922.

Littérature non-brevet

[0112] À toute fin utile, les éléments non-brevets suivants sont cités :

- nplcitl : Gary-Bobo et al. Curr. Med. Chem. 2007, 14, 2945-2953 ;

- nplcit2 : El Cheikh K. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 52016 ;

- nplcit3 : Zhu Y., et al. Mol Ther. 2009,17, 954-963 ;

- nplcit4 : Basile I. et al., J. Control. Release, 2018, 10, 269 ,15-23 ;

- nplcitô : Zhou, Q et al., Bioconjugate Chem. 2013, 24, 12, 2025-2035.